1) Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 3, June 218, 342-349 https://doi.org/1.14478/ace.218.117 Article 박소현 신혁수 김아랑 정효진 현송화 홍인기 이대봉 * 박수남 서울과학기술대학교정밀화학과화장품종합기술연구소, 코스메틱융 복합산업지원센터, *( 주 ) 이바이오코리아 (218 년 2 월 19 일접수, 218 년 3 월 19 일심사, 218 년 4 월 3 일채택 ) Composition Ratio Analysis of Transesterification Products of Olive Oil by Using Thin Layer Chromatography and Their Applicability to Cosmetics So Hyun Park, Hyuk Soo Shin, A Rang Kim, Hyo Jin Jeong, Song Hua Xuan, In Kee Hong, Dae Bong Lee*, and Soo Nam Park Department of Fine Chemistry, Cosmetic R&D Center, Seoul National University of Science and Technology, 232 Gongneung-ro, Nowon-gu, Seoul 1811, Korea *ebio Korea, 55 Yeongsin-ro, Pyeongtaek-si, Gyeonggi-do 1784, Korea (Received February 19, 218; Revised March 19, 218; Accepted April 3, 218) 초록본연구에서는올리브오일의에스터교환반응으로생성된복합소재 (olive oil esters) 의화장품응용을위해물리화학적성질, 유화력, 보습력및세포독성을평가하였다. 실험에는반응시간이짧은 olive oil esters S와반응시간이긴 olive oil esters L을사용하였다. 먼저 TLC 이미지분석으로조성비를확인한결과, olive oil esters S의조성은 mono-, di-, tri-glyceride가 5.2, 24.1, 46.4% 이었고, fatty acid ethyl ester는 21.9% 이었다. Olive oil esters L은 mono-, di-, tri-glyceride가 4.1, 24.7, 4.6% 이었고, fatty acid ethyl ester는 28.8% 이었다. 올리브오일에스터를화장품에사용하기위한기준및시험방법설정을위해요오드가, 산가, 검화가, 불검화물, 굴절률, 비중및순도시험을수행하였고표준화시켰다. 또한올리브오일에스터의유화력평가로서, 계면활성제없이 O/W 에멀전을제조하여유화입자를확인하였다. 올리브오일에스터를사람피부에도포 5일후, 피부수분보유량은초기보다 13.1% 개선되었다. 피부세포에대한독성을평가한결과, 올리브오일에스터는.2-2 µg/ml에서세포생존율 9% 이상을나타내안전성이확인되었다. 결과적으로올리브오일에스터는화장품산업에서천연 / 무독성원료로서응용가능성이있음을시사하였다. Abstract In this study, the physicochemical properties, emulsifying capacity, moisture content and cytotoxicity of the composite material produced by transesterification reactions of the olive oil (olive oil esters) were investigated for cosmetic applications. Olive oil esters with short (S) and long (L) reaction times were studied. From the TLC-image analysis, composition ratios of the olive oil esters S were found to be 5.2, 24.1, 46.4, and 21.9% for mono-, di-, tri-glyceride, and fatty acid ethyl ester, respectively. Those of the olive oil esters L were 4.1, 24.7, 4.6, and 28.8% for mono-, di-, tri-glyceride, and fatty acid ethyl ester, respectively. The iodine value, acid value, saponification value, unsaponified matter, refractive index, and specific gravity were determined and purity tests were also carried out and normalized to establish standards and testing methods for using olive oil esters in cosmetics. To evaluate their emulsifying capacities, the O/W emulsion was prepared without surfactants and the formation of the emulsified particles were confirmed. After 5 days of applying the olive oil esters to human skin, the skin moisture retention was improved by 13.1% from the initial state. For the evaluation of toxicity on human skin cells, the olive oil esters showed 9% or more of the cell viability at.2-2 µg/ml. These results suggested that olive oil esters can be applied as natural/non-toxic ingredients to cosmetics industries. Keywords: transesterification, olive oil, secondary surfactant, TLC image analysis Corresponding Author: Seoul National University of Science and Technology, Department of Fine Chemistry, Cosmetic R&D Center, 232 Gongneung-ro, Nowon-gu, Seoul 1811, Korea Tel: +82-2-97-6451 e-mail: snpark@seoultech.ac.kr pissn: 1225-112 eissn: 2288-455 @ 218 The Korean Society of Industrial and Engineering Chemistry. All rights reserved. 1. 서론 화장품은제품생산시에너지소비가적고, 오염물질배출이거의없는친환경녹색산업이라는특징이있다. 하지만최근화장품에의한부작용사례가잇따르고, 안전성에대한논란이이슈화되면서천 342
343 Figure 1. General transesterification reaction. 연유래원료의개발에대한관심이커지고있다. 또한소비자들은합성한화장품원료보다는천연원료가처방된화장품을선호하는자연지향적인경향을나타내고있다. 이와함께저자극성이고, 독성이없는천연원료개발과이를이용한화장품개발에대한관심이모아지고있다. 일반적으로사용되는화장품원료중베이스오일과계면활성제, 컨디셔닝제등은주로석유계오일로부터화학적합성으로제조되는경우가많다. 그러나석유계오일은생분해성이떨어져환경에대해유해가능성이있고, 제조과정중사용되는화학적촉매또는용매와같은유해성분들의잔류가능성이있어피부자극성등문제발생의여지가있다. 따라서이들원료를대체할수있는저자극성, 무독성및생분해성의친환경화장품원료개발이지속적으로요구되고있다. 이러한문제점을해결하기위하여천연식물성오일을이용해효소적공법을통한친환경적이고피부에안전한천연오일에스터를개발하여화장품에응용하려는연구들이시도되고있다 [1,2]. 최근코코넛오일로부터폴리글리세롤과에스터교환반응으로제조한계면활성제가사용되고있다. 폴리글리세롤과에스터교환반응으로만든코코넛오일에스터 (INCI : coconut oil polyglycerol-6 esters) 는물에비교적잘분산되는계면활성제의성질을나타낸다. 이들오일에스터는자극이거의없고민감한피부에도사용할수있는계면활성제대체용으로사용될수있다 [3]. 식물성오일은주로 3개의지방산과 1개의글리세롤로이루어진 triglyceride 형태의구조를갖는다. 이들지방산은식물성오일의종류에따라탄소사슬길이, 이중결합의위치와수등이다르다. 대부분의식물성오일은이중결합을가진불포화지방산이다량함유되어있다. 화장품원료로사용되는오일로는올리브오일, 마카다미아넛오일, 호호바오일및동백오일등이있다. 식물성오일의에스터교환반응 (transesterification) 은석유디젤을대체할수있는친환경원료 바이오디젤 의제조방법으로도이용되고있다 [4,5]. 제조방법은 Figure 1에나타낸바와같이식물성오일을효소존재하에알코올 ( 예 : methanol 및 ethanol) 을이용하여교환반응시키는것이다. 이렇게제조된생성물에는최종적으로지방산에틸에스터와글리세롤그리고반응과정에서중간체인 diglyceride와 monoglyceride가생성되고, 미반응산물인 triglyceride가공존할수있다. Diglyceride와 monoglyceride는현재다양한분야에서계면활성제로이용되고있으며 [6], 특히 diglyceride는하나의글리세롤에두개의지방산이결합되어있는구조로화장품에서유화제, 에몰리언트제, 컨디셔닝제등범용적으로사용되고있다. 이는제조된오일에스터가유화력뿐만아니라우수한에몰리언트효과및보습효과를갖는베이스오일로활용될수있음을말해준다. 에스터교환반응에서효소, 온도및반응시간등을조절하여 mono-, di-, tri-glyceride 및지방산에스터가적절히공존하는복합소재를만들면, 이오일에스터복합소재로석유계오일과계면활성제 (polyethyleneglycol; PEG 등 ) 를대체하여보다안전하고친환경적인화장품을제조할수있을것이다. 본연구에서는인체에무해한에탄올과올리브오일을에스터교환반응시킴으로써무독성의친환경화장품원료를제조하였다. 제조된올리브오일에스터의 mono-, di-, tri-glyceride 및 fatty acid ethyl ester 비율은얇은막크로마토그래피 (TLC) 를통한이미지기법을개발하여확인하였다. 또한올리브오일에스터를화장품에응용하기위해서오일에스터의물리화학적성질 ( 요오드가, 산가, 검화가, 불검화물, 굴절률, 비중및순도 ), 유화력, 피부수분보유량및세포독성을평가하고, 화장품소재로서응용가능성을조사하고자하였다. 2. 실험 2.1. 시약및기기 Transesterified olive oil ( 9%) 은 ( 주 ) 이바이오코리아로부터공급받았으며, 반응시간을조절하여 2가지로제조하였다. 반응시간이 2 h인것은 olive oil esters S라하고반응시간이 6 h인것은 olive oil esters L로표시하였다. 상세한제조방법은회사대외비로공개하지않았다. TLC를이용한조성비분석에서사용된 TLC plate는 silica gel 6 F 254 (25 aluminium sheets, 2 2 cm) 를사용하였고, 검량선작성을위한표준물질은 1-oleoyl-rac-glycerol (M7765, Sigma-Aldrich), dioleoylglycerol (D8894, Sigma-Aldrich), glyceryl trioleate (T714, Sigma-Aldrich), ethyl oleate (55441, Sigma-Aldrich) 그리고 oleic acid (3128-1, Kanto) 를사용하였다. 요오드가, 산가, 검화가, 불검화물측정에는 iodine monochloride ( 9%, Wako, Japan), potassium iodide ( 99.5%, Daejung, Korea), sodium thiosulfate ( 98.5%, Samchun, Korea), potassium dichromate ( 99.5%, Daejung, Korea), potassium hydroxide ( 8%, Junsei, Japan) 를사용하였다. 적정을위한페놀프탈레인시약은 Sigma-Aldrich (Korea) 를통해구입하였으며, 아세트산, 에틸아세테이트, n-헥산, 에틸에테르, 클로로포름등각종용매는시판특급시약을사용하였다. 에멀전제조에사용된 cetearyl alcohol (Seppic, France), PEG-1 stearate (Seppic, France), glyceryl monostearate (M.S.I, Switzerland), polyglyceryl-3 methylglucose distearate (Doosan, Korea), sorbitan sesquioleate (Lonza, Switzerland), squalane (Lipoid GmbH, Switzerland), macadamia nut oil (Oleon, Belgium), dimethicone (Kokyu alcohol, Japan), vitamin E-acetate (P&G, USA), glycerin, methylpropanediol, carbopol 94, triethylamine은한국콜마 ( 주 ) 에서공급받아사용하였다. 에멀전제조에는유화장치로서 T.K. Homomixer Mark II Model 2.5 (Primix, Japan) 를사용하였다. 2.2. TLC를이용한조성비분석 Silica TLC plate는아래에서 2 cm 위에서 1 cm 간격을두고시료를 2. µl씩 loading하였다. TLC 분석시사용한전개용매는 hexane : Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 3, 218
344 박소현 신혁수 김아랑 정효진 현송화 홍인기 이대봉 박수남 Table 1. The Experimental Formulation for O/W Emulsion Ingredient #1 #2 #3 A phase Cetearyl alcohol Glyceryl monostearate PEG-1 stearate Polyglyceryl-3 methylglucose distearate Sorbitan sesquioleate Squalane Macadamia nut oil Olive oil or Olive oil esters (S, L) Dimethicone Vitamin E-acetate 2. 5.8 1.3 2. 7. 2. 8.8 B phase Deionized water Glycerin Methylpropanediol Carbopol 94 (1%) 55.9 4. 1 55.9 4. 1 55.9 4. 1 C phase Triethylamine (1%) 1,2-Hexandiol.3.3.3 Figure 2. Flowcharts of TLC image analysis using Image J. ethyl ether : acetic acid = 8 : 2 : 2 (v/v/v) 을사용하였으며 [7], 전개후 TLC plate에 staining solution (1 ml H 2 SO 4 in 85 ml H 2 O, and add 5 ml MeOH) 이스며들게한뒤 1 oven에서 3 min 동안탄화시켜서띠를확인하였다. 성분확인은시료와표준물질을같이전개시켜띠의 R f value를비교하여분석하였다. 확인된성분들의조성비를분석하기위하여 TLC plate 상의띠이미지를스캔한후, Image J를이용하여피크로변환하고그면적을계산하였다 (Figure 2). 2.3. 물리화학적성질올리브오일에스터의요오드가, 산가, 검화가및불검화물측정은화장품원료기준집 (2) 에준하여실시하였다. 굴절률은굴절계 (ATR-W2 Plus, Schmidt-Haensch, Germany) 의렌즈위에시료를떨어뜨린후, 외부의빛을차단하여백색광조사후측정하였다. 표준물질로사용된물의굴절률은 25 에서 1.33으로고정하였다. 비중은대기압하에서진동튜브밀도계 (DA-55, KEM, Japan) 를이용하여측정하였다. 중금속순도시험으로서납및비소함량의측정은화장품안전기준등에관한규정 (217) 내유도결합플라즈마-질량분석기법을이용하였다. 유도결합플라즈마-질량분석기 (icap-q, ThermoFisher, Germany) 는 power 1 W, 압력 3 psi, 온도를 2 로하여, 작동시간 2 min, 정지시간 2 min으로측정하였다. 2.4. 유화력시험 2.4.1. O/W 에멀전제조올리브오일에스터를 O/W 에멀전의기본처방에넣어제조하였다 (Table 1). 제조방법은다음과같다. A상과 B상을 7 에서각각용해시킨후, homomixer를이용하여다음과같이유화를진행하였다. 분산된 B상에 A상을투입후 7, 4, rpm에서 3 min 동안유화 교반을하고, C상을투입후 7, 4, rpm에서 2 min 동안추가로교반하였다. 만들어진샘플은천천히저어주면서 3 로냉각하였다. 총 3가지처방으로제조하여유화력을평가하였으며, 그 3가지는계면활성제가모두포함된처방 ( 대조군 ), 주계면활성제를제외한처방, 그리고모든계면활성제를제외한처방이다. 2.4.2. 광학현미경관찰올리브오일에스터의유화력을파악하기위하여광학현미경관찰을실시하였다. 제조된 O/W 에멀전을광학현미경 (HVC-3 PS, Hyvision, Korea) 을이용하여 4배율로관찰하였다. 관찰시소량의샘플을슬라이드글라스위에취한다음, 커버글라스를그위에올려놓고일정한힘을부여하여샘플의일정한도포를유지하였다. 2.5. 피부수분보유량각질층에대한보습력을평가하기위해, 인위적으로자극을준피부에올리브오일에스터를처리했을때의수분량을 Corneometer CM 82 (Courage & Khazaka, Germany) 으로측정하였다. 건강한정상피부의피험자들은보습력을측정하기전 2 min 동안항온항습실 (21 ± 1, 습도 5 ± 5%) 에머물게하였다. 첫번째측정은 sodium lauryl ether sulfate (SLES) 로피부자극을유발시키기전에수행하였다. 그후 8% SLES을피부에처리하여피부를자극 건조시켰다. SLES 을이용한피부자극은각피험자들의팔뚝안쪽의해당특정부위에 8% SLES 용액 2 ml를적신거즈를덮어놓고저자극성랩으로고정하였다. 6 h 후에거즈를제거하고난후 2 h에피부의수분보유량을측정하였다. 그후피험자들은자극을받은팔뚝의특정부위에샘플을매일아침저녁으로 5일동안바르도록하였다. 샘플처리후 2일및 5일째, 피부의수분보유량을다시측정하였다. 측정된 capacitance 공업화학, 제 29 권제 3 호, 218
345 지고있는데이효소는노란색의수용성기질인 MTT를진청색의비수용성 formazan으로변환시킨다. 따라서생성된 formazan의양을측정하면살아있는세포수를알수있다. 무혈청배지에올리브오일에스터를다양한농도별로희석하여 24 h 동안처리하였다. 배양후, 배지를모두제거하고 mg/ml MTT용액을각 well에첨가하고 12 h 동안 37 에반응시켰다. 생성된 formazan을 dimethyl sulfoxide (DMSO) 로녹이고 ELISA reader (Tecan, Austria) 를이용하여 57 nm 에서흡광도를측정하였다. 3. 결과및고찰 (a) 3.1. TLC를이용한조성비분석개발된올리브오일에스터를화장품에적용하기위해서는이들반응조건에따른소재내정확한조성비를알아야한다. 올리브오일에스터내에존재하는 mono-, di-, trigyceride 및 fatty acid ethyl ester 의조성비를분석하는데에는어려움이많다. 최근에오일및그유도체의분석에 gas chromatography (GC), high performance liquid chromatography (HPLC) 및 TLC를이용하는방법들이시도되고있다 [8-1]. 그중본연구에서는빠르고간편하며경제적인 TLC 이미지분석법을이용하고자하였다. 최근분석기술이발달함에따라 TLC 분석방법역시더정교해지면서정성적및정량적인데이터를모두제공할수있는잠재력이재평가되고있다 [11]. 또한 Image Decipher- TLC, Sorbfil TLC Video densitometer 그리고 Just TLC 등의기기와 software를사용함으로써정량적분석의어려운단점들을보완해줄수있게되었다 [12]. value 는 ~12 사이의 arbitrary capacitance unit (A.U.) 로전환하였다. 2.6. 세포독성평가 2.6.1. 세포배양 사람각질형성세포주인 HaCaT 세포는 Dr. Fusenig (German Cancer Research Center, DKFZ) 로부터분양받아사용하였다. 세포배양에사용된배지 (Dulbecco s modified Eagle s medium, DMEM, Capricorn, Germany) 는 1% fetal bovine serum (FBS, PAA, Austria), 1% penicillin/streptomycin, (P/S, PAA, Austria) 을혼합하여사용하였고, 37, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 2.6.2. 올리브오일에스터의처리에따른세포독성평가 (b) Figure 3. Preparation of calibration curve for standard using TLC analysis, in which (a) and (b) are TLC image analysis using Image J and calibration curve for standard, respectively. Hexane : ethyl ether : acetic acid (8 : 2 : 2, v/v/v) was used as the mobile phase. 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-di-phenyl-tetrazolium bromide (MTT, Sigma, USA) assay를이용하여올리브오일에스터의세포독성을평가하였다. 살아있는세포의미토콘드리아는 dehydrogenase 효소를가 3.1.1. 표준물질의검량선작성오일에스터내에존재하는성분들의표준물질을가지고 TLC를수행하여검량선을작성하였다. 그결과 Figure 3(a) 와같이명확한 TLC 결과를얻을수있었으며, 이때표준물질각각의농도범위는 monoolein ~6., diolein 1.~4., oleic acid ~2., triolein 2.~8., ethyl oleate 1.~4. mg/ml이었다. Figure 3(a) 의 TLC 이미지를이미지분석프로그램을이용하여피크로전환한후, Microsoft Office Excel 27 (Microsoft, USA) 을사용하여그면적을농도에대해 plotting하였다. 이와같은결과를바탕으로표준물질농도를 X축으로하고 TLC 이미지에서얻은피크면적을 Y축으로하여 Figure 3(b) 의검량선을얻을수있었다. 이때직선성 (R 2 ) 은모두.95 이상으로양호한상관관계를나타내었다. 3.1.2. 오일에스터에포함된성분들의조성비위의검량선작성결과를바탕으로오일에스터에포함된성분들각각의함량을측정하였다 (Figure 4). 올리브오일에스터내각각의성분들이표준물질의직선성을나타내는검량선범위안에들어올수있도록 2가지의농도 (1, 45 mg/ml) 로제조하여점적하였다. 각각의성분함량을조사한결과, olive oil esters S의 mono-, di-, tri-glyceride 는각각 5.2, 24.1, 46.4% 이었고, fatty acid ethyl ester는 21.9% 이었다. Olive oil esters L의 mono-, di-, tri-glyceride는각각 4.1, 24.7, 4.6% 이었고, fatty acid ethyl ester는 28.8% 이었다. 이와같이반응시간이증가한 olive oil esters L의 fatty acid ethyl ester 양은 6.9% 증가하였고 triglyceride 양은 5.8% 감소하였다. 따라서에스터교환반응시간이증가함에따라 triglyceride의전환률이더커졌음을알수있다. 한편, 표준오차는 peak 면적을설정하는방법및 background noise가나 Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 3, 218
346 박소현 신혁수 김아랑 정효진 현송화 홍인기 이대봉 박수남 Table 2. Iodine Value, Acid Value, Saponification Value, Unsaponified Matter, Refractive Index, Specific Gravity and Purity Test for Olive Oil, Olive Oil Esters S and L Olive oil Olive oil esters S Olive oil esters L Iodine value (g/1 g oil) 81.4 ± 1.26 83.77 ±.69 83.78 ± 2 Acid value (mg/g).63 ±.2.77 ±.1.81 ±.1 Saponification Value (mg/g) 21.5 ± 3.85 26.28 ± 1.63 27.28 ± 4.38 Unsaponified Matter ±.3.84 ±.5.96 ±.9 Refractive index 1.467 1.466 1.465 Specific gravity ( ).897 ±.3.9 ±.4.91 ±.4 Pb (ppm) -.47 ±.1.34 ±.1 As (ppm) -.46 ±.2.48 ±.2 Values are presented as mean ± SD (n = 3). 타나는정도등의차이에의한것으로생각해볼수있다. 3.2. 물리화학적성질오일에스터복합소재를화장품원료로서이용하려면새로운원료에대한조성비뿐만아니라화장품원료로서사용이적합한지를판단하기위한기준및시험방법을표준화시키는작업이필요하다. 우리나라에서화장품및원료회사들은품질관리를위해화장품원료별기준및시험방법에따라롯트별로시험검사하여합격품에대해서만출하가가능하도록관리하고있다. 본실험에서는 화장품원료기준집 (2) 에화장품에상용되고있는원료들과이들의시성치가기재된항목들을참고하여, 시험항목및기준설정을위해올리브오일에스터에적합한기준및시험방법을제시하고실험하여화장품에사용할수있는기준을마련하였다. 요오드가의측정은불포화도에대한척도로서이용되고있으며, 일반적으로화장품원료로사용되는올리브오일의경우 79~88이다. 실험대조군으로는올리브오일을사용하였고, 올리브오일에스터의요오드가를측정한결과를 Table 2에나타내었다. Olive oil esters S, L 및올리브오일의요오드가는 83.77, 83.78 및 81.4로유사하게나타났으며, 에스터교환반응이불포화도에는영향을미치지않는것으로확인되었다. 따라서지방산잔기에는화학적변화가없음을알수있다. 또한에스터교환반응시간이다른 olive oil esters S 및 L도요오드가차이가보이지않았는데, 이또한같은이유라고볼수있다. 산가는유리지방산에대한척도로이용된다. 화장품원료기준집 (2) 에서올리브오일의산가기준은 1. 이하로명시되어있다. Table 2에올리브오일에스터의산가를측정한결과를나타내었다. Olive oil esters S가올리브오일에비해 18.2% 높은산가를나타내었다. 또한 olive oil esters L이 olive oil esters S에비해 4.9% 높은산가를나타내었다. 이는에스터교환반응을오래시킬수록오일성분 (triglyceride 등 ) 에서지방산이분해되어지방산잔류량이증가하기때문으로여겨진다. 그러나모든시료의산가는화장품원료기준집에명시되어있는일반적인수치인 1. 이하로측정되어화장품소재로사용하기에적합한것으로확인되었다. 검화가는유지중의비누로변할수있는물질의양및그유지를구성하고있는지방산의분자량의대 소를표시해주는기준이된다. 올리브오일, olive oil esters S 및 L의검화가는각각 21.5, 26.28 및 27.28로유사하게나타났다. 에스터교환반응에의해지방산분자량이변화하는것은아니므로검화가가큰차이를보이지않 Figure 4. Composition ratio of olive oil esters S and L by image analysis using thin layer chromatography. Values are presented as mean ± SD (n = 1). 았다. 다만, 유리지방산이많을수록이를중화하는데쓰이는 KOH가많기때문에검화가가높아질수있다. 따라서산가의결과와같이유리지방산이많은 L이 S보다는검화가가약간높게측정되었다. 식물성오일을구성하고있는주요성분은중성지질인트리글리세라이드 (triglyceride) 이며식물성오일의약 9% 를차지하고있다. 그외에인지질, 유리지방산, 무기질및불검화물등이함유되어있다 [13]. 불검화물은비누화반응을일으키지않는지질성분을말하며, 주요불검화물로는 tocopherol, phytosterol 등이있다. 화장품원료기준집 (2) 에서유지원료의불검화물기준은 1% 미만으로명시되어있다. 실험결과, olive oil esters S의불검화물은.84%, olive oil esters L의불검화물은.96% 이었다 (Table 2). 따라서 olive oil esters S 및 L 모두화장품원료로사용되기에적합한것으로나타났다. 굴절률은진공중의광의속도와물질중의광의속도의비를나타내며, 광선이진공에서보다밀도가높은물질을지날때더작은각도로꺾이게되어굴절률은 1 이상이나오게된다. 따라서오일의밀도는공기보다높으므로굴절률은항상 1 이상이나오게된다. 또한매질의밀도는온도에따라변화될수있으므로, 보통굴절률은온도에따라변화한다. 25 에서측정결과, 올리브오일, olive oil esters S 및 L의굴절률은각각 1.467, 1.466 및 1.465으로나타났다 (Table 2). 이러한결과로에스터교환반응을시킬수록매질의밀도가감소한다는것을예상해볼수있다. 이는밀도가높은 triglyceride 양이줄어들고, 가벼운 fatty acid ethyl ester 양이증가했기때문으로사료된다. 비중은오일의구성지방산을확인할수있는척도로사용되고있으며저급지방산의함량이많을수록, 불포화도가높을수록커진다. 공업화학, 제 29 권제 3 호, 218
347 Table 3. Optical Microscope Images of O/W Emulsion ( 4) Olive oil Olive oil esters S Olive oil esters L #1 #2 #3 비소함량은.34,.48 ppm이었다. 시료모두기준을만족하는수치를나타내어화장품소재로사용되기에적합하다고사료된다. Figure 5. Water content of the stratum corneum of artificially irritated skin with olive oil and olive oil esters L. Values are presented as mean ± SD (n=3). *p <.5 compared to olive oil. 측정결과, olive oil esters S, L 및올리브오일의비중은각각.9,.91 및.897이었다. 비중측정결과는불포화도에대한척도로서요오드가와마찬가지로모두유사하게나타났다. 화장품원료의순도시험에는중금속시험법및비소시험법이사용된다. 중금속시험법은원료중에불순물로서들어있는중금속의한도시험으로그한도는납 (Pb) 으로서중량백만분율 (ppm) 로나타낸다. 비소시험법은원료중에불순물로서들어있는비소의한도시험으로그한도는삼산화비소 (As 2 O 3 ) 의양으로나타내며보통중량백만분율 (ppm) 로나타낸다. 화장품원료기준집 (2) 에서명시하는오일의중금속및비소의함량은각각 2, 2 ppm 이하로, 각시료의중금속및비소의함량은 Table 2에나타내었다. Olive oil esters S의중금속및비소함량은.47,.46 ppm이었고, olive oil esters L의중금속및 3.3. 유화력시험올리브오일에스터로제조한 O/W 에멀전의입자형성을확인하기위하여실온에서편광현미경 4배율로관찰하였다 (Table 3). 화장품에사용하는계면활성제 (glyceryl monostearate, PEG-1 stearate, polyglyceryl-3 methylglucose distearate, sorbitan sesquioleate) 와올리브오일에스터로처방된처방 1 에멀전은매우작은입자크기와높은조밀도를보였다. 주계면활성제는제외하고보조계면활성제 (glyceryl monostearate, PEG-1 stearate) 와올리브오일에스터가처방된처방 2 에멀전은주계면활성제가없기때문에처방 1의입자보다입자크기가좀더크게나타났다. 주계면활성제및보조계면활성제가모두없고올리브오일에스터만처방된처방 3 에멀전은처방 1 및 2와비교하여크기가현저히큰입자로나타났다. 이때처방 3은계면활성제를전혀넣지않은처방임에도불구하고입자가형성되는유화가진행되었음을확인할수있었다. 이는올리브오일에스터에도유화력을갖는 mono-, di-glyceride가함유되어있기때문으로예상된다. 처방 1 및 2에비해입자크기가크게형성된이유는입자를둘러싸야하는양친매성분자의함량이적어서나타난결과로사료된다. 또한에스터교환반응시간이더긴 olive oil esters L의경우, olive oil esters S보다더작고조밀한입자를형성하였다. 이는 TLC 조성비분석에서확인했듯이, olive oil esters L의 triglyceride 함량이더낮아졌기때문으로사료된다. 반면일반올리브오일을첨가한대조군에서는처방 3에서입자가형성되지않아계면활성제없이는유화가진행되지않음을확인할수있었다. 결과적으로본연구에서개발된올리브오일에스터는계면활성제와베이스오일의복합소재로서가능성을나타내었다. Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 3, 218
348 박소현 신혁수 김아랑 정효진 현송화 홍인기 이대봉 박수남 3.4. 피부수분보유량사람피부에올리브오일에스터를처리하고수분보유량을측정한결과를 Figure 5에나타내었다. 본실험에서는대조군으로올리브오일을사용하였고, 실험군으로는오일에스터와일반오일의효과를확실히비교하기위하여에스터교환반응시간이긴 olive oil esters L 을사용하였다. Figure 5에서와같이양쪽팔뚝에 SLES로피부자극후피험자피부의수분보유량은올리브오일및올리브오일에스터 L 처리하지않은경우는각각 33.5% 및 34.4% 만큼현저히감소하였다. SLES로자극만된피부는손상받은표피장벽을자체적으로재생할수없음을나타낸다. SLES로자극된피부에오일에스터로처리하면그피부는수분보유량이증가하였다. 2일간올리브오일에스터를처리했을때피부수분보유량은초기피부에비해 8.5% 개선되었고, 5일간처리후에는 13.1% 개선되었다. 이는 SLES에의해손상된각질층이오일에스터에의해막이생김으로써수분증발을억제하고 diglyceride와같은유사지질막지질성분들이재배치되면서수분저장공간이확대되어보습효과가나타나는것으로사료된다. 대조군으로올리브오일을사용하였고올리브오일로처리된자극피부의수분보유량을측정한결과 2일후 3.5% 개선되었으나 5일후에는오히려 3% 저하됨으로써일반오일보다오일에스터가수분보유량회복에더욱효과적이라는결론을낼수있었다. 이러한결과는일반오일 (triglyceride) 은차폐효과만갖고있으나오일에스터는 diglyceride 및 monoglyceride의양친매성분자가함유되어있어 water capacity를늘려가는데기여한것으로사료된다. 3.5. 세포독성평가새로운화장품소재를개발하였을때, 실제적용에있어서생물학적안전성을평가하는것은매우중요하다. 본연구에서는사람각질형성세포주인 HaCaT 세포를이용하여올리브오일에스터의세포독성평가를수행하였다 (Figure 6). Olive oil esters S 및 L을세포독성의차이를확연히나타낼수있는농도범위 (.2~2 µg/ml) 에서수행하였다. 실험결과, 모든농도에서세포생존율이 9% 이상으로나타났다. 따라서올리브오일에스터가에스터교환반응을거친후에도효소나용매에의한독성을나타내지않음을알수있었다. 본연구에서제시된 MTT assay 결과는개발된올리브오일에스터가천연화장품에이용될수있는잠재적인무독성복합소재라는것을입증하였다. 4. 결론 올리브오일의에스터교환반응으로생성된복합소재 (olive oil esters) 는화장품에서계면활성제및에몰리언트제로의응용이가능하다. 따라서본연구에서는화장품에의응용을위하여올리브오일에스터의조성비분석, 물리화학적성질, 유화력, 보습력및세포독성에대한평가를진행하였다. 1) TLC를이용한이미지분석으로올리브오일에스터내성분들의조성비를확인하였다. Olive oil esters S의 mono-, di-, tri-glyceride 는각각 5.2, 24.1, 46.4% 이었고, fatty acid ethyl ester는 21.9% 이었다. Olive oil esters L의 mono-, di-, tri-glyceride는각각 4.1, 24.7, 4.6% 이었고, fatty acid ethyl ester는 28.8% 이었다. 2) 올리브오일에스터의기준및시험방법항목으로는요오드가, 산가, 검화가, 불검화물, 굴절률, 비중및순도시험을실시하였다. Olive oil esters S 및 L의요오드가는각각 83.77 및 83.78이었고, 산가는.77 및.81, 검화가는 26.28 및 27.28, 불검화물은.84 및.96, Figure 6. Effects of olive oil esters S and L on HaCaT cells viability. HaCaT cells were treated with different concentration of samples for 24 h, and cytotoxicity was then determined by the MTT assay. Values are presented as mean ± SD (n = 3). 굴절률은 1.466 및 1.465, 비중은.9 및.91이었으며, 순도시험에서중금속및비소함량은화장품에사용가능한안전성이확보된범위내에들어왔다. 3) 올리브오일에스터는계면활성제로서도이용될수있을것으로예상되므로유화력시험을수행하였다. 계면활성제를전혀넣지않은 O/W 에멀전처방으로제조하였을때, 입자가형성되어유화가진행되었음을확인하였다. 이는올리브오일에스터에유화력을갖는 mono-, di-glyceride가함유되어있기때문으로판단된다. 또한 olive oil esters L이 olive oil esters S보다더작고조밀한입자를형성하였다. 4) 사람피부에서수분보유량을측정한결과, 2일간올리브오일에스터를처리했을때피부수분보유량이초기피부에비해 8.5% 증가하여개선되었으며, 5일간처리후에는 13.1% 개선되었다. 대조군으로사용된올리브오일은 2일후 3.5% 개선시켰고 5일후에는오히려 3% 저하됨으로써일반오일보다오일에스터가수분보유량회복에더욱효과적이었다. 5) 올리브오일에스터의화장품적용을위해 MTT assay를이용하여피부세포에대한독성을평가하였다. Olive oil esters S 및 L 모두.2-2 µg/ml 농도에서세포생존율 9% 이상을나타내어안전성에대한결과를확보하였다. 이는천연화장품에서피부친화성 / 안전성이강조된무독성원료로이용될수있는가능성을보여주었다. 결과적으로올리브오일에스터는화장품산업에서석유계오일및합성계면활성제를대체할수있는천연 / 무독성원료로서응용가능성이있음을시사하였다. 유화력뿐만아니라높은컨디셔닝효과및보습력을갖는베이스오일로이용될수있음을말해준다. 또한본연구에서진행한 TLC 이미지분석법은에스터교환반응생성물의조성비분석을진행할때빠르고쉽게이용될수있을것으로기대된다. 공업화학, 제 29 권제 3 호, 218
349 References 1. U. Schuchardt, R. Sercheli, and R. M. Vargas, Transesterification of vegetable oils: A review, J. Braz. Chem. Soc., 9, 199-21 (1998). 2. S. Shahla, N. G. Cheng, and R. Yusoff, An overview on transesterification of natural oils and fats, Biotechnol. Bioprocess Eng., 15, 891-94 (21). 3. M. Cortese, M. Ricciutelli, R. Censi, and P. D. Martino, Qualitative characterization of a transesterification product of coconut oil by FIA-APCI-MS, Int. J. Cosmet. Sci., 37, 379-385 (215). 4. S. Hawash, N. Kamal, F. Zaher, O. Kenawi, and G. E. Diwani, Biodiesel fuel from Jatropha oil via non-catalytic supercritical methanol transesterification, Fuel, 88, 579-582 (29). 5. D. Y. C. Leung, X. Wu, and M. K. H. Leung, A review on biodiesel production using catalyzed transesterification, Appl. Energy, 87, 183-195 (21). 6. E. Dickinson and S. Tanai, Protein displacement from the emulsion droplet surface by oil-soluble and water-soluble surfactants, J. Agric. Food Chem., 4, 179-183 (1992). 7. F. F. P. Santos, S. Rodrigues, and F. A. N. Fernandes, Optimization of the production of biodiesel from soybean oil by ultrasound assisted methanolysis, Fuel Process. Technol., 1, 1-7 (211). 8. H. J. Sim, J. H. Kim, S. K. Lee, E. H. Kim, Y. H. Jin, E. K. Seo, and J. K. Hong, Non-aqueous reversed phase HPLC-evaporative light scattering detection of triacylglycerols: Quality evaluation of Coix seed, Bull. Korean Chem. Soc., 36, 177-179 (215). 9. C. Plank and E. Lorbeer, Simultaneous determination of glycerol, and mono-, di- and triglycerides in vegetable oil methyl esters by capillary gas chromatography, J. Chromatogr. A, 697, 461-468 (1995). 1. K. Bansal, J. McCrady, A. Hansen, and K. Bhalerao, Thin layer chromatography and image analysis to detect glycerol in biodiesel, Fuel, 87, 3369-3372 (28). 11. S. A. Kustrin and C. G. Hettiarachchi, Quantitative high performance thin layer chromatography for the analysis of herbal medicines: Problems and advantages, Mod. Chem. Appl., 2, 118 (214). 12. D. Casoni and C. Srbu, High sensitive and selective HPTLC method assisted by digital image processing for simultaneous determination of catecholamines and related drugs, Talanta, 114, 117-123 (213). 13. R. Aparicio and R. Aparicio-Ruıź, Authentication of vegetable oils by chromatographic techniques, J. Chromatogr. A, 881, 93-14 (2). Appl. Chem. Eng., Vol. 29, No. 3, 218