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Journal of the Korean Ceramic Society Vol. 45, No. 10, pp. 618~624, 2008. Effects of Macrophage on Biodegradation of β-tricalcium Phosphate Bone Graft Substitute Young-Hee Kim, Anirban Jyoti, In-Sun Byun, Ik-Hyun Oh***, Young-Ki Min**, Hun-Mo Yang**, Byong-Taek Lee*, and Ho-Yeon Song Department of Microbiology, School of Medicine, Soonchunhyang University, Cheonan 330-090, Korea *Department of Biomedical Engineering & Materials, School of Medicine, Soonchunhyang University, Cheonan 330-090, Korea **Department of Physiology, School of Medicine, Soonchunhyang University, Cheonan 330-090, Korea ***Korea Institute of Industrial Technology (KITECH), Gwangju Research Center, Gwangju 506-824, Korea (Received September 26, 2008; Accepted October 14, 2008) sƒ β-tricalcium Phosphate w e w ½ ÁAnirban JyotiÁ Á x***á»**á z **Á k*á y w w w w * w w w œw ** w w w w ***w» Ÿ l (2008 9 26 ; 2008 10 14 ) ABSTRACT Various calcium phosphate bioceramics are distinguished by their excellent biocompatibility and osteoconductivity. Especially, the exceptional biodegradability of β-tcp makes it a bone graft substitute of choice in many clinical applications. The activation of osteoclasts, differentiated from macrophage precursor cells, trigger a cell-mediated resorption mechanism that renders β-tcp biodegradable. Based on this evidence, we studied the biodegradation process of granular-type β-tcp bone graft substitute through in vitro and in vivo studies. Raw 264.7 cells treated with RANKL and M-CSF differentiated into osteoclasts with macrophage-like properties, as observed with TRAP stain. These osteoclasts were cultured with β-tcp nano powders synthesized by microwaveassisted process. We confirmed the phagocytosis of osteoclasts by observing β-tcp particles in their phagosomes via electron microscopy. No damage to the osteoclasts during phagocytosis was observed, nor did the β-tcp powders show any sign of cytotoxicity. We also observed the histological changes in subcutaneous tissues of rats implanted with granule-type β-tcp synthesized by fibrous monolithic process. The β-tcp bone graft substitute was well surrounded with fibrous tissue, and 4 months after implantation, 60% of its mass had been biodegraded. Also, histological findings via H&E stain showed a higher level of infiltration of lymphocytes as well as macrophages around the granule-type β-tcp. From the results, we have concluded that macrophages play an important role in the biodegradation process of β-tcp bone graft substitutes. Key words: Bone graft substitute, β-tcp, Biodegradation, Macrophage 1. w» w x,, x, z e w xk š. ƒ» w ù ƒ j w w ƒ,» w ƒ y šm ƒw. ƒ j w, Ÿ Corresponding author : Ho-Yeon Song E-mail : songmic@sch.ac.kr Tel : +82-41-570-2412 Fax : +82-41-577-2415 q x ü w ú. w w» w, w ey œ w š. 1,2)» g 3 ƒ» w wš w. w» 3) 70% y qk p (hydroxyapatite, HAp) β-tcp (β-tricalcium phophate) Ca/P 1.68-1.71. e 4)» yw w» 3,5) s š,, ww t y. t e 6,7) 618

HAp β-tcp š. w β-tcp w w ù8-13) HAp w» ƒ w ƒ š. β-tcp» š x ƒ j» w œ x β-tcp w., microwave assisted process 14) w sƒ β-tricalcium Phosphate w e w 619 100 nm w x β-tcp w. w β-tcp w, œ mw œ x β-tcp w.» j ƒ, e š ü e w w w w w, w w w. s(osteoblast)ù s(osteocyte) w x q s(osteoclast) w ³ x w w w w. 15,16) w w w q s monocyte/ macrophage s l M-CSF (macrophage colony stimulating factor), RANKL w y s w mw s p s w w s(multinucleated giant osteoclast) x w. 17,18) β-tcp ù w q s s œ 19) w œ x β-tcp ü w w sƒ β-tcp w w e š w. 2.1. 2. x x β-tcp 14) j q (microwave assisted process) w w œ w. w, Ca(OH) 3 H 3 PO 4 w j q w ph w w w β-tcp yw w w š, j»ƒ 100 nm w x β- TCP w. w w β-tcp w, œ œ x β-tcp w. 2.2. 2.2.1. s q s Raw 264.7 s 10% k x (fetal bovine serum; Hyclone) 1% w³ (100 U/ml penicillin, 100 µg/ml streptomycin, Gibco)ƒ sw Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM; Gibco) w. 100 nm w β-tcp š» ³ 121 C 15 ³ w» o (dryoven) 24 k z, 0.1 mg/ml 10% k x ƒ DMEM w xk k z β-tcp xk ƒƒ 10 w s w. 24 well» ƒ well 4 1 10 s w 37 o C, 5% CO 2» w. x PBS (phosphate buffer saline) 2z w. sw q s w w. 2.2.2. Tartrate-resistant acid phosphate (TRAP) Raw 264.7 s RANKL (50 ng/ml) M- CSF (30 ng/ml) w q s y TRAP mw y w. w, 24-well 1 10 4 cells/well s wš y w 7 w. y ƒ sw 2 w. PBS (ph 7.4) w s 2% glutaraldehyde 15 š w. TRAP acid phosphatase, leukocyte kit (Sigma-Aldrich) w w w. 2.2.3. Scanning electron microscopy (SEM) Scanning electron microscopy (SEM) w q s y xkw y w» w β-tcp wì d Raw 264.7 s 2% glutaraldehyde 2 š w z, 0.1 M PBS 1% OsO 4 1.5 zš w. s 0.1 M PBS (ph 7.4) 10 3z w z 50 ~ 100% k k g. hexamethyldislazene (sigma) w š, r rl w gqw z SEM (JSM-541-LV, JEOL) w. 2.2.4. Transmission electron microscopy (TEM) TEM w q s s w» w β-tcp wì w s 2.5% glutaraldehyde š 2ml ƒw z 4C 2 o š w š 1% OsO 4 1.5 z š w. s 0.1 M PBS (ph 7.4) 10 3 z w z 50 ~100% k k g. s w microtube ¼ z g propylene oxide 1:1 yww prophylene oxide ƒw 20 w. Prophylene oxide 45«10y(2008)

김영희 Anirban Jyoti 변인선 오익현 민영기 양훈모 이병택 송호연 620 Fig. 1. Microstructure of β-tcp particles and granule: (a) β-tcp nano powder fabricated by microwave assisted process. (b) β-tcp granule fabricated by fibrous monolitic process. araldite mixture (araldite epoxy resine 502 52 ml+ddsa 48 ml+dmp 30 1.5%)의 1:1 혼합액에서 2시간 동안 정 치시킨 뒤 새로운 혼합액으로 교환하여 12시간 동안 실 온에서 정치시켰다. 세포들을 다시 캡슐로 옮긴 후 araldite 혼합액을 채워 60 C에서 2~3일 동안 중합시킨 후 전자 현미경용 절편을 만들었다. LKB-V ultratome으로 1 µm 두 께의 절편을 만들어 toluidine blue로 염색하여 광학현미 경으로 세포 부위를 확인한 후 60~70 nm 두께로 초박절 편을 만들었다. 각각의 절편들은 전자현미경(JEM 100 CXII)으로 관찰하였다. o 2.2.5. 실험동물 및 피하 내 이식 실험동물은 7주령의 수컷 Sprague-Dawley (SD) 랫트 18 마리를 사용하여, 랫트의 등 피하조직에 다중압출공정에 의해 제조된 β-tcp 과립을 이식하였다. β-tcp 과립의 이 식 수술은 ether로 전신 마취를 시킨 후, 70% 에탄올과 베타딘으로 등을 소독하여 2 cm 정도를 절개한 후 피하 조직에 멸균된 시편을 삽입하고 봉합하였다. 삽입 후 1, 4, 8, 16주에 랫트를 살 처분하여 시간에 따른 피하조직 내 이물 반응과 β-tcp 과립의 생분해 과정을 해부현미경 과 H&E 염색법을 통해 관찰하였다. 또한, 이들 뼈이식제 의 생분해 과정이 대식세포와 어떤 관련성이 있는지를 관 찰하였다. 3. 결과 및 고찰 생체적합성이 우수하고 생분해 특성이 있어 인공 뼈 이 식제로 많이 사용되고 있는 β-tcp의 기계적 강도 및 골 유도 특성을 증가시키기 위해 β-tcp 나노분말을 이용하 여 과립형의 다공성 뼈이식제를 제작하였다. β-tcp 원료 분말의 합성은 기존에 사용하는 합성법과 는 다른 새로운 방법인 마이크로파(microwave assisted process)를 이용하여 초기 출발물질인 Ca(OH) 와 H PO 로 부터 ph를 조절함으로서 입자 크기가 100 nm 이하의 구 3 한국세라믹학회지 3 4 형 β-tcp 분말 원료를 제조하였다(Fig. 1(a)). 일반적인 wet-reaction 법을 사용하면 침상형의 HAp가 합성되는데 비해 마이크로파를 이용하여 합성하면 ph 조건을 조절함 에 따라 HAp와 β-tcp의 상 비를 조절할 수 있으며, submicron이 아닌 나노 크기의 구형 분말을 합성할 수 있었 다. 이렇게 합성한 나노 β-tcp 분말을 이용하여, 다중압 출공정을 거쳐 다공성의 β-tcp 과립을 제작함으로써 βtcp의 단점인 기계적 강도를 높일 수 있었다. 또한, 다공 성 β-tcp 과립을 SEM으로 관찰한 결과 200 µm의 균일 한 기공을 가지고 있어 뼈모세포의 성장을 위한 최적의 기공 크기인 200~300 µm를 구현하였다(Fig. 1(b)). 파골세포는 골 조직에서 뼈의 흡수에 관여하는 존재하 는 유일한 다핵세포이다. TRAP 염색은 기질인 naphtol AS-MX phosphate와의 반응 산물을 Fast red LB로 염색하 여 확인하는 방법으로 다핵의 파골세포를 관찰함으로써 Raw 264.7 세포가 포식기능을 갖는 파골세포로 분화됨을 확인 할 수 있다. Raw 264.7 세포의 배양액에 RANKL (50 ng/ml)과 M-CSF (30 ng/ml)를 처리하여 7일간 배양 후, TRAP 양성인 세포를 관찰하였다. 그 결과, 아무것도 처 리하지 않은 대조군에서는 TRAP 양성인 세포가 관찰되 지 않는 반면(Fig. 2(a)), RANKL과 M-CSF를 처리한 군 에서는 TRAP 양성인 세포들이 많이 관찰되었다(Fig. 2(b)). 또한, β-tcp 분말과 같이 배양한 군에서도 TRAP 양성인 세포들이 관찰되었다(Fig. 2(c)). 이렇게 분화된 Raw 264.7 세포의 파골세포로의 분화 및 형태학적 변화를 자세하게 관찰하기 위해 SEM으로 관찰하였다. 그 결과, 대조군에 서는 작고 동글한 조약돌 형태로 여러층으로 자라는 전 형적인 Raw 264.7 세포를 관찰할 수 있었다(Fig. 3(a)). 반 면, RANKL과 M-CSF를 처리한 군에서는 대식세포 특유 의 납작하고 여러세포들이 융합된 거대세포(multinucleated giant cell)들이 관찰되어(Fig. 3(b), 3(c)) Raw 264.7 세포 들이 포식기능을 갖는 파골세포로 잘 분화되었음을 확인 하였다. 분화를 유도시킨 파골세포에서의 포식작용을 관 찰하기 위해 세포들을 β-tcp 분말과 함께 배양한 후, 20,21)

대식세포가 β-tricalcium Phosphate 뼈이식제의 생분해에 미치는 영향 Fig. 2. Fig. 3. 621 Inverted microscopic images of differentiated Raw 264.7 cells; (a) control Raw 264.7 cells, (b) TRAP positive osteoclast-like cells (arrows) treated with RANKL and M-CSF, (c) TRAP positive osteoclast-like cells cultured with nano powders of β-tcp. d) Number of TRAP positive osteoclast-like cells. Scanning electron microscopic images of differentiated Raw 264.7 cells; (a) control Raw 264.7 cells, (b) TRAP positive osteoclast-like cells treated with RANKL and M-CSF, (c) TRAP positive osteoclast-like cells cultured with nano powder of βtcp. TEM으로 관찰하였다. 대조군과 실험군 세포 모두에서 정 상형태의 미토콘드리아 및 기타 세포 소기관들이 관찰되 는 것으로 보아 파골세포는 정상적으로 분화 성장된 것 으로 판단된다. 대조군의 파골세포에서는 정상적인 대식 세포 내 구조물과 함께 내부가 비어있는 phagosome을 관 찰 할 수 있었다(Fig. 4(a)). 반면 β-tcp 분말과 함께 배 양된 세포군에서는 많은 β-tcp 분말 및 분해산물들이 phagosome 내에서 관찰되었는데(Fig. 4(b)) 이는 파골세포 의 포식작용에 의한 것으로 사료된다. 이는 파골세포가 뼈모세포와는 달리 대식세포의 일종으로 근본적으로 이 물질을 쉽게 포식하여 제거하는 특성을 가지고 있어 β-tcp의 생분해 과정에서 생기는 적은 수의 뼈 이식제 입자는 세포막의 손상 없이 세포내로 포식할 수 있고 포 식된 입자에 의한 세포내 소기관들의 손상도 유도되지 않 은 것으로 사료된다. 랫트의 피하에 이식된 과립형 β-tcp 뼈이식제의 조직 내 이물 반응과 시간경과에 따른 생분해 정도를 관찰하 였다(Fig. 5). 이식된 β-tcp 뼈 이식제는 섬유조직으로 잘 둘러싸여져 있었고, 시간이 지남에 따라 생분해되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5(b), 5(c)). 특히, 이식 4개월 후의 22,23) 제 45 권 제 10호(2008)

김영희 Anirban Jyoti 변인선 오익현 민영기 양훈모 이병택 송호연 622 Fig. 4. Fig. 5. Transmission electron microscopic images of osteoclast-like Raw 264.7 cells cultured with the suspension of β-tcp nano powder: (a) control Raw 264.7 cells: (b) Raw 264.7 cells cultured with nano powder of β-tcp. P: phagosome; N: nucleus; M: mitochondria; β-tcp; β-tcp debries. Photographs of implanted porous β-tcp granules into subcutaneous tissue of rat. (b) After 4 weeks, the porous bodies were fully covered with fibrous tissue (c) After 16 weeks, implanted porous β-tcp granules were markedly degraded. 뼈 이식제의 경우 60% 이상의 질량 감소가 있었고 특히 바깥쪽의 기공을 확인할 수 없을 정도로 가장자리부터 중 앙으로 생분해 되어 들어감을 확인하였는데, 이는 가장자 리 부분이 이물 반응에 관여하는 세포들에 노출될 기회가 많았기 때문으로 생각된다(Fig. 5(c)). 또한 이식된 뼈 이식 제 주위의 조직을 H&E 염색을 하여 관찰하였다. 대조군 에서는 아무런 염증 반응이 관찰되지 않은 반면(Fig. 6(a)) 이식 1주째에는 이물 반응(foreign body reaction)에 관여 하는 다핵거대세포(multinucleated giant cells) 및 대식세포 의 부분적 침윤이 관찰되었다(data not shown). 이식 4주 째의 조직학적 소견상, 이물반응에 관여하는 다핵거대세 한국세라믹학회지 포, 대식세포 및 림파구의 침윤이 가장 많이 관찰되었다. 또한 이식 4개월 후에는 뼈이식제 분해산물로 보이는 이 물들이 많이 관찰되었고 이들 주위로 많은 수의 다핵거 대세포들이 관찰되었으나 만성 염증세포들은 감소하는 양 상을 보였다(Fig. 6(c)). 4. 결 론 본 연구에서는 생체적합성이 우수하며 인체 뼈를 구성 하는 무기 성분 중 하나인 β-tcp 나노분말을 합성한 뒤 다중압출공정을 통해 β-tcp 뼈 이식제의 단점인 낮은 기

대식세포가 β-tricalcium Phosphate 뼈이식제의 생분해에 미치는 영향 Fig. 6. 623 Histological findings (H&E stain) of subcutaneous tissue implanted with porous β-tcp granule. (a) Control, no inflammatory reaction was observed. (b) 4 weeks after implantation, the cells in regard to foreign body reaction were markedly infiltrated around the porous body. (c) 4 months after implantation, debris of β-tcp granules were observed around β-tc granule. (d) Infiltration of many macrophages and lymphocytes were observed at 4 weeks post-operation. M: marcrophage; D: debries of β-tcp granule. 계적 강도를 개선하였고, 뼈세포 및 모세혈관의 형성유도 에 적합한 200~250 µm 크기의 3차원 기공으로 이루어져 뼈의 우수한 재생을 유도하는 다공성의 과립형 β-tcp을 제조하였다. β-tcp 뼈이식제의 생분해 과정에서 발생할 수 있는 βtcp 미세입자 및 분해 산물들이 어떻게 처리되며 세포독 성이 없는지를 관찰하기 위해 마이크로파 합성법으로 제 조한 β-tcp 분말을 대식세포로 분화된 파골세포와 함께 배양하여 관찰하였다. 파골세포로 분화된 세포들은 대식 세포 특유의 납작하고 여러 세포들이 융합된 거대세포 (multinucleated giant cell)들로 관찰되었고 파골세포의 phagosome 내에 포식된 β-tcp 입자들이 많이 관찰되었 다. 그러나 파골세포의 미토콘드리아 및 기타 세포 내 소 기관들이 정상 형태를 유지하고 있는 것으로 보아 β-tcp 분말 자체의 세포독성이나 포식과정에서 올 수 있는 세 포 손상은 발견되지 않았다. 또한 다공성의 β-tcp 과립 을 쥐의 피하조직에 이식한 후 시간 경과에 따른 생분해 변화를 관찰한 결과, β-tcp 뼈이식제는 섬유조직으로 잘 둘러싸여져 있었고, 이식 4개월 후에는 다공질체의 바깥 쪽 기공을 확인 할 수 없을 정도로 분해되어 질량대비 60% 이상의 생분해가 진행되었다. 또한, 이식체 주위의 피하조 직을 H&E 염색을 통해 조직학적으로 관찰한 결과, 과립 형 β-tcp 주변에 이물 반응 및 포식작용에 관여하는 대 식세포 및 림프구의 침윤이 증가되어 있었다. 이상의 파골세포 및 동물 실험의 결과로 미루어 보아, β-tcp 뼈이식제의 생분해 과정에 포식기능을 갖는 대식 세포가 중요한 역할을 하는 것으로 사료된다. Acknowledgment 본 연구는 산업자원부 지역혁신센터 사업비의 지원을 받아 수행되었음(MOCIE-RIC 60605). REFERENCES 1. P. Ducheyne, Q. Qiu, Bioactive Ceramics: the Effect of Surface Reactivity on Bone Formation and Bone Cell Function, Biomaterials, 2287-303 (1999). 2. J.E. Lee, J.C. Park, Y.H. Kim, and H. Suh, In vitro Evaluation of PEG Modified Polyurethanes in Cellular Toxicity, Biomet. Res., [2] 65-8 (1998). 3. H. S. Kang, Histology First Edition, pp. 115-145, Komoonsa, Korea, 1993. 4. S. A. Park, J. W. Shin, et al In Vitro Study of Osteogenic Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells on Heattreated Porcine Trabecular Bone Blocks., Biomaterials, 20 2 25 제 45 권 제 10호(2008)

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