(72) 발명자 우선희 충청북도청주시흥덕구탑골로 6, 106 동 503 호 ( 산남동, 현진에버빌아파트 ) 권수정 충청북도청주시흥덕구대신로 10 번길 16-3, 102 동 1102 호 ( 복대동, 하복대 1 차현대아파트 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처

Size: px

Start display at page:

Download "(72) 발명자 우선희 충청북도청주시흥덕구탑골로 6, 106 동 503 호 ( 산남동, 현진에버빌아파트 ) 권수정 충청북도청주시흥덕구대신로 10 번길 16-3, 102 동 1102 호 ( 복대동, 하복대 1 차현대아파트 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처"

하라 강
5 years ago
Views:

1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (45) 공고일자 2017년02월13일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2017년02월06일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/34 ( ) A23L 1/30 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2013 년 07 월 12 일 심사청구일자 2014 년 12 월 18 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2015 년 01 월 21 일 (56) 선행기술조사문헌 KR B1* * 는심사관에의하여인용된문헌 (73) 특허권자 주식회사웰파이토 광주광역시북구첨단과기로 123,B-304( 오룡동, 광주과학기술원창업기술사업화센터 ) (72) 발명자 부희옥 서울특별시노원구덕릉로 517, 106 동 906 호 ( 중계동, 건영아파트 ) 김학현 충청북도청주시흥덕구대신로 10 번길 16-3, 104 동 505 호 ( 복대동, 하복대 1 차현대아파트 ) ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 위병갑전체청구항수 : 총 3 항심사관 : 고일영 (54) 발명의명칭도라지추출물을유효성분으로포함하는항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을가지는약학적조성물 (57) 요약 본발명은도라지추출물을유효성분으로포함하는항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을가지는약학적조성물에관한것으로서, 본발명에따른조성물은 DPPH, 아질산염또는 ABTS 양이온소거활성을증가시키고, 위암세포, 유방암세포, 직장암세포, 폐암세포, 간암세포, 자궁경부암세포에서항암활성을보였으며, 글루코오즈내당성이높았고, 기관지질환의여러균에항균활성을보임을확인하여항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을가지는약학적조성물로유용하게사용할수있다. 또한, 세포독성이일어나지않으며, 약물에대한독성및부작용도없어장기간복용시에도안심하고사용할수있으며, 체내에서도안정한효과가있다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (72) 발명자 우선희 충청북도청주시흥덕구탑골로 6, 106 동 503 호 ( 산남동, 현진에버빌아파트 ) 권수정 충청북도청주시흥덕구대신로 10 번길 16-3, 102 동 1102 호 ( 복대동, 하복대 1 차현대아파트 ) 이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 부처명 연구관리전문기관 연구사업명 연구과제명 기여율 1/ HD020 농림축산식품부 농림수산식품기술기획평가원 (IPET) 고부가가치식품기술개발사업 4 배체도라지의효율적생산및 bioreactor 를이용한배양근의대량생산시스템확립 주관기관 충북대학교 ( 총괄주관 ), ( 주 ) 파이토M&F( 세부주관 ) 연구기간 ~

3 명세서청구범위청구항 1 동결건조, 자연건조또는열풍건조된 4배체도라지추출물, 및곰보배추, 산수유및유자에서선택되는하나이상의첨가물을유효성분으로포함하고, 상기도라지추출물은디프테리아균 (Corynebacterium diphtheriae) KCCM 40413, 클렙시엘라폐렴균 (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) KCCM 및화농연쇄구균 (Streptococcus pyogenes) KCCM 11817으로이루어진군중에서선택되는하나이상의균주를억제하는항균활성을갖는항균용약학적조성물. 청구항 2 삭제청구항 3 제1항에있어서, 상기추출물은물, 유기용매또는이들의혼합용매추출물인것을특징으로하는항균용약학적조성물. 청구항 4 삭제청구항 5 삭제청구항 6 삭제청구항 7 삭제청구항 8 삭제청구항 9 동결건조, 자연건조또는열풍건조된 4배체도라지추출물, 및곰보배추, 산수유및유자에서선택되는하나이상의첨가물을유효성분으로포함하고, 상기도라지추출물은디프테리아균 (Corynebacterium diphtheriae) KCCM 40413, 클렙시엘라폐렴균 (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) KCCM 및화농연쇄구균 (Streptococcus pyogenes) KCCM 11817으로이루어진군중에서선택되는하나이상의균주를억제하는항균활성을갖는건강기능식품. 발명의설명 [0001] 기술분야 본발명은도라지추출물을유효성분으로포함하는항산화, 항암, 항당뇨또는항균용조성물에관한것이다. [0002] 배경기술 도라지는한의학에서는길경 ( 桔梗 ) 이라고하며, 초롱과에속하는다년생초로서한국을비롯한중국, 일본등지 - 3 -

4 에자생하며, 배농, 거담, 기관지염, 천식등의호흡기계질환에사용되어온생약재이다. 또한, 도라지는이를이용한한방처방수가동의보감에 273건, 방약합편에 49건이수록되어있을정도로다양한약리작용을가지고있는데, 도라지의주요약리성분은트리테르페노이드 (triterpenoid) 계사포닌 (saponin) 이알려져있고, 이러한성분은진해, 거담작용, 중추신경억제작용 ( 진정, 진통, 해열효과 ), 급만성염증에대한항염증작용, 항궤양및위액분비억제작용, 혈관을확장하여혈압을낮추는항콜린작용, 혈당강하작용, 콜레스테롤대사개선작용등이있는것으로알려져있다. [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 이외에도도라지의추출물은곰팡이의아프라톡신을억제하며, 이눌린분획은식균작용과고형암및복수암에대한강력한항종양효능이있고, 40% 도라지엑기스는알코올흡수억제작용을가지고있다. 한편, 도라지를포함하여생체유용한생리활성물질을함유한식물은 1차생산자로서사람을비롯한모든동물의식량이되기때문에이의개량이나증산에대한연구가필요하다. 그결과식물의세포및조직배양기술이발달하였고미분화세포덩어리인캘러스로부터완전히식물체의재분화가가능해지면서식물자원의효과적활용이가능케되었는데, 연구결과의예로식물생장조절물질들을사용하여식물의생장을촉진시킬수있게되었고, 식물의조직이나기관을특수한기내환경조건을구비하여재배함으로써외부의악영향을받지않고기내에서지속적인식물생산물을얻을수있게되었다. 이외에도배수체를제조하여식물을증가시키는연구도진행되고있다. 한편, 개발된종래방법에있어서 4배체식물을유도하는방법으로는콜히친방법에사용되고있으나, 종래는종자를콜히친용액에처리하여식물체를획득하는것으로 4배체의유기효율이적은단점이있다. 또한, 기내라는특수환경하의식물생장증식은여러가지기내환경에맞는선별적인영양분이필요하며, 대상이되는식물의종류및특성에따른적정배지가필요한문제점이있다. 이에본발명에서는도라지의생리활성물질을극대화할수있는방법을찾기위해노력하였으며, 이렇게제조된추출물을이용하여항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을갖는약학적조성물을제조하였다. 선행기술문헌 [0009] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 한국등록특허제 호 발명의내용 [0010] [0011] 해결하려는과제따라서본발명의목적은생체에부작용이없으면서다양한약리효과를갖는도라지추출물을유효성분으로포함하는항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을갖는약학적조성물을제공하는것이다. 또한, 본발명의목적은도라지추출물을유효성분으로포함하는항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을갖는건강기능식품을제공하는것이다. [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] 과제의해결수단상기와같은본발명의목적을달성하기위해서, 본발명은도라지추출물을유효성분으로포함하는항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을갖는약학적조성물을제공한다. 본발명의일실시예에있어서, 상기도라지는 2배체또는 4배체일수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기추출물은물, 유기용매또는이들의혼합용매추출물일수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기추출물은동결건조, 자연건조, 열풍건조또는마이크로웨이브건조를수행한것일수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기추출물은 DPPH, 아질산염또는 ABTS 양이온소거활성을증가시키는것일수있다

5 [0017] [0018] [0019] [0020] 본발명의일실시예에있어서, 상기조성물은곰보배추, 산수유및유자에서선택되는하나이상의첨가물을더포함하는것일수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기추출물은직장암또는자궁경부암세포사멸활성을갖는것일수있다. 본발명의일실시예에있어서, 상기추출물은디프테리아균 (Corynebacterium diphtheriae) KCCM 40413, 클렙시엘라폐렴균 (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) KCCM 41285, 화농연쇄구균 (Streptococcus pyogenes) KCCM 11817으로이루어진군중에서선택되는하나이상의균주를억제하는활성을갖는것일수있다. 나아가본발명은도라지추출물을유효성분으로포함하는항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을갖는건강기능식품을제공한다. [0021] 발명의효과본발명은도라지추출물을유효성분으로포함하는항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을가지는약학적조성물에관한것으로서, 본발명에따른조성물은 DPPH, 아질산염또는 ABTS 양이온소거활성을증가시키고, 위암세포, 유방암세포, 직장암세포, 폐암세포, 간암세포, 자궁경부암세포에서항암활성을보였으며, 글루코오즈내당성이높았고, 기관지질환의여러균에항균활성을보임을확인하여항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을가지는약학적조성물로유용하게사용할수있다. 또한, 세포독성이일어나지않으며, 약물에대한독성및부작용도없어장기간복용시에도안심하고사용할수있으며, 체내에서도안정한효과가있다. [0022] 도면의간단한설명 도 1 은 2 배체, 4 배체도라지추출물의건조방법별 SOD 효소활성을측정한결과이다 (FD: 동결건조, ID: 자연건조, HD: 열풍건조, MD: 마이크로웨이브건조 ). 도 2는 2배체, 4배체도라지추출물의건조방법별 CAT 활성을측정한결과이다 (FD: 동결건조, ID: 자연건조, HD: 열풍건조, MD: 마이크로웨이브건조 ). 도 3은 2배체, 4배체도라지추출물의건조방법별 APX 활성을측정한결과이다 (FD: 동결건조, ID: 자연건조, HD: 열풍건조, MD: 마이크로웨이브건조 ). 도 4는 2배체, 4배체도라지추출물의건조방법별 POD 활성을측정한결과이다 (FD: 동결건조, ID: 자연건조, HD: 열풍건조, MD: 마이크로웨이브건조 ). 도 5는디프테리아균 (Corynebacterium diphtheriae) KCCM 40413의항균활성정도를측정한결과이다 (A: 2배체, B: 4배체 ). 도 6은클렙시엘라폐렴균 (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) KCCM 41285의항균활성정도를측정한결과이다 (A: 2배체, B: 4배체 ). 도 7은화농연쇄구균 (Streptococcus pyogenes) KCCM 11817의항균활성정도를측정한결과이다 (A: 2배체, B: 4배체 ). [0023] [0024] [0025] [0026] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은도라지추출물을유효성분으로포함하는항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을갖는약학적조성물을제공함을특징으로한다. 도라지 는한의학에서는길경이라고도하는데성질은약간따뜻하며독이많고맛은맵고쓰다. 한방에서길경은노쇠하거나폐기가완전히쇠약해지지않은사람의기관지와폐의병에특효약이라고언급한다. 주로기혈을보강해주고뱃속의냉기를덜어주어심장쇠약, 설사, 주독등에도효과를나타내는데이는도라지의주성분이라할수있는사포닌에의한것으로거담, 항염, 항궤양, 부신피질호르몬분비촉진, 기도점액분비, 타액분비촉진등의약리작용을나타내며면역력을강화시키는영양소라고알려져있다. 이에본발명자들은도라지의생리활성물질을극대화할수있는방법을찾기위해노력하던중 2배체도라지에비해 4배체도라지에서생리활성물질의효과가더욱좋음을알수있었으며, 건조방법에따라서도효과가달라질수있음을확인하였다. 본발명의일실시예에따르면, 도라지추출물을 2배체와 4배체로나누었으며, 동결건조 (FD), 실내건조 (ID), 열 - 5 -

6 풍건조 (HD), 마이크로웨이브건조 (MD) 의방법및다양한농도로처리하여 DPPH 소거활성을분석한결과, 2배체도라지에비해 4배체도라지에서 DPPH 라디칼소거능이높게나타났으며, 건조방법별로는동결건조한시료에서비교적높은효능을보였고, 이러한 DPPH 소거활성의증가는농도에비례하는농도의존적경향을나타냄을알수있었다 ( 표 2 참조 ). [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] 본발명의일실시예에따르면, 도라지추출물을 2배체와 4배체로나누었으며, 동결건조 (FD), 실내건조 (ID), 열풍건조 (HD), 마이크로웨이브건조 (MD) 의방법및다양한농도의 ph를처리하여도라지의아질산염소거능을측정한결과, 반응용액이 ph 1.2일경우시료추출물대부분이아질산염을 60% 이상분해시킬수있었으며, 이중 2배체도라지의자연건조와마이크로웨이브건조에서각각 69.8% 와 66.7% 로가장높은아질산염소거활성을나타냈다. 2배체도라지에서 4배체도라지보다상대적으로다소높은소거능을보였지만, 크게유의성있는차이는아니었다 ( 표 4 참조 ). 본발명의일실시예에따르면, ABTS 양이온소거활성을 2배체, 4배체도라지의건조방법별검증한결과를보면, 추출물의농도가증가할수록비례적으로증가되는경향을보였으며, 대체적으로 4배체도라지에서 2배체도라지보다상대적으로높은소거활성을나타냈지만, 건조방법은소거활성의변화에그다지영향을주지못함을알수있었다 ( 표 6 참조 ). 본발명의일실시예에따르면, 도라지추출물에항암활성이있는지를알아보기위하여다양한부위의인체암세포주에 MTT방법을이용하여측정한결과, 전반적으로 4배체도라지에서 2배체도라지보다좋은효과가있는것으로나타났고, 여러세포주중에서특히직장암세포인 HCT 116 Cell과자궁경부암세포인헬라세포 (Hela Cel l) 에서는상대적으로높은효과를나타냈으며, MCF-7 Cell과 Calu-6 Cell에서는다른암세포주와비교하여다소낮은독성도를보였음을알수있었다 ( 표 12 참조 ). 또한, 본발명의일실시예에따르면, 도라지추출물에항당뇨효과가있는지를알아보기위하여 2배체, 4배체로나눈다음건조방법에따른내당성실험을한결과, 2배체와 4배체도라지추출물모두에서내당성이양호하게나타났으며, 동결건조, 자연건조보다열풍건조및마이크로웨이브건조에서내당성이우수함을알수있었다 ( 표 13 참조 ). 나아가본발명자들은도라지추출물에항균활성이있는지를알아보기위하여 3 종류의기관지질환유발세균에대한항균활성을측정한결과, 4배체도라지도라지추출물이 2배체도라지와비교하여상대적으로활성이높았으며, 특히클렙시엘라폐렴균 (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) 에서는현저히높은활성을나타냄을알수있었다 ( 도 5 내지 7 참조 ). 따라서이러한결과를통해본발명자들은본발명의도라지추출물이항산화, 항암, 항당뇨또는항균활성을가지는약학적조성물로사용할수있다는사실을알수있었다. 본발명에따른도라지는당업계에공지된추출및분리하는방법을사용하여천연으로부터추출및분리하여수득한것을사용할수있으며, 본발명에서정의된 추출물 은적절한용매를이용하여도라지로부터추출한것이며, 예를들어, 도라지의열수추출물, 극성용매가용추출물또는비극성용매가용추출물을모두포함할수있다. 도라지로부터추출물을추출하기위한적절한용매로는당업계에서허용되는용매라면어느것을사용해도무방하며, 물또는유기용매를사용할수있다. 예를들어, 정제수, 메탄올 (methanol), 에탄올 (ethanol), 프로판올 (propanol), 이소프로판올 (isopropanol), 부탄올 (butanol) 등을포함하는탄소수 1 내지 4의알코올, 아세톤 (acetone), 에테르 (ether), 벤젠 (benzene), 클로로포름 (chloroform), 에틸아세테이트 (ethyl acetate), 메틸렌클로라이드 (methylene chloride), 헥산 (hexane) 및시클로헥산 (cyclohexane) 등의각종용매를단독으로혹은혼합하여사용할수있으나, 이에제한되지는않는다. 추출방법으로는열수추출법, 냉침추출법, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법등의방법중어느하나를선택하여사용할수있다. 또한, 목적하는추출물은추가로통상의분획공정을수행할수도있으며, 통상의정제방법을이용하여정제될수도있다. 본발명의도라지추출물의제조방법에는제한이없으며, 공지되어있는어떠한방법도이용될수있다. 예를들면, 본발명의조성물에포함되는도라지추출물은상기한열수추출또는용매추출법으로추출된 1차추출물을, 감압증류및동결건조또는분무건조등과같은추가적인과정에의해분말상태로제조할수있다. 또한상기 1차추출물을실리카겔컬럼크로마토그래피 (silica gel column chromatography), 박층크로마토그래피 (thin layer chromatography), 고성능액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography) - 6 -

7 등과같은다양한크로마토그래피를이용하여추가로정제된분획을얻을수도있다. [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] 따라서본발명에있어서도라지추출물은추출, 분획또는정제의각단계에서얻어지는모든추출액, 분획및정제물, 그들의희석액, 농축액또는건조물을모두포함하는개념이다. 이러한도라지추출물을유효성분으로포함하는본발명의조성물은약제학적조성물일수있다. 본발명의약제학적조성물은상기유효성분이외에약제학적으로적합하고생리학적으로허용되는보조제를사용하여제조될수있으며, 상기보조제로는부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제또는향미제등을사용할수있다. 상기약제학적조성물은투여를위해서상기기재한유효성분이외에추가로약제학적으로허용가능한담체를 1종이상포함하여약제학적조성물로바람직하게제제화할수있다. 상기약제학적조성물의제제형태는과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제또는주사가능한액제등이될수있다. 예를들어, 정제또는캡슐제의형태로의제제화를위해, 유효성분은에탄올, 글리세롤, 물등과같은경구, 무독성의약제학적으로허용가능한불활성담체와결합될수있다. 또한, 원하거나필요한경우, 적합한결합제, 윤활제, 붕해제및발색제또한혼합물로포함될수있다. 적합한결합제는이에제한되는것은아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스또는베타-락토오스와같은천연당, 옥수수감미제, 아카시아, 트래커캔스또는소듐올레이트와같은천연및합성검, 소듐스테아레이트, 마그네슘스테아레이트, 소듐벤조에이트, 소듐아세테이트, 소듐클로라이드등을포함한다. 붕해제는이에제한되는것은아니나, 녹말, 메틸셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄검등을포함한다. 액상용액으로제제화되는조성물에있어서허용가능한약제학적담체로는, 멸균및생체에적합한것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민주사용액, 덱스트로즈용액, 말토덱스트린용액, 글리세롤, 에탄올및이들성분중 1 성분이상을혼합하여사용할수있으며, 필요에따라항산화제, 완충액, 정균제등다른통상의첨가제를첨가할수있다. 또한희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제및윤활제를부가적으로첨가하여수용액, 현탁액, 유탁액등과같은주사용제형, 환약, 캡슐, 과립또는정제로제제화할수있다. 더나아가해당분야의적절한방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에개시되어있는방법을이용하여각질환에따라또는성분에따라바람직하게제제화할수있다. 본발명의일실시예에있어서, 본발명의도라지추출물은조성물총중량에대하여 0.1ug/ml 내지 500ug/ml의농도로포함될수있다. 또한, 본발명의조성물은또한식품조성물일수있는데, 이러한식품조성물은유효성분인도라지추출물을함유하는것외에통상의식품조성물과같이여러가지향미제또는천연탄수화물등을추가성분으로서함유할수있다. 상술한천연탄수화물의예는모노사카라이드, 예를들어, 포도당, 과당등 ; 디사카라이드, 예를들어말토스, 슈크로스등 ; 및폴리사카라이드, 예를들어덱스트린, 시클로덱스트린등과같은통상적인당, 및자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨등의당알콜이다. 상술한향미제는천연향미제 ( 타우마틴 ), 스테비아추출물 ( 예를들어레바우디오시드 A, 글리시르히진등 ) 및합성향미제 ( 사카린, 아스파르탐등 ) 를유리하게사용할수있다. 본발명의식품조성물은상기약제학적조성물과동일한방식으로제제화되어기식품으로이용하거나, 각종식품에첨가할수있다. 본발명의조성물을첨가할수있는식품으로는예를들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올음료류, 비타민복합제및건강보조식품류등이있다. 또한상기식품조성물은유효성분인도라지추출물외에여러가지영양제, 비타민, 광물 ( 전해질 ), 합성풍미제및천연풍미제등의풍미제, 착색제및중진제 ( 치즈, 초콜릿등 ), 펙트산및그의염, 알긴산및그의염, 유기산, 보호성콜로이드증점제, ph 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에사용되는탄산화제등을함유할수있다. 그밖에본발명의식품조성물은천연과일쥬스및과일쥬스음료및야채음료의제조를위한과육을함유할수있다. 본발명의유효성분인도라지추출물은천연물질로서독성및부작용은거의없으므로항산화, 항암, 항당뇨및항균효과를위한목적으로장기간복용시에도안심하고사용할수있다. 본발명의건강기능식품은항산화, 항암, 항당뇨및항균효과를위한목적으로정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, - 7 -

8 환등의형태로제조및가공할수있다. [0049] [0050] [0051] [0052] [0053] [0054] [0055] [0056] 본발명에서 건강기능식품 이라함은건강기능식품에관한법률제6727호에따른인체에유용한기능성을가진원료나성분을사용하여제조및가공한식품을말하며, 인체의구조및기능에대하여영양소를조절하거나생리학적작용등과같은보건용도에유용한효과를얻을목적으로섭취하는것을의미한다. 본발명의건강기능식품은통상의식품첨가물을포함할수있으며, 식품첨가물로서의적합여부는다른규정이없는한, 식품의약품안전청에승인된식품첨가물공전의총칙및일반시험법등에따라해당품목에관한규격및기준에의하여판정한다. 상기 식품첨가물공전 에수재된품목으로는예를들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산등의화학적합성물 ; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검등의천연첨가물 ; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제등의혼합제제류등을들수있다. 예를들어, 정제형태의건강기능식품은본발명의유효성분인도라지추출물을부형제, 결합제, 붕해제및다른첨가제와혼합한혼합물을통상의방법으로과립화한다음, 활택제등을넣어압축성형하거나, 상기혼합물을직접압축성형할수있다. 또한상기정제형태의건강기능식품은필요에따라교미제등을함유할수도있다. 캅셀형태의건강기능식품중경질캅셀제는통상의경질캅셀에본발명의유효성분인도라지추출물을부형제등의첨가제와혼합한혼합물을충진하여제조할수있으며, 연질캅셀제는도라지추출물을부형제등의첨가제와혼합한혼합물을젤라틴과같은캅셀기제에충진하여제조할수있다. 상기연질캅셀제는필요에따라글리세린또는소르비톨등의가소제, 착색제, 보존제등을함유할수있다. 환형태의건강기능식품은본발명의유효성분인도라지추출물과부형제, 결합제, 붕해제등을혼합한혼합물을기존에공지된방법으로성형하여조제할수있으며, 필요에따라백당이나다른제피제로제피할수있으며, 또는전분, 탈크와같은물질로표면을코팅할수도있다. 과립형태의건강기능식품은본발명의유효성분인도라지추출물과부형제, 결합제, 붕해제등을혼합한혼합물을기존에공지된방법으로입상으로제조할수있으며, 필요에따라착향제, 교미제등을함유할수있다. 상기건강기능식품은음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올음료류, 비타민복합제및건강보조식품류등일수있다. [0057] [0058] 이하, 실시예를통하여본발명을추가적으로설명하고자한다. 이들실시예는본발명을보다구체적으로설명 하기위한것으로, 본발명의범위가이들실시예에한정되는것은아니다. [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] < 실시예 1> 도라지추출물의제조도라지추출물을제조하기위하여본발명자들은도라지를동결건조후, 증류수와주정알코올을 50%:50% 의비율로 3회상온추출한다음감압농축하였으며, 상기의방법으로감압농축된추출물을동결건조하여분말화하였다. 동결건조분말 100g을 n-헥산 (n-hexane), 메틸렌클로라이드 (Methylene chloride), 아세트산에틸 (Ethyl acetate), 부틸알코올 (Butyl alcohol), 증류수 (D.W.) 등의용매를사용하여순차적으로연속추출하여분획화한다음, 추출액을감압농축기로완전히농축한후에무게를측정하는방법으로각분획물의회수율을조사하였다. 그결과, 2배체, 4배체도라지모두물추출에서가장높은회수율을보였고아세트산에틸층에서는극히미미한수준의수율을보임을알수있었다 ( 표 1 참조 ). 표 1-8 -

9 [0064] 도라지추출물의용매별추출수율측정결과 Solvents Yield (g) 2배체 (Diploid) 4배체 (Tetraploid) n-hexane Methylene chloride Ethyl acetate Butyl alcohol D.W.(distilled water) [0065] [0066] < 실시예 2> 도라지추출물의 DPPH 라디칼소거능측정 [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] [0072] [0073] <2-1> 건조방법에따른 2배체, 4배체도라지의 DPPH 소거활성측정본발명자들은실시예 1의방법으로제조된도라지추출물에항산화효과가있는지알아보기위하여 Choi 등 (2003) 의방법을이용하여 DPPH 라디칼소거능을측정하였다. 먼저, 여러농도의시료를메탄올용매로용해하여 900 μl의 DPPH 용액 (100 μm) 과각시료 100 μl를혼합하여교반하였다. 이혼합시료를암소에서 30분간반응시킨후 517 nm에서흡광도를측정하였으며, 수소전자공여능은각실험을 3회반복하여평균을낸다음대조구에대한흡광도의감소정도를다음식에의하여계산하였다. An= (A 0 -A)/A An : DPPH radical 소거능에대한항산화활성 (%) A 0 : 시료가첨가되지않은 DPPH 용액의흡광도 A : 반응용액중의 DPPH와시료의반응한흡광도 [0074] 본발명의도라지추출물을 2배체와 4배체로나누었으며, 동결건조 (FD), 실내건조 (ID), 열풍건조 (HD), 마이크로웨이브건조 (MD) 의방법및다양한농도로처리하여 DPPH 소거활성을분석한결과, 2배체도라지에비해 4배체도라지에서 DPPH 라디칼소거능이높게나타났으며, 건조방법별로는동결건조한시료에서비교적높은효능을보였고, 이러한 DPPH 소거활성의증가는농도에비례하는농도의존적경향을나타냄을알수있었다 ( 표 2 참조 )

10 [0075] [0076] [0077] [0078] <2-2> 기능성강화를위한선발소재의 DPPH 소거활성측정본발명자들은본발명의도라지추출물과더불어다른식물소재를추가하여더욱더항산화기능이향상된추출물을제조하기위하여다양한식물소재의 DPPH 소거활성을측정하였다. 그결과, 다양한식물소재에서 DPPH 소거활성이존재하였지만특히산수유와뱀차조기추출물에서월등한 DPPH 소거활성이나타났으며, 이러한효과는농도의존적으로증가함을알수있었다 ( 표 3 참조 )

11 [0079] [0080] [0081] < 실시예 3> 도라지추출물의아질산염소거능측정 [0082] [0083] <3-1> 건조방법에따른 2 배체, 4 배체도라지의아질산염소거능측정 본발명자들은도라지추출물의아질산염소거능을측정하기위하여 1mM NaNO 2 20 μl에시료의추출액 40 μl와 0.1N HCl(pH 1.2) 또는 0.2M 시트레이트버퍼 (citrate buffer (ph 4.2, 6.0)) 를 140μl사용하여부피를 200μl로맞추었다. 이반응액을 37 항온수조에서 1시간반응시킨후 2% 아세트산 1000μl, Griess 시약 (30% 아세트산으로조제한 1% 설파닐산 (sulfanilic acid) 과 1% 나프틸아민 (naphthylamine) 을 1:1 비율로혼합한것, 사용직전에조제 ) 80μl를가하여잘혼합시켜빛을차단한상온에서 15분간반응시킨후 520nm에서흡광도를측정하여아래와같이아질산염소거능을구하였다. [0084] [0085] [0086] N(%) = [1-(A-C)/B] 100 N : 아질산염소거 (nitrite scavenging ability) A : 1 시간기다린후샘플에 1mM 아질산염을가한다음의흡광도 (absorbance of 1mM NaNO 2 added sample after standing for 1hour) [0087] [0088] B : 아질산염의흡광도 (absorbance of 1NaNO 2 ) C : 대조군의흡광도 (absorbance of control)

12 [0089] [0090] [0091] 본발명의도라지추출물을 2배체와 4배체로나누었으며, 동결건조 (FD), 실내건조 (ID), 열풍건조 (HD), 마이크로웨이브건조 (MD) 의방법및다양한 ph를처리하여도라지의아질산염소거능을측정한결과, 반응용액이 ph 1.2일경우시료추출물대부분이아질산염을 60% 이상분해시킬수있었으며, 이중 2배체도라지의자연건조와마이크로웨이브건조에서각각 69.8% 와 66.7% 로가장높은아질산염소거활성을나타냈다. 2배체도라지에서 4배체도라지보다상대적으로다소높은소거능을보였지만, 크게유의성있는차이는아니었다. ph 4.2에서도대부분 50% 이상의아질산염소거활성을나타냈지만, ph 6.0에서는거의대부분활성이없었다. 따라서 ph 변화에따른식물배수성별, 건조방법별추출물의아질산염소거활성은 ph 1.2에서가장높았으며 ph 가증가함에따라활성도점차감소되거나상실되었음을알수있었다. [0092] [0093] <3-2> 기능성강화를위한선발소재의아질산염소거능측정 본발명자들은본발명의도라지추출물과더불어다른식물소재를추가하여더욱더항산화기능이향상된추 출물을제조하기위하여다양한식물소재의 ph 농도를달리하여아질산염소거능을측정하였다

13 [0094] [0095] [0096] 그결과, 반응용액이 ph 1.2일경우시료추출물대부분이아질산염을 85% 이상분해시킬수있었으며, ph 4.2 에서도대부분 10% 이상의아질산염소거활성을나타냈지만, ph 6.0에서는거의대부분활성이없었다. 따라서 ph 변화에따른추출물의아질산염소거활성은 ph 1.2에서가장높았으며 ph가증가함에따라활성도점차감소되거나상실되었음을알수있었고, 다양한식물소재중산수유및여주추출물에서월등한아질산염소거활성을보임을알수있었다 ( 표 5 참조 ). [0097] [0098] < 실시예 4> 도라지추출물의 ABTS 양이온 (ABTS+) 소거활성측정 [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] [0104] <4-1> 건조방법에따른 2배체, 4배체도라지의 ABTS 양이온소거활성측정본발명자들은도라지추출물의 ABTS 양이온소거활성을측정하기위하여 7.4 mm ABTS(2,2'-azinbis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) 용액과 2.6 mm과황산칼륨 (potassium persulphate) 을혼합한다음암소에서약 15시간반응시킨후 414 nm에서흡광도가 1.5가되도록희석하였다. 희석한용액 3 ml에각농도별로조제한시료 150 μl를첨가한다음시험관혼합기 (vortex mixer) 로 10초간진탕하고실온에 90분간방치한후 414 nm에서흡광도를측정하였다. 한편, 아스코르브산 (ascorbic acid) 을시료와같은농도로조제하여동일한방법으로흡광도를측정함으로써비교하였다. 양이온소거능은 AEAC(relative ascorbic acid equivalent antioxidant capacity) 로나타내었으며, 이는아스코르브산의소거능을 1.000으로하였을때동일농도시료의 ABTS 양이온소거능을나타내는것으로다음과같은식에의해계산하였다. RAEAC = Caa As [0105] Aaa Cs [0106] ΔAaa : 아스코르브산넣었을때흡광도변화, Caa : 아스코르브산의농도

14 [0107] ΔAs : 시료넣었을때흡광도변화, Cs : 시료농도 [0108] [0109] ABTS 양이온소거활성을 2 배체, 4 배체도라지의건조방법별검증한결과를보면, 추출물의농도가증가할수록 비례적으로증가되는경향을보였으며, 대체적으로 4 배체도라지에서 2 배체도라지보다상대적으로높은소거활 성을나타냈지만, 건조방법은소거활성의변화에그다지영향을주지못함을알수있었다 ( 표 6 참조 ). [0110] [0111] <4-2> 기능성강화를위한선발소재의 ABTS 양이온소거활성측정 본발명자들은본발명의도라지추출물과더불어다른식물소재를추가하여보다더항산화기능이향상된추 출물을제조하기위하여다양한식물소재의농도를달리하여 ABTS 양이온소거활성을측정하였다

15 [0112] [0113] 그결과, 다양한식물소재에서 ABTS 양이온소거활성이존재하였지만특히산수유, 뱀차조기및유자 ( 과피또 는잎 ) 추출물에서월등한 ABTS 양이온소거활성을보였으며, 이러한효과는농도의존적으로증가함을알수있 었다 ( 표 7 참조 ). [0114] [0115] 기능성강화소재로서선발된 8 종의식물을대상으로항산화활성을검증한결과를보면, DPPH 소거능, 아질산염 소거능, ABTS 소거능결과모두에서곰보배추, 산수유, 유자가다른식물보다상대적으로높게나타났으며, 따 라서도라지소재외첨가소재로서는이들식물이적합하다. [0116] [0117] < 실시예 5> 도라지추출물의건조방법별항산화효소활성측정 [0118] [0119] <5-1> SOD (SuperOxide Dismutase) 효소활성측정 시료 0.5g 에분획버퍼 (extraction buffer)[100 mm K-PO 4 buffer(ph7.5), 100 mm EDTA, 1% PVP, 100 mm PMSF] 2 ml로균질화하여 15,000g 로 20분간원심분리한다음상층액을항산화활성측정에사용하였다. Ascorbate peroxidase(apx) 의경우분획버퍼 (extraction buffer) 에위의조성액 10mM를첨가하여사용하였다. 단백질정량은 BSA를표준물질로사용하여 Bradford (1976) 방법에따라측정하였으며, SOD효소활성검정은분석용 Kit (Sigma사,19160) 를사용하여측정하였다. 즉, SOD의효소활성이 NBT(Nitroblue tetrazolium) 의환원을저해하는능력을검정하는 photochemical NBT method를사용하였다. 반응액은 50 mm 카르보닉버퍼 (carbonic buffer, ph 10.2), 0.1 mm EDTA, 0.1 mm 크산틴 (Xanthine), mm NBT로하였으며, NBT환원저해율을흡광도 450nm 에서측정하였다. 각시료에대하여 3회반복으로하였으며, SOD효소활성은다음의계산식에의해환산하였다. [0120] SOD 활성 (NBT 환원저해율, %) = {[(A blank1 -A blank3 )-(A sample -A blank2 )] / (A blank1 -A blank3 )x100 [0121] 그결과, 동결건조및자연건조한 4 배체도라지에서 90% 로가장높은활성을보인반면, 마이크로웨이브건조의

16 2 배체도라지에서 47.5% 로가장낮은활성을나타내었으며, 전체적으로 4 배체도라지가 2 배체도라지보다상대 적으로다소높은활성을보였다 ( 도 1 참조 ). [0122] [0123] <5-2> CAT(Catalase) 활성측정 CAT 활성은 Aebi 등 (1984) 의방법에의해측정하였으며, 반응액은 50 mm 포타슘포스페이트버퍼 (potassium phosphate buffer, ph 7.0) 와 10 mm H 2 O 2 로하였다. CAT 활성은반응액에추출액을가한다음 240 mm 에 2 분간 의흡광도변화를측정하였다. [0124] [0125] [0126] 그결과, 모든건조조건에서 4배체도라지의활성이 2배체에서보다높은결과를보였다. 건조방법은동결건조와자연건조에서상대적으로높은활성을나타냈다 ( 도 2 참조 ). <5-3> APX (Ascorbate Peroxidase) 활성측정 APX 활성은 Nacano and Asada(1981) 방법에따라아스코르브산염 (ascorbate) 의산화정도를 290nm에서 2분간의흡광도변화를측정하였다. APX의반응액은 0.5mM 아스코르브산염와 0.2mM H 2 O 2 가첨가된100mM 포타슘포스페이 트버퍼 (potassium phosphate buffer, ph 7.5) 로하였다. [0127] 그결과, 동결건조한도라지에서다소높은활성을보였지만, 배수성과건조방법간에유의성있는차이를나타 내지는않았다 ( 도 3 참조 ). [0128] [0129] <5-4> POX (Peroxidase) 활성측정 POX 활성은 Egley 등 (1983) 의방법에의해측정하였으며, 반응액은최종농도가 40mM K-PO 4 buffer (ph6.9), 1.5mM guaiacol, 6.5mM H 2 O 2 가되도록만든다. POD 활성은반응액에샘플을혼합하여스펙트로포타미터 (spectrophotometer) 를이용해서 470nm 에서 2 분간흡광도변화를측정하였다. [0130] 그결과, 2 배체, 4 배체도라지모두동결건조및자연건조에서상대적으로높은활성을보였지만, 배수성간에 는유의한차이를나타내지않았다 ( 도 4 참조 ). [0131] [0132] [0133] < 실시예 6> 도라지추출물의용매분획별항산화효소활성측정각시료추출물의용매분획별항산화효소활성을보면, SOD와 CAT 활성은에틸아세테이트 (Ethyl acetate) 분획과메틸렌클로라이드 (Methylene chloride) 분획에서, APX 활성은부틸알코올 (Butyl alcohol) 분획과물 (Water) 분획에서, 그리고 POD 활성은메틸렌클로라이드분획과물분획에서상대적으로높은활성을보였다. 전반적으로 4배체도라지가 2배체도라지에서보다활성이높은것을알수있었다 ( 표 8 내지 11 참조 )

17 [0134] [0135] [0136]

18 [0137] [0138] [0139] [0140] [0141] < 실시예 7> 도라지추출물의항암활성분석본발명자들은도라지추출물에항암활성이있는지를알아보기위하여 2배체, 4배체도라지를준비하였으며 MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazoliumbromide) 분석을실시하여측정하였다. 위암세포인 SNU-601, SNU-1066, 유방암세포인 MCF-7, 직장암세포인 HCT-116, 폐암세포인 Calu-6, 간암세포인 Hep 3B, 자궁경부암세포인 Hela 등 7종의세포를 96웰플레이트에분주하고 37, 5%, CO 2 인큐베이터에서 24시 간동안배양하였다. [0142] 배양한세포에시료농도가 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000μg / ml이되도록 10μl처리한후, 각각 24시간배양하였고, 0.2mg / ml의 MTT 용액 10μl를각웰에넣고인큐베이터에서 4시간동안배양하였다. 배양종료후상등액을제거하고각웰에 100μl의 DMSO를첨가하여상온에서 10분동안반응시킨후흡광기 (microplate reade r) 로 540nm에서흡광도를측정하였고, 세포독성은시료의흡광도를대조군의흡광도에대한백분율로나타내었다

19 [0143] [0144] MTT방법에의한각시료추출물의인체암세포주에대한세포독성도를확인한결과, 전반적으로 4배체도라지에서 2배체도라지보다좋은효과가있는것으로나타났다. 특히직장암세포인 HCT 116 Cell과자궁경부암세포인헬라세포 (Hela Cell) 에서는상대적으로높은효과를나타냈으며, MCF-7 Cell과 Calu-6 Cell에서는다른암세포주와비교하여다소낮은독성도를보였음을알수있었다 ( 표 12 참조 ). [0145] [0146] [0147] [0148] [0149] < 실시예 8> 도라지추출물의항당뇨활성분석또한, 본발명자들은도라지추출물에항당뇨효과가있는지를알아보기위하여내당성실험을수행하였다. 내당성 (glucose tolerance test) 실험은글루코오즈 (Glucose) 함량을측정하는방법에의해수행하였으며, 본발명자들은각시료추출액이글루코오즈함량에미치는효과를측정하고자 BCS 글루코오즈키트를사용하여분석하였다. 효소시약을완충용액에용해시킨효소액 1.5 ml에각식물추출액 10 μl을넣고충분히혼합하여 37 에서 5분간가온한후 40분이내에 blank를대조로하여파장 505 nm에서흡광도를측정하였으며다음의식에따라글루코오즈함량을측정하였다. 이때, 효소액 1.5 ml에표준액 (glucose 200mg/dl) 20ul를넣은용액을표준용액으로사용하였다. 글루코오즈함량 (mg/dl) = (OD sample /OD standard ) 200mg/dl

20 [0150] [0151] 상기방법으로내당성실험한결과, 배체도라지에서글루코오즈내당성이다소양호하게나타났지만큰차이는 없었으며, 전체적으로도라지는내당성이뛰어남을확인할수있었다. 특히동결건조, 자연건조보다열풍건조 및마이크로웨이브건조에서내당성이우수함을알수있었다 ( 표 13 참조 ). [0152] [0153] [0154] [0155] < 실시예 9> 도라지추출물의항균활성분석나아가본발명자들은도라지추출물에항균활성이있는지를알아보고자 2배체, 4배체도라지추출물을시료로하여기관지질환균배양용액체배지 (meat extract 1%, tryptone 1%, NaCl 0.5%, glucose 0.2%, yeast extract 0.3%, pepton 0.1% ph7.3) 에첨가하여항균효과를조사하였다. 세균배양용배지는 blood agar base (Difco 0045) 를변형하여이용하였으며, 항균활성검정은한천배지확산법 (disk agar plate diffusion method) 으로측정한다. 즉, 각시험미생물에적합한배지에 10 7 CFU/mL 농도로시험미생물을배양한 soft agar를페트리디시 (petri dish) 에분주한후페이퍼디스크 (paper disc) 를올려놓고시료추출물 40 μl씩분주후배양하여저해환의생성을관찰하였다. 24시간이내에저해환이생성된경우항균활성이양성인것으로판정하였으며, 저해환의직경을측정한후비교하였다. 하기표 14는본발명의도라지항균활성실험에사용한 3가지균주종류및배양조건을기재한것이다. [0156]

21 [0157] 3 종류의기관지질환유발세균에대한항균활성결과, 4 배체도라지추출물이 2 배체도라지와비교하여상대적 으로다소활성이높았으며, 특히클렙시엘라폐렴균 (Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae) 에서는현저히 높은활성을나타냄을알수있었다 ( 도 5 내지 7 참조 ). [0158] 이제까지본발명에대하여그바람직한실시예들을중심으로살펴보았다. 본발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자는본발명이본발명의본질적인특성에서벗어나지않는범위에서변형된형태로구현될수있음을이해할수있을것이다. 그러므로개시된실시예들은한정적인관점이아니라설명적인관점에서고려되어야한다. 본발명의범위는전술한설명이아니라특허청구범위에나타나있으며, 그와동등한범위내에있는모든차이점은본발명에포함된것으로해석되어야할것이다. 도면 도면 1 도면

22 도면 3 도면 4 도면

23 도면 6 도면

Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No μ μ

Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,