11-1543 000-002 142-01 발간등록번호 R&D Report 첨단생산기술개발사업 - 1 -
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보고서요약서 과제고유번호 115051-2 해당단계 연구기간 2015.12.18. ~2017.12.17. (24 개월 ) 단계구분 2015.12.18. ~2017.12.17. (24 개월 ) 단위사업 농식품기술개발사업 연구사업명 사업명 첨단생산기술개발사업 연구과제명 대과제명 세부과제명 과산화물계화합물활용주요작물세균및진균병해의친환경관리기술개발 ( 주관제 1 세부 ) 과산화초산화합물활용원예작물병해관리 ( 제 1 협동 ) 과산화초산화합물활용식량작물병해관리 ( 제 2 협동 ) 과산화초산화합물개발및상품화 해당단계 총 : 명 해당단계 정부 : 천원 참여 내부 : 명 연구개발 민간 : 천원 연구원수 외부 : 명 비 계 : 천원 연구책임자 홍점규 총연구기간 총 : 10 명 정부 : 200,000 천원 참여 내부 : 2 명 총연구개발비 민간 : 68,000 천원 연구원수 외부 : 8 명 계 : 268,000 천원 연구기관명및 소속부서명 ( 주관제 1 세부 ) 경남과학기술대학교원예과학과 ( 제 1 협동 ) 세종대학교바이오산업자원공학과 ( 제 2 협동 ) ( 주 ) 대성 C&S 기술연구소 참여기업명 ( 주 ) 대성 C&S 위탁연구 연구기관명 : 연구책임자 : 보고서면수 49 쪽 - 3 -
코드번호 D-01 최종연구개발목표는국내주요원예작물및식량작물생산을위한저비용친환경병해방제제의개발 과산화초산혼합제의토마토, 딸기및벼식물체에대한약해검정 연구의 목적및내용 토마토, 딸기및벼의주요병원균에대한 in vitro 항균활성검정 ( 토마토풋마름병균, 딸기위황병균, 벼흰잎마름병균, 벼잎집무늬마름병균 ) 과산화초산혼합제처리에의한토양 ph 에대한영향을분석 토마토, 딸기및벼의주요세균및진균병해방제를위한과산화초산혼합제의적정처리시기및방법제안 이를바탕으로과산화초산혼합제의효능강화방안탐색하며농자재로등록 과산화초산혼합제의농도별처리에대한토마토, 딸기및벼식물체의약해발생수준구명 토마토, 딸기및벼의주요병원성진균 ( 딸기위황병균, 벼잎집무늬마름병균 ) 및세균 ( 토마토풋마름병균, 벼흰잎마름병균 ) 에대한 in vitro 항균활성검정 과산화초산혼합제는토마토풋마름병세균을액체배지상에서 in vitro 생장을억제하였으며, 딸기위황병진균의분생포자발아와균사생장을억제하였음 과산화초산혼합제는벼흰잎마름병세균을액체배지상에서 in vitro 생장을억제하였으며, 벼잎집무늬마름병진균의균사생장을억제하였음 연구개발성과 토마토풋마름병방제를위하여과산화초산혼합제 1% 희석액을식물체주변에 토양관주가효과적임 딸기위황병방제를위하여딸기배양상토살균에효과적이었으며, 딸기생육기를고려하여과산화초산혼합제의희석액을처리해야함 0.02% 과산화초산혼합제의토양처리가딸기위황병의발생을지연시켰음 5% 과산화초산혼합제의살포처리는벼흰잎마름병의발생을억제시켰음 0.5% 과산화초산혼합제의 1회살포처리로벼잎집무늬바름병을감소시켰으며, 3회처리는병방제효율을증가시켰음 과산화초산화합물의다양한조성물을개발하여독성검사를하였으며안정적인조성물의조합으로최적화을이루어특허출원함 연구개발성과의 활용계획 ( 기대효과 ) 과산화초산혼합제를활용하여병발생에의하여많은수확량감소를초래하는토마토풋마름병, 딸기위황병, 벼흰잎마름병과잎집무늬마름병방제를위한친환경적방제제로의적용이기대됨 본연구성과를바탕으로고질적으로병방제가어려운다양한작물병에대해적용방법을제시할수있을것으로기대됨 중심어 (5 개이내 ) 과산화초산 화합물 페로산병방제친환경항미생물 - 4 -
코드번호 D-02 Development of low cost- and eco-friendly disease management agents for sustainable horticultural and stable food crop production Purpose & Contents Evaluation of phytotoxicity in tomato, strawberry and rice plants by peroxyacetic acid mixture treatment Evaluation of in vitro antimicrobial activity and in planta crop protection efficacies in tomato, strawberry and rice diseases by peroxyacetic acid mixture treatment Registration of peroxyacetic acid mixture as an eco-friendly disease management agent Dose-dependent phytotoxic effect of peroxyacetic acid mixture on tomato, strawberry and rice plants were investigated Results In vitro antibacterial activity of peroxyacetic acid mixture on Ralstonia pseudosolanacearum and Xanthomonas oryzae pv. oryzae, as well as in vitro antifungal activity on Fusarium oxysporum f. sp. fragariae and Rhizoctonia solani were investigated Applying peroxyacetic acid mixture effectively controlled tomato bacterial wilt, strawberry Fusarium wilt, rice bacterial blight and rice sheat blight Disease protection efficacies were dependent on treatment method and concentration of peroxyacetic acid mixture Expected Contribution Peroxyacetic acid mixture was applied for a domestic patent as an eco-friendly disease management agent after toxicity tests Expected for an eco-friendly disease management during tomato, strawberry and rice plants against tomato bacterial wilt, strawberry Fusarium wilt, rice bacterial blight and rice sheat blight using the peroxyacetic acid mixture Expected for application of the peroxyacetic acid mixture for other economically important crop productions Keywords peroxyacetic acid mixture Perosan disease control eco-friendly antimicrobial - 5 -
1. Research Introduction 1 2. Current Technology Trends 5 3. Research Results 7 4. Outcome & Contribution 43 5. Application Plan 44 6. Information abroad 45 7. Security 45 8. Instruments 45 9. Research Safety 45 10. Research Achievement 47 11. Others 47 12. References 47-6 -
1. 연구개발과제의개요 1 2. 국내외기술개발현황 5 3. 연구수행내용및결과 7 4. 목표달성도및관련분야에의기여도 43 5. 연구결과의활용계획등 44 6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 45 7. 연구개발성과의보안등급 45 8. 국가과학기술종합정보시스템에등록한연구시설 장비현황 45 9. 연구개발과제수행에따른연구실등의안전조치이행실적 45 10. 연구개발과제의대표적연구실적 47 11. 기타사항 47 12. 참고문헌 47-7 -
1. 연구개발과제의개요 1-1. 연구개발목적 코드번호 D-03 < 최종목표 > 국내주요작물생산을위한저비용친환경병해방제제의개발 < 세부목표 > 과산화초산혼합제의토마토, 딸기및벼에대한약해검정 과산화초산혼합제의토마토, 딸기및벼의주요병원균에대한 in vitro 항균활성검정 과산화초산혼합제의토양 ph 및유용미생물에대한영향분석 토마토, 딸기및벼의주요세균및진균병해방제를위한과산화초산혼합제의적정처리시기및방법제안 과산화초산혼합제의효능강화방안탐색 과산화초산혼합제의농자재등재 1-2. 연구개발의필요성 가 ) 국내토마토와딸기시설재배현황 우리나라의시설원예면적은 2007년을기준으로 52,000ha이며이중비닐온실이 50,000ha, 유리온실이 300ha, 복합형구조온실이 1,700ha를차지하고있음. 토마토생산량은 20만톤대내에서변동하다가 2004년부터급속히증가하여 2005 2006 년 42만톤대를유지하며현재까지지속적으로생산량이증가하고있으며, 노지재배보다는주로시설내에서의양액재배가주를이룸. [ 그림 1] 토마토의생산량과재배면적 [ 그림 2] 전국토마토재배면적현황 딸기는 2011년 5,816 ha였던재배면적이 2013년에 6,890 ha으로증가될정도로재배면적이전국적으로꾸준히증가하는추세임. 또한기술의집적에힘입어생산량은 171,519 톤에서 216,804톤으로, 생산액은 8,940억에서 13,359억으로증가될만큼상당한증가가이루어지고있음. 특히홍콩, 싱가포르등으로의수출이이루어지고있는고부가가치작물로자리매김함. - 1 -
[ 표 1] 국내딸기생산동향 [ 표 2] 국내딸기수출현황 나 ) 시설토마토와딸기의주요병해발생 야간온도가낮고습도는매우높아지는현상이지속될때에토마토의잿빛곰팡이병, 역병, 딸기의잿빛곰팡이병등의발생율이가파르게상승함. 토마토흰가루병은노지재배에서는 6 7월과 9 10월에주로발생하게되나피해가큰편은아님. 시설재배에서는일교차가큰계절인 3 6월과 10 11월에많이발병. 고온건조한날씨가지속될때에다양한종류의바이러스병해발생양이증가함. 특히지난 2008년 6월경남통영의시설토마토농가에서담배가루이에의하여전염되는토마토황화잎말림바이러스 (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV) 가처음발견된이후전국적으로피해가증가하는추세. 온도가올라가는 6~10월고온기에토마토풋마름병이많이발생. 토양내에있는 Ralstonia solanacearum 세균이상처, 뿌리끝및이차근의생성부위를통하여토마토에침입하며뿌리피층 (cortex) 을통한세포내진전및도관의점유가이루어짐. 토마토전신에세균이파급되며이결과시들음증상이심화됨. [ 그림 4] 토마토풋마름병발생생태 - 2 -
딸기의육묘단계에서는탄저병, 위황병등의토양전염성병해의발생이많이일어나며, 정식후본포에서는위황병발생이지속적으로문제가될뿐만아니라잿빛곰팡이병과흰가루병의발생이증가함. 딸기위황병은토양전염성진균 Fusarium oxysporum f. sp. fragariae에의하여발생하는데육묘기뿐아니라주로개화기부터수확기에도많이발생. 새잎의소엽이누렇게되고작아지며비틀어지거나안쪽으로말리는기형이됨. 병든포기가위축되고불량하며런너의발생도적음. 감염크라운, 엽병, 열매자루의관다발조직이갈변되며뿌리의갈변부패도관찰됨. [ 그림 5] 위황병발생에의한딸기식물의병징 [ 그림 6] 겨울철딸기와토마토의병해충발생주의경보 다 ) 벼의최근병해충발생현황 농촌진흥청은최근고온성해충인벼멸구, 흰등멸구, 혹명나방과병해로는잎도열병, 잎집무늬마름병-Rhizoctonia solani(sheath blight), 흰잎마름병-Xanthomonas oryzae pv. oryzae(bacterial blight) 이빈발할것으로우려되고있다고밝힘. 잎도열병은거름기가많은논에비가자주올경우쉽게발병하는데병무늬가생기면급속히확산될우려가있어수시로예찰해방제해야함. 벼줄무늬잎마름병은애멸구에의해전염되는바이러스병으로논에애멸구가발생하면즉시적용약제를살포해야함. 최근지구온난화의영향으로인하여, 벼재배지의주요병으로잎집무늬마름병 (Rhizoctonia solani) 의발생이크게증가. 잎집무늬마름병은벼포기의밑둥인잎집에서진균에의해검은무늬가생기면서발생. 병방제를위해서는중간물떼기를잘해주고병든줄기가 20% 이상나타나면적용약제를뿌리는것이일반적인방제법임. 라 ) 친환경병해방제제연구개발의현황과필요성 수확량을목적으로선발육종한결과재배되는작물들은기존의원형야생식물과매우다르게육종되는경우가많이있었으며종종기존의병저항성성질을잃어버리며병해충에약해지는경우가발생하고인간이추가로공급할수있는토양의양분은그육종을위한목적형질로고려되지못하는경우가많아왔음. - 3 -
최근까지도식물병을관리하기위해서는화학적방제방법이널리사용되어왔고생장을촉진시키기위하여지속적인화학비료의사용이요구되어왔음. 최근전세계적으로모든분야에있어서가장부각되는키워드는 친환경 (green) 임. 국내에서도환경보존에대한국민적공감대가커지고소득수준이높아지면서먹거리자체의품질뿐만아니라안전성에대한관심이높아지고있음. 지구적인 친환경 으로토양과수질환경을직접 / 간접적으로오염시키는식물생육을위한필요이상의비료의사용과병원균방제를위한과도한농약의사용이다음세대로물려줄환경을황폐하게하고있다는데공감하고있음. 또한생활수준이높아지면서점점친환경농업의중요성이강조되고있고식물병관리와생산량증대를위해당연히사용되어왔던농약등사용에부정적인의식이쌓이기시작. 친환경적이고지속가능한농업을이루고자하는노력의일환으로증가하는식물병해발생을저지하기위한새로운방제법들의개발이연구되고있으며, 주로다양한종류의유기물또는천연물유래추출물을처리하여병발생을감소시키거나, 다양한기작의길항미생물을도입하여식물병원균을억제하는방안들이제시되고있음. [ 그림 7] 친환경농산물재배면적 딸기위황병은현재까지토양소독외에는구리수화제및길항세균을활용한방제법이제시된이래로어떠한친환경적인적절한방제법이제시되지못하고있음. 이는토양에오랫동안생존하는위황병균의후막포자의존재때문인것으로생각됨. 따라서육묘기와본포에서의딸기위황병관리를위하여새로운접근법이절실한상황. 특히과산화수소및산화질소의혼합처리에의하여토마토풋마름병세균에대하여증가된항세균능력을바탕으로병발생의감소가보고됨. 최근토양에개량제, 식물정유, 길항세균, 식물생장촉진근권세균및식물방어활성제의처리에의하여토마토풋마름병의친환경적인관리법이제시되고있음. 토마토풋마름병의방제를위하여현재까지토양소독제및항생제처리에의한방제법들이제시되어오고있으나, 잔류토양소독제에의한토마토의약해발생우려와잦은항생제처리에의한내성균주의발생이염려되고있는실정. 몇몇구리화합물과항생제기반살균제의처리에의하여국내의토마토풋마름병발생감소효과가보고됨. - 4 -
벼흰잎마름병은태풍또는집중호우등의영향으로물을통하여전염되는세균병으로발생시기가매년빨라지고있으며이상기후로인해서그병원성이갈수록증가하고있음. 특히농촌진흥청국립식량과학원에따르면벼흰잎마름병의균계가운데병원성이강한균계 (K3a K4 K5) 가늘어나수량및미질저하가우려되고있음. 벼흰잎마름병은한번발병하면기존의약제로는방제가어렵다고인식되고있으며품종에따라발병에차이가있어서친환경재배에있어서는품종선택이여전히가장중요한점으로고려되고있음. 친환경제제로특허등록된미생물제제등이있으나생균제이므로구입즉시사용해야하며미생물제품의단가가높고, 품질이균일하지않아최종수요자인농가가이용하는데는아직많은어려움이있음. 벼잎집무늬마름병의경우는지금까지이곰팡이병에대한저항성품종이거의없는상황이기때문에경종적인방제와약제방제이주로사용되고있음. 친환경방제방법에대한선행연구가미미한실정으로라지벳취병방제를위해개발된약제를이벼잎집무늬마름병방제에도사용하고있고, 천연식물성항균물질을이용한방제법등이개발되어있으나아직은일반약제를통한방제가주를이루고있는상황임. 1-3. 연구개발범위 가 ) 과산화초산혼합체의처리농도와방법에따른작물에대한약해검정나 ) 과산화초산혼합체의작물병원성세균및진균에대한 in vitro 항균활성검정및최소억제농도결정다 ) 주요작물의세균병및진균병방제를위한과산화초산혼합체의처리농도, 시기, 횟수결정라 ) 과산화초산혼합체의항균활성효능강화방안탐색마 ) 과산화초산혼합체의제재화및상품화 2. 국내외기술개발현황 코드번호 D-04 국외에서는이미과산화초산화합물이친환경적이고지속적인시설원예를위한병해충방제의대체제로인식이되기시작함. 과산화초산및과산화초산함유혼합제를이용하여미생물을제어하려는노력들이이루어져왔으며, 상품화되어출시된다양한예들이존재함. 일반적으로시설소독용으로사용되거나과채류의과실수확후저장전에처리하여유통기간을늘리려는목적으로실시함. 브라질 Peroxidos do Brasil 사 ( 社 ) 에서두종류의과산화초산혼합제인 Proxitane R 0510 과 - 5 -
Proxitane R 1512를출시하였음. Proxitane R 0510은과산화초산 5%, 과산화수소 18%, 아세트산 15% 로구성되어있으며, Proxitane R 1512는과산화초산 15%, 과산화수소 23%, 아세트산 16% 로구성되어있음. 두물질살진균, 살세균, 살바이러스제제로제시됨. Proxitane R 0510 을수경재배중의토마토식물에처리하였을때에 0.05% 이상의처리에의하여 약해가발생하는것이발견됨 (Vines et al. 2003). 어느종류인지는밝히지않고있으나 Proxitane R 의처리에의하여방울토마토표면의 Salmonella 세균의수가상당히감소하였음을보고함 (Josẻ & Vanetti 2010). 수경재배중인물냉이 (watercress) 에과산화초산혼합제를 0.04% 농도로첨가한결과뿌리생육을위한산소공급이원활하게이루어져전체생육지표가상승되었을뿐만아니라생산량이증가함 (Carrasco et al. 2011). 미국 Ecolab사 ( 社 ) 에서출시된 Tsunami R 100는과산화초산 15.2% 와과산화수소 11.2% 를함유하고있는혼합제재로서여러나라에서그활용방안이제안되어왔음. 파프리카, 오이, 딸기등의과채류의과실에처리한 Tsunami R 100에의하여식중독을유발하는 Salmonella spp. 세균의불활성화를유도하였음 (Yuk et al., 2006). 수확후토마토와파프리카를 500 mg/litre의농도로희석한 Tsunami R 100에 1분간세척하고건조시킨후식물병원성진균 Rhizopus stolonifer를접종한결과접종 25일후까지썩음증상이나타나지않음 (Alvaro et al. 2009). 동일회사에서출시한 Tsunami R 200을사과, 칸탈루프, 딸기, 상추, 토마토의과실표면에적용하여 Enterobacter sakazakii 세균을감소시킴 (Kim et al. 2006). 각회사별로출시된과산화초산혼합제들이구성성분이모두다름을알수있음. 200 μl/liter 농도의과산화초산의단독처리에의하여딸기열매에 Botrytis cinerea에의해발생하는잿빛곰팡이병의발생이 66% 가량감소함 (Abd-Alla et al. 2011). 영국 Certis사 ( 社 ) 에서개발한 Jet 5(5% 과산화초산 ) 으로수선화구근을처리하여 Fusarium oxysporum f. sp. narcissi에의한밑둥썩음병과줄기선충에의한피해를감소시킴 (Hanks & Linfield 1999). 특히포름알데히드로는사멸시킬수없었던 F. oxysporum f. sp. narcissi의후막포자 (chlamydospore) 의파괴한것으로보아주요작물에서발생하는다양한종류의 Fusarium 시들음병방제가가능할것으로생각됨. Jet 5는또한감자의저장에사용이제안되기도하였으며, 최근영국전역에서문제가되고있는 Chalara fraxinea 에의한진균성병해인서양물푸레나무잎마름병 (ash dieback) 을방제하기위하여제안됨. Peroxyacetic acid의처리는 4 의냉장조건에서식중독세균인 Salmonella enterica와식물병원성세균인 Pectobacterium carotovorum의 biofilm을분산시키는효과가있었으며, 각각의세균에대하여 MAHMA와 molsodomine과같은소독제와혼합할경우 biofilm 분산효과가더욱좋아졌음 (Marvasi et al. 2016). Peroxyacetic acid의상업화산물인 PERACLEAN R 5의첨가로토마토잿빛곰팡이병균인 Botrytis cinerea의포자발아와균사생장억제를위한두종류의살균제 SWITCH(26.7% boscalide, 6.7% pyraclostrobine) 와 SIGNUM(37.5% cyprodinil, 25% fludioxonil) 의효과를상 - 6 -
당히증가시킬수있었음 (Ayoub et al., 2017). 딸기열매를 8 에서보관하는중에열매에발생할수있는다양한미생물들을제어하기위한시도로과산화초산화합물이매우효과적이었으며, 초음파 (ultrasound) 를함께처리하면그효과가매우증가하였음 (Rosário et al. 2017). 과실수확전에처리에의하여저장병발생을감소시키려는노력들이이루어지고있으나육묘단계및작물의생육중에사용하여식물병을방제하려는시도들은상대적으로미미함. 최근에는과산화초산화합물단독으로처리하기보다는기존의살균제나소독제에첨가하여그효율을증가시키기위한방안으로소량의과산화초산화합물을처리하는방법들이제시되고있음. 국내연구진에의하여과산화초산화합물의식물병원균에대한항균활성이제시됨. 이물질은소독제로사용이허가되었으나, 최근토양소독등의다양한기구의살균을위하여그활용이제시되고있음. 3. 연구수행내용및결과 연구개발방법과결과 코드번호 D-05 [ 주관 1 세부과제 : 과산화초산화합물활용원예작물병해관리 ] 가 ) 과산화초산혼합제의처리농도와방법에따른토마토와딸기식물에대한약해검정 - 토마토식물과딸기식물에과산화초산혼합제의농도별희석액을제조하여처리한후약해가발생하는농도와처리양을결정. - 다양한농도로과산화초산혼합제원액을사용하여이를물로희석하여퍼센트 (%) 단위의용액을제조. 제조시과산화초산혼합제원액의휘발성과독성으로인하여흄후드하에서제조. 과산화초산혼합제의다양한농도의희석액을 50-ml 짜리코니칼튜브에 10 ml씩분주. - 5주동안생육한 5엽기토마토의본엽제3엽을절단하여생체중을측정하고절단엽의엽병을다양한농도의과산화초산혼합물각용액에침지. 엽병침지후 7일동안매일생체중변화를측정하여생육저해여부를평가. - 지름 8 cm와 12 cm의둥근포트에각각재배중인토마토와딸기식물의지제부에식물당각각 10 ml와 20 ml 씩다양한농도의과산화초산혼합제를토양관주처리후잎면적과엽록소의변화량의측정하여생육저해여부를평가. 첫번째처리후 3일 - 7 -
간격으로처리후 2 주후생육평가. - 페로산의처리는수용액의 ph 를낮추는효과가있으며, 처리된페로산의농도가높을 수록수용액의 ph 는상당히감소 (Fig. 1-1A). 페로산처리 6 일째까지비슷한경향을나 타냄. - 토마토엽병을농도별로희석한페로산수용액에꽂았을때에낮은농도의페로산처 리구에서의 ph 는회복이일어났으나, 높은농도의페로산처리구에서는 ph 의회복이 일어나지않았음 (Fig. 1-1B). ph 가감소된페로산처리구에서의엽병의생체중은비례하 여감소하였음. - 0.1% 이상의페로산농도가식물체에직접적으로유입되었을때에식물체에상당한피 해를주는것으로밝혀짐. - 엽병침지에의한페로산의약해수준은큐피랑품종과베네키아 220 품종에서비슷한 수준으로관찰됨. Fig. 1-1. Temporal ph changes of aqueous solution containing different concentrations of Perosan and responses of Perosan-treated detached tomato leaves by the Perosan treatments. (A) The ph changes in Perosan-treated water (0.001, 0.01, 0.1 and 1%) for 6 days without placing petioles of detached tomato leaves (B) The ph changes in Perosan-treated water (0.001, 0.01, 0.1 and 1%) with petioles of detached tomato leaves (cv. Cupirang and cv. Benekia 220), and growth of the detached tomato leaves treated with different concentrations of Perosan for 6 days. Relative fresh weights were measured in the detached tomato leaves. - 큐피랑품종과베네키아 220 품종을포트에서 4 주간재배한후포트에농도별로희석 한페로산수용액을토양관주하여토마토식물의약해를관찰함 (Fig. 1-2) Fig. 1-2. Phytotoxic effect of Perosan treatment onto tomato seedlings growing in pots. (A) Phytotoxic effect in the four-week-old tomato seedlings (cv. Cupirang and cv. Benekia 220) by drenching different concentrations (0, 0.5, 1, 2 and 5%) of Perosan solution into the soil mixtures in pots. Photos were taken 1, 2, 4 and 6 days after Perosan treatments. (B) Collapsed stem basal parts of the tomato seedlings damaged by 5% of Perosan treatment. Enlarged photos were taken at 6 days. Values presented are means, and error bars indicates the standard errors of the means of four independent experimental replications. Means followed by the same letter are not significantly different at 5% level by least significant difference test. - 8 -
- 5% 페로산수용액처리에의하여두품종의토마토식물은심각한약해를받았으나, 2% 이하의페로산수용액처리에의해서는식물약해가발생하지않았음. - 딸기매향품종을포트에서재배한후포트에농도별로희석한페로산수용액을토양관주하여식물의약해를관찰함 (Fig. 1-3). - 10% 페로산의토양관주로인하여딸기식물체는심각한약해를받았으며, 1% 이하의페로산농도에의해서눈에띄는약해는관찰할수없었음 (Fig. 1-3A). - 심각한약해가초래된식물의뿌리는갈변되어있었음 (Fig. 1-3B). - 페로산에의한약해를정량화하기위해잎에서의전해질유출을측정한결과, 10% 페로산처리에의하여심각한전해질유출이나타남 (Fig. 1-3C). Fig. 1-3. Responses of strawberry plants treated with different concentrations of Perosan (0, 0.01, 0.1, 1 and 10%). Twenty ml of each Perosan solution was poured into crown part of the plants. (A) Phytotoxicity in the aerial parts of strawberry plants treated with high concentration of Perosan overtime. (B) Phytotoxicity in the strawberry plant roots treated with high concentration of Perosan. (C) Increases in electrolyte leakages from the leaves damaged from Perosan drenching application. Means followed by the same letter are not significantly different at 5% level by least significant difference test. Error bars represent the standard errors of the means of four individual experimental replications. 나 ) 과산화초산혼합물의토마토풋마름병세균에대한 in vitro 항균활성검정 - 토마토풋마름병세균의배양 : Ralstonia pseudosolanaearum 균주 GMI1000을 TTC 고체배지에서이틀간격으로계대배양하여주며액체배양시단일균총을취하여 15 ml- 짜리코니칼튜브에담긴 4 ml의 TTC 액체배지에접종. 30 진탕배양기에서하루동안배양하여토마토풋마름병세균배양액을얻음. - 토마토풋마름병세균배양액을마이크로튜브에옮겨원심분리하고상등액을버린후세균침전물을살균수로희석하고이를다시원심분리하고상등액을버림으로써남은배지성분을모두제거. 최종세균침전물 (pellet) 을살균수로희석하여세균현탁액농도를분광광도계 600nm 조건에서흡광도가 0.15가되도록조정, 이는토마토풋마름병 - 9 -
세균의현탁액이 10 8 cfu/ml로존재함을의미. - 10 8 cfu/ml 농도의세균현탁액을 10 배희석하여 10 7 cfu/ml의균농도가되도록조정하여 in vitro 항균활성시험을위한접종원으로준비하고 15 ml-짜리시험관에담긴 4 ml의 TTC 액체배지에 40 μl 씩접종하여배양. 이과정을통하여 4 ml 액체배지내에초기세균접종원의농도는 10 5 cfu/ml로설정됨. - 저농도의풋마름병세균현탁액 (10 5 cfu/ml) 으로배양이시작되었을때분주된여러개의 4 ml의 TTC 액체배지에과초산화합물혼합물을최종농도기준으로 0, 0.0005, 0.001, 0.002, 0.005, 0.001, 0.002% 농도로첨가하고 vortexing하여혼합한후 30 진탕배양기에서적정시간배양하여 600nm에서흡광도를측정하여균생장율을측정. 무처리시험구액체배지에서의 OD 600 값이 0.30±0.03에도달하는시간에과산화초산혼합물처리구에서의 OD 600 값을동시에측정. 무처리구에서세균의생장에대비하여과산화초산혼하불처리구에서의세균의생장을퍼센트 (%) 로표시. - 고농도의풋마름병세균현탁액 (10 7 cfu/ml) 을준비하고모든세균을사멸시키기위한과산화초산혼합물의농도를결정. 과산화초산혼합물을농도별로세균현탁액에처리하고 1시간동안배양하고세균현탁액의 0.1 ml를채취하여 TTC 고체배지에도말. 3 0 배양기에서 2일동안배양하여형성된균총을수를셈. - 위의두가지검정법에대하여최소 4반복시험을수행하여평균과표준편차를계산. - 10 7 cfu/ml과 10 8 cfu/ml의고농도의현탁액내의토마토풋마름병균은페로산의처리로인하여생존수가감소했음 (Fig. 1-4). - 10 7 cfu/ml의세균을완전히사멸시키기위하여 1 시간배양시에는 0.0006% 의페로산농도가필요하며, 24 시간배양시에도동일한농도가필요함. - 10 8 cfu/ml의세균을완전히사멸시키기위하여 1 시간배양시에는 0.006% 의페로산농도가필요하며, 24 시간배양시에는 0.004% 의페로산농도로가능함. Fig. 1-4. In vitro inhibitory activity of peroxyacetic acid mixture Perosan against Ralstonia pseudosolanacearum. Survival of R. pseudosolanacearum (10 7 cfu/ml) treated with different concentration of Perosan (0.0002, 0.0004, 0.0006, 0.0008 and 0.001%) for 1 and 24 h (left). Survival of R. pseudosolanacearum (10 8 cfu/ml) treated with different concentration of Perosan (0.002, 0.004, 0.006, 0.008 and 0.01%) for 1 and 24 h (right). Bacterial numbers were counted on the TTC agar plate 2 days after incubation at 30 C. Independent experiments were performed four times with similar results. The data points are the mean ± standard errors. Means followed by the same letter are not significantly different at 5% level by least significant difference test. The same letter above bars represented no significant difference between treatments. - 10 -
다 ) 과산화초산혼합물의딸기위황병진균에대한 in vitro 항균활성검정 - Fusarium oxysporum f. sp. fragariae 균주 SFW-10는감자한천배지 (potato dextrose agar, PDA) 에서 3일간격으로계대배양하고 25 배양기에서생육. - 과산화초산혼합제의딸기위황병진균분생포자발아억제효과검정을위하여 streaking 방법으로 PDA에접종하고배양기에서 14일동안생육한균주의균총에 1/2 PDB를붓고분생포자현탁액 10 6 conidia/ml의농도로준비. - 위의 10 6 conidia/ml 분생포자현탁액 0.5 ml와최종부피 1 ml에 0, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1% 처리하도록 2배농도로제조한과초산화합물혼합제을 0.5 ml를 1.5-ml microtube 내에서혼합후균일하게현탁. 최종적으로 5 10 5 conidia/ml의분생포자에상이한농도의과초산화합물혼합물을처리하도록함. 두개의글라스슬라이드에 20 μl의혼합액을 4방울을떨어뜨리고습실처리를하면서포자발아를관찰. 과산화초산혼합제의휘발효과가예상되므로일정부피의습실을사용. 무처리시험구에서의평균적인분생포자발아율이 90% 이상나타났을시각에과산화초산혼합제처리구에서의분생포자발아율을측정하여발아억제효능을퍼센트 (%) 로표현. 일정시간에완전히분생포자발아를억제하는과산화초산화합물의농도를구명할뿐만아니라상대적으로낮은농도의과산화초산화합물혼합물에의하여완전히분생포자발아가억제되는시간을구명. - 과산화초산혼합제함유 PDA 배지에서딸기위황병진균균사생육억제효과검정. PDA 배지를 100 ml 제조하여멸균후과산화초산혼합제의최종농도가 0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2% 가되도록원액을처리하고섞어준후 5개의 Petri dish에균일하게부어줌. 과산화초산혼합물이농도별로포함된배지가굳은후 7일간배양한딸기위황병균균총의가장자리로부터얻은균사 disc(5 mm 지름 ) 를배지의한가운데에접종하고 25 배양기에서 7일간배양. 무처리구대비처리구에서의균총지름의감소정도를측정. - 휘발효과를통한과초산화합물혼합물의항균활성검정을위하여 paper disc에과초산화합물혼합물을원액기준으로 0, 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1 μl를처리하고건조시킨후 PDA 배지의뚜껑안쪽이부착. 딸기위황병균균사 disc(5 mm 지름 ) 를배지의한가운데에접종후 7일간배양후생육상태를조사. - 위의검정법에대하여최소 4반복시험을수행하여평균과표준편차를계산함. - 페로산의처리로인하여딸기위황병균의분생포자발아와발아관의신장은억제되었으며페로산의처리농도가높아질수록항균활성은더욱높게나타남 (Fig. 1-5). 분생포자의발아는 0.015% 페로산에의해, 발아관이신장은 0.02% 페로산에의하여완전히억제됨. - 11 -
Fig. 1-5. In vitro antifungal activity of Perosan during conidial germination and germ tube elongation of Fusarium oxysporum f. sp. fragariae. (A) Conidial germination of F. oxysporum f. sp. fragariae treated with different concentrations of Perosan (0, 0.005, 0.01, 0.015 and 0.02%). The germination was observed under light microscope (x400). Photos were taken 10 h after inoculation at 25 C. Scale bar represent 50 m. (B) Relative conidial germination and germ tube elongation reduced by increasing Perosan treatments. Means followed by the same letter are not significantly different at 5% level by least significant difference test. Error bars represent the standard errors of the means of four individual experimental replications. - 페로산의처리로인하여딸기위황병균의균사생장은억제되었으며페로산의처리농 도가높아질수록항균활성은더욱높게나타남 (Fig. 1-6). 2% 페로산에의해서균사생 장은전혀나타나지않았음. Fig. 1-6. In vitro antifungal activity of Perosan during mycelial growth of Fusarium oxysporum f. sp. fragariae. Fungal colonies on PDA media containing different concentrations (0, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2%) of Perosan. Photos were taken 7 days after inoculation at 25 C. Fungal mycelial growth inhibited by Perosan treatments shown as percentage of the fungal colonies on PDA media with different concentrations of perosan. Means followed by the same letter are not significantly different at 5% level by least significant difference test. Error bars represent the standard errors of the means of four individual experimental replications. - 상토를코니칼튜브에넣은후딸기위황병균분생포자를접종한직후페로산수용액을농도별로 (0, 0.01, 0.1, 1%) 로처리로한결과, 0.01% 페로산처리에의하여오히려분생포자발아가촉진되는것이관찰되었으며, 0.1% 로페로산농도를높였을때에다시무처리정도의분생포자발아가나타났음. 1% 페로산처리에의해서딸기위황병균의분생포자발아는 25% 수준으로억제되었음 (Fig. 1-7). - 12 -
Fig. 1-7. Antifungal activity of Perosan against conidial germination of Fusarium oxysporum f. sp. fragariae in soil mixture. Conidial suspension was applied into soil mixture in tubes and different concentrations (0, 0.01, 0.01, 1%) of Perosan were drenched onto the soil surface. Conidia were recovered from the soil mixture at 1 h after Perosan treatment. Relative number of fungal colonies on PDA media from Perosan-treated soil mixtures was counted and shown as percentage of the fungal colonies. Photos were taken 2 days after inoculation at 25 C. Means followed by the same letter are not significantly different at 5% level by least significant difference test. Error bars represent the standard errors of the means of four individual experimental replications. 라 ) 과산화초산혼합제가토마토풋마름병발생에미치는영향분석 - 토마토와딸기식물에약해를유발하지않는과산화초산혼합제의농도를기준으로하여그이하의농도로몇가지농도를설정하여시험평가. - 토마토의절단잎을사용하여과산화초산혼합제의다양한농도의용액 10 ml에침지하고, 각각토마토풋마름병세균현탁액이 10 7 cfu/ml 초기접종원양을설정하고매일잎의무게를측정하여병진전을관찰하며시들음증상에따른생체중감소를정량화. - 과산화초산혼합제의처리시기에따른병방제효과를검정하기위하여우선적으로병원균접종직후처리에의하여병방제효과를검정. - 병방제효과가뚜렷한과산화초산혼합제의한가지농도를기준으로, 토마토풋마름병세균및딸기위황병진균의접종전 1일, 3일, 접종직후, 접종후 1일, 3일에병원균을접종하고병진전을관찰하여과산화초산혼합제에의한병방제의예방효과와치료효과를구명. - 병원균접종직후과산화초산혼합제의처리후병진전과 1일후, 1일과 3일후추가적으로동일농도의과산화초산혼합제를처리해준경우병진전을관찰하여병방제효과를비교검정. - 13 -
- 큐피랑과베네키아 220 두품종의토마토의절단잎을사용하여평가한과산화초산혼합제의토마토풋마름병방제효과검정결과, 0.001% 페로산의처리는접종 2-6일에걸쳐서방제효과를발견할수없었으나, 0.01% 페로산의처리는두품종에서접종 2-6 일에방제효과가나타났음 (Fig. 1-8A). - 에탄올을이용하여엽록소를제거한결과, 풋마름병발생에의하여피해가심한토마토엽병은심한갈변이관찰되었으나페로산첨가로병이발생하지않은엽병은조직의갈변이관찰되지않았음 (Fig. 1-8B). Fig. 1-8. Effects of Perosan treatments on bacterial wilt disease of detached tomato leaves. (A) Relative fresh weight of the detached tomato leaves (cv. Cupirang and cv. Benekia 220) inoculated by Ralstonia pseudosolanacearum GMI1000 (10 7 cfu/ml) using a petiole-dipping inoculation. Values presented are means, and error bars indicates the standard errors of the means of four independent experimental replications. Means followed by the same letter are not significantly different at 5% level by least significant difference test. (B) Attenuated brown discolouration of tomato petioles infected by Ralstonia pseudosolanacearum GMI1000 (10 7 cfu/ml) by Perosan treatment. Tomato petioles were cleared with 95% ethanol overnight. Photos were taken at 6 days after the bacterial inoculation with or without 0.01% Perosan treatment. - 4주간생장한큐피랑과베네키아 220 두품종의토마토식물이있는포트에토마토풋마름병균을토양관주하여접종직후에페로산수용액을토양관주하여병발생을평가한결과, 0.1% 페로산의처리는방제효과를발견할수없었으나, 1% 페로산의처리는두품종에서방제효과가나타났음 (Fig. 1-9). - 14 -
Fig. 1-9. Reduced bacterial wilt in tomato seedlings in pots by Perosan treatment. Relative areas under disease progress curve (AUDPC) for evaluating tomato bacterial wilt caused R. pseudosolanacearum (10 8 cfu/ml) inoculated by soil-drenching for 12 days. The data points are the means relative AUDPC ± standard errors. Values presented are means, and error bars indicates the standard errors of the means of four independent experimental replications. Means followed by the same letter are not significantly different at 5% level by least significant difference test. [ 제 1 협동과제 : 과산화초산화합물활용식량작물병해관리 ] 가 ) Perosan 처리에대한벼식물의약해 (phytotoxicity) 검정 벼잎에직접접촉을통한 Perosan 의약해검정 - Perosan이식물의병방제에사용될수있는지를알아보기에앞서서식물에약해 (phytotoxicity) 를나타내는지알아보기위하여다양한종류의실험을수행하였음. - 벼의절단잎을과산화초산혼합제에엽병침지하여약해여부를조사하였을때 10% 의고농도페로산에서는잎의전체에황화 (chlorosis) 가발생하였고 3% 와 5% 의페로산에서는부분적인황화가발생. 1% 의페로산에서는눈에띄는약해를발견할수없었음 - 벼의잎을절단하여습실처리하고과산화초산혼합제의종이디스크를올려약해발생여부조사하였을때 25% 의고농도페로산종이디스크에서는디스크밑의잎에심한약해발생하고 10% 의페로산에서는일부약해가관찰됨. 5% 이하의페로산에서는눈에띄는약해가관찰되지않음. - 15 -
Fig. 2-1. Phytotoxicity of Perosan on rice leaves. (A) Fully expanded leaves were harvested and then dipped in the different concentrations of Perosan (1, 3, 5, and 10%) for one day. Discoloration of rice leaves were photographed one day after Perosan treatment. (B) The sterilized paper discs containing 20 μl of Perosan (0, 0.2, 1, 5, 10, and 25%) were placed on the detached rice leaves. One hour later, the discs were removed and the rice leaves were maintained in transparent containers at room temperature. Chlorosis caused by phytotoxicity were photographed 18 hours after Perosan treatment. Experimental results were repeated three times, with similar results. 이온전도도 (ionic conductivity) 를이용한약해검정 - 벼의잎디스크조각들을물이나페로산혼합제에띄우고이온전도도를조사하여약해여부조사하였을때 5%, 10%, 15% 의페로산에서는농도와시간에따른이온전도도증가를보여약해가발생함을보여줌 - 1% 의페로산의경우 1시간이지나도이온전도도가거의증가하고있지않아약해가거의없는것으로관찰됨 Fig. 2-2. Ion conductivity of rice leaf discs after Perosan measurements. Phytotoxicity of Perosan was quantified by measuring ionic conductivity. Rice leaf pieces were floated on the distilled water containing different concentrations of Perosan (0, 1, 5, 10, and 15%). Ion leakage caused by phytotoxicity was monitored over time (0, 1, 20, 40, and 60 min). 페로산에의한벼유묘의성장저해실험 - 수경재배로발아된벼유묘의뿌리를페로산에 6일동안침지하고생장저해를관찰하였을때 0.001% 의페로산에서는성장저해를보이지않음. - 0.005% 에서 0.5% 의페로산농도에서는약 35% 정도의성장저해를보여주었음. - 기존의약해실험에서보다민감하게저농도에서도역해를보인이유는유묘상태에서지속적으로페로산에노출된상태로페로산을흡수하였기때문으로생각됨. Fig. 2-3. Growth of analysis of Perosan-treated rice plants in the hydroponic system. Six to seven rice seedlings raised in the dishes with distilled water for two weeks. The distilled water in each dishes was substituted with 20 ml of Perosan solution (0, 0.001, 0.005, 0.01, 0.03, and 0.05%). Growth in mean biomass of rice seedlings was monitored for eight days. The error bars represent standard error of three replicates. - 16 -
벼재배환경에서페로산에의한 ph 변화 - 물이채워져있는 tub 안의화분에서정상적으로자라고있는벼에페로산을첨가하여특정농도가되게한후해당농도에서 ph의변화정도를측정하였음. - 최종농도가 0.07% 이될때까지페로산을첨가했을때까지는통계적으로유의미한 ph 변화가관찰되지않음. - 0.1% 에서 ph의변화가나타나서비록약간의변화지만약한산성으로바뀌는것을관찰할수있었음. Fig. 2-4. Effect of ph changes in a rice-growing tub after Perosan treatment. Perosan was added into a plastic tub containing rice-growing pots (rice field-mimicking condition), generating different concentrations of Perosan (0, 0.005, 0.03, 0.05, 0.07, and 0.1%). After approximately five minutes, the ph changes were checked by a ph meter. The error bars represent standard error of three replicates. The difference in letters on each bar means statistically significant. 나 ) Perosan 의 in vitro 항세균활성검정 Disc diffusion method 을이용한페로산의 in vitro 항세균활성검정 - 벼흰잎마름병세균 (Xanthomonas oryaze pv. oryzae, Xoo) 이도말된배지에다양한농도의페로산다스크를올려놓고 clear zone의지름을측정함. - 1% 이상의페로산 (20ul) 을적신종이디스크 (paper disc) 를올렸을때에세균의 clear zone이관찰됨. - 8% 이상의페로산에서는세균의생장이거의관찰되지않을정도로넓은 clear zone이형성됨. - 비교적높은농도의페로산에서농도의존적인 clear zone이나타났는데페로산이아가배지에직접침투확산 (diffusion) 하는효과가적기때문인것으로생각됨. 따라서 1% 는되어야항세균활성을보인다고해석해서는안된다고생각됨. - 17 -
Fig. 2-5. Antibacterial activity of Perosan using disc diffusion method. (A) 100 μl of Xanthomonas oryzea pv. oryzea (Xoo) (OD600=0.8) was spread on peptone sucrose agar (PSA) plates. Sterilized paper discs were impregnated with 20 μl of different concentration of Perosan (0, 1, 2, 4, 6, 8, and 10%) and placed on the center of each PSA plates. The plates were incubated at 28 and then zones of inhibition for Xoo was photographed four days after Perosan treatment. (B) The diameter of the zone of inhibition was measured four days after Perosan treatment. The error bars represent standard error of three replicates. Optical density 측정을통한페로산의 in vitro 항세균활성검정 - 확산 (diffusion) 하는효과를고려해야하는위의 disc diffusion method 실험과는달리직접적인 antibacterial activity를보여주는실험을수행함. - Peptone sucrose broth에페로산을넣어주고항세균활성을보여주는지를 Xoo의생장을 optical density 측정으로알아봄. - 0.0005% 의낮은페로산에서도 Xoo의생장은처리후 12시간부터억제되는것으로보이나, 24 시간후에는더이상그억제효과가관찰되지않음. - 이는낮은페로산 (0.0005%) 이 Xoo의일부를죽이기는하지만일부살아남은 Xoo가배양중에회복되는것으로생각됨. - 0.07% 의페로산을처리하였을때는 36시간이지난후에도 Xoo의 optical density 값이전혀증가하지않음. 이는 0.07% 의페로산에의해서초기접종 Xoo가모두사멸 (microbcidal) 되었거나강력한성장억제 (microstatic) 효과를보임을의미함. Fig. 2-6. Growth inhibition of Xoo by optical density measurements after Perosan treatment. Single colony of Xoo was inoculated in peptone sucrose broth in the presence of different concentrations of Perosan (0.0005, 0.001, 0.003, 0.005, and 0.007%) and incubated at 28 in a shaking incubator. For 36 hours after inoculation, optical density at 600 nm was measured. The error bars represent standard error of two replicates. - 18 -
Colony counting 을통한페로산의 in vitro 항세균활성검정 - 페로산 1시간처리를통해서 Xoo를실제사멸 (microbcidal) 시키는지를알아보기위하여페로산처리후도말하여 CFU를측정하였음. - 0.0002% 의페로산을처리한후도말하였을때어느정도의 CFU의감소를보여주었으나통계적으로유의미한수준은아니었음. - 그러나 0.0006% 이상의페로산처리에서는흡광도 0.3에해당하는농도의거의모든 Xoo를사멸시켜도말하였을때 colony를형성하지않는것으로나타남. Fig. 2-7. Inhibition of Xoo survival after Perosan treatment. The diluted Xoo (OD600=0.03) was incubated in the presence of different concentrations of Perosan (0, 0.0002, 0.0004, 0.0006, 0.0008, and 0.001%) for one hour and then plated on PSA media containing 7.5 mg/l cephalexin. After one day incubation at 2 8, the colonies of Xoo were counted as Xoo survival in Perosan. 다 ) Perosan 의 in vitro 항세균활성검정 Agar dilution method 을이용한페로산의항세균활성검정 - 서로다른농도의페로산이함유된배지의중앙에벼잎집무늬마름병진균 (Rhizoctonia solani AG-1, R. solani)) 의디스크를올리고페로산농도에따른균사성장의차이를관찰하였음. - 0.05% 의페로산이함유된배지에서는진균의균사가어느정도생장하는모습을보임 - 0.07%, 0.1% 의페로산이함유된배지에서는진균의균사생장이몹시저해되는모습을보임. - 0.2% 의페로산이함유된배지에서는진균의균사가전혀생장하지못하는것으로관찰됨. - 19 -
Fig. 2-8. Growth inhibition of Rhizoctonia solani AG-1 (R. solani) by agar dilution method. (A) 6.5 mm diameter of mycelial agar discs were prepared from edge of the growing R. solani in potato dextrose agar (PDA) media and placed in the center of new PDA media containing different concentrations of Perosan (0, 0.05, 0.07, 0.1, 0.15, and 0.2%). The plates were incubated at 28 for two days and the hyphal growth was photographed. (B) The diameters of hyphal growth of R. solani on PDA media containing Perosan were measured after two days. The error bars represent standard error of three replicates and the difference in letters on each bar means statistically significant. Disc diffusion method 을이용한페로산의 in vitro 항진균활성검정 - R. solani는무성생식을통한많은포자생산을하지않아서사실이 disc diffusion method를이용한실험에는적당하지않음. - 그러나진행된실험에서 2% 에서 10% 까지페로산의농도의존적인진균균사생장억제효과를보여주어항진균활성을가지는것으로결론내릴수있었음. - 세균에서실험되었던 disc diffusion method과유사하게페로산의농도가높은경우에만항진균활성이보였는데이것역시페로산이아가배지에서확산이잘되지않아서나타난결과로생각됨. Fig. 2-9. Growth inhibition of R. solani by paper disc diffusion method. (A) Mycelium harvested from actively growing R. solani in PDA were suspended and vortexed in 1 ml of distilled water. After 50 μl of mycelial suspension was spread on new PDA media and sterilized paper discs impregnated with 40 μl different concentrations of Perosan (0, 2, 4, 6, 8, and 10%) were placed in the center of the PDA media. The plates were incubated at 28 for two days and then digital images were obtained by Digital Gel Documentation. (B) The area of the zone of inhibition were measured using digital images. The images were analyzed by ImageJ program. The error bars represent standard error of three replicates and the difference in letters on each bar means statistically significant. - 20 -
라 ) Perosan 의 in vivo 병보호검정 벼흰잎마름병방제검정 - 벼의잎에 Xoo를 scissors-dip 방법을사용하여접종하여주고 (Song et al. 1995), 페로산을처리하여 Xoo 감염에의한병반의길이에감소가있는지측정하였음. - 2% 이하의페로산에서는유의미한수준의 in vivo 항세균활성이관찰되지않았음 (data not shown) - 5% 까지올린고농도의페로산에서는유의미한수준의비교적높은 in vivo 항세균활성이관찰되었음. - 그러나 in vitro 항세균활성이 0.0004% 의낮은농도에서높은살균력을보인것과비교하여볼때 5% 의페로산농도는 in vivo 실험이라는것을고려하더라도비교적높은농도로생각됨. - Xoo의경우물관조직에침입하여증식하는특성상외부에서살포된페로산에영양을덜받게되는것으로생각됨. - 접촉된페로산에의해서 Xoo의살균이일어난다할지라도일부생존한 Xoo가 xylem vessel에침입하여증식하면서병징을보이는것으로생각됨. - 페로산의반복살포로어느정도약효의증가를기대할수는있을것으로생각됨. Fig. 2-10. Antibacterial assay of Perosan on Xoo-inoculated rice leaves. (A) After fully-expanded rice leaves were inoculated with Xoo by scissors-dip method, 10 ml of different concentrations of Perosan (0, 2, and 5%) was spayed on the inoculated rice plants. Four days after inoculation, rice leaves were harvested and photographed. (B) Lesion lengths were measured four days after inoculation. The error bars represent standard error between three biological replicates. Experimental results were repeated three times with similar results. 벼잎집무늬마름병방제효과검정 - R. solani 의접종을위하여균사디스크부착법 (Delventhal et al. 2016) 를이용하였으며 접종후페로산을처리하여 4 일까지관찰하였음 - 21 -
- 0.5% 의페로산을 1회처리하였을때 4일차에서눈에띄는차이를보였음. - 0.5% 의페로산을 3회에걸쳐서반복살포하였을때에는 4일차에서거의병징의진전이일어나지않았음. - 반복살포에의한약효의증가가확실하게나타났으며발병초기등의낮은농도의진균병이발병하기시작할때충분한방제효과를기대할수있을것으로생각됨. - 벼잎집무늬마름병은포장에서균핵으로월동하여이듬해의전염원이되고있으므로추후페로산에의해균핵의생존능력을감소시킬수있는지가능성을평가할필요가있음. Fig 2-11. Antifungal assay of Perosan against R. solani on rice leaves. Mycelial agar discs of 6.5 mm diameter were prepared from the margin of and actively growing R. solani AG-1 and placed on the fully expanded rice leaves. The inoculated rice leaves were sprayed with five ml of 0.5% of Perosan once (A) or thrice (B). The rice leaves were incubated in transparent containers at 23 in dark/light condition. Experimental results were repeated three times with similar results. [ 제 2 협동과제 : 과산화초산화합물개발및상품화 ] 가 ) 과산화초산화합물조성물개발및조성물최적화 과산화초산합성및그혼합물개발 - 과산화수소와초산성분의함량조절및반응을통해과산화초산혼합물개발하고두가지조성물이가장안정적임 (A: 과산화수소 25~30%, 과산화초산 1~5%, 초산 10~15% B: 과산화수소 10~15%, 과산화초산 1~5%, 초산 2~7%) - 유효성분에대한온도안정성확인결과, 두조성물모두안정. - 22 -
Fig. 3-1. 몇가지종류의과산화초산화합물의안정성평가. 과산화초산혼합물의주요식품및식물병원미생물대상살균력검증 - 주요식품병원미생물인 Escherichia coli에대한최소살균농도는과산화초산혼합물 A가 0.01% 이상, 과산화초산혼합물 B는 0.1% 이상이며 Salmonella enterica 는두혼합물모두 0.01% 이상의농도에서살균효과를보이며각최소살균농도에서 3시간이후에생육이억제됨 - 식물병원성진균시험균주총 5가지 (Alternaria panax, Botryris cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Rhizotonia solani) 에대한살균력검증결과, Alternaria panax는과산화초산혼합물 A, 과산화초산혼합물 B 각 0.2% 에서생육을저해시키고, Botryris cinerea는과산화초산혼합물 A, 과산화초산혼합물 B 각 0.5% 에서생육이저해되며, Colletotrichum gloeosporioides는각개발품 0.1% 이상에서, Fusarium oxysporum 는각개발품 0.2% 이상에서, Rhizotonia solani의경우과산화초산혼합물 A 는 0.1% 이상, 과산화초산혼합물 B는 0.2% 이상에서생육이저해됨. - 두과산화초산혼합물모두미생물에대한살균효과와유효성분에대한안정성이확인되기에시생산을진행하고, 차후추가약해, 약효검증을통해선정하기로함. - 23 -
Fig. 3-2. 다양한식물병원성진균에대한페로산, 페로산 A, 페로산 B 의항균활성 나 ) 과산화초산혼합물의약해실증시험 딸기에대한약해시험 - 24 -
- 약해시험은농촌진흥청발간농약등록약효 약해시험세부지침 ( 살균제편 ) 기준에따라다음과같이실시함. - 시험물질을처리한기준량구와배량구시험포트에서딸기의생육양상을처리후 3일, 7 일, 14일 3회에걸쳐달관조사한결과, 기존구, 시험물질 A 및시험물질 B에서기준량및배량의농도의증가에대하여무처리구와동일하게황화, 위축, 오갈, 반점등의증상을보이지않았음. 따라서, 시험물질 ( 과산화초산화합물 ) 처리에의한딸기에대한약해는없는것으로판단된다. Fig. 3-3. 딸기에대한과산화초산혼합물처리농도에따른약해검정 ( 처리 14 일째 ) - 추가적으로실시한생육조사에서딸기의경우아래 Table 3-1에서와같이기존물질을포함한시험물질에서엽장, 엽폭및엽록소함량이무처리구에비하여적게나타나시험물질에의해딸기의생육이약간저해되는양상을보였다. 따라서, 사용농도를 10배정도더희석하여사용하는것이좋을것으로사료된다. Table 3-1. 과산화초산혼합물처리농도에따른딸기의생육정도 시험물질 B 시험물질 A 기존구 딸기생육정도 페로산처리 엽장 (cm) 엽폭 (cm) 엽록소함량 (mg/100 cm 2 ) 배량 0.8 % 6.14bc 5.10bc 37.64a 기준량 0.4 % 5.56bc 5.71bc 37.68a 배량 0.8 % 5.97c 5.42bc 36.98a 기준량 0.4 % 6.81b 5.80bc 37.14a 배량 0.4 % 6.10bc 5.52bc 37.77a 기준량 0.2 % 6.69bc 5.96b 37.24a 무처리구 0 % 7.90a 6.72a 39.22a *Ducan s multiple range test (P<0.05). 평균차이는유의수준 p<0.05 수준에서유의함. 평균값및동질적부분집합 (a-c) 으로표시 토마토에대한약해시험 - 약해시험은농촌진흥청발간농약등록약효 약해시험세부지침 ( 살균제편 ) 기준에따라 다음과같이실시함. - 시험물질을처리한기준량구와배량구시험포트에서토마토의생육양상을처리후 3 일, - 25 -
7일, 14일 3회에걸쳐달관조사한결과, 기존구, 시험물질 A 및시험물질 B에서기준량및배량의농도의증가에대하여무처리구와동일하게황화, 위축, 오갈, 반점등의증상을보이지않음. 따라서, 시험물질처리에의한토마토에대한약해는없는것으로판단됨. Fig. 3-4. 토마토에대한과산화초산혼합물처리농도에따른약해검정 ( 처리 14 일째 ) - 추가적으로실시한생육조사에서아래 Table 3-2 과같이기존물질을포함한시험물질 에서엽장, 엽폭및엽록소함량이무처리구에비하여비슷하거나적게나타났으며시험 물질 B 의경우가무처리구와비교하여생육정도가가장양호함. Table 3-2. 과산화초산혼합물처리농도에따른토마토의생육정도 시험물질 B 시험물질 A 기존구 페로산처리초장 (cm) 토마토생육정도 직경 엽록소함량 (cm) (mg/100 cm 2 ) 배량 0.8 % 22.41ab 5.59b 44.53b 기준량 0.4 % 23.73a 5.49b 46.72a 배량 0.8 % 21.57abc 5.62b 44.48b 기준량 0.4 % 21.63abc 5.70b 45.68ab 배량 0.4 % 19.64bc 5.21b 45.44ab 기준량 0.2 % 19.26c 5.20b 44.11b 무처리구 0 % 23.33a 6.51a 44.31b *Ducan s multiple range test (P<0.05). 평균차이는유의수준 p<0.05 수준에서유의함. 평균값및동질적부분집합 (a-c) 으로표시. 벼에대한약해시험 - 약해시험은농촌진흥청발간농약등록약효 약해시험세부지침 ( 살균제편 ) 기준에따라다음과같이실시함. - 시험물질을처리한기준량구와배량구시험포트에서벼의생육양상을처리후 3일, 7 일, 14일 3회에걸쳐달관조사한결과, 기존구, 시험물질 A 및시험물질 B에서기준량및배량의농도의증가에대하여무처리구와동일하게황화, 위축, 오갈, 반점등의증상을보이지않았다. 따라서, 시험물질처리에의한벼에대한약해는없는것으로 - 26 -
판단되었다. Fig. 3-5. 벼에대한과산화초산혼합물처리농도에따른약해검정 ( 처리 14 일째 ) - 추가적으로실시한생육조사에서아래 Table 3-3 과같이기존물질을포함한시험물질 에서엽장, 엽폭및엽록소함량이무처리구에비하여비슷하게나타났으며시험물질 B 의경우가무처리구와비교하여생육정도가더좋게나타났다. Table 3-3. 과산화초산혼합물처리농도에따른벼생육 벼생육 페로산처리 초장 (cm) 엽록소함량 (mg/100 cm 2 ) 시험물질 배량 0.8 % 23.24ab 31.21a B 기준량 0.4 % 23.74a 30.41a 시험물질 배량 0.8 % 21.69bcd 32.0a A 기준량 0.4 % 21.16cd 31.69a 기존구 배량 0.4 % 20.42d 29.53a 기준량 0.2 % 20.42d 31.66a 무처리구 0 % 22.86abc 30.69a *Ducan s multiple range test (P<0.05). 평균차이는유의수준 p<0.05 수준에서유의함. 평균값및동질적부분집합 (a-c) 으로표시. 다 ) 과산화초산혼합물의약효실증시험 딸기위황병에대한약효시험 - 딸기위황병방제효과를확인하기위하여인위발병시험을실시함 - 농촌진흥청의농약등록약효 약해시험세부지침 ( 살균제편 ) 에따라대전유성구소재목원대학교시험포장에서실시함 - 처리구시험포트당 2주씩 5반복으로수행하였다. 딸기는원예용상토에파종하여약 4 주간키운유묘를이용하였으며, 딸기위황병인위발병유도및이식이틀전과산화초산혼합물을처리농도별무처리, 대조구 (0.01% 및 0.02%), 처리구 (0.04% 및 0.08%) 로시험포트에 1일 1회씩 2차에걸쳐균체현탁액을관주함 - 시들음병에대한포트에서의효과를검정한결과, 과산화초산혼합물처리대조구 0.02% 에서무처리에비하여 75% 의방제가를나타냈으나나머지농도에서는효과가없 - 27 -
었고농도가높아질수록이병주율이오히려증가하여처리구 0.08% 처리농도에서도무 처리에비하여이병주율이높게나타남으로서고농도인처리구농도에서는방제효과가 없었으나저농도인대조구에서는 0.02% 농도에서방제효과가있는것으로판단됨 Fig. 3-6. 페로산처리농도에따른딸기시들음병의이병주율 (%) 토마토풋마름병에대한약효시험 - 토마토풋마름병방제효과를확인하기위하여인위발병시험을실시함 - 농촌진흥청의농약등록약효 약해시험세부지침 ( 살균제편 ) 에따라대전유성구소재목원대학교시험포장에서실시함 - 처리구시험포트당 2주씩 5반복으로수행하였다. 딸기는원예용상토에파종하여약 4 주간키운유묘를이용하였으며, 토마토청고병인위발병유도및이식이틀전과산화초산혼합물을처리농도별무처리, 대조구 (0.1% 및 0.2%), 처리구 (0.4% 및 0.8%) 로시험포트에 1일 1회씩 2차에걸쳐균체현탁액을관주함 - 청고병에대한포트에서의효과를검정한결과, 모든페로산처리구에서무처리보다낮은이병주율을나타냄. 페로산농도 0.1%, 0.2%, 0.4% 및 0.8% 처리는무처리대비 34.5%, 22.1%, 71.9% 및 72.4% 의방제가를각각나타내었고, 각각의페로산처리농도에대한약해는없는것으로판단되었으며, 페로산처리농도는 0.4% 가적정한것으로판단됨. Fig. 3-7. 페로산처리농도에따른토마토의이병주율 (%) 토마토풋마름병에대한상토내병원균밀도변화조사 - 28 -
- 토마토청고병방제효과를확인하기위하여시험포트내풋마름병원균의밀도변화를조사함. - 토마토근권토양내병원균밀도는감염처리직후, 감염처리 14일, 21일및 42일후에조사함. - 처리농도별시험포트의토마토근권으로부터채취한토양시료 10g을 90ml멸균수에넣고 150 rpm으로 1시간동안진탕처리한후시료를 10-3 10-5 까지희석하여토마토병원균 Ralstonia 선택배지 (SMSA배지) 에 100μl씩접종하고, 28 에서 2일간배양한후, 형성된붉은색콜로니를계수하여병원균의밀도를측정 - 페로산처리농도에따른발병정도와병원균체량의밀도의상관관계는정확하게일치한다고판단하기는어려우나병원균체의밀도는무처리구에비하여감소하는것으로판단됨 CFU/g rhizosphere soil 10 8 무처리 (0%) 0.1% 0.2% 0.4% 0.8% 10 7 10 6 10 5 0 10 20 30 40 Days after infection Fig. 3-8. 페로산처리농도에따른시기별풋마름병병원균밀도변화 벼흰잎마름병에대한약효시험 - 페로산처리농도에따른벼흰잎마름병방제효과를확인하기위하여인위발병시험을실시함. 생물검정시험은농촌진흥청의농약등록약효 약해시험세부지침 ( 살균제편 ) 에따라충북농업기술원시험포장에서실시하였으며, 각각의처리구시험포트당 5주씩 2반복으로수행하였음. 벼는수도용상토에파종하여약 4주간키운유묘를정식하여사용함 - 처리농도별 [ 무처리, 대조구 (0.1% 및 0.2%), 처리구 (0.4% 및 0.8%) 로시험포트에 1일 1회씩 2차에걸쳐균체현탁액을분무처리함벼흰잎마름병병원균 Xanthomonas oryzae는 LB 고체배지에서 2-3일키운후 LB 배양액에접종하여 2일간진탕배양 (150rpm) 한다음, 균체현탁액을살균수로 1 10 6 cfu/ ml농도로희석하여사용하였으며, 병원균은균체현탁액에가위를담근후벼잎끝을가위로잘라감염시켰으며, 남은균체현탁액을벼줄기에분무처리함. 접종후일주일간격으로 4차에걸쳐생육양상및병발생정도를확인하고접종직후 2차에걸쳐페로산을처리농도별로추가로분무처리하였으며, 발병조사는병원균감염후 28일째에발병도를조사하여산출함 - 29 -
- 페로산농도별로분무처리하여가위감염시킨후흰잎마름병에대한포트에서의효과를검정한결과, 처리구농도에서무처리보다낮은발병도를나타냈다. 인위발병 28일후결과와같이, 페로산처리에의한발병도는무처리구가 34% 이었으며페로산처리농도가증가함에따라발병도는감소하는경향을나타내어 0.1% 에서 34.2%, 0.2% 에서 46.9% 이었으며, 0.4% 및 0.8% 처리구에서는각각 26% 및 17% 로 0.8% 처리구에서가장낮게나타남. 모든측정값은처리구간발병도에있어통계적으로유의적인상관관계 (P<0.05) 를나타내는것으로분석됨. 따라서, 페로산농도 0.1% 및 0.2% 에서는효과가없었으며 0.4% 및 0.8% 처리에서는무처리에비하여 23.5% 및 50% 의방제가를각각나타냈다. 각각의페로산처리농도에대한약해는없는것으로판단되었으며, 처리구의배량구 (0.8%) 에서페로산처리효과가무처리구대비 50% 까지방제효과가있는것으로나타났다. Fig. 3-9. 페로산처리농도에따른벼흰잎마름병의발병도 (%) 벼잎집무늬마름병대한약효시험 - 페로산처리농도에따른벼잎집무늬마름병방제효과를확인하기위하여인위발병시험을실시함. 생물검정시험은농촌진흥청의농약등록약효 약해시험세부지침 ( 살균제편 ) 에따라충북농업기술원시험포장에서실시하였으며, 각각의처리구시험포트당 5 주씩 3반복으로수행함. 벼는수도용상토에파종하여약 4주간키운유묘를정식하여사용하였으며, 벼잎집무늬마름병인위발병유도이틀전페로산을처리농도별 [ 무처리, 대조구 (0.1% 및 0.2%), 처리구 (0.4% 및 0.8%) 로시험포트에 1일 1회씩 2차에걸쳐균체현탁액을분무처리함 - 벼잎집무늬마름병병원균 Rhizoctonia solani는 PDA 고체배지에서 7일동안키운후 PDB 배양액에접종하여 5일간진탕배양 (150rpm) 한다음, 포자농도가 10 6 spore/ ml이되도록균체현탁액을멸균수로희석하여사용함. 병원균은균체현탁액에가위를담근후벼잎끝을가위로잘라감염시켰으며, 남은균체현탁액을벼줄기에분무처리하였음. 접종후일주일간격으로 4차에걸쳐생육양상및병발생정도를확인하고접종직후 2차에걸쳐페로산을처리농도별로추가로분무처리하였으며, 발병조사는병원균감염후 28일째에피해도를조사하여산출하였다. - 30 -
- 페로산농도별로분무처리하여가위감염시킨후잎집무늬마름병에대한포트에서의효과를검정한결과, 처리구농도에서무처리보다낮은피해도를나타냈다. 인위발병 28일후결과와같이, 페로산처리에의한피해도는무처리구가 35.7% 이었으며페로산처리농도가증가함에따라피해도는감소하는경향을나타내어 0.1% 에서 44.7%, 0.2% 에서 35.7% 이었으며, 0.4% 및 0.8% 처리구에서는각각 60.6% 및 36% 로 0.8% 처리구에서가장낮게나타남. 모든측정값은처리구간피해도에있어통계적으로유의적인상관관계 (P<0.05) 를나타내는것으로분석됨. 따라서, 페로산농도 0.1%, 0.2% 및 0.4% 에서는효과가없는것으로나타났으나 0.8% 처리구에서는무처리에비하여 36% 의방제가를나타냄. 각각의페로산처리농도에대한약해는없는것으로판단되었으며, 처리구의배량구 (0.8%) 에서페로산처리효과가무처리구대비 36% 까지방제효과가있는것으로확인됨. Fig. 3-10. 페로산처리농도에따른벼잎집무늬마름병의피해도 (%) 4. 과산화초산혼합물의독성시험 과산화초산혼합물의급성경구투여독성시험 ( 독성등급법 ) - 과산화초산혼합물의 Sprague-Dawley 랫드에급성경구투여하였을때독성반응을관찰하고, GHS (Globally harmonized system of classification and labelling of chemicals) 의 category를구분하고자수행. - 과산화초산혼합물 2,000 ppm 내과산화수소및아세트산의함량은약 100~300ppm, 과산화초산이약 20~100 ppm이며확실한독성징후를평가하기위해서 2000ppm으로설정한후시험함. 3일간사망개체가발생하지않아 2단계용량을 2000ppm으로설정함 - 군구성은각단계별로 3 마리를사용하였고, 시험물질투여후 14일간관찰하며관찰기간동안사망률, 일반증상및체중변화를확인하였고, 부검시육안적관찰을수행함. - 시험결과로서모든단계에서사망동물, 이상증상, 체중의이상변화는관찰되지않았으며, 부검관찰결과모든단계에서시험물질투여와관련된이상변화는관찰되지않음. - 모든단계에서사망동물은관찰되지않음. (1단계및 2단계 : 2000 ppm) - 31 -
Table 3-4. 사망율 - 투여당일 (0 일 ) 에투여후 30 분까지는적어도 1 회이상, 1, 2, 3 및 4 시간째에일반 상태 ( 독성징후의종류, 발현시기, 회복시기등 ) 및사망유무를관찰. - 모든단계에서이상증상은관찰되지않음. Table 3-5. 일반증상 - 체중은전자저울을사용하여동물입수시, 군분리시, 투여당일 ( 투여전 ), 투여후 1, 3, 7 일및 14 일 ( 부검일 ) 에측정. - 1 단계에서투여후 1 일에 1 마리 ( 개체번호 : 2101) 에서약 2.5% 의체중감소가관찰되었고, 2 단계의 1 마리 ( 개체번호 : 2201) 에서투여후 1 일및 3 일째에각각 1.4 및 2.7 % 의체중의감소가관찰되었다. 1 단계및 2 단계에서관찰된체중의감소는같은투여량을투여한다른개체에서는관찰되지않았고, 시험물질투여후이상증상이관찰되지않았기때문에시험물질에의한영향이아닌우발적인체중의감소로생각되나, 시험군이 2 개군 6 마리이므로추가적인실험을통해시험물질이체중감소에미치는영향을판단해야할것으로판단됨. - 32 -
Table 3-6. 체중 - 관찰기간종료후, 모든생존동물에대해서 CO2 가스를흡입시켜후대정맥 / 배대동맥에 서방혈하여안락사시키고부검하여육안적으로모든장기를관찰. - 모든단계에서시험물질투여와관련된이상변화는관찰되지않음. Table 3-7. 부검소견 과산화초산혼합물의급성경피투여독성시험 - 과산화초산혼합물의 Sprague-dawley 랫드에급성경피투여하였을때관찰되는독성반응과반수치사약량 (LD50) 을알아보기위하여실시함. - 과산화초산혼합물의각성분의반수치사량 ( 랫드, 경피 ) 은과산화수소가 4,060mg/kg, 과산화초산이 1,410 mg/kg, 아세트산이 1,060 mg/kg 이며시험물질 4,000 mg/kg 내과산화수소및아세트산의함량은약 200 ~ 600 mg/kg, 과산화초산이약 40 ~ 200 mg/kg 이므로, 시험물질투여군은 4,000 mg/kg 을투여하는한계용량군을설정함 - 암수각 5 마리를사용하여투여한후 14 일간의사망률, 일반증상, 체중변화및부검소견을관찰함. - 시험결과로서수컷에서사망동물은관찰되지않았지만, 암컷에서 1 마리가투여후 8-33 -
일에사망 ( 안락사 ) 함. 암컷및수컷모든개체에서투여후 1 일부터투여부위의피부궤양 (Ulceration) 이관찰되었고, 투여후 4 일부터 6 일에걸쳐피부궤양이회복되면서가피형성 (Crust formation) 이관찰됨. 가피형성은관찰종료일 (14 일 ) 까지관찰됨. 피부궤양이회복되지못한 1 마리는출혈 (Hemorrhage) 및자발운동저하 (Decreased locomotor activity) 가관찰되었음. 수컷의 1 마리에서투여후 3 일에약 0.3 % 의체중의감소가관찰되었고, 암컷의 3 마리에서투여후 3 일에약 2.3 ~ 2.9 % 체중의감소가관찰되었음. 또한, 암컷의 1 마리에서투여후 7 일째의체중이투여당일에비하여약 20.2 % 감소하였음. 부검소견관찰결과, 시험물질투여와관련된변화는관찰되지않음. - 반수치사약량 (LD50) 은 4,000 mg/kg 을초과하는것으로산출됨. - 수컷에서사망동물은관찰되지않았지만, 암컷에서 1 마리 ( 개체번호 : 2101) 가투여후 8 일에사망 ( 안락사 ) 함. Table 3-8. 사망율 - 투여당일 (0 일 ) 에투여후 30 분까지는적어도 1 회이상, 1, 2, 3 및 4 시간째에일반상태 ( 독성징후의종류, 발현시기, 회복시기등 ) 및사망유무를관찰. - 암컷및수컷모든개체에서투여후 1 일부터 8 일까지투여부위의피부궤양 (Ulceration) 이산발적으로관찰되었고, 투여후 4 일부터 14 일까지가피형성이산발적으로관찰됨. 암컷의 1 마리 ( 개체번호 : 2101) 에서출혈 (Hemorrhage) 및자발운동저하 (Decreased locomotor activity) 가관찰됨. Table 3-9. 일반증상 - 34 -
- 체중은전자저울을사용하여동물입수시, 군분리시, 투여당일 ( 투여전 ), 투여후 1, 3, 7 일및 14 일 ( 부검일 ) 에측정. - 수컷의 1 마리 ( 개체번호 : 1105) 에서투여후 3 일에약 0.3 % 의체중의감소가관찰되 었고, 암컷의 3 마리 ( 개체번호 : 2101, 2103, 2105) 에서투여후 3 일에약 2.3 ~ 2.9 % 체 중의감소가관찰됨. 또한, 암컷의 1 마리 ( 개체번호 : 2101) 에서투여후 7 일째의체중 이투여당일에비하여약 20.2 % 감소함. Table 3-10. 체중 - 관찰기간종료후, 모든생존동물에대해서 CO2 가스를흡입시켜후대정맥 / 배대동맥에 서방혈하여안락사시키고부검하여육안적으로모든장기를관찰. - 모든개체에서이상소견은관찰되지않음. - 35 -
Table 3-11. 부검소견 과산화초산혼합물의피부감작성시험 국소림프절시험 - 과산화초산혼합물의피부감작성유 무를확인하기위해수행함. 피부감작성유 무는암컷 CBA/J 마우스를이용한국소림프절시험 (Local Lymph Node Assay,LLNA)-BrdU-ELISA 법을통하여확인함 - 예비시험을통해과산화초산혼합물도포용량을 5% 로설정하였으며마우스양쪽귓등에 25 μl씩 3 일간 1 일 1 회씩투여하였고, 투여후 4 일째 BrdU 를복강투여하였음. 동물의일반증상및처치부위의국소피부자극성 ( 홍반 ) 을관찰하고, 체중과귀두께를총3 회측정함. 투여후 5 일째이개림프절을채취하였고림프절은단일림프절세포로분리하고, 다음날세포의건조, 고정및변성과정을거쳐, ELISA reader 로흡광도 (370 nm 와 492 nm) 를측정함, 결과는평균자극지수 (Stimulation index, SI) 로표현하였고, SI 가 1.6 이상일때양성으로판정하였으며시험물질군및양성대조군은음성대조군과비교함 - 시험결과로서시험기간동안사망개체및시험물질투여과관련된증상은관찰되지않았음. 또한시험물질을처리한국소부위를관찰한결과, 모든개체에서홍반및부종등의피부자극이관찰되지않았으며체중및귀두께측정결과통계적으로유의한변화는관찰되지않음. 자극지수 (Stimulation index, SI) 를산출한결과, 시험물질 1, 2.5 및 5 % 투여시자극지수는 0.9, 1.3, 2.0 으로산출됨. 이때양성대조물질인 25 % Eugenol 의자극지수는 5.0 으로산출되었다. (SI 가 1.6 이상일때양성으로판정 ) - 과산화초산혼합물은 1, 2.5 % 농도에서음성으로, 5 % 농도에서양성으로판정되어, 5 % 농도에서감작성을유발하는것으로판정됨. - 전시험기간중매일 1 회이상귀의국소피부자극성 ( 홍반 ) 유무를관찰하고, 일반상태 ( 독성징후의종류, 발현시기, 회복시기등 ) 및사망유무를관찰하였다. - 시험기간동안사망개체및일반증상의이상변화는관찰되지않음. 시험물질을처리한국소부위를관찰한결과, 모든개체에서홍반및부종등의피부자극이관찰되지않음. - 36 -
Table 3-12. 일반증상 - 체중은전자저울을사용하여동물입수시, 군분리시, 물질도포하기직전 (0 일 ), 도포개 시후 2 일, 5 일 ( 부검일 ) 에측정하였다. - 음성대조군과비교시통계적으로유의한변화는관찰되지않음. Table 3-13. 체중 - 37 -
- Digimatic Micrometer(ID-C112XBS, Mitutoyo, Japan) 를사용하여물질도포하기직전 (0 일 ), 도포개시후 2 일, 5 일 ( 부검일 ) 에측정 - 음성대조군과비교시통계적으로유의한변화는관찰되지않음. Table 3-14. 귀두께 - SI 는시험물질군과음성대조물질군및양성대조물질군의흡광도를 ELISA reader(epoch, Biotek, USA) 를사용하여측정 - BrdU 표지지수 (BrdU Labelling Index) 를다음과같이산출하며, SI 가 1.6 이상일때양성으로판정 - 자극지수 (Stimulation index, SI) 를산출한결과, 시험물질 1, 2.5 및 5 % 투여시자극지수는 0.9, 1.3, 2.0 로각각산출됨. 이때양성대조물질인 25 % Eugenol의자극지수는 5.0 으로산출됨. - 38 -
Table 3-15. 자극지수 5. 과산화초산혼합물의제형화와상품화 - 농가사용의편리성과안전성을위해제품을 4리터단위로소포장화를진행중임. - 기존판매중인제품페로산의매출추이를바탕으로페로산마일드 ( 가칭, 페로산 B) 의무상공급을통해영업루트및그효과를확인하고, 차후년도부터본격적으로영업 / 판매활성화예정 Fig. 3-11. 4 리터소포장된페로산마일드시제품 - 과제종료후사업화계획년차생산량 (kg) 매출액 ( 천원 ) 비고 2018년생산량의절반수준을무상공급, 실제포장에서 500 750 ( 종료후 1년차 ) 의방제효과, 보완개선점확인 ( 경남지역 ) 2019년연구과제종료 1년차까지실제포장데이터를 1,000 2,000 ( 종료후 2년차 ) 근거로판매활성화 ( 경남, 전라지역 ) 2020년농가판매활성화, 대리점상품홍보 2,000 4,000 ( 종료후 3년차 ) ( 경남, 전라, 강원지역 ) - 39 -
연구개발성과정량적목표와실적 성과목표 지식재산권특특허허출등원록 품 종 등 록 사업화지표기술실시사업화 ( 이전 ) 기제매수건술품출출수료화액액 고용창출 투자유치 기술인증 연구기반지표정책학술성과활용 홍보교인논문육력학정홍지양술책보비도성 SCI 발활전 SCI 표용시 기타 ( 타연구활용등 ) 최종목표 1 차년도 2 차년도 소계 종료 1 차년도종료 2 차년도소계 목표 1 1 - 실적 5 1 목 표 1 1 1 2 2 - 실 적 1 0 0 0 1 1 1 목 표 1 1 1 1 2 3 - 실 적 1 0 0 0 1 6 2 목표 실적 목 표 1 1 1 1 1 실적 1 1 1 2 1 1 합계 2 1 2 2 4 3 1 1 2 2-40 -
연구개발성과 가 ) 지식재산권출원 No 지식재산권등명칭국명 1 과산화초산을포함하는 친환경병해방제제 대한민국 출원 등록 출원인출원일출원번호등록인등록일등록번호 안동완 김량환 김효중 2017. 12.15. 10-2017 -0172931 기여율 100% 나 ) 논문게재 No 논문명학술지명주저자명 Functional roles of the pepper leucine-rich repeat protein and its interactions 1 with pathogenesis-related Planta 홍점규 and hypersensitive-induced proteins in plant cell death and immunity 2 3 Reduced bacterial wilt in tomato plants by bactericidal peroxyacetic acid mixture treatment First report of fungal leaf spot disease in Echeveria spp. caused by Cladosporium tenuissimum in Korea The Plant Pathology Journal Plant Disease 호국명발행기관 246: 351-364 홍점규 34: 78-84 조혜수 SCI 여부 (SCI/ 비 SCI) 독일 Springer SCI 급 한국 미국 한국 식물 병리 학회미국 식물 병리 학회 SCI 급 SCI 급 게재일등록번호 2017. 9. 1. 2018. 2. 1. 예정 ( 출판중 ) 다 ) 학술대회발표 No 학술대회명칭발표제목 / 발표자발표일시장소국명 1 2 3 한국식물병리학회 2016 춘계학술대회및국제학술대회 한국식물병리학회 2016 춘계학술대회및국제학술대회 6th International Bacterial Wilt Symposium Potential application of Perosan as a green chemical to control rice pathogens 조혜수, 장민, 홍점규, 박창진 In vitro growth inhibition of Botrytis cinerea and Fusarium oxysporum f. sp. fragariae by plant essential oils and peroxyacetic acid treatments 박진영, 정대훈, 우성민, 도유진, 김나희, 김수현, 이영희, 이상우, 박창진, 홍점규 Treatment with thiamine, Mn/Zn nutrients and peroxyacetic acid mixtures reduced tomato bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum 이영희, 김현지, 하주희, 장민, 박창진, 홍점규 2016. 4. 21.-22. 2016. 4. 21.-22. 2016. 7. 3.-8. 농촌진흥청 농촌진흥청 INRA /CNRS 대한민국 대한민국 프랑스 4 한국식물병리학회 Application of peroxyacetic acid mixture to 2016. 서울대학교대한민국 - 41 -
5 6 2016 추계학술대회및국제학술대회 한국식물병리학회 2016 추계학술대회및국제학술대회 한국식물병리학회 2017 춘계학술대회및국제학술대회 reduce tomato bacterial wilt and strawberry fusarium wilt diseases 10. 이영희, 박진영, 도유진, 김혜원, 하주 19.-22. 희, 박창진, 김효중, 홍점규 Potential application of peroxyacetic acid as 2016. a green chemical to control rice bacterial 10. and fungal pathogens 19.-22. 조혜수, 장민, 홍점규, 김효중, 박창진 Effect of peroxyacetic acid-based chemical as a green chemical on rice bacterial and fungal pathogens 조혜수, 장민, 홍점규, 박창진 2017. 4. 27.-28. 평창캠퍼스서울대학교평창캠퍼스한국과학기술회관 대한민국 대한민국 라 ) 인력양성 No 분류 기준년도 현황학위별성별지역별 박사석사학사기타남여수도권충청권영남권호남권기타 1 2017. 8 1 1 1 2 2018. 2 1 1 2 2 연구개발종합분석 - 전반적으로당초연구계획에따라기반연구가잘진행되었으며, 정성적목표를이루었다고판단됨 - 정량적으로논문게재는일부성과를이루었으나종료후 1-2년사이에최종적으로논문게재의정량적성과에도달할것으로예상됨 - 학술대회발표는국내외관련학술대회에참여하여정량목표이상의성과를이룩하였음 - 과산화초산화합물의동물독성시험자료를얻을수있었음 - 과산화초산화합물에대하여친환경병해방제용으로특허출원을하였으며연구종료 1-2년사이에특허등록될것으로예상함 - 추가적으로과산화초산화합물의영농활용을위하여보다구체적인사용매뉴얼의작성이필요하므로작물별로이를제작하기로함 - 제1협동기관에서수행한실험실내에서는과산화초산화합물페로산이벼흰잎마름병과잎집무늬마름병방제효과를보였으나제2협동기관에서수행한온실시험에서는병방제효과가뚜렷하지않았음. 벼흰잎마름병의경우뚜렷한방제효과를위하여온실에서더높은페로산농도가처리되어야하며, 벼흰잎마름병의경우 3회이상의반복처리가필요함을알수있음. - 작물병해방제를위한과산화초산화합물의상업화를위하여보다안정적이고방제효과를증가시키기위한추가적인물질및제형에대한탐색이추후필요함 - 42 -
4. 목표달성도및관련분야기여도 코드번호 D-06 4-1. 목표달성도성과목표 과산화초산혼합제에의한토양 ph 변동과토마토, 딸기및벼에대한약해검정 과산화초산혼합제의토마토, 딸기및벼의주요병원균에대한 in vitro 항균활성검정 토마토, 딸기및벼의주요세균및진균병해방제를위한과산화초산혼합제의적정처리시기및방법제안 과산화초산혼합제의효능강화방안탐색 과산화초산혼합제의농자재등재 개발내용 - 농도별로희석하여처리한과산화초산혼합제에의하여토마토, 딸기및벼식물에상이하게발생하는약해의범위를구명함 - 산성의 ph를가지고있는과산화초산혼합제에의하여변동되는식물재배환경및 ph의변동을밝힘 - 페로산처리에의한토마토와딸기재배토양에서의 ph 변동과회복양상에대한연구가미진함 - 벼유묘를대상으로페로산의농도별처리에대한약해반응을다양한방법으로검정함 - 토마토풋마름병세균과벼흰잎마름병세균에대한과산화초산혼합제페로산의 in vitro 생장억제를구명 - 딸기위황병진균에대한페로산의 in vitro 분생포자발아억제및균사생장억제를구명 - 벼잎집무늬마름병진균에대한페로산의 in vitro 분생포자발아억제및균사생장억제를구명 - 토마토풋마름병세균접종직후처리된 1% 의페로산수용액의처리에의해서풋마름병의발생이지연됨 - 1% 의페로산수용액의처리가딸기생육상태에따라약해를초래하는경우가있어페로산의딸기위황병방제효과에대한재평가가필요함 - 1% 페로산에의해서딸기위황병균의포자발아가상당히억제되어딸기재배용상토소독용으로적용가능성을제시함 - 벼흰잎마름병과잎집무늬마름병방제를위하여페로산희석액의엽면살포가효과적임을제시함 - 소독용으로개발된기제품인페로산과조성의변경물을비교분석하여페로산제품의항균활성에있어우수성을입증함 - 작물병의방제효과와더불어작물약해시험및동물독성자료를근거로하여특허출원을하여농자재로의등록을앞두고있음 달성도 (%) 90 100 95 100 95-43 -
4-2. 관련분야기여도 - 친환경병해방제제로서과산화초산화합물이적용될수있음을시시하는국내최초의연구결과이며, 국외의사례로볼때본연구결과를바탕으로과산화초산화합물을다양한작물병에적용하기위한상업화가가능할것으로생각됨 - 일반적으로병해방제가어렵다고알려진세균병 ( 토마토풋마름병, 벼흰잎마름병 ) 과진균병중딸기위황병과같은 Fusarium 속과벼잎집무늬마름병과같은 R. solani를친환경적으로방제하기위한기술개발에기여하였음 5. 연구결과의활용계획 코드번호 D-07 국내주요생산작물인토마토, 딸기및벼를대상으로친환경적병방제를위하여적용한과산화초산화합물의적용연구를바탕으로, 국내에경제성이높은다른주요원예작물 ( 고추, 오이, 배추, 사과, 배, 복숭아 ) 및식량작물 ( 콩, 감자 ) 에적용할계획임 페로산처리방법 ( 엽면살포, 토양관주, 양액에주입 ) 및처리농도와양, 횟수에따라대상작물의품종, 생육기 ( 유묘, 성체 ), 식물기관 ( 잎, 줄기, 뿌리, 과실 ) 에따라변화할수있는약해의범위를추가적으로구명할예정임 페로산은대부분의세균및진균에대하여광범위한항균활성을나타내는물질로작물재배전후에토경재배에서는토양에, 수경재배에서는배지살균용소독제로활용이가능하므로, 이를위한구체적인적용매뉴얼을작성할수있음 잔류성은매우낮은물질로생각되나처리후일정기간후의잔류페로산에의하여작물에약해발생여부도추가적으로구명되어야함 페로산의소량혼합처리로기존의화학살균제의병방제효과를향상시켜살균제의사용량과빈도를감소시키는연구가필요함 페로산과다양한종류의친환경방제제와의조합으로주요작물의세균및진균병해방제효율을증가시킬수있을것으로기대됨 페로산을수확후오염될수있는식중독균을살균하기위한제재로활용이가능함 - 44 -
6. 연구과정에서수집한해외과학기술정보 코드번호 D-08 Peroxyacetic acid의상업화산물인 PERACLEAN R 5의첨가로토마토잿빛곰팡이병균인 Botrytis cinerea의포자발아와균사생장억제를위한두종류의살균제 SWITCH(26.7% boscalide, 6.7% pyraclostrobine) 와 SIGNUM(37.5% cyprodinil, 25% fludioxonil) 의효과를상당히증가시킬수있었음 (Ayoub et al., 2017). 딸기열매를 8 에서보관하는중에열매에발생할수있는다양한미생물들을제어하기위한시도로과산화초산화합물이매우효과적이었으며, 초음파 (ultrasound) 를함께처리하면그효과가매우증가하였음 (Rosário et al. 2017). 7. 연구개발결과의보안등급 공개가능 코드번호 D-09 8. 국가과학기술종합정보시스템에등록한연구시설 장비현황 해당없음 9. 연구개발과제수행에따른연구실등의안전조치이행실적 연구실안전점검수행계획 코드번호 D-11 점검유형 점검시기 점검수행자 점검대상 설치및운영기기및장비, 일상점검 정기점검 특별안전 점검 연구활동수행하기 전오전 9 시수행 분기별실시 ( 매월분기시작월 ) 안전위험예고시 연구활동종사자 ( 과제책임자수행감독 ) 기관별과제책임자 ( 참여연구원전원 ) 기관별과제책임자 ( 필요시안전점검대행업체 ) 재료에대한보관상태및 보호상태에대한육안검사 실시안전점검기기 ( 도입장비 ) 를 활용한세부점검수행폭발및화재사고등연구 활동종사자의안전상의치 명적인위험가능성발견시 - 연구대상실험실은각기관별과제책임자가안전관리규정에명시한연구실및위험물 보관소 연구실정밀안전진단실시계획 - 수행시기 : 각기관별운영하는연구실에대한 1 년에 1 회자체계획에의거하여수행 - 45 -
- 점검대상연구실 : 산업안전보건법제 39조에의거지정된유해인자를취급하는연구실 - 수행방법 : 정밀안전진단을실시할수있는자격요건을갖춘정밀안전진단업체및전문가를통하여안전검사실시 - 안전분야별수행요건자격자 : 방화관리자, 산업안전기사, 산업위생기사, 소방설비기사, 가스기사 - 정밀안전진단비용은연구활동비에통하여집행 참여연구원연구실안전교육훈련계획 교육훈련과제 교육내용 대상자 수행시기 소방안전교육 화재및폭발등의안전사고예방교육 참여연구원 연 1회 가스안전교육 유해가스사용및안전취급교육 참여연구원 연 1회 전기안전교육 전기안전관련교육 참여연구원 연 1회 참여연구원건강검진계획 - 수행시기 : 참여연구원중건강위험에노출대상이높은자를과제책임자가선정하여연 1회실시함 - 수행내용 : 참여기관의장은해당과제개발및연구수행자중건강검진대상자에대한건강검진을수행하도록여건을보장함 - 46 -
10. 연구개발과제의대표적연구실적 구분 ( 논문 / 번호특허 / 논문명 / 특허명 / 기타 소속 기관명 기타 과산화초산을포함하는 대성발명자 1 특허친환경병해방제제 C&S ( 김효중 ) Functional roles of the pepper leucine-rich repeat protein and its 2 논문 interactions with 경남제1저자 pathogenesis-related and 과기대 ( 홍점규 ) hypersensitive-induced proteins in plant cell death and immunity 경남 3 논문 4 논문 Reduced bacterial wilt in tomato plants by bactericidal peroxyacetic acid mixture treatment First report of fungal leaf spot disease in Echeveria spp. caused by Cladosporium tenuissimum in Korea 과기대교신저자세종대 ( 홍점규 ) 대성 C&S 경남교신저자과기대 ( 박창진 ) 세종대 역할논문게재지 / 특허등록국가 Impact Factor 코드번호 D-12 사사여부특기사항 논문게재일 / 특허등록일 ( 단독사사 또는 중복사사 ) 대한민국 2017.12.15. 단독사사 (SCI 여부 / 인용횟수 등 ) Planta 3.361 2017. 9. 1. 중복사사 SCI The Plant Pathology Journal Plant Disease 1.255 2018. 2. 1 단독사사 SCIE 3.173 https://doi.org/1 0.1094/PDIS-08-17-1277-PDN 중복사사 SCI 11. 기타사항 코드번호 D-13 없음 12. 참고문헌 코드번호 D-14 Abd-Alla MA, Abd-El-Kader MM, Abd-El-Kareem F, El-Mohamedy RSR (2011) Evaluation of lemongrass, thyme and peracetic acid against gray mold of strawberry fruits. J Agric Technol 7:1775-1787 Alvaro JE, Moreno S, Dianez F, Santos M, Carrasco G, Urrestarazu M (2009) Effects of peracetic acid disinfectant on the postharvest of some fresh vegetables. J Food Eng 95:11-15 Ayoub F, Ben oujji N, Chebli B, Ayoub M, Hafidi A, Salghi R, Jodeh S (2017) Antifungal effectivenss of fungicide and peroxyacetic acid mixture on the growth of Botrytis cinerea. Microb Pathog 105:74-80 Ben-Jabeur M, Ghabri E, Myriam M, Hamada W (2015) Thyme essential oil as a defense inducer of tomato against gray mold and Fusarium wilt. Plant Physiol Biochem 94:35-40 - 47 -