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1 J Korean So Food Si Nutr 한국식품영양과학회지 45(1), 1~11(2016) 미나리추출물의기억력손상억제와산화스트레스억제효과및 Isorhamnetin 분석 원범영 1 * 신기영 2 * 하현지 1 위지향 3 윤여상 1 김예리 1 박용진 1 정경옥 3 성혜미 3 이형근 1 1 브레인트로피아기업부설연구소 2 단국대학교자연과학대학미생물학과 3 ( 재 ) 전남생물산업진흥원식품산업연구센터 Inhiitory Effets of Dropwort (Oenanthe javania) Extrats on Memory Impairment and Oxidative Stress and the Qualitative Analysis of Isorhamnetin in the Extrats Beom Young Won 1*, Ki Young Shin 2*, Hyun Jee Ha 1, Ji-Hyang Wee 3, Yeo Sang Yun 1, Ye Ri Kim 1, Yong Jin Park 1, Kyoung Ok Jung 3, Hea Mi Sung 3, and Hyung Gun Lee 1 1 Researh & Development Center, Braintropia Co., Ltd. 2 Department of Miroiology, College of Natural Siene, Dankook University 3 Food Researh Center, Jeonnam Bioindustry Foundation ABSTRACT This study was onduted to investigate effet of the aetylholinesterase inhiitor ativity, the protetive effet of the extrat on SH-SY5Y ell death y H 2O 2, the memory improvement from sopolamine-indued rat. Moreover, the antioxidant ativity of isorhamnetin from the dropwort (Oenanthe javania) was investigated. Aetylholinesterase inhiitor ativity was highest (28.59%) in Hwasun O. javania extrat (H-OJE). H-OJE and Naju O. javania extrat (N-OJE) were not signifiantly different. SH-SY5Y ell death deeased to 37.23% and 36.68% for H-OJE and N-OJE, respetively, following treatment with the extrats. O. javania extrats showed a protetive effet against H 2O 2-indued neurotoxiity. Treatment with O. javania extrats slightly improved sopolamine-indued (1 mg/kg, i.p.) memory impairment in rats. H-OJE ontained the highest total phenoli and flavonoid ontents of 117 mg/g and 30 mg galli aid equivalents/g, respetively, and had a DPPH radial savenging ativity (SC 50) of μg/ml and ABTS radial savenging ativity of 48.2 μg/ml, whih was higher than the other extrats. The thioarituri aid reative sustanes value was highest (50.2%) in H-OJE. Antioxidant ativity differed signifiantly among dropwort extrats. Isorhamnetin was known as one of the flavonoid and for having neuroprotetive effet. So we analyzed aid-hydrolyzed O. javania extrat HPLC. The results were that peak at 14 min and spetrum of the extrats was onsistent with standard solution. The results of LC/MS/MS analysis were that the extrat and standard solution were onfirmed total ion hromatogram at idential time, preursor ion was 317 [M-H] + m/z, produt ion was 302 [M-H] + m/z. Overall, the results showed that the dropwort extrat led to memory improvement and had antioxidant ativity. Based on these finding, further researh to investigate the prodution of ethanol extrat of dropwort as a proessed food is warranted. Key words: Oenanthe javania, isorhamnetin, memory, antioxidant ativity, funtional food 서 현대의학의발달에따른인간수명의연장은노령인구의증가를초래하였고, 이와함께노인성치매환자는 65세이상노인인구의약 10% 로높은발병률을보이고있어심각한문제가되고있다. 노인성치매는주로뇌혈관성치매 (ererovasular dementia) 와알츠하이머병 (Alzheimer disease, AD) 으로구분되며, 이중 AD는 50% 이상차지한 Reeived 2 Septemer 2015; Aepted 16 Novemer 2015 Corresponding author: Beom Young Won, Researh & Development Center, Braintropia Co., Ltd., Anyang, Gyeonggi-do 14057, Korea ywon@raintropia.om, Phone: * These authors ontriuted equally to this work. 론 다 (1). AD는발병원인이뚜렷치않으나일반적으로콜린성신경의손상, 산화적스트레스, 아밀로이드침착, 염증성인자, 스테로이드호르몬의결핍, 흥분성신경독성등이나타나는것으로보고되고있고 (2), AD의주증상인기억력장애는기억과학습에있어서중요한역할을수행하는 holinergi system의심각한손상에의한것으로알려졌다 (3). AD 질환의인지력감소는 aetylholine을생성하는신경세포의손상과 aetylholine을분해하는효소인 aetylholinesterase(ache) 활성이증가되어기억장애가더욱악화된다 (4). 또한인지장애를일으키는손상부위인뇌신경세포는다른조직에비해고도불포화지방산함량과산소소비가높은반면, 항산화효소는상대적으로부족하여산화적스트레스에의한영향이크다 (5,6). 활성산소 (O 2) 나산화

2 2 원범영 신기영 하현지 위지향 윤여상 김예리 박용진 정경옥 성혜미 이형근 질소 (NO) 에의해일어난뇌의염증반응으로알츠하이머성인지기능장애가유발된다고한다 (7). AD 치료를위해서 tarine, donepezil, rivastigmine 및 galantamine의네가지약물이 FDA(U.S. Food and Drug Administration) 의승인을받았으나, 그중하나인 tarine의경우간독성때문에지금은거의사용되지않고있다 (8). 이에다양한치료법이제시되고있지만대부분이부작용및손상기전의복잡성, 생체내낮은이용률및간독성등으로안전성이입증된천연물이나약용식물에서기존약물들을대체할수있는새로운치료및예방효과를나타낼수있는개선제개발이진행되고있다 (9). 천연물로부터얻은물질의신경보호효과로원지 (Polygala tenuifolia Willdenow) 추출분말, 은행 (Ginko iloa) 잎추출물및녹차 (green tea) 추출물 / 테아닌 (L-theanine) 복합물, 로즈마리 (Rosmarinus offiinalis L.) 잎추출물등의연구가보고되었다 (10-14). 미나리 (Oenanthe javania) 는미나리과에속하는다년초초본으로한국의농가에서특용작물로재배하고있다 (15). 독특한향미및약리작용으로인해기능성식품소재나향신료로활용도가높은약용식물이며 (16), 특히혈압강하, 진정, 보혈, 정력강장등에효과가있다 (17). 미나리의주요성분인 isorhamnetin은 queretin 의 3'-O-methylated metaolite로서항산화, 항증식, 항염, 항암효능을나타낸다 (18-20). 미나리의항산화활성에관한연구에는미나리에탄올추출물 (21), 돌미나리추출물 (22), 흑마늘 (Allium sativum L.) 과미나리를이용한음료 (23) 등이진행되었다. 스코폴라민 (sopolamine) 은시냅스의무스카린수용체 (musarini reeptor) 의길항제로서시냅스에서유리되는신경전달물질인아세틸콜린과무스카린수용체간의결합저해로정보전달을일시적으로차단하여학습과기억력을손상시키기때문에학습과기억력증진효과를검증하고자하는기억력감퇴동물모델에흔히이용된다 (24,25). 따라서본연구에서는미나리추출물의기능성검토와이용개발을위하여 AChE 활성억제, SH-SY5Y의세포사멸억제효과, sopolamine으로기억손상을유발한실험동물의기억력개선에미치는효과를평가하고, 생리활성효과를검토하기위하여항산화활성과 isorhamnetin을분석함으로써미나리추출물을이용한기능성식품을개발하기위한기초자료를얻고자하였다. 재료및방법미나리추출물제조본연구에사용한미나리는전라남도화순, 나주, 의령지역에서재배된것을구입하였다. 미나리는수세한후열풍건조기 (VB-200DM, Vision Bioteh, Inheon, Korea) 를이용해건조시킨후, 분쇄기 (Pin Crusher-140, Korea Pulverizing Mahinery Co., Ltd., Inheon, Korea) 를이용하여분쇄하였다. 이를 50% 에탄올에 75±5 C에서 4시 간 2회추출하였고 Whatman No. 1(Whatman Ltd., Maidstone, Kent, UK) 여과지를이용하여여과한후, 농축기 (CEP-20S, OKAWARA Co., Tokyo, Japan) 를사용하여 50 C에서감압농축하였다. 농축된미나리추출물은분무건조기 (MSD200, GEA Niro Co., Soeorg, Denmark) 를이용하여건조한후분말상태로준비하여시료로사용하였다. 시약본실험에사용된시약중 ethyl alohol은 Ethanol Supplies World Co.(Jeonjoo, Korea) 의제품을사용하였고, 생리식염수 (JW Pharmaeutial Co., Seoul, Korea) 를구입하였다. Aetylthioholine iodide, isorhamnetin, Folin- Cioalteu phenol reagent, galli aid, atehin, asori aid, linolei aid, thioarituri aid, trihloroaeti aid, utylated hydroxytoluene, trifluoroaeti aid(tfa)(sigma-aldrih Co., St. Louis, MO, USA) 를구입하여사용하였고, DPPH, ABTS(Wako Pure Chemial Industries, Ltd., Osaka, Japan) 는라디칼소거능측정을위해구입하였다. 모든분석시사용한용매는 HPLC 등급으로사용하였다. 실험동물체중 150~180 g 되는 Sprague-Dawley 계수컷을 ( 주 ) 코아텍 (Peongtaek, Korea) 에서구입하여표준사료로일주일동안사육실의환경에적응시킨후체중에따라임의로나누어실험에사용하였다. 실험군은대조군, sopolamine 투여군, 미나리추출물투여군으로나누었다. 식이와물은자유섭취방법으로급여하였으며, 실험실의사육조건은온도 22±2 C, 습도 50±5%, 명암은 12시간 (08:00~20:00) 을주기로자동조절되었다. 동물실험프로토콜은서울대학교병원동물실험윤리위원회 (Seoul National University Hospital Institutional Animal Care and Use Committee, SNUH-IACUC) 의승인을받은후시행되었으며, 전실험과정동안모든동물은실험동물관리원칙 (the priniples of laoratory animal are National Institutes of Health puliation No , revised 1985) 을준수하였다. 시험물질투여시험물질은매일 1번, 8주동안투여하였으며, 시험진행기간에도지속하였고수동회피테스트 30분전에 10 mg/kg 의용량으로생리식염수에녹여경구투여하였다. 투여용량 (10 mg/kg) 의설정은 Park 등 (26) 원지추출분말 (Polygala tenuifolia Willdenow) 에대한 SD-rats에서의기억력개선효과에준하여결정하였다. 기억손상유발을위해인지시험 1시간전에 vehile ontrol 군과미나리추출물투여군에 sopolamine(1 mg/kg. i.p.) 을주사용생리식염수에희석하여복강투여하였다.

3 미나리의기억력개선효과연구 3 HPLC 분석용시험용액조제미나리추출분말은 90 C에서 30분동안 H 2SO 4 를처리하여산가수분해를시켰다. 산가수분해처리후미나리추출분말은 50% MeOH이담긴 25 ml 정용플라스크에넣고정용한후 0.45 μm PTFE syringe filter(millipore, Milford, MA, USA) 로여과한용액을시험용액으로사용했다. 표준용액은 50 ml(100 μl/ml) 의 MeOH에 5 mg isorhamnetin을용해한후 4 C에서보관하였다. 이를 HPLC 분석시 sulfuri aid를함유한 50% MeOH에희석하여사용하였다. Aetylholinesterase 억제활성측정아세틸콜린분해효소분석은 Ellman 등 (27) 의 aetylthioholine iodide를기질로사용한비색분석법으로측정하였다. 아세틸콜린분해효소로동물뇌무게의 10배수용량 homogenization uffer(12.5 mm sodium phosphate ph 7.0, 400 mm NaCl) 를넣고 Potter-Elvehjem homogenizer(pro250, ProSiene, Oxford, CT, USA) 를이용해균질화시킨후 1,000 g로 10분간원심분리 (Hanil Siene, Inheon, Korea) 하였다. 상층액을취한후 0.5% Triton X-100이포함된 homogenization uffer를첨가하고 30분동안반응시켜 1,000 g로 10분간원심분리하였다. 모든과정은 4 C를유지하며진행시키고상층액을취하여아세틸콜린분해효소로본실험에사용되었다. 미나리추출물은 5% dimethyl sulfoxide(dmso) 에용해하고, 사용바로전에 uffer 1(100 mm sodium phosphate, ph 8.0) 에 200 μg/ml의농도로희석하였다. 1.5 ml의희석된미나리추출실험용액은 100 μl의 aetylthioholine iodide solution (75 mm) 과 100 μl의 uffered Ellman's reagent[10 mm 5,5'-dithio-is(2-nitroenzoi aid)], mm sodium iaronate 혼합물을순서대로혼합하고 10분동안 25 C 에서반응시켰다. 1.2 ml reation uffer와 100 μl 효소를첨가한후 410 nm에서 5분동안 30초간격으로측정하였다. Reation lank는생리식염수를사용하였다. 아세틸콜린분해효소활성은흡수계수 1.36 L/mmol/min을사용해서계산되었다. 모든실험은 5회반복측정하였다. 세포사멸분석 WST-1의 metaolizing ativity는제조사 (Rohe, Indianapolis, IN, USA) 의지시에따라수행하였다. SH- SY5Y 세포는 ell/well의농도로 96-well plate에처리하고, 이전보고된연구 (28-31) 에따라서세포는 24시간동안배양하였다. SH-SY5Y 세포보호효과측정을위해 750 μm H 2O 2 를처리하기 4시간전에미나리추출물 (10 μg/ml) 을처리한후 37 C에서 5% CO 2 와 95% air가공급되는환경에서 1시간동안배양하였다. ELISA reader(bio- Rad, Munih, Germany) 로 450 nm에서측정하였다. 수동회피테스트기억과학습에대한미나리추출물의효과를측정하기위해수동회피테스트기구 (PACS-30, San Diego Instrument, San Diego, CA, USA) 를사용하였다 (32). Shuttle ox는 2개의같은크기방 ( m) 으로나누어지고, guillotine door( m) 에의해분리된다. 불이밝게켜진방은조명이설치되어있고, 동물은 guillotine door를통과해서어두운방으로들어가게된다. 동물은처음에불이켜진방에놓여지고, 탐험적인행동을보이다가어두운방으로들어간다. 어두운방에들어가자마자 guillotine door는자동적으로닫히게된다. Training은동물이 20초이내에어두운방으로들어갈때까지의훈련을반복시킨다. Training 24시간후에 sopolamine과 saline(1 mg/ kg, i.p.) 을각각실험그룹과 ontrol 그룹동물복강에투여하였다. Sopolamine 투여 30분후단한번의미나리 (10 mg/kg) 를경구투여하고, 이로부터 30분후에동물은불이켜지는방에놓여졌다. 동물이어두운방에들어가면 guillotine door는자동적으로닫히게되고, grid floor를통해 3초동안 shok(1 ma) 가가해진다. 그동물이어두운방으로들어가는시간은최장 300초를기준으로측정되었다. 만약동물이 300초 (ut-off time) 이내에어두운방으로들어가지않았다면그것은 300초의값으로측정하였다. 총폴리페놀함량측정미나리추출물의총폴리페놀함량은 Hwang 등 (33) 의방법에따라 Folin-Cioalteu reagent가추출물의폴리페놀성화합물에의해환원된결과몰리브덴청색으로발색하는것을원리로분석하였다. 각추출물 100 μl에 2% Na 2CO 3 용액 2 ml를가한후 3분간방치한다음 50% Folin-Cioalteu reagent 100 μl를가하였다. 2% Na 2CO 3 용액을가하고 30분후반응액의흡광도값을 spetrophotometer(gene Spe Ⅲ, JP/U-3010, Hitahi High-Tehnologies Co., Tokyo, Japan) 로측정하였다. 총폴리페놀함량은 galli aid equivalents(gae)/100 g으로나타냈다. 모든샘플은 3번반복분석하였다. 총플라보노이드함량측정미나리추출물의총플라보노이드함량은 Kim 등 (34) 의방법에따라측정하였다. 미나리추출물 250 μl에 3차증류수 1 ml와 5% NaNO 2 75 μl를가하여잘혼합하고, 5분후 10% AlCl 3 6H 2O 150 μl를가하여실온에서 6분동안반응시킨다. 그후 1 N NaOH 500 μl를가하여 11분후, 510 nm에서흡광도를측정한다. 표준물질은 (+)-atehin hydrate를사용하였으며, 총플라보노이드함량은시료 (+)-atehin hydrate equivalents(ce)/100 g으로나타냈다. 모든샘플은 3번반복분석하였다.

4 4 원범영 신기영 하현지 위지향 윤여상 김예리 박용진 정경옥 성혜미 이형근 DPPH 라디칼소거능및 ABTS 측정 DPPH 라디칼을이용한항산화능은 Blois(35) 의방법을이용하여측정하였다. 10 μl의각추출물과 positive ontrol(asori aid) 에 EtOH 100 μm의 190 μl DPPH (Wako Pure Chemial Industries, Ltd.) 를혼합하여첨가하였다. 25 C에서 30분동안반응후 515 nm에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼항산화능측정은아래와같은식을이용하여산출하였다. DPPH radial-savenging = Asontrol-Assample 100 ativity (%) As ontrol 2,2'-Azino-is(3-ethylenzothiazoline-6-sulphoni aid)(abts) 법을이용한항산화능측정은 Re 등 (36) 의방법을변형하여 ABTS 양이온라디칼을분석하기위한성분의탈색을기본으로하여측정하였다. ABTS + 는 100 mm의 potassium phosphate uffer(ph 7.4) 에 2.5 mm potassium persulfate와 7 mm ABTS stok을같이반응시키고 stok 용액은 80:1로희석한다. 10 μl의각추출물과 positive ontrol(asori aid) 을 96 well에넣고, 300 μl의 ABTS + 용액을첨가한다. 감소하는흡광도는어두운곳에서 3분동안 734 nm에서측정하였다. ABTS를이용한항산화능측정은아래와같은식을이용하여산출하였다. Savenging ativity (%) = Asontrol-As sample 100 As ontrol 결과값은샘플 radial의 50% 농도로정의된다. Parameter SC 50 은 Turumtay 등 (37) 에의해나타났다. Thioarituri aid reative sustanes(tbars) 측정 Thioarituri aid(tba) 법을이용한항산화능측정은손상되지않은세포와세포내의무세포추출액에의해 linolei aid 과산화억제능으로판단한다 (38). 0.4 ml 각추출물에 1 ml linolei aid 유화액, 0.5 ml의 phosphate uffer solution(0.5 ml, 0.02 M, ph 7.4), 0.2 ml의 H 2O 2 (0.56 mm) 를혼합하여 37 C에넣었다. Blank는 DMSO 또는 3차증류수를첨가한다. 37 C에넣은 2 ml의 reation solution을 12시간후에 4% 의 trihloroaeti aid(tca) 0.2 ml와 0.8% 의 TBA, 0.4% 의 utylated hydroxytoluene(bht) 을같이혼합하였다. 이혼합물을 100 C에 30 분동안반응시키고흡광도를 532 nm에서측정하였다. Linolei aid 과산화억제력측정은아래와같이산출하였다. Anti-lipid peroxidation = Asontrol-Assample 100 ativity As ontrol HPLC 를이용한미나리추출물의 isorhamnetin 분석 Isorhamnetin을분석하기위해 Agilent 1100 series HPLC(Agilent 1100, Agilent Tehnologies, Santa Clara, CA, USA) 와 UV detetor(waters 486, Waters, Milford, MA, USA) 를사용하였다. Column은 X ridge C 18 olumn ( mm, 5 μm), 온도는 30 C로유지하였다. Injetion volume은 20 μl, flow rate는 1.0 ml/min으로하였다. 이동상을목적으로용매 A(0.1% TFA 함유 10% MeOH), 용매 B(0.1% TFA 함유 100% aetonitrile) 를사용하였다. 모든용매는기포를제거하였고, 0.45 μm filter(millipore) 를통해 filter 하였다. Gradation은처음에서 25분까지용매 A : B(80:20, %:%) 로흘려주고 25분부터분석마지막까지용매 A : B(55:45, %:%) 로흘려주었다. LC/MS/MS 를이용한미나리추출물의 isorhamnetin 분석 Isorhamnetin을분석하기위해 Agilent 6550 LC-MS/ MS(Agilent 6550, Agilent Tehnologies) 와 UV detetor (Waters 486, Waters) 를사용하였다. Column은 Shimpak XR-ODS olumn( nm, 2.2 μm, SHIMADZU, Kyoto, Japan) 을사용하였다. 분석용매는용매 A(0.1% TFA in water), 용매 B(0.1% in ACN) 를사용하였으며, 모든용매는기포를제거하였고 0.45 μm filter(millipore) 를통해 filter 하였다. Flow rate는 0.25 ml/min, olumn 온도는 50 C, injetion volume은 5 μl, 파장은 370 nm로고정하였다. LC-MS/MS 전자분무이온화법의조건은질소 1.5 L/min, 기화온도는 200 C, apillary voltage는 4,500 V, mass range는 150~1,500 m/z였다. Gradation은 Tale 1과같다. 통계분석통계분석은 SPSS 통계프로그램 (Statistial Pakage for the Soial Siene, Ver. 12.0, SPSS In., Chiago, IL, USA) 을이용하여각측정군의평균과표준편차를산출하고처리간의차이유무를 one-way ANOVA(analysis of variation) 의 Dunan's multiple range test 사후분석을이용하여 P<0.05 수준에서유의성을검정하였다. Tale 1. LC-MS/MS gradient speifiations for isorhamnetin of Oenanthe javania extrat (%) Time (min) A B 결과및고찰 Aetylholinesterase 억제활성측정 Aetylholine의합성과분해에관련된효소로는 holine aetyltransferase(chat) 와 aetylholinesterase(ache) 가있다. 따라서체내의신경전달이원활하게이루어지려면 A: 0.1% TFA (trifluoroaeti aid) in water. B: 0.1% TFA in aetonitrile

5 미나리의기억력개선효과연구 5 AChE 수준에영향을미치는 ChAT와 AChE 효소활성이매우중요하다 (39). 미나리추출물의 AChE 활성에미치는효과는 Fig. 1과같다. 양성조절 DHED(dehydroevodiamine) 는 IC 50 이 37.5 µm로알려져있으며 (40), 대조군으로서 DHED는 44.36% 억제력이나타났다. 화순미나리추출물은 28.59% 로가장높은억제력을나타냈고, 나주미나리추출물은 25.11%, 의령미나리추출물 11.66% 로나타났다. 의령미나리추출물은나주미나리추출물과비교하여유의적으로낮은억제력을나타내었으며 (P<0.05), 화순미나리추출물은의령미나리추출물과비교하여통계적으로 AChE의활성을유의적으로저해하였다 (P<0.05). 화순미나리추출물은나주미나리추출물과통계적으로유의적차이가없었다 (P>0.05). 미나리추출물의지역별마다 AChE 활성억제차이가나타난것은품종, 토양및환경조건의변화에따른결과라고사료된다. Kim 등 (41) 은 37종의식물추출물에서 AChE 저해활성을살펴본결과, 당근 28.3%, 고추나물 21.5%, 딸기 19.4% 로약 20% 이상의 AChE 저해활성을보였고, 박하는 13.2% 의저해활성을나타내었으나그외추출물에서는 10% 이하의활성을나타내거나또는활성을전혀나타내지않았다고한다. 미나리의총페놀함량은 1.50% 이며 (42), 페놀성복합물은 aetylholinesterase 활성을억제한다고보고하였다 (43). 따라서미나리추출물은 aetylholinesterase inhiitor와같이신경접합부에있는 aetylholine을분해하는 aetylholinesterase 활성을억제하여 aetylholine의활성을촉진하게되므로기억과학습개선에효과가있는것으로사료된다. 세포사멸분석 H 2O 2 는생물학적으로반응성이매우약하지만주요효소활성부위에있는 thiol group을산화시켜불활성화를초래하거나 10~100 μm 이상의농도에서세포에직접적인손상을유발할수도있다 (44). 신경계질환은산화적스트레스에 % of inhiition a DHED U-OJE N-OJE H-OJE Fig. 1. Oenanthe javania extrats inhiit aetylholinesterase (AChE) ativity. Inhiition is expressed relative to the ontrol value (100%). AChE ativity was inhiited y all Oenanthe javania extrats (500 μg/ml). DHED (37.5 mm) was used as a positive ontrol. Eah value represents the mean±sem. Different letters show a signifiant differene at P<0.05 as determined y Dunan's multiple range test. 의한신경세포의사멸에의해발생되며, 천연항산화제인 flavonoids, polyphenols 등은산화적스트레스로부터신경세포보호효과가뛰어난것으로보고되고있다 (45). H 2O 2 에의해유도된산화적스트레스상태에서미나리추출물 (10 μg/ml) 처리에따른 SH-SY5Y 신경세포에서나타나는독성의결과는 Fig. 2에나타내었다. H 2O 2 를처리한 human neurolastoma ell line인 SH- SY5Y 세포에서 H 2O 2 비처리대조군과비교하여세포사멸이유의하게증가하였다 (P<0.05). DMSO 41.69% 와비교하여화순미나리추출물 37.23%, 나주미나리추출물 % 로세포사멸이통계적으로유의하게감소하였으며 (P< 0.05), 의령미나리추출물 42.91% 로 DMSO에대하여통계적으로유의한차이가나타나지않았다 (P>0.05). Ma 등 (46) 은미나리의 persiarin이초기배양 rat의피질세포내에서 glutamate 유발신경독성에대항하여신경세포보호와항산화작용을나타내는것으로보고하였다. 미나리추출물은활성산소활성에효과적이라고보고하였다 (47). 또한 Zhang 등 (48) 은미나리의 isorhamnetin이유해한산화에대해보호작용을나타낸다고하였으며, 은행잎추출물은플라보노이드배당체를구성분으로하며신경보호작용이있다고한다 (49). 따라서미나리추출물에함유된플라보노이드의영향으로산화적스트레스에대한신경보호작용을나타낸것이라고사료된다. 수동회피테스트수동회피시험은설치류의 working memory aility를측정하는방법으로해마에서조건화된기억과변연계와연관있는기억에관한영향을측정하기위해주로사용된다 (50). 수동회피테스트측정결과는 Fig. 3에나타내었다. Sopolamine(1 mg/kg, i.p.) 의투여에의해기억이손상된 vehile ontrol군은 57.7초로 sopolamine을투여하지않은대조군 244.3초보다통계적으로유의하게감소하였다 (P<0.05). % of ell death a Control DMSO U-OJE N-OJE H-OJE 750 μm H 2 O 2 Fig. 2. Oenanthe javania extrats derease H 2O 2-indued ell death. SH-SY5Y neurolastoma ells were pretreated with 10 µg/ml Oenanthe javania extrat for 4 h efore H 2O 2 treatment (750 μm). After 24 h, WST-1 ativity was determined aording to the manufaturer's instrutions (Rohe). The values represent the mean±sem. Different letters show a signifiant differene at P<0.05 as determined y Dunan's multiple range test.

6 6 원범영 신기영 하현지 위지향 윤여상 김예리 박용진 정경옥 성혜미 이형근 Lateny time (se) a CTL So So+N-OJE So + H-OJE Sopolamine (1 mg/kg, i.p.) Fig. 3. Effet of Oenanthe javania extrats on sopolamineindued memory impairment. In a passive avoidane test, exposure of rats to sopolamine (1 mg/kg, i.p., n=5) indued signifiant memory defiits ompared to the ontrol group (n=5). H-OJE (Hwasun Oenanthe javania extrat) (10 mg/kg, p.o., n=5) and U-OJE (Uiryeong Oenanthe javania extrat) (10 mg/ kg, p.o., n=5) was administrated to rats efore 1 h of the sopolamine treatment. CTL: non-treated. So: sopolamine (intraperitoneal injetion, ip) treated+test-sustane non-treated. So+ N-OJE: sopolamine (intraperitoneal injetion, ip) treated+naju Oenanthe javania extrat. So+H-OJE: sopolamine (intraperitoneal injetion, ip) treated+hwasun Oenanthe javania extrat. Eah value represents the mean±sem. Different letters show a signifiant differene at P<0.05 as determined y Dunan's multiple range test. 대조군과비교하여 sopolamine을처리한모든그룹에서 lateny time이낮게측정되었다. Sopolamine 처리그룹에서나주미나리추출물 130.4초, 화순미나리추출물 102.4초로미나리추출물을투여한그룹이 vehile ontrol군보다높게측정되었으며, 통계적으로유의적차이는없었다 (P> 0.05). 본연구결과대조군과비교하여미나리추출물투여 (10 mg/kg) 에의하여 lateny time이증가되지않은것은미나리추출물투여용량이다소적은용량이었기때문이라사료된다. 이는 Nam과 Lee(51) 의 ICR mouse에곤달비뿌리및잎의메탄올추출물 (250 mg/kg) 과 Oh 등 (52) 의도라지열수추출물 (300 mg/kg) 의투여용량과비교하여적은용량으로향후미나리추출물의농도를높여서기억력개선에대한추가연구진행으로정확히판단할것이필요하다고판단된다. 은행 (Ginko iloa) 잎추출물은수동회피테스트에서학습과기억력기능을개선하였으며 (53), 은행잎추출물에는몇가지활성구성분중플라보노이드배당체 (queretin, kaempferol, isorhamnetin derivatives) 가가장중요한것이라고하고 AD 동물모델에서은행잎추출물이신경보호작용을가지고있다고보고하였다 (46). 이상의결과로보아본실험에서미나리추출물을투여하지않은그룹과미나리추출물투여군은유의적인차이는없었지만플라보노이드는미나리에함유된성분으로써기억력개선에영향을미친다고사료된다. 총폴리페놀과플라보노이드함량미나리추출물의총폴리페놀함량과플라보노이드함량 을측정한결과는 Tale 2에나타내었다. 화순미나리추출물이 117 mg/g으로가장높게나타났으며, 나주미나리추출물이 70 mg/g, 의령미나리추출물이 53 mg/g으로나타났다. 모든미나리추출물은총폴리페놀함량이통계적으로유의적차이가나타났다 (P<0.05). Moon 등 (54) 의보고에따르면약용식물의폴리페놀함량중상황버섯 (Phellinus linteus) 이 17.9 mg/g, 갈근 (Puerariae radix) 이 5.5 mg/g 으로나타났고, Kim 등 (55) 의보고에서는미나리과에속하는사상자 (Torilis frutus) 에탄올추출물이 15.7 mg/g, 당귀 (Angelia gigas Nakai) 에탄올추출물이 14.7 mg/g으로측정되었다고하며, 이와비교하여본실험에서의미나리추출물은폴리페놀함량이상당히높은것으로사료된다. 또한 Jeong 등 (23) 의흑마늘과미나리를이용한음료연구에서미나리첨가량에따라총폴리페놀함량이증가하여미나리에함유된폴리페놀의영향이라고보고하였으며, Lee (56) 는미나리의첨가량이증가할수록혼합음료의총폴리페놀함량이증가한다고하였다. 미나리추출물의총플라보노이드함량을측정한결과는 Tale 2와같다. 화순미나리추출물이 30 mg GAE/g, 나주미나리추출물이 12 mg GAE/ g, 의령미나리추출물이 10 mg GAE/g으로나타났으며, 모든미나리추출물은통계적으로유의적차이가나타났다 (P< 0.05). 돌미나리 70% 에탄올추출물의총페놀함량과총플라보노이드함량은각각 88.9±0.46 mg GAE/g, 28.6± 0.64 mg QE(queretin equivalents)/g으로나타났다 (22). 한편 Huda-Faujan 등 (57) 의연구에서돌미나리메탄올추출물의페놀함량이 7.41 mg TAE(tanni aid equivalents)/ 100 g으로나타났으며, Wan-Irahim 등 (58) 의연구에서돌미나리물추출물의페놀함량이 684±14.7 mg GAE/g으로나타난것과비교하면미나리의품종에따른차이의영향이있는것으로판단되며, 본연구에서미나리추출물의총폴리페놀과플라보노이드함량은높게나타난것으로보인다. Kim 등 (59) 은대부분의식물에서폴리페놀함량이플라보노이드함량보다높다고하며, 폴리페놀함량이플라보노이드함량보다월등히많은시료의경우높은항산화활성을나타내는것으로보아플라보노이드외에 phenoli aids, hydroxyinnami aids 등에속하는다른폴리페놀화합물들이전자공여능에상당히기여한다고보고하였다. Tale 2. Total phenol and flavonoid ontents of the extrats of Oenanthe javania extrat Samples 1) Phenol (mg/g) Flavonoid (mg GAE/g) H-OJE N-OJE U-OJE 117±3 a2) 70±1 53±2 30±1 a 12±1 10±1 1) H-OJE: Hwasun Oenanthe javania extrat, N-OJE: Naju Oenanthe javania extrat, U-OJE: Uiryeong Oenanthe javania extrat. 2) Data are presented as the mean±sd of tripliate experiments. Different letters (a-) show a signifiant differene at P<0.05 as determined y Dunan's multiple range test.

7 미나리의기억력개선효과연구 7 DPPH 라디칼소거능및 ABTS 측정미나리추출물의 DPPH 라디칼소거능과 ABTS 라디칼소거능에대한 SC 50 을측정한결과는 Fig. 4에나타내었다. DPPH 라디칼소거능에대한 SC 50 은대조군으로사용한 asori aid의값이 3.3 µg/ml였으며, 화순미나리추출물이 µg/ml, 나주미나리추출물이 µg/ml로나타났고의령미나리추출물이 µg/ml로나타났다. 이는모든미나리추출물사이에서통계적으로유의차가있었으며 (P<0.05), 화순미나리추출물에서우수한 DPPH 라디칼소거능을나타내었다. Hwang 등 (21) 의연구에서는미나리에탄올추출물에서 1.07 mg/ml, 에틸아세테이트미나리추출물층에서 0.08 mg/ml, 헥산분획물에서 3.31 mg/ml, 클로로포름분획물에서 2.43 mg/ml로보고되었다. 또한미나리지상부메탄올추출물에틸아세테이트분획물에서 mg/ml로보고되었다 (60). 이와같이미나리추출용매분획물에따라측정값은다르게나타났으며, 본실험의미나리추출물군은 Hwang 등 (21) 이보고한미나리에탄올추출물보다는다소높은값을나타냈다. ABTS 라디 칼소거능을측정한결과는 Fig. 5에나타냈으며, 대조군으로사용한 asori aid의값이 5.3 µg/ml로측정되었다. 화순미나리추출물이 48.2 µg/ml, 나주미나리추출물이 78.1 µg/ml, 의령미나리추출물이 98.7 µg/ml로나타났으며, 모든미나리추출물은통계적으로유의차가있었다 (P< 0.05). 이러한결과는 DPPH 라디칼소거능및폴리페놀, 플라보노이드의결과와유사하게나타났다. TBARS 측정지질과산화와관련된산화스트레스는여러신경병성뇌질환을근원으로하는병리생리학적메커니즘에서원인이되어왔으며 (61), 세포손상에잠재적기여인자이다 (62). 미나리추출물의지질과산화억제효과는 Fig. 6에나타내었다. 미나리추출물은 55, 110, 220, 440 µg/ml의농도로처리하였다. 미나리추출물 440 µg/ml에서화순미나리추출물이 50.7% 의억제력으로가장높았으며다른미나리추출물보다통계적으로유의하게높았다 (P<0.05). 나주미나리추출물 31.0% 과의령미나리추출물이 15.9% 로통계적 A DPPH radial savenging (%) µg/ml B SC50 (µg/ml) d a Asori aid U-OJE N-OJE H-OJE Fig. 4. DPPH radial savenging ativity of three Oenanthe javania extrat. (A) DPPH radial savenging ativity of three Oenanthe javania extrats in a dose dependent manner. : asori aid, : Hwasun Oenanthe javania extrat (H-OJE), : Naju Oenanthe javania extrat (N-OJE), : Uiryeong Oenanthe javania extrat (U-OJE). (B) SC 50 value of eah extrat. Data are presented as the mean±sd of tripliate experiments. Different letters show a signifiant differene at P<0.05 as determined y Dunan's multiple range test. A ABTS radial savenging (%) µg/ml B SC50 (µg/ml) a d Asori aid U-OJE N-OJE H-OJE Fig. 5. ABTS radial ation deolorization of three Oenanthe javania extrat. (A) ABTS radial ation deolorization of three Oenanthe javania extrats in a dose dependent manner. : asori aid, : Hwasun Oenanthe javania extrat (H-OJE), : Naju Oenanthe javania extrat (N-OJE), : Uiryeong Oenanthe javania extrat (U-OJE). (B) SC 50 value of eah extrat. Data are presented as the mean±sd of tripliate experiments. Different letters show a signifiant differene at P<0.05 as determined y Dunan's multiple range test.

8 8 원범영 신기영 하현지 위지향 윤여상 김예리 박용진 정경옥 성혜미 이형근 Lipid-peroxidation inhiitory. ativity (%) f Queretin 45 µg/ml a a e a a f µg/ml Fig. 6. Lipid-peroxidation inhiitory ativities of Oenanthe javania extrat. Data are presented as the mean±sd of tripliate experiments. Different letters show a signifiant differene at P<0.05 as determined y Dunan's multiple range test. : Hwasun Oenanthe javania extrat, : Naju Oenanthe javania extrat, : Uiryeong Oenanthe javania extrat. 으로유의적인차이가나타났다 (P<0.05). 이러한결과는총폴리페놀, 플라보노이드, 라디칼소거능의결과에서얻어졌던결과와일치한다. 따라서미나리추출물의총페놀함량과항산화활성의높은연관관계를보여준다. 화순미나리추출물이나주미나리, 의령미나리추출물보다지질산화억제효과가높게나타난것은추출물이함유하는폴리페놀화합물및미나리고유의항산화활성성분에기인된것으로 f d 판단되며, Shin 등 (63) 은 phenol류화합물을높게함유하고있는추출물이지방산화억제효과가높다고보고하였다. Oh와 Lee(64) 는에탄올추출물 1,000 µg/assay 처리시돌미나리가 61.5% 의저해율을보였으며, 시금치 (Spinaia oleraea L.) 43.8%, 부추 (Allium tuerosum Rottler) 31.6%, 쑥갓 (Chrysanthemum oronarium L.) 21.8% 로나타났다. HPLC를이용한미나리추출물의 isorhamnetin 분석표준용액과같이시료전처리방법으로처리한미나리추출물이크로마토그램을비교하여 isorhamnetin 피크가분리되는지확인한결과다른물질과간섭없이성분이분리되었다 (Fig. 7). 표준용액과미나리추출물의머무름시간은 14분대로표준용액의피크유지시간과미나리추출물의피크유지시간이일치하였다. 산가수분해를처리하지않은미나리추출물은동일시간대에피크가나타나지않았다. 또한표준용액과미나리추출물의 UV spetrum 측정결과에서동일한 spetrum을나타내어본시험에서정확한 isorhamnetin의분리를확인할수있었으며, 검량선의상관계수 (R 2 ) 는 이상으로높은유의수준을보여분석에적합함을알수있었다. LC/MS/MS를통해미나리추출물의 isorhamnetin 성분을분석하였다 (Fig. 8). 분석결과표준용액과시험용액에서동일한시간대의 Total Ion Chromato- (a) () A B () Fig. 7. HPLC hromatograms of isorhamnetin standard and Oenanthe javania extrat. (a) A: lank, B: isorhamnetin standard, C: non-hydrolyzed sample, D: hydrolyzed sample. () A: isorhamnetin standard solution, B: Oenanthe javania extrats. The UV spetra were onfirmed at 370 nm (maximum) y a photodiode array detetor. () Caliration urve of isorhamnetin standard solution.

9 미나리의기억력개선효과연구 9 (a) A () A B B Fig. 8. LC-MS/MS hromatograms of isorhamnetin standard and Oenanthe javania extrat. Comparison of hromatogram and total ion hromatogram (TIC) analysis. (a) A: isorhamnetin standard solution, B: Oenanthe javania extrats. Mass spetrum analysis for () A: isorhamnetin standard solution, B: Oenanthe javania extrats. gram(tic) 을확인할수있었고, 질량스펙트럼을확인해본결과 preursor ion은 317 [M-H] + m/z이고, produt ion 302 [M-H] + m/z로확인할수있었다. 위의제시된분석조건으로 HPLC/MS/MS를이용하여분석한결과표준용액과시험용액의 TIC에서동일한시간대에 peak를확인하였고, preursor ion(317 [M-H] + m/z) 및 produt ion (302 [M-H] + m/z) 이유사한값을가지므로표준용액과미나리추출물중의 isorhamnetin이동일성분임을확인할수있었으며, 미나리추출물중 isorhamnetin이 1.8 mg/g 함유되어있음을확인할수있었다. Kim 등 (65) 의기능성원료지표성분으로 Shizandrin의분석법개발보고에서특이성측정에서도표준용액과시료의피크유지시간이일치하였으며, 검량선의상관계수 (R 2 ) 가 으로나타났다. 요약본연구는한국인이일상생활에서주로상용하는미나리에대해기억력관련효과와항산화효과, 미나리추출물의 flavonoid 중 isorhamnetin을분석하여기능성식품개발및이용에기여하고자실시하였다. Aetylholinesterase의활성억제를측정한결과화순미나리추출물이 28.59% 로가장높게나타났으며, 나주미나리추출물 25.11% 와유의적인차이가없었다. SH-SY5Y 세포사멸에미치는영향을측정한결과 DMSO와비교하여화순미나리추출물 % 와나주미나리추출물 36.68% 로세포사멸이유의적으로감소하였다. 수동회피실험결과 sopolamine 처리에의해 기억력이손상된동물모델에서미나리추출물을투여하였을때 vehile ontrol보다 lateny time이높게나타났다. DPPH 및 ABTS 라디칼소거능측정결과화순, 나주, 의령미나리추출물모두미나리처리그룹군간에도유의적차이가있었고 (P<0.05), 화순미나리추출물이총폴리페놀함량 117 mg/g, 총플라보노이드함량 30 mg GAE/g으로가장높게측정되었다. TBARS 측정결과미나리추출물 440 µg/ml의농도에서화순미나리추출물이 50.7% 의억제력으로가장높았으며, 나주와의령미나리추출물보다유의하게높았다. 미나리추출물의플라보노이드중 isorhamnetin 을분석한결과표준용액과미나리추출물의머무름시간이 14분대로피크유지시간이일치하였으며, 동일한 spetrum을나타내어정확한 isorhamnetin의분리를확인하였다. 또한 LC/MS/MS를통한분석결과표준용액과미나리추출물에서동일시간대에 TIC를확인하였고 preursor ion은 317 [M-H]+ m/z, produt ion은 302 [M-H]+ m/z 로확인할수있었다. 이러한연구결과에기초하여미나리추출물은천연항산화제와기억력개선제로써의활용가치를시사한다고사료된다. 또한건강기능성소재로서식품산업분야의이용률향상에도움이될것으로판단된다. 감사의글본논문은농림축산식품기술기획평가원고부가가치식품기술개발사업 ( 과제번호 : ) 의지원으로이루어진것입니다.

10 10 원범영 신기영 하현지 위지향 윤여상 김예리 박용진 정경옥 성혜미 이형근 REFERENCES 1. Franis PT, Palmer AM, Snape M, Wilok GK The holinergi hypothesis of Alzheimer's disease: a review of progress. J Neurol Neurosurg Psyhiatry 66: Kuhl DE, Koeppe RA, Minoshima S, Snyder SE, Fiaro EP, Foster NL, Frey KA, Kilourn MR In vivo mapping of ereral aetylholinesterase ativity in aging and Alzheimer's disease. Neurology 52: Park CH, Kim SH, Choi W, Lee YJ, Kim JS, Kang SS, Suh YH Novel antiholinesterase and antiamnesi ativities of dehydroevodiamine, a onstituent of Evodia rutaearpa. Planta Med 62: Kasa P, Papp H, Kasa P Jr, Torok I Donepezil dosedependently inhiits aetylholinesterase ativity in various areas and in the presynapti holinergi and the postsynapti holinoeptive enzyme-positive strutures in the human and rat rain. Neurosiene 101: Meoi P, MaGarvey U, Kaufman AE, Koontz D, Shoffner JM, Wallae DC, Beal MF Oxidative damage to mitohondrial DNA shows marked age-dependent inreases in human rain. 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11 미나리의기억력개선효과연구 11 HS Change of physiohemial harateristis of Korean pear (Pyrus pyrifolia Nakai) juie with heat treatment onditions. Korean J Food Si Tehnol 38: Kim HY, Woo KS, Hwang IK, Lee YR, Jeong HS Effets of heat treatments on the antioxidant ativities of fruits and vegetales. Korean J Food Si Tehnol 40: Blois MS Antioxidant determinations y the use of a stale free radial. Nature 181: Re R, Pellegrini N, Proteggente A, Pannala A, Yang M, Rie-Evans C Antioxidant ativity applying an improved ABTS radial ation deolorization assay. Free Radi Biol Med 26: Turumtay EA, Islamoglu F, Cavus D, Sahin H, Turumtay H, Vanholme B Correlation etween phenoli ompounds and antioxidant ativity of Anzer tea (Thymus praeox Opiz susp. auasius var. auasius). Ind Crops Prod 52: Nishikimi M Oxidation of asori aid with superoxide anion generated y the xanthine-xanthine oxidase system. 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