최지은 1,2, 1 정미랑, 1 이가연, 1 문병철, 강영민 1,2* 1. 한국한의학연구원 K-herb연구단 2. 한국과학기술연합대학원대학교 (UST) 한의생명과학전공 Rapid In vitro Propagation and Accumulized of Angelica acutiloba Kitag. Using the Selected Seeds Choi Jieun 1,2, Jeung Mirang 1, Lee Kayoun 1, Moon Byeongcheol 1, Kang Youngmin 1,2* 1. K-herb Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 305-811, Republic of Korea 2. University of Science & Technology (UST), Korean Medicine Life Science, Campus of Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon 305-811, Republic of Korea Abstract The roots of Angelica acutiloba Kitag. were widely used in herbal medicines and they also used in multi-purpose plants as vegetables and functional foods. Recently, a lot of researches have been done about medicinal plants in Korean herbal medicine, but the studies about propagation or biomass uptakes of A. acutiloba have not been done, yet. This experiment investigated the optimal in vitro culture conditions (stem growth, root growth, and root number) for 4 weeks in 10 different kinds of culture media after seed selection. Then, they were translated to soils for performing of mature plants. The case of stem growth in vitro cultured was positive on WPM (Woody plant Medium) however, the root growth and root number were positive on DJ (De Greef and Jacobs) culture medium. Simply, this study had been identified optimal medium conditions of in vitro cultures and accumulized in soil environments using healthy seeds of A. acutiloba. Thus, this study could provide information about rapid and simple methods of A. acutiloba for multiple propagation.
강영민외. 선발된왜당귀종자를이용한최적배양및순화조건규명 우리나라는한의학에기반을둔천연물및식품의약에관한연구가활발하게진행되어왔으며, 최근 에는합성의약품보다천연의약품의안정성이높아약용식물의재배및기원식물의대량생산관련연 구의중요성이높아지고있다. 1) 동의보감등고문헌의처방에서다수로사용되어왔던한약재 當歸의 경우대한민국약전은 Angelica gigas Nakai( 참당귀= 토당귀), 중화인민공화국약전은 A. sinesis (Oliv.) Diels( 중국당귀= 당당귀), 일본약전의경우는 A. acutiloba Kitag.( 왜당귀= 일당귀) 로표기되 어있으며, 대한약전외한약 ( 생약) 규격집에서도일당귀에대한기원내용이명시되어있다. Table 1. The origin of Angelica root in different countries 국가 출전 약명 생약명 영문명 기원 한국대한민국약전 Angelicae Angelica 참당귀 Angelica gigas Nakai 당귀 ( 當歸 ) 제11개정 Gigantis Radix Gigas Root ( 산형과) 의뿌리. 대한민국약전 'Angelica acutiloba Kitagawa' 한국 외한약( 생약) Japanese 또는 'Angelica acutiloba Kita 일당귀 ( 日當歸 ) Angelica Root 규격집 Angelicae Radix gawa var. sugiyamae Hikino' 제4개정 ( 산형과) 의뿌리. 중국 중화인민공화산형과식물중국당귀 Angelic Angelicae 국약전当归 ( 당귀) - a sinensis (Oliv.) Diels의뿌 Sinensis Radix 2010년판리를말린것. 왜당귀 Angelica acutiloba Kit agawa 또는홋카이당귀 Angel 일본 일본약국방 Japanese ica acutiloba Kitagawa var. su 当帰 ( 당귀) Angelicae Radix 제16개정 Angelica Root giyamae Hikino ( 산형과) 의 뿌리로서, 일반적으로뜨거운 물에데친것 대만 산형과식물중국당귀 Angelic 대만중약전 Angelicae Chinese 當歸 ( 당귀) a sinensis (Oliv.) Diels의뿌제2판 Sinensis Radix Angelica Root 리를말린것. 북한 조선인민민주당귀 Angelica gigas Nak. ( 미주의공화국당귀, 참당귀 Radix Angelicae - 나리과) 의뿌리. 약전제7판 한의학적으로당귀는맛이달면서쓰고매우며, 보혈활혈 ( 活 ), 조경지통 ( 止痛 ), 윤장통변 ( 潤 便 ) 하며, ferulic acid(c 10H 10 O 4 ) 성분은혈액순환에도움을주어, 부인과질환에이용되어왔 다. 2) 식물학적으로왜당귀는산형과(Umbeliferae, Apiaceae) 에속하는다년생초본식물로주로뿌리 를약용부위로이용하고있다. 왜당귀뿌리의주요성분은 bergapten, hydropthalid, valeropehnome, 비타민 B12 등이며, 왜당귀잎은무기물과칼슘함량또한높다. 3,4) 지구온난화와환경변화로인한생태계의변화가일어나고, 이변화는한약자원식물의다양성과분포 지및자생지에막대한피해를주고있다. 식량, 원예, 특용작물의활용가치를높이고우수한한약자원 을생산하는일은미래한약과미래식물자원을개발하고안정적으로공급하는데필요한연구분야로 서식물학자들에게많은관심을받고있다. 그럼에도불구하고, 현재중국당귀와왜당귀연구는조직배 양및대량번식연구에관한논문이거의발표되어있지않으며, 특히, 건전종자를선발하여우량종자 의대량번식및환경순화를통해증식한연구는전무한수준이다. 특히, 왜당귀는한약으로써뿐만 아니라, 기능성쌈채소로서각광을받고있으며, 대체한약재및유용식물에대한관심도가높아지는 34
시점에서왜당귀의대량증식관련연구가필요하다. 무병주식물체를생산하는것은병이걸리지않은 (Virus-free) 식물체를생산하는것으로, 우량(Elite) 개체를생산하여대량생산을하기위한첫걸음 이라고할수있다. 또한최근당귀는약용뿐아니라, 기능성채소로도많이이용되고있어, 최적번식 방법및우량개체선발등을통해대량생산이더욱필요하며, 약용으로사용하는부위가뿌리이므로 부위별비대실험및무병주개체생산을통해우수한한약자원식물을생산하는데도움이될것으로 사료된다. 본실험은왜당귀의건전종자선별을통하여무병주우량식물의대량생산을위한기내배양 조건을규명한연구로, 유용한약자원식물의번식을위한기초자료로활용될것이라사료된다. 1. 실험재료 본실험에서사용된왜당귀( 한약명: 일당귀, Angelica acutiloba Kitag.) 는충북농업기술센터작물연 구과특작팀에서 2013년채종원에서채취한종자를 2014 년에분양받아실험에사용하였다. 국제종자 검정협회 (ISTA: International Seed Testing Association) 규정에따라 4 C에보관해둔종자를실험 전실내에두어실내온도와습도를동일하게맞춘뒤실험재료로사용하였다. 2. 종자외부형태관찰및건전종자선별 왜당귀의건전종자를선별하기에앞서, 광학현미경 (Olympus SZX16 Microscopie with SDF PLAPO 1X PF, Olympus, Japan) 을이용하여종자외부형태( 길이, 폭, 이미지) 를측정하였으며, 종자군집의 30 립을선정하여평균길이를산정하였다. 종자측정이완료된종자는증류수에침적시킨후가라앉은
강영민외. 선발된왜당귀종자를이용한최적배양및순화조건규명 종자들을 1 차적으로선발하였다. 종자활력도검증을위하여 1차선발한종자를 TTC(2,3,5-Tripheny l Tetrazolium Chloride) 처리를하여화학적처리에따른색변화도를관찰하였다 ( 그림 1). 이때 TTC 는 0.9078g/0.1L 의 KH 2 PO 4 와 0.9472g/0.1L Na 2 HPO 4 를 2:3 의비율로처리하였고, ph는 6.5-7.5 로 조정하여실험에사용하였다. 1차선별된종자를증류수에 24시간침지시켜전처리한후 1%TTC 용액에옮겨상온에서총 5 시간처리하였다. 종자의색변화도는 1 시간간격으로관찰하였으며, 처리 후종자는증류수로 2-3 회수세하여세밀하게관찰하였다. 3. 선발개체의기내최적배양조건규명 종자의비중에따른 1 차선별후무균기내배양을위해, 종자들은 NaClO에 3분간침지후증류수로 수회수세하였고, 이후 70% EtOH에 1분간침지후증류수로 3 회수세하였다. 세척이완료된종자는 filter paper에 1시간건조후 MS(Murashige and Skoog Media, 1962) 5) 배지 (3% Sucrose, w/vit- amines, PH 5.6 0.2) 에치상하였다. 치상된종자는온도 25 1, 5,000Lux 및광주기 16/8 시간( 명/ 암) 으로조정된생육상에서배양하였다. ( 그림 2). Fig 2. Initial in vitro cultures of A. acutiloba A: A sterilized seed on plant medium, B: Initial seedling after inoculated on the MS(Murashige and Skoog, 1962) 5) plant medium for 5days, C: In vitro cultures after 10days. 선발된개체의기내생육최적배지조건을규명하기위하여 10가지의다른조성을가지는배지에 치상하였다. 실험에사용된개체는뿌리가없고잎이줄기와잎에 3개인것을표준으로하여 MS(Murashige and Skoog, 1962), DJ(De Greef and Jacobs, 1979) 6), NN(Nitsch and Nitsch Medium) 7), QL(Quoirin and Lepolvre, 1977) 8), LS(Linsmaier and Skoog 1975) 9), White(White, 1931) 10), WPM(McCown Woody Plant Medium, 1981) 11), B5(Gamborg B5) 12), AR(Anderson s Rhododendron, 1984) 13), CHU(CHU [N6], 1975) 14) 배지의 test tube에각각 3 반복으로치상되었다. 36
이때의배지조성은각각의기본배지에 3% Sucrose, 0.6% agar 을첨가하였고, 그후 ph를 5.6 0.2 로 조정한후 10ml 씩 Test Tube 에분주하였다. 배양조건은온도 25 1, 5,000Lux 및광주기 16/8시간 ( 명/ 암) 으로조정하였다. 배지의무기염조성들에따른뿌리및줄기길이, 뿌리개수를 7일간격으로 총 28 일측정하였다. 4. 기내배양조건에따른환경적응과순화 기내에서자란식물체의순화를위해펄라이트 (Hohyunbio, Korea) 와하이상토 (Punong, Korea) 를 3:7(v/v) 으로혼합한후직경 7cm 의불투명플라스틱화분에식재하였다. 식재후지상부의건조를 막고뿌리활착을돕기위해 7 일동안비닐백(polyethylene vinyl) 을씌워유지시켰으며 22, 광도 5,000Lux 에서 16/8h(light/dark) 광주기로조절된생장상안에서순화시켰다. 개체의크기별로 30개 체를 3반복하여 4 주후생존율을확인하였다. 15) 5. 선별종자의활력검증결과 비중에따라 1차선별된종자를 5시간동안 TTC 처리한후색의변화를관찰한결과, 색의변화가 거의없음을관찰할수있었다. TTC 발색법은종자의세포대사과정에서발생하는이산화탄소에 의해종자내부에위치한배혹은종자표면의색깔이붉은색으로변하는데, 이변화를통해서종자의 활력을구분하는방법이다. 16,17) 왜당귀종자의경우외피부분에 TTC 용액이흡수되기힘들고, 종피의 밀도가높아 CO 2 에대한민감성이저조하여발색이되지않았을것이라사료된다. 내복자( 무의씨) 의 경우 TTC 용액에대한민감성이높아외부종피를파괴하여절단하지않아도염색하기가용이하고 이산화탄소민감성이높은것으로연구보고된바있다. 18) 그러나왜당귀종자의경우민감성과활력도 부분에적용이되지않아추후건전종자를선별하기위한검정방법연구가필요하다고사료된다.
강영민외. 선발된왜당귀종자를이용한최적배양및순화조건규명 6. 선발된종자의최적배양조건규명결과 선발된종자들은 MS 배지에치상되어 4주동안기본배지에서기내식물체를만든후종류가다른 10 개의배지(MS, DJ, NN, QL, LS, White, WPM, B5, AR, CHU) 에표준화된개체의상태로치상되어 4 주동안배양되었다 ( 그림 3). GI(Growth Index) 는생장을수치적으로나타낸지표인데, 왜당귀길이 생장의 GI를살펴보면최소생장배지인 NM배지는 10% 인것에반해최대생장배지인 WPM배지는 100% 의수치를나타내약 10 배정도의차이를보였다. 한편뿌리의길이생장과개수의 GI 경우, DJ배 지가다른배지에비해높은수치를보였지만 ( 표 2, 표 3). WPM 배지에서는낮은수치를보였다. 이러한실험결과를보아쌈채소로쓰이는 4) 왜당귀는줄기생장이좋았던 WPM배지에서의생육이 바람직할것이라사료되며, 개체의대량번식을위해조직배양시뿌리활착또는약용으로의사용을 위해서는 DJ 배지의사용이효과적일것이라사료된다. Table 2. Effect of various plant media on the root growth of A. acutiloba Medium 1 week 2 week 3 week 4 week GI (%) LS 0.4 0.3 0.6 0.5 0.8 0.8 1.7 1.8 768 B5 0.1 0.0 0.4 0.5 1.5 1.7 2.0 1.8 904 DJ 0.5 0.6 1.1 1.2 1.8 1.6 4.1 3.9 1595 AR 0.2 0.1 0.4 0.4 0.7 0.8 1.7 1.3 643 White 0.3 0.3 1.0 1.5 1.3 1.6 2.9 2.2 1365 CHU 0.1 0.0 0.2 0.1 0.5 0.7 1.5 1.4 485 WPM 0.1 0.0 0.1 0.0 0.1 0.0 0.9 1.0 210 NN 0.1 0.0 0.2 0.2 0.4 0.2 1.4 1.3 440 QL 0.1 0.0 0.3 0.4 0.6 0.7 2.1 1.3 650 MS 0.1 0.0 0.2 0.2 0.7 0.6 1.6 1.3 560 Growth Index = [(Final growth initial growth) / initial growth] 100 LS: Linsmaier and Skooog 1975 9), B5: Gamborg B5 12), DJ: De Greef and Jacobs 1979 6), AR: Anderson s Rhododendron 1984 13), White: White 1931 10), CHU: CHU [N6] 1975 14), WPM: McCown Woody Plant Medium 1981 11), NN: Nitsch and Nitsch Medium 7), QL: Quoirin and Lepolvre 1977 8), MS: Murashige and Skoog 1962 5) Table 3. Effect of various plant media on the root number of A. acutiloba Medium 1 week 2 week 3 week 4 week GI (%) LS 1.8 0.4 1.8 0.4 3.2 3.3 5.8 4.5 215 B5 1.8 0.8 1.6 0.5 2.4 0.9 2.8 0.8 115 DJ 2.8 3.0 3.8 4.1 4.8 3.9 6.2 3.7 340 AR 1.4 0.5 2.0 1.0 3.0 2.4 3.8 2.3 155 White 1.6 0.9 2.6 2.6 4.6 3.9 5.6 2.7 260 CHU 1.0 0.0 1.8 1.3 3.2 2.7 3.4 2.2 135 WPM 1.0 0.0 1.0 0.0 1.0 0.0 2.8 1.8 45 NN 1.0 0.0 2.2 1.8 3.8 3.3 4.6 2.9 190 QL 1.0 0.0 1.6 1.3 4.0 3.1 5.6 4.2 205 MS 1.0 0.0 1.6 0.9 2.8 1.9 2.8 1.5 105 Growth Index = [(Final growth initial growth) / initial growth] 100 LS: Linsmaier and Skooog 1975 9), B5: Gamborg B5 12), DJ: De Greef and Jacobs 1979 6), AR: Anderson s Rhododendron 1984 13), White: White 1931 10), CHU: CHU [N6] 1975 14), WPM: McCown Woody Plant Medium 1981 11), NN: Nitsch and Nitsch Medium 7), QL: Quoirin and Lepolvre 1977 8), MS: Murashige and Skoog 1962 5) 38
7. 기내배양조건에따른환경적응및왜당귀순화결과 기내배양왜당귀식물체는펄라이트와상토가 3:7의비율로혼합된토양으로이식하여환경적응을 한후무병주배양묘를대량생산하였다. 완전히배양된식물체는 7일간비닐백을덮어서습도를 90% 로유지시켜순화시키면서점차덮개를벗긴후 22 생장상에서재배한결과 4주동안의환경적응 후높은생존율을보였으며, 순화된식물체는토양적응성이높게나타났다 ( 그림 4). 토양순화실험에 서는뿌리의생육이좋은개체일수록토양활착이빨랐으며, 기내배양및재분화개체모두토양이식 에쉽게성공함으로써순화과정에서발생하는노동력과비용및시간을절약할수있을것으로사료된 다.
강영민외. 선발된왜당귀종자를이용한최적배양및순화조건규명 본연구에서는왜당귀의건전종자선별을통한기내배양및순화조건을확립하였다. 1차선별은 종자의비중에따라건전종자와비건전종자를분류하였으며, 건전하다고판단되어진종자는 TTC 활력검증을통해서 2 차선별을하였다. 하지만 TTC 용액에대한왜당귀종자의낮은민감성과외피의 특성으로화학적처리후의변화를확인하기어려웠으며, 추후에우량종자를분류하기위한검증방법 연구가필요하다고사료된다. 이외에도왜당귀의기내배양시최적배양조건을확인하였으며, 이러한 결과는우량종자와우량수종이확보되었을시, 무병주기내배양체의대량생산에큰도움이될것이라 생각된다. 추후에는식물생장조절제를이용한뿌리비대연구및특정무기염처리를통한생육변화연 구가추가적으로필요할것이다. 결론적으로본연구를통해향후왜당귀식물체를짧은기간안에 기내에서대량증식하고토양이식을통한뿌리의비대로우수한약재및우량개체를생산할수있는 기초자료로사용할수있을것으로사료된다. 본연구는한국한의학연구원의한약자원기원검증체계구축및육묘 증식기술개발(K15421) 연구 비를지원받아수행하였습니다. 시료를공급하여주신충북농업기술원김인재연구관및작물연구과 관계자분들과초기무균식물체배양에도움을주신민지윤박사와김미선연구원께깊은감사드립니 다. 1. 조지숙, 김명환, 김지연, 이경선, 전수환, 김익환, 김동일. Angelica gigas Nakai 뿌리배양에의한 decursin 유도체생산증진을위한연구. 한국생물공학회. 학술발표대회논문집. 2000:155-8. 2. 김선애, 오혜경, 김지영, 홍진우, 조수인. 참당귀, 중국당귀, 일당귀및그구성생화합물의약리작용 에대한고찰. 대한한의학회지. 2011;32(4):1-24. 3. 황진봉, 양미옥. 토당귀와일당귀의화학성분비교. 한국식품과학회. 1997;29(6):1113-6. 4. 문종옥, 박권우, 강호민. 일당귀발아에미치는광, 온도, 및 Priming 처리의효과. 원예과학기술지. 2003;21(4):434-9. 5. Murashige, T. and F. Skoog. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture. Physiol. Plant. 1962;15:473-794. 6. De Greef, W. and M. Jacobs. In virto culture of sugar beet: description of a cell line with high regeneration capacity. Plant Science Letters. 1979;17:55-61. 7. Nitsch, J.P. and C. Nitsch. Haploid plants from pollen grains. Science. 1969;163:85-7. 8. Quoirin, M. and P. Lepoivre. Improved medium for in vitro culture of Prunus sp. Acta. Hort. 1977;78:437-42. 9. Linsmaier, E.M. and F. Skoog. Organic growth factor requirements of tobacco. Physiol. Plant. 1975;18:100-27. 10. White, P.R. Plant tissue culture. The history and present status of the problem. Arch. Exp. 40
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