J Korean So Food Si Nutr 한국식품영양과학회지 43(12), 1852~1857(2014) http://dx.doi.org/1746/jkfn.2014.43.12.1852 Spirulina maxima 의초음파및열수추출공정에따른항염증효과비교탐색 신재빈 1 최운용 1 강도형 2 이현용 3 1 강원대학교생물의소재공학과 2 한국해양과학기술원 3 서원대학교식품공학과 Comparison of Anti-Inflammatory Ativity of Spirulina maxima Extrat by Ultrasoniation and Water Extration Proess Jae Bin Sin 1, Woon Yong Choi 1, Do Hyung Kang 2, and Hyeon Yong Lee 3 1 Department of Medial Biomaterials Engineering, Kangwon National University 2 Korea Institute of Oean Siene & Tehnology (KIOST) 3 Department of Food Siene and Enginneering, Seowon University ABSTRACT The aim of this study was to ompare the anti-inflammatory ativities of Spirulina maxima treated with ultrasoniation and water extration proess. S. maxima extrated via ultrasoniation showed low ytotoxiity (16.90%) in a normal human ell line, CCD-986sk. Espeially, S. maxima ultrasoniation extrat showed the highest DPPH radial savenging ativities (46.82%) ompared to water extrat (31.30%) at 100 C. In addition, ultrasoniation extrat showed a high amount of flavonoids (21.60 mg/g) and total phenols (8.36 μg/ml). Nitri oxide prodution by mg/ml of S. maxima ultrasoniation extrat strongly inhibited (1.3770 μm), whereas water extrat showed lower inhibition (1.5784 μm). TNF-α and IL-6 ytokines were effetively inhibited by mg/ml of S. maxima ultrasoniation extrat, whih shows strong antioxidant ativities. Based on these results, it an be onluded that the ultrasoniation proess inrease anti-inflammatory ativity of S. maxima extrat. Key words: Spirulina maxima, antioxidant, anti-inflammatory, ultrasoniation 서 Spirulina는나선형모양을가진조류로써길이 200 500 μm, 너비약 8 μm 정도의크기로존재하며, 현재 35종이아프리카, 중남미등아열대와열대지방의호수에많이분포하고있다고알려져있다 (1,2). 이러한 Spirulina의영양성분은단백질 55 70%, 지방 6 9%, 탄수화물 15 20% 와무기질, 비타민및색소들을많이함유하고있으며 (3), 섬유소가없고세포벽이얇아소화흡수가빠르고많은열량을가지고알려져있어기능성식품으로효용이있다고알려져있다. 특히 Spirulina maxima는 Spirulina platensis보다단백질함량이더높다고알려져있다고알려져있으며 (4), 단백질함량이높기때문에단백질이용률 (net protein utilization, NPU) 이높고완전단백질식품처럼우수한단백질식품으로평가되고있다 (5). 또한 phyoyanin과비타민 Reeived 21 August 2014; Aepted 20 Otober 2014 Corresponding author: Hyeon-Yong Lee, Department of Food Siene and Engineering, Seowon University, Cheongju, Chungbuk 361-742, Korea E-mail: hyeonl@kangwon.a.kr, Phone: +82-43-299-8471 론 B 12 및다량의 phenoli aid와 toopherols 등을함유하고있고 flavonoid와 phenol 함량이많아일반천연물의항산화능이뛰어난것으로알려져있다 (1,6). 게다가 Spirulina 에함유된 arotenoid 색소와 phyoyanin, novel sulfated polysaharide는항암, 노화방지및종양전이억제등많은효과가있다고한다 (7-9). 이러한 Spirulina를기능성식품등으로사용하기위해서보통열수추출이나에탄올추출방법을통해서유용생리활성물질을확보한다. 하지만열수추출이나에탄올추출을통해서는약 80 100 C의고온에서추출을해야하기때문에 Spirulina에함유되어있는 flavonoid나 phenol의경우고온에서구조가파괴되는단점을가지고있다 (10,11). 따라서고온추출방법의단점을보안하기위한공정을통해서 Spirulina에함유되어있는유용생리활성물질을추출해야한다. 추출방법중초음파공정은낮은온도에서도단백질이덜파괴되고생리활성물질을보호하고추출하기쉽다고알려져있다 (10,11). 이러한초음파공정은초음파에너지의진동으로인하여공동현상이생기게되어추출물의생리활성물질이효과적으로추출이된다고한다 (12). 이러한기존
Spirulina maxima 의초음파및열수추출공정에따른항염증효과비교탐색 1853 에연구된초음파추출방법을통해항산화물질로알려진 flavonoid와 total phenol의파괴가최소화된다고알려져있으며 (13), 미세조류의두꺼운세포벽이초음파공정의공동현상으로인하여효과적으로분쇄되어추출속도개선및높은수율을확보할수있다고알려져있다 (14,15). 따라서본논문에서는 S. maxima 추출물의항산화능과항염증효능에대해조사함과동시에고온추출에서의단점을보완하고자저온초음파공정을통한효능증대효과를알아보고자한다. 재료및방법재료및시약이실험에서사용된 S. maxima 건조분말은한국해양과학기술원 (Ansan, Korea) 에서지원받아사용하였다. Human dermal fibroblasts(hdf) 는 CCD-986sk로 raw ell과함께한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea) 에서동결된상태로구입하였다. CCD-986sk는 RPMI1640 배지에서, raw ell은 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum(hylone, Logan, UT, USA), 1% gentamyin을첨가한후배양하여사용하였다. 시료의제조시료의제조방법은수직환류냉각기가있는열수추출기 (TL-6Point(K), Misung Sientifi Co., Yangjoo, Korea) 를사용하였다. 열수추출은 60 g의분말을 600 ml의증류수에첨가하여 100 C 온도로 24시간추출하였다. 또한초음파추출은 60 g 분말을 600 ml의증류수에넣은후초음파추출기 (AUG-R3-900, ASIA ULTRASONIC, Gyeonggi, Korea) 를이용하여 120 khz의조건으로 30분간전처리하였다. 전처리후 60 C의조건으로열수추출을 12시간하여최종적으로초음파추출물을얻었다. 얻어진각각의추출물은감압여과펌프 (KNF Laboport Pressure Pump, Cole- Parmer, Vernon Hills, IL, USA) 와 Whatman사 (Pisataway, NJ, USA) 의 20 25 μm 여과지를이용하여여과한후, 여과한추출물들을감압회전농축기 (Rotary Vauum Evaporator N-N series, EYELA, Rikakikai Co., Tokyo, Japan) 를이용해농축한후동결건조기 (PVTFA 10AT, ILSIN, Suwon, Korea) 를사용하여분말로만들어실험을진행하였다. 정상세포 (CCD-986sk) 에대한세포독성측정세포독성확인은 MTT 시약을사용하였다. 사용된세포로는 CCD-986sk 세포를사용하였다. 세포독성측정방법은 ell을 3.0 10 5 농도로 96-well plate에 24시간동안배양한후각샘플을농도별로처리하여다시 24시간동안배양하였다. 200 μg/ml 농도의 MTT 시약을 50 μl씩암실에서주입하여 3시간동안배양한후 PBS buffer로두번 세척하고 DMSO를각 well에 200 μl 주입하여 20분뒤에 570 nm에서흡광도로측정하였다. 세포생존율을계산한방법은 ( 시료첨가군의 O.D값 / 시료무첨가군의 O.D값 ) 100 하여 % 로계산하였다. DPPH 자유라디칼소거활성및 flavonoid 함량측정 DPPH 자유라디칼소거활성확인을위하여 Dietz 등 (16) 의방법을변형하여실험을실시하였다. 각샘플들과 positive ontrol(asorbi aid 0.2 mg/ml) 을각각 80 μl와 0.1 mm DPPH 200 μl를혼합하여 25 C에서 20분간방치한후 525 nm에서흡광도를측정하였다. 결과값은 DPPH 라디칼소거능 (%) 으로다음과같이나타내었다. DPPH radial savenging ativity (%)=(1- A ) 100 B A: absorbane value of S. maxima extrat B: absorbane value of ontrol Flavonoid 및 total phenol 함량측정 Flavonoid 함량방법은 Kong 등 (17) 의방법을변형하여실시하였다. 각시료의농도를 mg/ml로넣어준다음 1 N NaOH 1 ml를첨가한뒤 1시간방치후 420 nm의흡광도에서측정을하였으며, 대조군으로는루틴을사용하였다. Total phenol 함량측정방법은 Gutfinger(18) 의방법을참고하여각시료의농도를 0.5 mg/ml로 100 μl와 Na 2CO 3 20 μl를첨가하여 3분간반응후 50% Folin- Cioalteu reagent 100 μl를첨가하여 30분간반응시킨다. 반응후 750 nm 흡광도로값을측정하고 standard로는 gali aid를사용하였다. NO 생성반응 Nirti oxide 생성량측정방법은 Green 등 (19) 의방법을변형하여실시하였다. Raw ell을 3.0 10 5 정도로키운후 96-well plate에 200 μl 넣고 24시간배양한후배지를석션한후 LPS 무처리군과처리군으로나누어 10 μg/ml의농도로주입하였다. 또한샘플처리군과미처리군도나누어 24시간동안배양하였으며, 이때 plate에는각각총 200 μl 가되도록배지를채워주었고, 샘플처리군에는 100 μl의 LPS와 100 μl의배지를채워주었다. 24시간배양후상층액 50 μl를취하여새로운 96-well plate에옮기고 Griess 시약 50 μl를주입한후 10분간방치하고 540 nm에서흡광도를측정하였다. IL-6 및 TNF-α 측정 IL-6 측정방법은 Quantikine ELISA Mouse IL-6 kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 를사용하였다. 96-well plate에 raw 264.7 세포를 3.0 10 5 ells/ml만큼 24시간동안배양한뒤 S. maxima의열수추출물과초음파공정을거친추출물을각농도에맞게처리하고 LPS 0.2
1854 신재빈 최운용 강도형 이현용 μg/ml의농도로넣어준뒤대기하였다. 24시간후 kit 순서에맞춰서 assay diluent 50 μl를처리하고흔들어준다음, standard와샘플을넣고섞은뒤 2시간동안대기하였다. 그후 plate를 wash buffer로씻고 IL-6 onjugate를넣고다시 2시간동안실온에방치한뒤다시한번 wash buffer 로씻고 substrate solution을 100 μl만큼넣은후빛을차단하고 30분동안실온에방치하였다. Stop solution을넣고 miroplate reader기 (Thermo Fisher Sientifi, Waltham, MA, USA) 를사용하여 450 nm에서흡광도를측정한뒤정량방법은 standard 선을이용하여정량을하였다. TNF-α 정량방법은 Quantikine ELISA Mouse TNF-α kit(r&d Systems) 를사용하였다. 처음부분은 IL-6 방법과동일하게 raw ell과 LPS를넣어준뒤 50 μl의 assay diluent RD1-63를각각의 well에처리한다. 그뒤 standard와 ontrol 그리고샘플을 50 μl 넣어주었다. 2시간후 wash buffer로세척한후 TNF-α onjugate 100 μl를첨가한뒤 2시간동안실온에방치하였다. Wash buffer로세척하여 substrate solution 100 μl를넣고암실에 30분동안방치하였다. 그후 stop solution 100 μl를첨가하여 miroplate reader기 (Thermo Fisher Sientifi) 를이용하여 450 nm 파장으로흡광도를측정한뒤 standard 선을이용하여 TNF-α를정량하였다. 통계처리실험은총 3회반복으로실시하였으며, 모든실험의데이터통계처리는실험값의 SAS(Statistial Analysis System, ver 9.3, SAS Institute In., Cary, NC, USA) 프로그램을통하여 two-way ANOVA 방법으로처리하였다. 처리구간의유의수준의차는 P<0.05로통계처리하였다. 결과및고찰정상세포 (CCD-986sk) 에대한세포독성측정 S. maxima 추출물에대한세포독성을확인하기위하여인간피부섬유아세포 CCD-986sk를이용하였고그결과를 Fig. 1에나타내었다. S. maxima 열수추출물의경우농도의존적으로 S. maxima 추출물의농도가 mg/ml로높아질수록세포독성이높아지는것을확인하였다. 특히가장농도가높은 mg/ml의농도에서 4.4% 의세포독성을보이는것을확인하였으며, 가장낮은농도인 mg/ml에서 1.4% 의세포독성을보여단지약 3% 차이를보이는낮은세포독성을보이는것을확인하였다. 반면초음파열수추출물의경우농도의존적으로세포독성이높아지는것이확인되는데가장높은농도인 mg/ml의농도에서약 16.90% 의비교적높은세포독성을나타내었으며, 가장낮은농도인 mg/ml의경우약 1.8% 의낮은세포독성을나타내는것을확인하였다. 상기의결과처럼초음파열수추출물의경우일반열수추출보다높은세포독성을보이는것은초음파열수추출물이저온으로추출을진행함으로서유효성분물질의보호및용출이더잘되어세포독성이더높게나온것으로사료된다 (10,11). 또한상기의결과는기존에보고된 S. maxima 추출물의세포독성실험에서 mg/ml에서 24.5% 의독성을보인거에비해낮은세포독성을보인것으로판단된다. 또한기타식용으로쓰이고있는천연물인복분자의세포독성과비교했을때현저히낮은독성을보여주고있으며, 복분자의가장낮은세포독성의결과는약 21.6% 를나타내고있다 (20). 이러한결과를바탕으로비록초음파열수추출물이고농도에서비교적높은세포독성을보이나일반적으로다른미세조류나천연물의세포독성보다낮은것을확인할수있었다. Cytotoxiity (%). 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 mg/ml 0.5 mg/ml 0.75 mg/ml mg/ml h g e g d f Fig. 1. Cytotoxiity of the Spirulina maxima extrat from and against human fibroblast ells (CCD-986sk)., water extrat at 100 C;, extrats from water ultrasoniation at 60 C. Values are mean±sd (n=3). Means with different letters above the bars are signifiantly different (P<0.05). b a S. maxima 초음파추출물의항산화활성측정 S. maxima 추출물의항산화활성을알아보기위하여 DPPH radial savenging ativity (%). 60 50 40 30 20 10 0 mg/ml 0.5 mg/ml 0.8 mg/ml mg/ml f e f d Fig. 2. DPPH radial savenging ability of Spirulina maxima extrat., water extrat at 100 C;, extrats from water ultrasoniation at 60 C. Values are mean±sd (n=3). Means with different letters above the bars are signifiantly different (P<0.05). b a
Spirulina maxima 의초음파및열수추출공정에따른항염증효과비교탐색 1855 Table 1. Flavonoid, total phenol ontents, and extration yields in Spirulina maxima Antioxidant ativity Flavonoid (mg/g) Total phenol ontent (μg/ml) Extration yields (%, w/w) 19.60±1.372 b1)2) 8.19±0.294 a 9.31±1.195 b 21.60±15 a 8.36±51 a 10.87±1.322 a : water extrat at 100 C, : extrats from water ultrasoniation at 60 C. 1) Mean±SD (n=3). 2) Means with different letters in a row are signifiantly different (P<0.005). DPPH 자유라디칼소거활성을실험하였다. 그결과를 Fig. 2에나타내었으며, S. maxima의초음파열수추출물의농도가 1 mg/ml에서가장높은약 46.82% 의 DPPH 자유라디칼소거활성을보였으며, 가장낮은농도인 mg/ml에서약 8.14% 의 DPPH 자유라디칼소거활성을보이는것을확인하였다. 반면열수추출물의경우고농도인 mg/ml 의농도에서약 31.30% 의자유라디칼소거능을확인하였으며, 상기의결과는초음파열수추출물의농도가 0.5 mg/ml 일때약 26.97% 의 DPPH 자유라디칼소거활성과크게차이가나지않은것을확인할수있었다. 상기의 DPPH 자유라디칼소거능결과는기존에알려진 Chlorella elliposidea C020 추출물의 DPPH 자유라디칼소거능결과와비교하였을때, Chlorella elliposidea C020 추출물이가장높은농도인 1 mg/ml에서약 39%, 그리고가장낮은농도인 0.25 mg/ml일때약 10% 의 DPPH 자유라디칼소거활성을보이는것과비교하여 S. maxima의초음파열수추출물이보다더높은활성을가지는것으로확인되었다 (21). 이러한결과는 S. maxima에항산화능에가장큰영향을준다고알려진비타민성분과더불어베타카로틴, phyoyanin 과 phenoli aid 그리고 toopherols을많이함유하고있어항산화능이높은것으로예상된다 (7,8). S. maxima 추출물의 flavonoid 함량과 total phenol 함량을측정한결과인 Table 1을확인한결과, flavonoid 함량에서열수추출물의경우약 19.60 mg/g의양이측정된반면, 초음파전처리를적용한추출물의경우약 21.60 mg/g의 flavonoid를함유하고있는것으로확인되었다. 이수치는항산화가좋다고알려진흑마늘의 flavonoid 양보다 10배이상많은수치이며 S. maxima의항산화능이뛰어난것을증명하고있다 (22). 또한 total phenol 함량에서는열수추출물에서 8.19 μg/ml, 초음파열수추출물에서는 8.36 μg/ml 함유하고있는것을확인하였다. 흑마늘의수치인 0.81 mg/100 g과비슷한수치를보이는것을확인할수있었다. 상기의결과모두초음파공정을적용하였을경우보다많은양의 flavonoid와 total phenol이용출된것을확인할수있었고, 이는초음파공정을통해진동에너지의공동현상으로인하여추출물의생리활성물질이더추출된것으로사료되며 (12), 초음파로인해물분자집단의크기인클러스트가일반증류수의크기인 118 Hz보다적어지기때문에 S. maxima의 세포벽에물분자가빠른흡수를일으켜높은용해력을가지는것으로사료된다 (23). 또한저온에서의초음파추출로인해 flavonoid와 total phenol의파괴가최소화되어높은함량을보인것으로사료된다 (24). 특히 S. maxima 의열수추출물과초음파추출물의추출수율을비교한결과열수추출의경우약 9.31%(w/w) 그리고초음파추출의경우약 10.87%(w/w) 의수율을확인할수있었으며, 이러한결과를통해서초음파로인한추출이효과적으로이루어진다는것을다시확인할수있었다. 따라서초음파공정을거칠경우항산화능에관련된생리활성물질의추출이용이해지기때문에항산화능이더높은것을확인할수있었다. S. maxima 초음파추출물의항염증활성측정 S. maxima 초음파추출물의항염증활성을측정하기위해 NO 생성량을측정하였다. 그결과를 Fig. 3에나타내었으며, LPS만첨가하여측정한값을기준으로 LPS와함께시료를넣어준값들을비교분석하였다. 그결과 S. maxima 의추출물에 LPS를넣어준군과넣지않은군을비교하여 LPS를넣지않은군의 NO 생성이 22 23% 가량감소하는것을확인할수있었다. 또한열수추출물과초음파열수추출물을비교하면초음파열수추출물이 NO를약 12% 정도덜생성하는것으로보아초음파공정을거친 S. maxima 추출물의항염증효능이좋다는것을확인할수있었다. 항염증관련 ytokine인 IL-6 및 TNF-α의생성량을측정한결과를 Table 2에나타내었다. IL-6 생성량비교결과열수추출물의경우농도에따라각각 785.0, 699.0 및 596.0 pg/ml의농도를생성하였으며, 초음파열수추출물의경우각각 718.5, 516.5 및 533.0 pg/ml의 IL-6를생성하는것을확인하였다. TNF-α의경우열수추출물은농도에따라각각 1,311.4, 1,303.1 및 1,284.5 pg/ml가생성되었으며, 초음파열수추출물의경우각각 1,307.9, 1,292.8 및 1,279.0 pg/ml의 IL-6가생성하는것을확인하였다. 상기 NO (μm) 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.4 0.2 0 d e b + LPS LPS Fig. 3. Nitri oxide ontent of Spirulina maxima extrat on the marophage through the addition of mg/ml from two different extration proesses., water extrat at 100 C;, extrats from water ultrasoniation at 60 C. Values are mean± SD (n=3). Means with different letters above the bars are signifiantly different (P<0.05). a
1856 신재빈 최운용 강도형 이현용 Table 2. Estimation of IL-6 and TNF-α seretion of the extrats obtained from different extration proesses Cytokine mg/ml pg/ml mg/ml pg/ml IL-6 TNF-α 785.0±3.6 Aa1)2)3) 699.0±8.5 Ba 596.0±5.1 Ca 1,311.4±50.1 Aa4)5) 1,303.1±37.5 Aa 1,284.5±20.4 Ba 718.5±13.5 Ab 561.5±5.6 Bb 533.0±10.7 Ca 1,307.9±34.7 Ab 1,292.8±26.0 Bb 1,279.0±22.9 Ca : water extrat at 100 C, : extrats from water ultrasoniation at 60 C. 1) Mean±SD (n=3). 2) Means with different apital letters in a olumn are signifiantly different (P<0.05) at IL-6. 3) Means with different small letters in a row are signifiantly different (P<0.05) at IL-6. 4) Means with different apital letters in a olumn are signifiantly different (P<0.005) at TNF-α. 5) Means with different small letters in a row are signifiantly different (P<0.005) at TNF-α. 의결과를바탕으로초음파열수추출물의경우일반열수추출물보다적은양의 ytokine을생성하는것을확인할수있었으며, 이러한결과는기존에알려진천연물중칡추출물의 TNF-α의측정량인 1,337 mg/ml와비교하면낮은수치를보이기때문에 S. maxima가항염증효능이좋다는것을추측할수있었다 (24). 또한기존에연구된천연물인달맞이순추출물의 IL-6 생성량이 25.0 μg/ml에서약 400 pg/ml가생성되었기때문에일반천연물에비해항염증효과가우수한결과를얻을수있었다 (25). 이러한 S. maxima 초음파추출물의항염증활성이높아지는결과는열수추출의경우고온으로인한성분파괴나변성등이일어나원하고자하는효능들이떨어져활성이감소한것에비해, 초음파열수추출물은 60 C에서추출을진행하여열변성에대해적게반응하고초음파에너지를이용하여항산화활성에관련된생리활성물질을용이하게추출하였을것이라고사료된다. 기존에연구된염증반응을유발한다고알려진활성산소는대식세포에서활성화되는 IL-6, TNF-α와같은각종 ytokine 및 NO(nitri oxide) 를유발한다고알려져있다 (26). 따라서초음파전처리공정을통한 S. maxima 추출물은활성산소를소거하는항산화활성이증진됨에따라항염증효과가증진되었다고사료된다. 요 본실험은초음파전처리를통한 Spirulina maxima 추출물이기존의열수추출공정과비교하여항산화, 항염증효과가증진되는지에대한연구를하였다. 낮은세포독성을통해안정성을확보하였으며, 항염증성효과를증진시키기위한항산화효능에서는 DPPH의경우약 50% 정도이상의 약 효능을보였다. Flavonoid 함량에서는열수추출물보다초음파공정을거친추출물은 10% 정도의함량증가를보였으며, total phenol에서도함량의증가를확인하였다. 또한이결과로일반천연물보다항산화능이좋을뿐아니라독성도낮은결과를얻어 S. maxima의뛰어난효능을입증하였다. 항염증효과의경우 NO, TNF-α 및 IL-6 생성량을확인한결과 3가지생성량모두열수추출물보다초음파공정을통하여항염증효능의증대를보이는것을확인하였다. 이러한결과를바탕으로초음파공정을이용해낮은온도에서활성물질들의파괴가없을뿐더러초음파의높은에너지로인하여더많은활성물질들을추출하여효능들의증대로보이며, 초음파공정전처리를통하여 S. maxima의두꺼운세포벽을효과적으로파쇄하여생리활성물질의추출이효과적으로진행되어항산화능이증가하게되고, 항산화능의증가로항염증효능에영향을미치는것으로사료된다. 이실험결과들을바탕으로 S. maxima의활성증진및기능성식품으로의개발에적용될것이라고사료된다. 감사의글 이연구는한국해양과학기술원의연구비 (PE99213) 지원으로수행되었습니다. REFERENCES 1. Kay RA. 1991. Miroalgae as food and supplement. Crit Rev Food Si 30: 555-573. 2. Son MH, Park KH, Choi AR, Yoo G, In MJ, Kim DH, Chae HJ. 2009. Investigation of biologial ativities of enzymati hydrolysate of Spirulina. J Korean So Food Si Nutr 38: 136-141. 3. Romano I, Bellitti MR, Niolaus B, Lama L, Mana MC, Pagnotta E, Gambaorta A. 2000. Lipid profile: a useful hemotaxonomi marker for lassifiation of a new yanobaterium in Spirulina genus. Phytohemistry 54: 289-294. 4. Saeid A, Chojnaka K, Korzyński M, Korniewiz D, Dobrzański Z. 2013. Biomass of Spirulina maxima enrihed by biosorption proess as a new feed supplement for swine. J Appl Phyol 25: 667-675. 5. Zao X, Yang YH, Cho YS, Chun HK, Song KB, Kim MR. 2005. Quality harateristis of Spirulina-added salad dressing. J East Asian So Diet Life 15: 292-299. 6. Yang HN, Lee EH, Kim HM. 1997. Spirulina platensis inhibits anaphylati reation. Life Si 61: 1237-1244. 7. Hernández-Corona A, Nieves I, Mekes M, Chamorro G, Barron BL. 2002. Antiviral ativity of Spirulina maxima against herpes simplex virus type 2. Antiviral Res 56: 297-285. 8. Jung SW, Lee NK, Kim SJ, Han D. 1995. Sreening of tyrosinase inhibitor from plants. Korean J Food Si Tehnol 27: 891-896. 9. Kim IS, Cho ZS. 1993. Modulation of human fibroblast proliferation and ollagen prodution by prostaglandin E2. Korean Biohem J 23: 40-52. 10. Toma M, Vinatoru M, Paniwnyk L, Mason TJ. 2001. Investigation of the effets of ultrasound on vegetal tissues during
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