생약학회지 Kor. J. Pharmacogn. 45(4) : 326 331 (2014) 미강에틸아세테이트분획물의 C2C12 세포를통한조골세포분화효과 문정선 1 문성희 2 최성숙 1 이숙연 3 임동술 1,3 * 1 삼육대학교약학대학약학과, 2 한국화학연구원신약연구본부, 3 삼육대학교약학대학약식동원연구소 Effects of Osteoblast Differentiation via C2C12 Cell by Rice Bran Ethyl acetate Fraction Jungsun Moon 1, Seung Hee Moon 2, Sungsook Choi 1, Sookyeon Lee 3, and Dongsool Yim 1,3 * 1 College of Pharmacy, SahmYook University, Seoul 139-742, Korea 2 Laboratory of Translational Therapeutics, Pharmacology Research Center, Division of Drug Discovery Research, Korea Research Institute of Chemical Technology, Daejeon 305-600, Korea 3 Korea Re-Creation Institute of Phytochemicals, College of Pharmacy, SahmYook University, Seoul 139-742, Korea Abstracts In this study, we investigated pharmacologic activity of rice bran ethyl acetate fraction (RBE), based on their osteoblast enhancing effects. It has been found that REB have a stimulatory effect on the commitment of bi-potential mesenchymal precursor C2C12 cells into osteoblasts in the presence of BMP-2. Furthermore, RBE enhanced the BMP-2-stimulated induction of ALP, an early phase biomarker of osteoblast differentiation. In addition, Western blot analysis showed RBE enhanced the BMP-2-stimulated phosphorylation of p38, but not those of ERK or JNK. These findings show RBE has the potential to enhance the BMP-2-mediated commitment of C2C12 cells into osteoblasts and their differentiation through p38 activation. Key words Rice bran ethyl acetate fraction (RBE), BMP-2, Osteoblast Differntiation, p38 미강은벼과에속하는벼 (Oryza sativa L.) 를탈곡하여현미에서백미로도정하는과정에서생기는과피 (pericarp), 종피 (seed caot) 및호분층 (aleurone layer) 등과배아 (embryo) 의일부가포함된분쇄혼합물을말하며현미의약 8% 정도를차지한다. 미강의조성은벼의품종, 도정방법등에따라다르나미강에는탄수화물, 조지방, 조단백질, 조회분등이함유된것으로분석되었고지방산의 80% 이상이 oleic acid 와 linoleic acid 등의불포화지방산으로나타났다. 그외에비타민 C 가함유되었고무기질함량에있어서도 Al, Ca, Fe, Mg, 및 Zn 등이검출되어영양적가치가뛰어난소재임이밝혀졌다. 1,2) 이처럼쌀의도정과정에서부산물로생산되는미강은영양소및생리활성성분의보고이며최근많은연구에서미강에대한재고찰이이루어지고있다. 과거미강의이용현황은사료자원, 비료, 유지원료, 미용제품정도였으나식용파우더, 제과및제빵, 음료등에응용되면서기능성소재로써도그이용이확대되고있으며최근에는각종암을비롯한당뇨, 알레르기등질병치료효과들이입증 * 교신저자 (E-mail) : yimds@syu.ac.kr (Tel): +82-2-3399-1604 되고있다. 또한벼의품종별미강에대한연구 3,4) 와미강에특수처리를하여생리활성을유도하는연구들도지속적으로진행되고있다. 5-7) 그동안연구발표된미강의유용성분및기능성성분을보면대표적으로혈중콜레스테롤을저하시키는효과가있는식이섬유에함유된 hemicellulose 를효소처리하여생성되며 5 탄당결합체로서면역증강활성이보고된 arabinoxylan, 8) IP6 의형태로존재하며항암, 항비만, 항당뇨의이용가능성이큰 phytic acid, 9,10) 항산화작용과더불어혈전억제효과, 자외선방어효과, 항균효과가있는 ferulic acid, 11,12) 강한항산화작용이있고항궤양, 항당뇨, 면역조절능, 고지혈증개선, 갱년기장애및자율신경실조증등에효과가있는것으로알려진 γ-oryzanol, 13,14) 미강유에많이포함되어있으며항산화, 항암, 혈압강하효과가있는비타민 E 아류인 tocotrienol, 15) 신경안정효과가있는 γ-amino butyric acid (GABA) 16) 등이있으며그외에도 isovitexin, 17) tricin, 18) octacosanol, 19) phytosterol, 및 squalene 이미강의기능성성분으로연구되고있다. 골의항상성은형성 (bone modeling) 과재형성 (bone remodeling) 과정인 osteoblast 매개의골형성과 osteoclast 매 326
Vol. 45, No. 4, 2014 327 개의골흡수의균형에의해유지된다 20). 하지만골흡수가골형성보다우세하여이러한균형이깨어지게되면골질량이실제적으로감소하게되고, 결과적으로골다공증과같은골격계질환으로이어지게되는것이다. 감소된골질량은골절의위험을증가시키고, 뼈의기형, 통증, 기능적손상, 사망률증가그리고심각한경제적부담을야기하게된다. 평균수명의증가와맞물려고령화가증가될수록발병률이증가되는질환으로따라서골질량감소를막고, 적절하게관리하는것이삶의질을높이는중요한수단이라고할수있다. 이에본연구자들은골다공증의예방할수있는약식동원 ( 藥食同源 ) 의개념에서밀기울 (wheat bran) 과미강 (rice bran) 추출물에착안하여실험을진행하여밀기울의부탄올분획물이파골세포분화의억제효과를보고하였고 21) 본연구에서는조골세포의분화과정에따른신호경로를바탕으로 bipotential mesenchymal 전구세포인 C2C12 cell 이조골세포로분화하는데미치는미강추출물의에틸아세테이트분획물의효과와이것의골형성능을설명하는잠재적기전에대해서얻은결과를보고하고자한다. 재료및방법 실험재료 본실험에사용된미강은경기도포천의식물나라에서공급받아삼육대학교약학대학의임동술교수가감별하여사용하였고실험실에표본을보관중이다. 총시료 8 kg 을 80% EtOH 에 4 시간씩 3 회 water bath 에서중탕으로추출하여감압농축한후 EtOH extract 를 1,787 g 수득하였다. 이중 1,700 g 의 EtOH extract 에적당량의증류수를넣고동량의 n-hexane, EtOAc, 그리고 BuOH 으로순차적으로분획하여얻은각분획물가운데예비실험을한결과가능성을확인한에틸아세테이트분획물을 (RBE) 조골세포분화촉진능측정실험의재료로사용하였다. 검체는농축된 RBE 분획물을 DMSO 용매에녹여 phosphate buffered saline(pbs) 용액을사용하여 1, 3, 10, 30 그리고 100 µg/ml 로실험에사용하였다. 조골세포의분화 C2C12 cell 은 10% 의 FBS 와 100 U/ml 의 penicillin, 100 µg/ml 의 streptomycin 을포함한 DMEM 배지에서배양하였다. 세포를 96-well plate 에서 4 10 3 cells/ well 로분주하여 24 시간 incubation 시킨후, 세포들을분화배지 (5% FBS, 100 ng/ml 의 rhbmp-2 를포함하는 DMEM 배지 ) 로교체하여세포들을분화시켰다. 배지는 3 일마다바꿔주었다. 본실험에서는 6 일간의세포분화후실험에사용하였다. 세포독성검사 C2C12 세포들은 96 well plate 에 4 10 3 cells/well 의농도로분주하였다. 24 시간후, 세포들을단계희석된 RBE 를포함하는 DM 배지에서 6 일동안배양하였다. 세포성장은 Cell Counting Kit-8 (Dojindo Moleculer Technologies, MD) 을사용하여 3번의실험으로평균을내서측정하였다. 흡광도는 Wallac EnVision microplate reader (Perkin Elmer) 를사용하여 450 nm에서측정하였다. ALP 활성측정 성숙한조골세포를시각화하여확인하고자조골세포분화의 biomarker 로서 ALP를이용하였다. C2C12 세포들은 96-well plate에 4 10 3 cells/well의농도로분주한후 24시간동안 incubation시켰다. 그후배지를 5% FBS와 100 ng/ml rhbmp-2를포함하는 DMEM배지로바꿔주었다. 배지는 3일마다교체하였다. 6일이지난후, 세포들을 PBS을사용하여 2번세척후, 3.7% 의 formaldehyde로 30초동안세포를고정시켰다. 그리고탈이온수로씻어내린후직사광선을피해 ALP kit (Sigma, LA, USA) 을사용하여염색하였다. UMAX Power Look 1100 (UMAX, Taiwan) 으로염색된이미지를스캔하고, DP70 digital camera (Olympus Optical, Japan) 으로캡쳐하였다. 이미지는 DP controller가장착된현미경으로현상하였다. Western Blot 분석 C2C12 세포를 RIPA buffer용액 [50 mm Tris-HCl (ph 7.5), 150 mm NaCl, 1% Tween-20, 0.2% NP-40, 1 mm PMSF (phenylmethylsulfonyl fluoride), 100 mm NaF, 1 mm Na 3 VO 4, 1 protease inhibitor cocktail tablet (Roche, Germany)] 을사용하여세포를용해하였다. 4 o C, 10,000 g에서 15분간원심분리하여상등액을단백질분획으로사용하였다. 단백질은 BCA-protein assay kit (Pierce, IL, USA) 를사용하여정량하고 30 µg의단백질을 5 SDS sample buffer와함께 5분간끓이고 SDSpolyacrylamide gel을이용하여전기영동한후, polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane (Millipore, CA, USA) 으로 transfer하였다. 전이시킨 membrane을 5% 탈지분유로 blocking하고희석된 (1:1000) 1차항체를처리하였다. 사용된항체는 p38 (Santa Cruz, CA, USA), p-p38 (Cell Signaling, MA, USA), ERK1/2 (Cell Signaling), p-erk1/2 (Cell Signaling), p-jnk (Santa Cruz), JNK (Santa Cruz) 이며 4 o C에서 overnight하여반응시켰다. 2차항체로는 horseradish peroxidase가결합된항체 (Santa Cruz) 를희석 (1:2000) 처리하여상온에서 1시간반응시켰다. 그후 SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce) 를처리하여막을전개시킨후 LAS-3000 luminescent image analyzer (Fuji Photo Film Co., Ltd., Japan) 에서측정하였다. 상대적인단백질발현량은 chemiluminescence (ECL, kit, Amersham, UK) 분석기를이용하여분석하였다. 통계분석 각각의실험은 3회이상의반복수행하였으며평균 (M) ± 표준편차 (SD) 로표시하였다. 결 세포독성효과 예비실험결과조골세포분화촉진능의 과
328 Kor. J. Pharmacogn. 가능성이확인된미강의 EtOAc fraction 인 RBE 의세포독성을평가하기위하여 C2C12 를이용하여 CCK-8 assay 를한결과전농도에서 92% 이상의세포가생존한것으로보아실험에사용한최고농도인 100 µg/ml 농도까지는세포독성이없는것으로확인하였다 (Fig. 1). ALP 활성 ALP 는거의모든조직에존재하며특히골조직에존재하는 ALP 는골성장이활발히일어날때그활성이증가한다. RBE 가 MSCs (C2C12 cells) 이 preosteoblast 로분화하는데미치는효과는 ALP staining 과조골세포분화에연관된유전자의발현수준을측정하는것을통해확인하였다. RBE 는실험에사용한 1~100 µg/ml 농도범위에서유의성있게 BMP-2 로인해자극된 ALP 유도를증가시켰다 (Fig. 2). ALP 유도증가에대한 p38 신호전달경로의관련성 최근보고된연구결과에따르면 PI3K 의하위신호전달분자인 Akt 와 MAPK 의신호전달경로가 BMP-2 유전자발현의활성화에중요한역할을한다 22) 는것을보여주고있다. 따라서 RBE 에의한 ALP 유도증가의신호전달경로를확인하기위해 ALP 유도증가를억제하는물질을처리하고 RBE 의효 Fig. 1. Cytotoxicity of RBE in C2C12 cells. C2C12 Cells (4 10 3 cells/well) were cultured in a 96-well plate for 1 day and then the medium was replaced with DMEM containing 5% FBS and rhbmp-2 (100 ng/ml) in the presence or absence of RBE (differentiation day 0). Medium was changed every 3 days. Cell viability assay was then performed on the differentiation day 6. Fig. 2. Effect of RBE on the enhancement of ALP activity in BMP-2-stimulated C2C12 cells. RBE enhanced BMP-2- induced osteoblast differentiation in C2C12 cells. Effect of RBE on BMP-2-stimulated ALP induction. On the differentiation day 6, ALP staining and its activity assay were performed as described in Materials and methods. 과를 ALP 활성측정을통하여확인하였다. RBE 에의한 ALP 유도증가효과는 p38 inhibitor 에의해강하게억제되는것으로나타났다. 하지만 PI3K 나 MEK 에대한 inhibitor 는억제효과를보이지않았다 (Fig. 3). RBE 에의한 ALP 유도증가에대한 MAPK 의신호전달경로의관련성은 western blot 을통해확인하였다. rhbmp-2 처리는 RBE 농도의존적으로 p-38 의인산화수준을증가시켰지만 JNK 나 ERK 에대해서는그렇지못했다 (Fig. 4). 이는 p38 이 BMP 의하위신호전달에관련된분자임을보여주는결과이다. 고 골은세포군과그주변의골기질로이루어져있으며골조직을이루는세포중의하나인조골세포는골조직의골기질을합성, 분비하고, 기질에 Ca, Mg이온등의무기염을침착시킴으로써골조직을석회화시키는능력을갖고있는세포이다. 조골세포의형성과정은중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell) 에서유래하며초기에전조골세포 (preosteoblast) 로분화하여뼈의무기화에필수적인조골세포 (osteblast) 로성숙된후석회화기의과정을거쳐골을형성한다. 23) 활발한대사작용으로석회화과정에중요한역할을하는조골세포는골표면에근접해있으며세포질내에과립형질내세망이발달해있고, 핵주위로골지체가위치하며, 골지체바깥세포질에사립체가존재한다 24). 또한세포막에당단백효소인 alkaline phophatase (ALP) 를갖고있어서, 이효소는조골세포의분화초기에나타나는표지인자로써기질성숙기에나타나기시작하여기질성숙기후반에최대로발현되고석회화단계에서는감소한다 25). 조골세포의활성은 protein kinase C (PKC), protein kinase A (PKA), mitogenactivated protein kinase (MAPK) 의활성과 camp response element-binding (CREB) 를활성화시키며이는 RANKL의발현을촉진하며, c-fos promoter을작동시킨다. 이들의증가는조골세포분화의초기와후기단계에나타나는표지인자인 ALP 및 osteocalcin의합성을증가시키며, 골기질의형성을유도하는 bone morphogenetic protein (BMP) 류인 BMP-2, BMP-4, BMP-7등을발현시킨다. 26) 특히 BMP-2를 C2C12 세포에가하면근육세포로의분화는억제되고조골세포로분화됨이보고되었다 22). 또한최근연구들은 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) 의하위신호전달분자인 Akt와 MAPK의신호전달경로가 BMP-2 유전자발현의활성화에중요한역할을한다는것을보여주고있다. 27) 미강의조골세포의분화억제에대한실험은 bi-potential mesenchymal 전구세포인 C2C12 cell을사용하여조골세포초기분화를유도하는인자인 BMP-2를이용하여조골세포세포막에존재하는 ALP의발현을확인하고그기전에대하여확인하였다. 실험의재료는예비실험을통하여미강의 찰
Vol. 45, No. 4, 2014 329 Fig. 3. Effect of RBE on MAPKs inhibitor in BMP-2-stimulated C2C12 cells. Involvement of p38 in the RBE-induced enhance3 ment of BMP-2-stimulated ALP induction. Cells (4 10 cells/well) in a 96-well plate were treated with each inhibitor for 2 h and then BMP-2 and/or RBE were added into cells. After 3 days, cells were treated with each inhibitor for 2 h and then BMP-2 and/or RBE were added into cells. On the differentiation day 6, ALP staining and its activity assay. EtOAc 분획층인 RBE를 실험의 재료로 사용하였다. 실험결 과 RBE는 사용된 전 농도에서 세포독성 없이 BMP-2로 자 극된 ALP의 유도를 증가시킴으로 조골세포의 분화를 농도 의존적으로 촉진시킴을 확인하였다(Fig. 2). 또한 p38이 BMP 의 하위 신호전달에 관련된 분자임도 확인하였다(Fig. 3, 4). 이는 골 형성능이 있는 BMP-2와 BMP-7과 같은 BMPs가 최근에 척추고정술, 골절치료, 치아조직공학 등에 임상사용 27) 을 승인받은 것을 고려할 때, BMP 발현과 이것의 신호전 달을 촉진하는 동화작용제제가 골형성 혹은 골재생을 통해 조골세포관련 질환의 치료제로서 사용될 수 있을 것이다. 이러한 관점에서 BMP 유전자발현을 유도하는 신호전달을 활성화시킴으로 mesenchymal 전구세포의 골세포로의 분화 를 촉진시키는 RBE는 골재생에 도움을 주는 소재임이 밝 혀졌다. 따라서 미강은 파골세포의 골흡수를 억제하고 조골 세포의 골 형성을 촉진하는 작용을 통하여 골다공증을 예 방하고 치료하는데 유용한 치료제의 역할을 할 것으로 기 대된다. Fig. 4. Effect of RBE on MAPKs activity in BMP-2-stimulated C2C12 cells. The effects of RBE on the activation of MAPK was evaluated by Western blot analysis. Cells (4 103 cells/well) were cultured in a 96-well plate for 1 day and then cells were incubated with DMEM containing 5% FBS in the presence or absence of BMP-2 and/or RBE for 15 min. 결 론 미강추출물의 에틸아세테이트 분획물의 조골세포 분화촉 진 작용은 RBE가 BMP-2자극으로 인한 ALP발현을 증가시 켰고 이는 p38의 활성화와 함께 상승적인 상호작용을 통해 C2C12 cell의 조골세포로의 분화를 촉진시킴을 확인할 수
330 Kor. J. Pharmacogn. 있었다. 따라서 RBE 분획물이골다공질환의치료또는예방의목적으로사용될수있음을입증하였다. 이는또한기존의파골세포를억제하여골다공증을예방또는치료할수있는것과는다른기전으로작용함을확인하였고추후미강에틸아세테이트분획물에서유효지표성분을분리하여조골세포분화에미치는영향을분석하는연구를계속할예정이다. 인용문헌 1. Choi, H. I., Lee, B. K. and Kim, S. J. (2010) Study on the nutritional componetts of non-fermented rice bran and fermented rice bran. Korea J. Food & Nutr. 23: 1-7. 2. Rukmini, C. and Raghuram, T. C. (1991) Nutritional and biochemical aspects of the hypolipidemic action of rice bran oil: a review. J. Am. Coll. Nutr. 10: 593-601. 3. Choi, S. P., Kang, M. Y., Koh, H. J., Nam, S. H. and Friedman, M. (2007) Antiallergic activities of pigmented rice bran extracts in cell assays. J. Food Sci. 72: S719-S726. 4. Muntana, N. and Prasong, S. (2010) Study on total phenolic contents and their antioxidant activities of Thai white, red and black rice bran extracts. Pak. J. Biol. Sci. 13: 170-174. 5. Qureshi A. A., Sami, S. A. and Khan, F. A. 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