Algae Volume 22(4): 287-295, 7 진해만에서분리한기생성와편모류 Amoebophrya sp. ex Heterocapsa triquetra 의생태특성 박종규 1 * 허현정 2 D. Wayne Coats 3 이원호 1 ( 1 군산대학교해양학과, 2 김해시청경제환경국, 3 스미스소니언환경연구센터 ) Ecological Characteristics of the Endoparasitic Dinoflagellate, Amoebophrya sp. ex Heterocapsa triquetra Isolated from Jinhae Bay, Korea Jong-Gyu Park 1 *, Hyun-Jung Hur 2, D. Wayne Coats 3 and Wonho Yih 1 1 Department of oceanography, Kunsan National University, Kunsan, 573-71, Korea 2 Welfare and Environment Bureau, Gimhae City Hall, Geoje, 65-, Korea 3 Smithsonian Environmental Research Center, Edgewater, Maryland 2137-28, USA Infection of free-living dinoflagellates by endoparasitic dinoflagellates of the genus Amoebophrya are thought to have significant impacts on host population dynamics and have long been proposed to be a potential biological agent for controlling harmful algal bloom (HAB). To understand the impact of Amoebophrya on particular host species, however, it is necessary to quantify aspects the parasites life cycle. Here we used cultures of Amoebophryahost systems from Jinhae Bay, Korea to determine, parasite generation time, and dinospore survival and infectivity. The proportion of host cells infected by Amoebophrya sp. changed sharply from 5% to 87% with increasing dinospore:host inoculation ratios. In the absence of H. triquetra, most free-living dinospores died within 72 hours and their ability to infect host cells decreased remarkably in a day. The relatively short free-living phase of Amoebophrya suggests that the spread of infections is most likely to occur during seasons of high host abundance, as that is when dinospores have the greatest chance of encountering host cells. Infection of host cells inoculated with dinospores during the day was higher than when inoculated during the night, suggesting that infection rates might be related to environmental light conditions and/or diurnal biological rhythm of host species. Total generation times of parasite strains from a thecate dinoflagellate Heterocapsa triquetra were nearly the same regardless of dinospore:host inoculation ratios, representing 54 ±.5 h in a 1:1 ratio and 55 ± 1.2 h in a :1 ratio. Dinospore production of Amoebophrya sp. infecting Heterocapsa triquetra was estimated to be 125 dinospores per a strain of Amoebophrya sp. There is a growing need to maintain a variety of host-parasite systems in culture and to examine their autecology under various environmental conditions. Such studies would be very helpful in understanding ecological role of these parasites, their overlooked importance in the flow of material and energy in marine ecosystem, and their practical use as biological control agents applied directly to areas affected by HAB. Key Words: Amoebophrya, dinospore, Harmful algal bloom, Heterocapsa triquetra, Jinhae Bay, Parasitic dinoflagellate 서론기생성와편모류 Amoebophrya에대한관심은약 여년에이르는짧지않은역사를가지고있다 ( 박 2). 그동안많은연구자들이 Amoebophrya의세포생물학적특성이나미세구조, 생활사등에대하여연구하였고, 일부정리하기도 *Corresponding author (rtjgpark@kunsan.ac.kr) 하였다 (Cachon and Cachon 1987; Drebes 1984; Coats 1999; 박 2; Park et al. 4). 최근에는 Amoebophrya의숙주특이성, 분자생물학적특성등에대한연구결과들을많이발표하고있다 (Gunderson et al. ; Kim et al. 4; Kim 6; Salomon et al. 3). 이런연구결과는미국 Smithsonian 환경연구센터의숙주-기생생물배양시스템확립에기인하는바가크다 (Coats et al. 1996; Yih and Coats ; Coats and Park 2). 그동안숙주-기생생물배양체를보유하지못하여이생물시스템의생태와생물학적특성에관한연구를
288 Algae Vol. 22(4), 7 전혀수행하지못했기때문이다. 국내에서도이들에이어몇차례배양시스템성공사례 ( 허 3; 김등 2a; 박등 7) 가발표되었고아울러학술적으로의미있는연구결과도발표되고있다 (Kim et al. 4; Kim 6). Amoebophrya에대한관심이증가하는이유중하나는생물학적으로적조를제어하려는실용적의도와관련이있다. Amoebophrya는숙주생물에기생하여이들을수일내로괴멸시키므로숙주의개체군동태에막대한영향을미친다 (Coats et al. 1996). 이런특성때문에이미오래전부터적조를생물학적으로제어하는데이용할수있을것으로판단하고있었다 (Taylor 1968). 하지만오래전에숙주특이성에의문이제기되었고 (Nishitani et al. 1985), 최근일부유각와편모류에기생하는 Amoebophrya spp. 중에서숙주특이성이미약하거나불확실한종들이존재하는것으로밝혀져 (Sengco et al. 3; Kim 6) 현장적용에문제점으로대두하였다. Amoebophrya의숙주특이성이외에적조와관련이있는또다른관심분야는이들의숙주감염능력, 총세대기간, Amoebophrya가어린개체인와편모포자 (dinospore) 를생산하는능력, 해수중에서생존능력등에관한것이다. 이와같은 Amoebophrya의생물학적특성은숙주생물의개체군동태와크게관련이있다. Amoebophrya는일단숙주를감염시키면감염된숙주를반드시죽이고빠져나온다. 따라서기생생물이숙주를감염시킬수있는능력과숙주생물체내에서한세대를마치는데소요되는기간, 숙주에서빠져나와새로운숙주를찾는 dinospore의수와이들이해수중에서숙주없이생존할수있는기간등은숙주생물의개체군동태와밀접한관계가있다. 하지만이런중요성에도불구하고이들의생물학적특성에대한연구는크게미흡하여아직소수의 Amoebophrya sp. 에대한연구결과만발표되었다 (Yih and Coats ; Coats and Park 2; 김 2b; Kim et al. 4). 앞으로현장에서생물학적적조제어에기생생물을실제로적용하려면독성적조종을포함한다양한숙주와여기에기생하는 Amoebophrya 배양체를확립하고이들의생물학적특성을사전에반드시인지하여야할것이다. 연구에앞서사전연구를통하여진해만에서 Akashiwo sanguinea와 Heterocapsa triquetra 2종에대한숙주-기생생물배양체를확립하였다. 본연구에서는새로확립한숙주-기생생물배양체를이용하여숙주세포에기생하는 Amoebophrya sp. 의숙주감염능력과총세대기간, Amoebophrya sp. 의 dinospore 생산능력, 해수중에서생존능력등을알아보고자하였다. H. triquetra에기생하는 Amoebophrya sp. 의생물학적특성은전세계적으로아직보고된적이없어이번에최초로제시한다. 재료및방법기생생물분리및배양기생생물배양을시도하기이전에먼저 1여년간사전연구를수행하여 Amoebophrya가기생하는숙주를탐색하고이들을배양하였다. 시료분리를위해진해만에서해수를채집하여형광현미경 (Olympus BH2, excitation filter BP-49, barrier filter L-435,, ) 하에서관찰한다음 Amoebophrya sp. 에감염되어특징적인녹색형광을띠는세포를 Pasteur-pipette으로분리하였다 ( 박등 7 참조 ). 분리한세포는여과해수로 3-4회세척하여숙주가있는 5mL vial에서 1차배양하였고, 1차배양에성공한시료는큰유리용기에서 2차, 3차배양하였다. 배양에완전히성공하면약 2 일간격으로멸균한 125 ml Narrow-Mouth Square Bottle (PC) 에숙주를 75 ml씩채운후amoebophrya sp. 에감염된숙주를약 25 ml 접종하여유지하였다. 실험에이용한배양체는수온 C, 빛의세기 µmol photon m 2 s 1, 광주기 14L:1D 환경에서배양하였다. 조류배양시 Si가첨가되지않은 f/2 배지 (Gullard and Ryther 1962) 를사용하였고, 배양용기는 125 ml Narrow-Mouth Square Bottle(PC) 를이용하였으며, 실험에필요한모든실험기구는 Autoclave로멸균 (121 C, 15 lb, 분 ) 하였다. 위의방법으로유각와편모류 Heterocapsa triquetra에기생하는 Amoebophrya spp. 의숙주- 기생생물시스템배양에성공하여숙주감염능력과총세대기간, Amoebophrya의 dinospore 생산능력, 해수중에서생존능력등을측정하는데이용하였다. Amoebophrya sp. ex Heterocapsa triquetra의생물학적특성 Amoebophrya sp. ex H. triquetra의생물학적특성을알아보기위해아래에기술한모든실험은지수성장기의숙주세포와동일세대의기생성와편모류를대상으로하였다. 동일세대의 dinospore를얻기위하여먼저, 압력을주지않은상태에서일차적으로공극 12 µm Nucleopore 여과지로숙주- 기생생물의배양체를걸러내어숙주세포와 dionspore를분리하였다. 여기에서수확한여과배양수내다양한나이의 dinospore를지수성장기의새로운숙주생물에충분한비율로접종하였으며, 1 세대기간이지난후다시위에서기술한방법으로숙주세포에서동일세대의신선한 dinospore를수확하여모든실험에이용하였다 (Coats and Park 2). 이렇게수확한 dinospore는최대6시간이내의나이를가진다. Amoebophrya sp. ex Heterocapsa. triquetra의숙주감염능력기생생물과숙주의비율에따라숙주생물의감염능력이어떻게변화하는지알아보기위하여 Amoebophrya sp. ex H.
Park et al.: Ecological Characteristics of Amoebophrya sp. ex Heterocapsa triquetra 289 triquetra의 dinospore와숙주생물 H. triquetra를 ml scintillation vial에각각1:1, 2.5:1, 5:1, 1:1, :1 비율로접종하였다. 실험에접종할 dinospore 수를결정하기위하여 12 µm Nucleopore 여과지로 dinospore를수확하여포르말린으로고정한다음, 그즉시 hemocytometer에옮겨형광현미경 (Olympus BH2, ) 하에서계수하였다. 실험은각접종비율마다 3배수로하였다. 숙주생물의초기농도는 1, cells ml 1 가유지되도록조절하였으며, 기생생물을접종한다음 24시간, 36시간, 42시간, 48시간후에숙주감염정도를파악하였다. 시료는포르말린으로고정하였으며고정시료는즉시 Sedgwick-Rafter Counting Chamber에옮긴다음, Amoebophrya sp. 에감염되어녹색형광을띠는감염숙주를형광현미경 (Olympus BH2, excitation filter BP-49, barrier filter L-435, ) 으로계수하였다 (Coats and Park 2). 매시료마다 개체를관찰하였으며이중감염된숙주세포의비율을 dinospore의숙주감염능력으로보았다. 실험결과는아래의 2매개변수단일지수함수식 (a single two-parameter exponential rise to maximum) 에적용하였다. y = a(1 e bx ) a: 최대감염능력 (I max ) α b: Imax α: 초기직선부분의경사즉, dinospore 의초기감염능력 Amoebophrya sp. ex H. triquetra의숙주감염능력이기생생물의일주기생체리듬이나광조건에따라달라지는지알아보기위하여낮시간 (light cycle) 과밤시간 (dark cycle) 에 dinospore를수확하여숙주생물에접종하였다. 밤시간에대한실험은 dinospore 수확시간을달리하여 2회수행하였다. 첫번째는밤시간을시작한지 1시간후, 두번째는 2시간후에dinospore를수확하였다. 실험방법은위와동일하며, 감염능력파악을위한시료는 42시간후에부채집하였다. Amoebophrya sp. ex Heterocapsa. triquetra dinospore의생존능력과감염능력숙주에서빠져나온 Amoebophrya의 dinospore가해수내에서생존하는능력을알아보기위해서숙주-기생생물의배양체를공극 12 µm인 Nucleopore 여과지로걸러낸다음숙주생물없이 dinospore만을원배양체와같은배양조건 ( 수온 C, 빛의세기 µmol photon m 2 s 1, 광주기 14L:1D) 에서 3배수로배양하였으며 6-12시간간격으로시료를채취하여 dinospore의생존능력과감염능력을측정하였다. Dinospore의생존은녹색형광의유지여부를지표로삼았다. Dinospore의생존능력은각시기별로 dinospore를포르말린으로고정하여 hemocytometer에옮긴다음형광현미경 (Olympus BH2, ) 하에서계수하여측정하였다. 숙주체내에서빠져나온 dinospore가해수중에서생존하는기간에따라감염능력이어떻게변화하는지측정하기위하여 ml scintillation vial에각시간간격별로초기농도 1, cells ml 1 의숙주생물에 1:5 비율의 dinospore를접종하였다. 시료는 36시간후에포르말린으로고정하였으며, 고정즉시 Sedgwick-Rafter Counting Chamber에옮겨형광현미경 (Olympus BH2, ) 하에서관찰하였다. 매시료마다 개체의숙주를관찰하였으며이중감염된세포와감염되지않은세포를구분하였다. Amoebophrya sp. ex Heterocapsa. triquetra의세대기간숙주생물 H. triquetra를감염시킨 Amoebophrya가숙주생물세포내에서성장한후숙주에서빠져나올때까지세대기간을측정하기위하여처음 32시간까지 8시간간격, 이후부터 72시간까지 8시간간격으로시료를채취하여숙주개체수와 dinospore 수를계수하였다. 먼저, 앞서기술한것과동일한방법으로숙주-기생생물배양체를공극 12 µm Nucleopore 여과지로걸러동일세대 dinospore를수확한다음 dinospore와숙주생물의비율을 1:1, :1 로각각2배수접종하였다. Dinospore 부시료는포르말린으로고정하였으며고정즉시 hemocytometer에옮겨형광현미경 (Olympus BH2, ) 하에서관찰하였다. 숙주개체수는 Sedgwick- Rafter Counting Chamber에옮긴다음광학현미경 (Olympus AX 7, ) 하에서계수하였다. 총세대기간은 dinospore를접종한시간부터신생 dinospore의평균출현시간까지소요된시간으로정의하였다. 신생 dinospore의평균출현시간은새로운 dinospore가최초로출현한시각부터 dinospore가최고농도를보인시각까지출현개체수의누적총량을계산하고그값의반에해당하는시각을산출하여알아냈다 (Coats and Park 2). 결과 Amoebophrya sp. ex Heterocapsa. triquetra의숙주감염능력숙주생물 Heterocapsa triquetra를감염시키기위하여 dinospores를접종하였을때, 감염률은접종비율에따라 5-87% 로변화하며최대값까지지수적으로증가하였으며시간이지날수록숙주감염률은크게증가하였다 (Fig. 1). 대상기생생물의총세대기간을고려하여 ( 아래세대기간결과참조 ) dinospores 접종후 42시간에수확한시료를기준으로할때, dinospore: 숙주의비율을 1:1로할경우25.3% 정도
29 Algae Vol. 22(4), 7 (a) (b) Parasite Prevalence(%) Parasite Prevalence(%) 1 3 5 1 3 5 Inoculum Size(Dinospore:Host Ratio) Inoculum Size(Dinospore:Host Ratio) (c) (d) Parasite Prevalence(%) Parasite Prevalence(%) 1 3 5 Inoculum Size(Dinospore:Host Ratio) 1 3 5 Inoculum Size(Dinospore:Host Ratio) Fig. 1. Parasite prevalence as a function of inoculum size for strains of Amoebophrya sp. infecting Heterocapsa triquetra. Inoculations of H. triquetra with dinospore were conducted at day time. Host cells were counted (a) 24 h, (b) 36 h, (c) 42 h, and (d) 48 h later after dinospore inoculation. In this case ruptured dead host cells were estimated as infected cells. Error bars indicate SE. 의감염률을보였고, 1:1 접종에서는 85.8% 의감염률을보였다 (Fig. 1c). :1 의경우에는숙주생물의 86.5% 가감염되어 1:1 접종과비교할때불과.7% 증가하는데그쳤다. 이처럼접종비율이증가함에따라숙주감염률이지수적으로증가하다가최대에이르는경향은배양후 24시간후에부시료를채취한경우를제외하면모든실험에서동일하게나타났다. 42시간경과후자료를 single two parameter maximum rise to maximum 함수에적용해보았다. 그결과최대감염능력 I max 는 86.69 ± 1.76이었으며, 곡선회귀그래프의초기기울기 α는 28.11 ±.4 (r 2 =.95; P <.1) 인것으로나타나숙주 :dinospore 비율이증가하여도숙주감염률은 % 에도달하지않는것으로나타났다. 하루중 dinospore를접종하는시기를달리하여 Heterocapsa triquetra를감염시켰을때숙주감염률은그접종시간에따라뚜렷하게차이가났다. 낮시간에접종하였을때에는숙주 :dinospore가증가할수록숙주감염률이급격하 게증가하여 1:일때최대86% 의감염률을보였으나 (Fig. 1c), 밤시간에접종하였을때에는숙주 :dinospore가증가하여도숙주감염률이크게증가하지않았으며최대감염율도높지않았다. 밤시간 (dark cycle) 을시작한지 1시간후에 dinospore를수확하고접종한실험 1에서는 1:에서 53% 의숙주감염률을보였고, 밤시간 (dark cycle) 시작 2시간후에 dinospore를접종한실험 2에서는최대 35% 의감염률에불과하였다 (Fig. 2). Amoebophrya sp. ex Heterocapsa. triquetra dinospore의생존능력과감염능력 Heterocapsa triquetra 체내에서빠져나온지 6시간이내의 dinospore를숙주가없는상태에서초기농도약 1 3 cells ml 1 로배양하였을때, 살아있는 dinospore 수는시간이경과함에따라급격히감소하였다. 처음 12시간동안에는초기접종농도보다약 % 정도증가하는추세를보이기도
Park et al.: Ecological Characteristics of Amoebophrya sp. ex Heterocapsa triquetra 291 experiment 1 experiment 2 5 Parasite Prevalence(%) Infection Success (%) 3 1 1 3 5 Inoculum Size(Dinospore:Host Ratio) Fig. 2. Parasite prevalence as a function of inoculum size for strains of Amoebophrya sp. infecting Heterocapsa triquetra. Dinospore was inoculated at night time and was counted 42 hours later after inoculation. Ruptured dead cells were accounted to be infected cells. 을거의상실하였다. Dinospore Age (h) Fig. 4. Capability of different aged dinospores to infect Heterocapsa triquetra displayed by percentage of harvested dinospores that successfully established host infections. Error bars indicate SE. X 1 3 Dinospores ml -1 15 5 Elapsed time (h) Fig. 3. Survival of dinospores from Amoebophrya sp. infecting Heterocapsa triquetra. Initial density of dinospore was 1 3 cells ml 1. Error bars indicate SE. 하였지만그이후부터기하급수적으로감소하여 72시간이경과한후에는대부분의 dionspore가사멸하여검출한계이하로떨어졌다 (Fig. 3). 형광현미경으로관찰하였을때형광의세기도초기의건강한상태에는매우밝고강하였지만시간이지날수록차츰약해졌다. 숙주세포를빠져나온 dinospore는해수중에서생존한기간에따라새로운숙주를감염시키는능력에큰차이를보였다 (Fig. 4). 체내에서나온지 6시간이내의초기에는숙주생물 H. triquetra의약37% 를감염시킬수있었지만, 24시간 (+ 6 h 이하 ) 정도경과한후에는 1% 내외의숙주만감염시킬수있었고, 48시간 (+ 6h이하 ) 이경과하면 dinospore가생존해있음에도불구하고새로운숙주를감염시키는능력 Amoebophrya sp. ex Heterocapsa triquetra의세대기간기생생물의세대기간을측정하기위하여숙주세포에 dinospore를접종한결과, 접종후약 2일이경과한다음부터숙주세포의체내에서새로운 dinospore가출현하기시작하였다. 숙주와 dinospore 비를 1:1로접종한경우에는약 44시간이지난다음에새로운 dinospore가나타나기시작하였다. 그후 dinospore 수가점차증가하다가약 시간이지났을때 15.3 ±2.7 1 3 ml -1 로최대에이르렀다. 1:의경우에는이보다조금빠른 시간후에미약하게나마 dinospore가출현하기시작하여그이후급격하게개체수를늘렸으며약 64시간이경과한후에는 118.2 ±5.3 1 3 ml -1 로최대에도달했다. Dinospore를접종한시간부터신생 dinospore의평균출현시간까지소요된시간을총세대기간으로정의한다면, H. triquetra에기생하는 Amoebophrya sp. 의총세대기간은숙주와 dinospore 비가 1:1일때약54 ±.5 시간이고 (Fig. 5a), :1 일때약55 ± 1.2시간정도되는것으로추정되었다 (Fig. 5b). 고찰 Dinospore가숙주생물체내부에침입하여생활사를새로시작할때체내에서이들의성장이충분하지않은단계이거나, 심지어성장이충분한경우에도, 특징적인녹색형광을발현하지못하는경우가있다. Alexandrium affine(kim et al. 4) 이나 Ceratium fusus(park et al. 4) 에기생하는 Amoebophrya가여기에해당하는데이경우감염된지오래
292 Algae Vol. 22(4), 7 (a) Cell counts of Host (cells ml -1 ) (b) Cell counts of Host (cells ml -1 ) 5 3 5 3 Control Host Dinospore 24 48 72 Control Host Dinospore Elapsed time (h) 24 48 72 Elapsed time (h) 1 1 되지않은개체는형광현미경으로그감염여부를판별하기가매우어렵다. Amoebophrya sp. ex Heterocapsa triquetra의숙주감염능력은시간에따라점차증가하여, dinospore를접종하고 42시간이지난후관찰한숙주감염률은 24시간과 36시간이지난후관찰한숙주생물감염률보다더높게나타났다 (Fig. 1). Fig. 3, 4에서볼수있듯이, 숙주를빠져나온 dinospore가숙주가없는상태에서해수중에서생존하는능력은접종후 24시간이지나면급격히떨어지고, 숙주를감염시키는능력도 12시간이지나면급격히낮아진다. 이런점을감안하면, 36시간이후감염률이크게증가한것은실제로숙주감염률이점차증가하였기때문이아니라감염초기에숙주가형광을발현하지못하였거나크게미약하다가감열중기이후에형광이발현되었기때문인것으로판단된다. Dinospore와숙주의비율에따른숙주감염률은최종적으로총세대기간 (5-52시간) 에조금모자란 42시간을기준으 1 1 Fig. 5. Temporal variation of Amoebophrya sp. infecting Heterocapsa triquetra inoculated at (a) low (1:1) and (b) high (:1) dinospore:host ratios. Bars with gray regions represent host abundance and those with black ones control. Closed circles are dinospore abundance. : night. Error bars indicate SE. 3 Dinospores (X1 ml -1 ) Dinospores (X1 3 ml -1 ) 로하였다. Dinospore 접종후 42시간과 48시간이경과하면 Amoebophrya sp. 중일부는 vermiform 의형태로숙주밖으로빠져나가며숙주세포를파괴하기때문이다 (Fig. 5b). 특히, dinospore와숙주의비율이 1:1 과 :1 로높을때에는숙주세포를파괴하고빠져나온 vermiform이더많을것이다. 따라서숙주감염률을계산하려면이렇게파괴된숙주의개체수를감염숙주에포함하여야한다. Fig. 1c, 1d는이런점들을고려한것인데, 이경우파괴된숙주의세포수는접종후36시간이후의숙주개체수와 42시간또는 48시간이후숙주개체수의차이로구하였다. 하지만, 자연적으로사멸하는개체도있을것이고감염되지않은숙주는계속성장할것이므로계산상의오차는시간이지날수록더커지게된다. 접종후48시간이후에나타난최대 94.7% 의숙주감염률 (Fig. 1d) 은이런점에서다소과대평가된것일수있다. 따라서접종후 42시간은파괴된숙주세포도적고형광을내기에도충분한시간이므로최종숙주감염률함수를결정하는가장적절한시간으로판단된다. 결국, 형광현미경으로감염된숙주의녹색형광을관찰하여숙주감염률을측정할때무엇보다중요한것은 dinospore 접종후감염숙주세포를계수하는시간을결정하는것이며, 그것은형광을내기에충분하지만총세대기간과는다소거리가있는시간이가장적당하다. Amoebophrya sp. ex Heterocapsa triquetra의숙주감염률은숙주에대한 dinospore의접종비율이높을수록급격히증가하였다. 하지만그비율이높아져도숙주를 % 감염시키지는못하였다 (Fig. 1c). 물론, dinospore 접종비율을계속증가시키면 % 에이를수도있겠지만, 자연생태계에서는그렇게높은비율이거의존재하지않을것이다. 이와비슷한예를 Karlodinium veneficum에서찾아볼수있다. Amoebophrya sp. ex K. veneficum도 dinospore 접종비율이 :1 이상에서약 91.3% 수준까지자기숙주를감염시켰지만 % 에이르지는못하였다 (Coats and Park 2). 심지어 :1 에서도 % 감염에는실패하였다. 단일지수함수식의회귀곡선에나타난초기경사 (α) 에서는두종에서다소차이를보였다. H. triquetra 숙주의 Amoebophrya sp. 는 28.1 로서, 19.6 의값을보인K. veneficum 숙주의 Amoebophrya sp. 보다약1 정도더높았으며, 이는 Amoebophrya sp. ex H. triquetra의 dinospore가 K. veneficum에서나온 dinospore보다초기감염능력이 1.5배정도더크다는것을의미한다. 위의 2종외에도국내에서배양한 Amoebophrya sp. ex Prorocentrum minimum의경우에도 :1 이상에서숙주감염률이더이상증가하지않았으며 ( 김등 2b), 유각와편모류 Alexandrium affine과 Gonyaulax polygramma도 1차숙주와 2차숙주모두% 감염에는성공하지못했다 (Kim 6). 반면, Amoebophrya sp. ex Akashiwo sanguinea의경우는 1:1
Park et al.: Ecological Characteristics of Amoebophrya sp. ex Heterocapsa triquetra 293 이상의비에서도자기숙주를 % 감염시켰으며, Amoebophrya sp. ex Gymnodinium instriatum도, 비록 1:1 에이르러서야가능했지만, 자기숙주를 % 감염시킬수있었다 (Coats and Park 2). 이상의결과로볼때, 일반적으로유각와편모류를숙주로하는 Amoebophrya sp. 는무각와편모류숙주의 Amoebophrya sp. 보다숙주감염률이떨어지며, 그최대값은대부분 9% 이하인것으로판단된다. 유각와편모류숙주의 Amoebophrya sp. 가이런특성을보이는것은그들의비교적낮은숙주특이성과관련이있을것이다 (Kim 6). 유각 / 무각와편모류숙주세포와기생생물사이의감염률차이와숙주특이성과관련된생물학적특징은앞으로와편모류의진화과정을이해하는데에도많은정보를줄수있을것으로보인다. 일반적으로유각와편모류의세대기간은무각와편모류보다짧고, dinospore의감염성공률도두와편모류에서크게차이나지않아서유각와편모류의외각이기생생물침투의장벽으로작용하지않는것으로알려져있다 (Kim et al. 4). 하지만외각을뚫고숙주세포내부로침투하는데소요되는시간에대해서는아직알져진바가없다. 사실, 무각와편모류는표면에외각이없어서 Amoebophrya dinospore의침투에쉽게노출되어있지만, 유각와편모류는단단한외각이있어서 dinospore가숙주생물의세포내부로침투하는데어려움을겪을수있다. 따라서 dinospore가 H. triquetra 의세포내부로침투하기에가장좋은때는 H. triquetra가분열하기위해외각을깨뜨리는순간이다. H. triquetra는주로새벽시간대에분열하기때문에 ( 저자의관찰경험 ), dinospore의침투도이시간대에가장많이일어날것으로예상할수있다. 하지만실험결과는예상을크게벗어났다. 물론, Amoebophrya sp. ex H. triquetra의숙주감염률은밤과낮에뚜렷한차이를보였다. 하지만낮시간에접종하였을때에최대 87% 의감염률을보였고, 밤시간에는실험 1의경우최대 53%, 실험 2의경우최대35% 에불과한감염률을보여정반대의결과가나왔다 (Figs 1, 2). 이러한실험결과는 dinospore의활동력과숙주침투시기가숙주생물의광합성활동과관련된일주기생체리듬에결합되어있을가능성이있음을시사한다. Dinospore가숙주생물의광합성활동에의한부산물이나이와연관된세포외분비물등을화학적추적자로이용하여물질을배출하는지점을목표로숙주침투를감행할가능성이있다. 생태학적으로는일주기수직운동을통해낮에표층에고밀도로모이는와편모류의일반적인생태특징을잘이용하는것으로볼수있다. Akashiwo sanguinea처럼감염된후 16시간이내에빠른속도로광합성능력을상실하고 (Park et al. 2b), 감염말기에일주기수직이동능력을잃고밀도약층으로가라앉는특징 (Coats and Bockstahler 1994, Fig. 2; Park et al. 2a) 을보이는경우에 는, 숙주생물을빠져나온 dinospore가생존능력을오히려하루이상증진시켜 (Coats and Park 2, Fig. 1) 표층에있던숙주생물이일주기수직운동으로저층에내려올때까지기다리거나 dinospore가직접표층으로이동하는전략을취할수있다. Amoebophrya sp. ex H. triquetra의 dinospore가숙주체내에서나온후약 12시간이후에나타나는유사한형태의생존능력향상 (Fig. 3) 도이런측면의생존전략일수있다. 숙주체내에서빠져나온 dinospore의생존능력은 Amoebophrya sp. 의종류에따라조금씩다르다. Coats and Park(2) 은 Gymnodinium instriatum, Akashiwo sanguinea, Karlodinium veneficum에기생하는 Amoebophrya spp. 의 dinospores가각각3, 5, 13일의생존능력을가진다고보고하였으며, 김등 (2) 도국내연안에출현한 Prorocentrum minimum 숙주의 Amoebophrya sp. 가약7일의생존능력이있는 dinospores를생산한다고보고하였다. 본연구의숙주생물인 H. triquetra에기생하는 Amoebophrya sp. 의 dinospore는숙주생물을빠져나온후새로운숙주를찾지못하면 3일이내에대부분사멸하였다. 이런생존능력은 G. instriatum을감염시키는 Amoebophrya sp. 의 dinospore와비슷한생존능력으로지금까지발표된값중에서가장낮은값이다. 해수중의 dinospore는그생존기간에따라숙주를감염시키는능력에도큰변화가생긴다. 대개시간이지날수록급격히감소하는데, Amoebophrya sp. ex H. triquetra의 dinospore는이런종류의연구가수행된와편모류중에서도변화속도가빠른편에속하였다. H. triquetra를빠져나온dinospore는약 1시간까지 3-% 의비교적높은감염능력을보였으나그이후부터는급격히감염능력을잃어버렸고 2일이후로는 dinospore가있더라도숙주감염능력을모두상실하였다. Coats and Park(2) 은 G. instriatum과 A. sanguinea를감염시키는 Amoebophrya sp. 의 dinospores가각각2일과 5일만에감염능력을모두잃어버린다고보고하였다. K. veneficum 에기생하는 Amoebophrya sp. 의 dinospores는이들과달리첫날보다그다음약 3일동안감염능력이 2배가량오히려더증가하며 11일이지나도죽지않고미약하게나마숙주를감염시킬수있는능력을갖는다 (Coats and Park 2). Prorocentrum minimum은 3일이후부터 dinospore의숙주에대한감염성공률이급격히낮아진다 ( 김등 2). 이러한결과들은숙주생물을감염시키는데에 dinospore의상태와시기가매우중요함을시사한다. 특히, H. triquetra가숙주인 Amoebophrya sp. 처럼해수내생존기간이 2-3일이내로매우짧고그사이숙주감염능력도급격히떨어지는경우에는, 이들의생존을위해숙주생물의집적이대단히중요하다. 그러므로숙주종이적조를일으킨시기는 Amoebophrya sp. 가확산을집중할수있는가장좋은순간이며또한숙주종에
294 Algae Vol. 22(4), 7 가장영향을많이끼치는시기가될것이다. Amoebophrya sp. 의총세대기간 (total generation time) 은 Amoebophrya sp. 가숙주세포를감염시킨후숙주세포내에서발달시간 (intracellular development time) 을포함하여 vermiform 형성및성숙등새로운dinospore를생성하기전까지걸리는시간을의미한다. Amoebophrya sp. 의세포내발달단계와총세대기간에대한자료는지금까지 3종의무각와편모류 (A. sanguinea, G. instriatum, K. veneficum) 와 2종의유각와편모류 (Alexandrium affine, Gonyaulax polygramma) 그리고 1종의정단와편모류 (Prorocentrum minimum) 에기생하는 Amoebophrya sp. 에대해서만보고되었다 ( 김등 2b; Coats and Park 2; Kim et al. 4). H. triquetra를감염시키는 Amoebophrya sp. 의총세대기간은숙주에대한 dinospore의비를1:1로했을때54 ±.5시간이고 (Fig. 5a), :1 로했을경우에는 55 ± 1.2시간으로나타났다 (Fig. 5b). 하지만 Coats and Park(2) 의계산법에따라총세대기간을구한경우에는 H. triquetra와 A. sanguinea를숙주로하는 Amoebophrya sp. 는계산치보다조금더짧은세대기간을가질것으로판단된다. Fig. 3에서볼수있듯이이들의 dinospore는숙주세포를빠져나온후 12시간에서 16시간정도경과하면 (Amoebophrya sp. ex H. triquetra) - 25 (Amoebophrya sp. ex A. sanguinea)% 가량생존세포수가증가한다. 이는한세대기간을마치고숙주세포를빠져나왔을당시, 즉총세대기간경과직후의 dinospore 수보다 1여시간더지난후의 dinospore 수가더많다는것을의미하는것으로서, Fig. 5의 dinospore 출현량그래프를총세대기간직후의실제 dinospore 출현그래프보다오른쪽으로약간편향되게하는결과를낳는다. 이런점을고려하여총세대기간을산출하면, 숙주에대한 dinospore의비를1:1 로했을때 53 ±.2시간이고, :1 로했을경우에는 52 ± 1.시간으로나타났다. 한편, 숙주에대한 dinospore의비를1:1로하여무각와편모류 A. sanguinea, K. veneficum, G. instriatum을감염시켰을때총세대시간은각각 67, 71, 59시간이었고, 115:1 의비율로 G. instriatum를감염시켰을때총세대시간은 55시간이었다 (Coats and Park 2). 반면, 유각와편모류 A. affine와 G. polygramma를 1:1로감염시켰을때총세대기간은각각 55, 53시간이었다 (Kim et al. 4). P. minimum 은 -3시간수준이라고추정하였다 ( 김등 2). H. triquetra와 A. affine 등의결과를보면대체적으로유각와편모류가무각와편모류보다총세대기간이더짧게나타났다. Kim et al.(4) 은이러한기생생물의세대기간에영향을미치는요인으로기생생물의부하량, 숙주의세포크기와부피, 성장환경그리고본질적인숙주특이적차이등을지적한바있다. Amoebophrya sp. ex H. triquetra의세대기간에대한실험에 서몇가지가정을전제하면 Amoebophrya 1 개체가생산하는총 dinospore 세포수를대략적으로계산할수있다. 첫번째가정은 dinospore의숙주감염능력이 Fig. 1c의곡선회귀그래프를따른다는것이고, 두번째는숙주세포에서빠져나온 dinospore가적어도 24시간은죽지않는다는것이며, 마지막으로숙주와 dinospore의접종비율을 1:1로했을때숙주세포 1 개체에는 dinospore 1 세포만기생할수있다는것이다. 첫번째가정에서숙주 :dinospore 접종비가 1:1일때 dinospore에감염된총숙주세포를구할수있다. 즉, Fig. 1c의회귀식으로부터접종비 1:1일때24.±.4% 의숙주가감염됨을알수있다. 따라서실험시작할때초기숙주농도가 511 cells ml 1 이었으므로 dinospore 접종후감염된숙주는약 123 cells ml 1 이다. 감염숙주의세포내부에서생활하던 Amoebophrya는생활사를마친후숙주세포를빠져나와 dinospore를생성하는데, 이때배양액에출현하는 dionspore 개체수는 1:1 접종을하였을때최대 15,3 cells ml 1 에이른다 (Fig. 5a). 결국, 123 cells ml 1 의감염숙주가 dionspore 15,3 cells ml 1 를생산하므로감염숙주 1 cell은 dinospore 약 125 cells을생산하는것을알수있다. 세번째가정에서감염숙주 1 cell에는 Amoebophrya 1 cell만기생하므로, Amoebophrya 1 cell이생산하는총 dinospore 수는약 125 cells이다. 이와같은 dinospore 생산성은약 5-개체의 dinospore를생성하는 A. sanguinea와 Gymnodinium instriatum보다는 3-4배정도적고약5여개체의 dinospore 를생성하는 Karlodinium veneficum보다는 2-3배정도많은것이다. 기생성와편모류 Amoebophrya에대한연구는앞으로도지속적으로이루어져많은숙주생물에대한숙주-기생생물배양체를확보하고, 다양한환경조건하에서숙주생물과기생생물간의생태적특성을살필필요가있다. 이는적조발생해역현장에직접적용하는생물학적적조제어연구에기초가되고, 그동안간과하였던기생생물의생태적중요성과해양생태계에서물질과에너지흐름에대한그들의역할을판단하는데도움을줄것이다. 사 사 본연구는한국과학재단지역대학우수과학자지원사업 ( 과제번호 : R5-3--11755-) 의지원을받아수행하였습니다. 연구비지원에감사드립니다. 참고문헌 김영길, 박명길, 이원호. 2a. 적조생물 Prorocentrum minimum 의숙주 - 기생자배양체 : (1) 기생성와편모류 Amoebophrya sp. 의
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