470 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 제 7 권제 22 호 2013 년국내유행홍역의유전형분석 Genotype Analysis of Measles Outbreaks in Korea 2013 질병관리본부국립보건연구원감염병센터호흡기바이러스과조혜정, 강혜지 Ⅰ. 들어가는말 홍역바이러스 (Mea sles v i r us) 는파라믹소바이러스과 (Paramyxoviridae) 에속하며, 외피가있는단일가닥 RNA 바이러스로서당단백질과지질피막이있고짧은표면돌기가있는구형의모양을가지고있다. 이바이러스는사람만을숙주로하며, 숙주와의융합과침투에관여하는 Fusion (F) 단백질, 세포에부착시키는 Hemagglutinin (H) 이존재하며그외에 Matrix (M), Phosphoprotein (P), Large protein (L), Nucleoprotein (N) 등 6개의단백질로구성되어있다 [1]. 홍역바이러스는단일혈청형으로알려져있으나, 현재 8가지 (A-H) 의유전형 (genotype) 이보고되어있다 [2, 3]. 각각의유전형내에소변이에의해 A, B1-B3, C1-C2, D1-D11, E, F, G1-G3, H1-H2 인 24가지로구분되어있으며, 각지역별로발생하는홍역바이러스의유전형현황이분석되고있다 (Figure 1). 홍역은전세계적으로유행하는급성발진성바이러스질환으로특히소아생명을위협하는주요질병이다. 처음에는감기처럼콧물, 기침과같은증상및결막염등을나타내다가고열과함께온몸에발진이생기고, 예방접종을받지않은소아가환자와접촉할경우 95% 이상감염이되는전염력이매우높은질환이다 [4]. 또한흔히중이염이나폐렴같은합병증이발생하며, 홍역환자 1,000 명중 1-2 명은뇌염등과같은심각한후유증을앓거나사망에이를수있다. 홍역예방을위해서는 12-15 개월 (1차) 과만4-6세 (2차) 에두번의 MMR(Measles, Mumps, Rubella) 1) 예방접종이필수적이다. 홍역이유행할때는최소접종연령 (12개월 ) 이전인 6-11 개월에영유아에가속접종하며, 1세이상에서는최소접종간격 (4주) 으로가속접종해야한다. 우리나라는어릴때홍역예방접종률이 95% 에이르기때문에큰문제가되지는않지만, 홍역은전염력이높고해외에서지속적으로발생하고있기때문에백신미접종자의홍역감염위험은항상노출되어있다. 홍역은환자와의직접접촉이나콧물, 기침등호흡기분비물, 오염된물건을통해호흡기로감염되며공기매개로도전파될수도있다. 우리나라는 1965년홍역백신을도입한이후, 1985년국가면역사업의일환으로광범위한 MMR 백신접종을실시한결과, 환자의발생수가매년 1,000 명이하로감소하였다. 예방접종률이 95% 이상유지되면집단발병을억제할수있는것으로알려져있으며, 생후 12-15 개월에실시하는 1차예방접종으로 95-98%, 만 4-6세에실시하는 2차예방접종으로 99% 의면역획득이가능하다. 그러나 2000-2001 년에접종률이 95% 이상을넘지못하는상황에서 2차예방접종을하지않았거나백신접종후면역획득에실패한감수성자가누적이되어 8개월간약 55,000 명의홍역환자가발생하는 홍역대유행 을겪었다 [5]. 이후, 95% 이상의예방접종률을유지하기위해 2001년홍역일제예방접종과예방접종등록사업을시작함과더불어홍역환자는점점감소하였고, 세계보건기구 (World Health Organization, WHO) 의홍역퇴치기준을만족시킴으로써 2006년홍역퇴치선언을하게되었다 [6]. 그러나 2007 년이후의료기관, 학교및미취학아동의경우유치원에서의집단감염등산발적으로홍역이발생 2), 하였는데그중에는해외유입및해외유입연관사례도확인되었다. 이러한산발적홍역발생은최근빈번해진해외여행을통한해외유입홍역바이러스로홍역의재유행가능성과국내에토착화된바이러스에의한홍역감염발생가능성이존재하고있음을보여준다. 따라서신속하고정확한 1) Abbreviation: Measles= 홍역, Mumps= 유행성이하선염, Rubella= 풍진 2) 2007년 194명, 2008년 2명, 2009년 17명, 2010년 114명, 2011년 42명, 2012년 2명, 2013년 107명
주간건강과질병 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 471 2012 2013 * Size of the pie chart is proportional to the number of genotypes reported by the country Figure 1. Measles genotype distribution of cases with onset in 2012 and 2013. WHO Western Pacific Region *Data source: WHO/WPRO database. Data as of 15 April 2014 실험실적진단을통해홍역확산을조기에차단하여홍역이유행되지않도록방지하는것이중요하다. 그러기위해서는신속한의심환자신고와적절한조기조치가필요하며더불어철저한예방접종률조사및백신접종이후면역획득실패 (vaccine failure) 에따른감수성연구도지속적으로수행되어야한다. 본글에서는 2013년도에발생한홍역유행대응실험실적진단방법을살펴보고, 유행바이러스에대한유전형분석결과에대해논의하고자한다. 중합효소연쇄반응 (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 유전형을분석하는염기서열분석법등분자생물학적방법이이용되고있다. 홍역의심환자의검체는 Figure 2 와같은흐름으로실험을진행하여결과를판정하는데, 홍역바이러스가세포배양을통해분리되거나혹은항원이나유전자가검출된경우를급성감염또는양성으로판정한다. 홍역진단을위한검체는검체채취시기가무엇보다중요하다. 확진을위해서는급성기의 IgM 검사, 급성기와회복기혈청의 IgG 항체역가의변화로확인해야하기때문이다. 홍역바이러스에 노출된환자는 2 주의잠복기후에발진증상을나타내며 IgM 의 Ⅱ. 몸말 홍역바이러스유전자진단법홍역의진단은임상적증상에기초하여판단할수있으나, 확진을위해서는바이러스의특이 IgM(immunoglobulin M) 항체검출및급성기와회복기의 IgG(immunoglobulin G) 항체가의 4배이상증가, 그리고홍역바이러스를증명하는것이필요하다. 항체를확인하기위해서는혈청학적인진단법 (Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA) 을사용하며, 바이러스를증명하기위해서는홍역바이러스분리법, 역전사 수치가증가하고, 7일후 IgM 이감소하면서면역반응의한 IgG의상승률이 4배에달하게된다. 따라서혈청학적진단을위한검체채취는발진발생시점부터 72 시간에서 30일이내채혈되어야하며, 회복기혈청을채취할경우발진발생후 14-30일이내에채혈하여야한다 (Figure 3). 홍역바이러스확인을위한검체또한발진후 7일이내에채취하여야하며, 호흡기검체와타액은검체수송배지 (Virus transport medium, VTM) 또는타액채취기구를사용하고, 소변은멸균용기에보관하며전혈은 EDTA (Ethylene diamine tetra acetic acid) 처리된시험관에채취한다. 채취된검체는 4 가유지되도록하여 24시간내
472 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 제 7 권제 22 호 Test algorithm for suspected case Specimens for virus isolation Blood (serum, lymphocytes) Respiratory specimens (Nasopharyngeal and throat swab) Urine, and oral fluid Vero/SLAM cell 1 st Serum RT-PCR IgM detection Genotyping Blind passage RT-PCR Differential diagnosis RT-PCR Others Rubella Parvovirus B29 HHV-6 2 nd Serum Genotyping MV IgM positive-confirmed Measles MV IgG 4 fold increase-confirmed Measles Figure 2. Test algorithm for confirmed measles of suspected case Virus detectable in nasopharynx Virus detectable in blood Rash Relative levels DC8 T cells DC4 T cells lgm lgg Immune suppression -14-7 -0 7 14 21 28 35 Days after onset of rash Infection Rash onset Figure 3. Immune responses in acute measles infection 신속하게실험실로수송하여야하며, 즉시실험이어려운경우 -70 에장시간보관이가능하다. 바이러스유전자검출을위한역전사중합효소연쇄반응법 (RT-PCR) 을이용하는진단은 6개의유전자중특이유전자로 Nucleoprotein (N) 을주로이용하는데, 이유전자부위는유전적변이가심한부위로알려져있어홍역유행주의유전적특성분석에중요한부위이다. WHO에서권장하는 N 유전자의 COOH 말단부위 450개염기를타겟 (target) 으로 RT-PCR 을실시하여이유전자부위가증폭되면양성으로판정하며 [7], 증폭된유전자의염기서열을분석하여유전형을확인한다. 바이러스감염증진단시숙주세포를이용하여원인바이러스를분리하는것은민감하고유용한방법으로, 세포배양부터분리된바이러스를유전학적, 면역학적, 또는전자현미경방법에의해동정하는것이진단의표준방법이다. 바이러스를분리하는주목적은분리한바이러스를이용하여항원및유전적특성분석, 그리고약제내성분석등이가능하기때문이다. 홍역바이러스분리에는감수성이높은세포인 Vero/hSLAM 을사용한다. 채취한검체에항생제를처리하여바이러스외의
주간건강과질병 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 473 병원체성장을억제시킨후세포에감염시켜세포병변효과를관찰한다. 감염된세포는보통 3-5 일배양후특징적인세포융합을형성하여다형거대세포를만들며세포중심에과립덩어리를둘러싸고있는고리를형성한다 (Figure 4). 이렇게세포병변효과를보이는세포를수거하여 RNA 유전자를추출하고특이 primer를이용하여 RT-PCR 로써확인한다. 또한세포병변효과를나타내지않는경우에는 2-3 차례계대 (blind passage) 를하여접종하지않은대조군과비교한다. Figure 4. Measles virus cytopathic effect (CPE) in Vero/hSLAM cells 2013 년국내홍역발생현황 2013 년 4 월경상남도창원시에위치한 1 개고등학교에서 84 85 KC305687.1_MVs/CapeTown.ZAF/34.10 JX315599.1_MVs/Minnesota.USA/11.11 KC570915.1_MVi/Sur.OMN/45.12 KC492071.1_MVs/Pichincha.ECU/28.12 KC879272.1_MVi/Chabahar.IRN/38.12/6 KF145171.1_MVs/Al-Muharraq.BHR/20.12 gb KF158987.1_MVs/Victoria.AUS/20.13 KF145165.1_MVs/Sohar.OMN/12.13 KF280648.1_MVs/Abu_Dhabi.ARE/52.12/1 KF0307.1_MVs/SouthAustralia.AUS/16.13 KF039696.1_MVs/WesternAustralia.AUS/44.12 KF4424.1_MVs/Quebec.CAN/26.13 KF672758.1_MVs/Massachusetts.USA/34.13 JN599064.1_MVs/Oslo.NOR/18.11 GQ903686.1_MVi/Massachusetts.USA/26.09 AB854751.1:_Mvs/Aichi.JPN/36.13/2 HQ645958.1_MVs/Denizli.TUR/41.10 AB824722.1_Mvs/FukuokaC.JPN/20.13/1 JX315589.1_MVs/Pastaza.ECU/51.11 MVs.Gyeongnam.KOR.20.13.1 1 MVs.Gyeongnam.KOR.18.13.1 MVs.Gyeonggi.KOR.39.13.1 MVs. Gyeonggi.KOR.36.13.1 KF179327.1_MVi/Doha.Qat/17.12 HQ395775.1_MVs/BritishColumbia.CAN/35.10 KF468717.1_MVi/Khash.IRN/26.13/3 64 KF468715.1_MVs/Zahedan.IRN/26.13/1 57 KF302438.1_MVs/Boende.COD/22.12s JX315580.1_MVs/Kansas.USA/3.12/2 KF228934.1_MVs/NewYork.USA/17.13/7 KF413763.1_MVs/Barcelona.ESP/27.13 59 JQ417717.1_MVi/Srwk.MYS/35.10 47 86 EF468495.1_MVs/Barletta.ITA/San06 EF533886_MVs/Roma.ITA/43.06/2 GU937498.1_MVs/Gaillac.FRA/06.09 70 FN663610.1_MVs/Gaillac.FRA/06.09 76 JX175280.1_MVs/Yenagoa.NGA/15.11 50 EU086728.1_MVs/Madrid.SPA/05.06/1 EU086725.1_MVs/Malaga.SPA/07.06/1 KF302437.1_MVs/Beni.COD/23.12 DQ390243.1_MVi/Niamey.NIG/26.03-1 99 FN564361.1_MVs/Zliten.LBY.45.08 36 FN564359.1_MVs/Sfax.TUN.09.09 32 MVs/Incheon.KOR.12.09 EF031460.1_MVs/Divo.CIV/25.04/2 69 FN564360.1_MVs/Zliten.LBY.14.09/1 EU111662.1_MVs/Sunderland.GBR/28.07 EF554311.1_MVs/London.GBR/9.07 HM044304.1_MVs/Arizona.US/06.10 JN599051.1_MVs/Oslo.NOR/5.10 88 JX680814.1_MVs/Oslo.NOR/9.11/31 11/3 37 49 GU952246.1_MVi/Hoima.UGA/7.09/1 GU120180.1_MVs/Sheffield.GBR/22.09 KF2630.1_MVs/New_Brunswick.CAN/51.05 90 83 DQ267518.1_MVi.Yaounde.CAE/8-6.01 AY551538.1_MVs/Bata.EQG/01/1 87 AY551556.1_MVs/Murcia.SPA/16.03/2 88 AY551553.1_MVs/Granada.SPA/10.03 AJ783818.1_MVs/Sfax.TUN/18.02 AJ783817.1_MVs/Msaid.LIY/18.03 DQ267521.1_Mvi/Caen.FRA/04 99 AY274614.1_MVs/Kimbanseke.DRC/37.02/41 DQ388901.1_MVs.Bangui.CAR/28.00/6 AY456407.1_MVs/Khartoum.SUD/34.02/2 54 AY456401.1_MVs/Khartoum.SUD/36.01/4 67 DQ023702.1_MVs/Omdurman.SUD/44.04 AY456410.1_MVs/Khartoum.SUD/11.03/2 GQ428190.1_Mvs/Drome.FRA/12.08 DQ779219.1_MVs/Tetouane.MOR/31.04/3 AF266291_MV/Edmonstone/Schwarz Vaccine Sequence similarity: 100% 2009 isolates from USA 2010 isolates from South Africa, Turkey 2011 isolates from USA, Norway, Ecuador 2012 isolates from Oman, Ecuador, Kingdom of Bahrain, United Arab Emirates, Australia, Iran 2013 isolates from Japan, Australia, USA, Canada, Oman 2013 Korean strain Sequence similarity: 95.4% 0.005 Figure 5. Phylogenetic trees generated by the Maximum Likelihood (ML) method, using the Tamura-Nei model of evolution, based on alignment of the 450 nucleotides that code for the C-terminal 150 amino acids of nucleocapsid (N) of measles viruses isolated of B3 genotypes. Bootstrap-support values of 1,000 NJ replicates using the ML model of evolution are shown at each node
474 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 제 7 권제 22 호 홍역환자발생을시작으로같은해 8월까지병원및인근지역으로감염이확산되어총 273 명의의심환자가신고되었다. 의심검체에대한실험실검사결과와역학조사결과를바탕으로총 74 명의환자가양성으로확진되었고, 그중 58명의유전형을분석한결과, 백신관련사례로확인된 5건의 A type 을제외하고는, 53명이유전형 B3로확인되었다. 경남지역의홍역유행이종결된직후, 경기도북부의의정부를시작으로 10월까지인근지역과강원도로유행이확산되어총 57명의의심환자가신고되었고, 총 25명의양성확진환자중 17명의유전형을분석한결과모두 B3로확인되었다. 국내의 B3 발생은 2009년리비아에서입국한외국인에서확인된것을제외하고는 2012년까지확인된적이없으며, 2013 년두지역에서유행했던 B3과 95.3% 상동성을나타낸것으로보아새로운유전형의홍역바이러스가발생했음을 전파되었다. 특히 2013 년우리나라를포함한일본, 호주, 미국, 캐나다, 오만등에서발생했던 B3 홍역바이러스와 100% 서열상동성을확인하였으며 (Figure 5), 그이전인 2010 년아프리카에서보고한 B3 유행바이러스와염기서열이 100% 일치하였다. 아프리카에서 2007 년에서 2009 년사이 21개도시에서발생했던홍역바이러스중유전형이분석된 220 개중 89% 인 1 개가 B3로보고되었으며 2010년이후에도계속적으로발생하였다. 아프리카에서발생했던 B3은두가지군집 (cluster) 즉, 아프리카전반에걸쳐발생했던군집과서부아프리카에제한적으로발생했던군집으로나뉘는데 [8], 분석결과이중서부아프리카에서발생했던군집과의유전형이일치하였다. 따라서아프리카에서발생한 B3 홍역바이러스가전세계로전파되었고이어서국내유입되었을가능성을추측할수있다. 확인하였다 (Figure 6). 전세계의홍역바이러스유전형별분포도 (Figure 1) 에서확인 할수있듯이 B3 은 2012 년에비해 2013 년에더많은국가에 67 92 MVi.Gyeongnam.KOR_27_11_1 D9 MVs.Gyeongnam.KOR_28_11_4 D9 94 MVs.Gyeongnam.KOR_29_11_5 D9 88 28 MVS. Seoul.KOR_41_13_1 D9 2013 Measles imported case MVi.Victoria.AUS.12.99 D9 13 MVi.Montreal.CAN.0.89Montreal D4 MVi.Palau.0.93 D5 77 55 Mvs_Gyeonggi.KOR_24.07 D5 2007 Korean strain (D5) MVi.Illinois.USA.0.89.1 D3 MVi.Manchester.GBR.30.94 D8 35 MVi.Menglian.Yunnan.CHN.47.09 D11 82 67 MVi.Illinois.USA.50.99_D7 79 MVi.Victoria.AUS.16.85 D7 56 MVi.Bristol.GBR.0.74 D1 MVi.New_Jersey.USA.0.94.1 D6 MVi.Johannesburg.ZAF.0.88.1 D2 59 MVi.Kampala.UGA.51.01.1 D10 MVi.Amsterdam.NLD.48. G2 83 MVi.Gresik.IDN.17.02 G3 MVi.Berkeley.USA.0.83 G1 90 MVi.Beijing.CHN.0.94.1 H2 MVi.Hunan.CHN.0.93.7 H1 MVi_Incheon.KOR_20.06 H1 99 92 MVi._Incheon.KOR_25_10_6(30) H1 MVi._Incheon.KOR_25_10_1(15) H1 93 Mvi_Seoul_KOR_22_07_18 H1 89 Mvs_Jeju_KOR_25_07_31 H1 MVs.Madrid.ESP.0.94 F 100 MVi.Erlangen.DEU.0.90 C2 78 MVi.Maryland.USA.0.77 C2 53 MVi.Tokyo.JPN.0.84 C1 MVi.Goettingen.DEU.0.71 E 65 99 73 MVs.Gyeongnam.KOR.24.13.117 A MVs.Gyeongnam.KOR.25.13.132 A MVs.Gyeongnam.KOR.26.13.182 A 2013 Korean strain (A) MVs.Gyeongnam.KOR.26.13.208 A MVi.Maryland.USA.0.54 A 50 MVi.Libreville.GAB.0.84 B2 MVi.Yaounde.CMR.12.83 B1 73 MVi.New_York.USA.0.94 B3 93 MVi.Ibadan.NGA.0..1 B3 49 MVs_Incheon_KOR_12_09 B3 77 MVs.Gyeongnam.KOR.16.13. B3 MVs.Gyeongnam.KOR.19.13. B3 29 MVs.Gyeongnam.KOR.22.13. B3 MVs.Gyeongnam.KOR.24.13. B3 MVs.Gyeongnam.KOR.28.13. B3 100 MVs.Gyeonggi.KOR.37.13. B3 MVs.Gyeonggi.KOR.36.13. B3 MVs.Gyeonggi.KOR.35.13. B3 0.01 2011 Korean strain (D9) 2006 Korean strain (H1) 2010 Korean strain (H1) 2007 Korean strain (H1) 2009 Korean strain (B3) 2013 Korean strain (B3)-Gyeongnam 2013 Korean strain (B3)-Gyeonggi Figure 6. Phylogenetic trees generated by the Maximum Likelihood (ML) method, using the Tamura-Nei model of evolution, based on alignment of the 450 nucleotides that code for the C-terminal 150 amino acids of nucleocapsid (N) of measles viruses isolated in Korea in 2006-2013. Bootstrap-support values of 1,000 NJ replicates using the ML model of evolution are shown at each node
주간건강과질병 PUBLIC HEALTH WEEKLY REPORT, KCDC 475 Ⅲ. 맺는말 감염병은조기발견으로그유행을최소화할수있는만큼, 홍역유행을차단하기위해서는신속한홍역확진이이뤄져야하다. 또한최근빈번해진해외여행으로인한해외유입과해외유입연관사례가 10년이상꾸준히발생하고있기때문에의심사례발생시유입여부를명확히판단하기위한역학조사와더불어빠르고정확한유전형분석이필요하다. 현재유전형분석에이용되고있는 N 유전자의 450 뉴클레오타이드염기서열부분은높은상동성때문에동시에여러유입사례가발생하였을경우좀더자세한유입경로파악이어렵다. 따라서현재유전형분석에이용되는유전자타깃과더불어추가적인유전자분석부위를확대하여좀더정교한분자수준의분석을위한시도가필요하다. 이는감염원구분및감염경로파악등에도움을줄수있을것으로사료된다. Ⅳ. 참고문헌 1. Barbosa HL et al.. 11. Subacute sclerosing panencephalitis: Isolation of suppressed measles virus from lymph node biopsies. Science. 173:840-841. 2. Griffin DE, Bellini WJ, 1996. Fields Virology. pp 1267-1312. In: Knipe DM, Howley PM et al. (Eds). Lippencott-Raven Publishers. 3. Karz SL, Enders JF. 1969. Diagnostic prodecures for viral and reckettsial infection, In EH Lennette and NJ Schmidt(eds.). pp 504-528. 4th ed. New York: American Public Health Association. 4. Moss WJ, Griffin DE. 2011. Measles. Lancet 379:153-164. 5. Korea Centers for Disease Control and Prevention. 2012. National Notifiable Infectious Diseases Reports. available at http://www.cdc.go.kr. Accessed on 18 December. 6. Elimination of Measles-South Korea. 2007. 2001-2006. MMWR April 6. 56(13);304-307. 7. World Health Organization. 2001. Nomenclature for describing the genetic characteristics of wild-tupe measles viruses (update). Part 1. Wkly Epidemiol Rec 76:242-7. 8. Paul A. Rota et al. 2011. Global Distribution of Measles Genotypes and Measles Molecular Epidemiology. JID 204. Supplement article.