J. Exp. Biomed. Sci. 2011, 17(1): 21~25 Antibacterial Activity of Puer Tea Extract on Pathogenic Microorganisms Hyo Jeong Kim, Su-Won Kim, Sun-Ah Baek, Jong-Won Kim and Min Yoo Department of Biology, College of Natural Sciences, Keimyung University, Daegu 704-701, Korea We have analyzed 11 different commercial brands provided by Daboo Culture and Art Center. This study was carried out to determine the antibacterial activity of water extract from puer tea ingredients against Staphylococcus aureus (S. aureus) and Listeria monocytogenes (L. monocytogenes). Antibacterial activity of the water extracts was shown against S. aureus and L. monocytogenes by paper disc method. In case of S. aureus, antibacterial activity of the extracts appeared as clear inhibitory zone. This antibacterial activity was greater along with ph and showed the highest effect at ph 10. In case of L. monocytogenes, antibacterial activity of the extract appeared as clear inhibitory zone. Some Puer tea appeared to be more powerful in antibacterial activity against S. aureus and L. monocytogenes. The polyphenol compounds were 3.46~8.68%, depending upon samples. In conclusion, puer tea is considered as a good choice for well-being food. Key Words: Puer tea, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Antibacterial activity, Total polyphenol compound 서 보이차는중국운남의대엽종으로만든쇄청모차로일부는사천지방의중엽종으로도제조된다. 제조과정중여러가지미생물이관여하여미생물이분비하는효소에의해발효되는후발효차로검은색혹은흑갈색이다 (Son et al., 2005). 보이차는카테킨류함유량이녹차에비해많지만발효과정중중합되거나분해되어떫은맛이없고, 담백하고순하며진한주황빛을띤다. 여러번우려내도향과빛깔이오랫동안지속되며장기간보존할수록상품의가치도올라간다 (Kim et al., 2003). 보이차는차의품질의기본요소인화학성분인폴리페놀을다량함유하고있다. 폴리페놀화합물은식물계에널리분포되어있는 2차대사산물의하나로서항산화작용, 항혈전작용, 고지혈증및지방간억제작용등의활성을가지는자연에서얻은항산화제중가장강력한효과를나타낸다 (Kim et al., 2003). 이는새로운신약및건강기능성음료를개발하는데기초가될수있는물질이다. 중국문헌인 * 접수일 : 2011년 3월 22일 / 수정일 : 2011년 3월 23일채택일 : 2011년 3월 24일 교신저자 : 유민, ( 우 ) 704-701 대구광역시달서구신당동 1000, 계명대학교자연과학대학생물학과 Tel: +82-53-580-5537, Fax: +82-53-580-5537 e-mail: ymin@kmu.ac.kr 론 본초강목십유 ( 本草綱目拾遺 ) 에서보이차의약리적특성을기술하기를 " 보이차의향은독특하며, 숙취해소와소화를돕고, 가래를식히고, 위를깨끗이하며, 갈증해소와우리몸에해로운기름기제거에좋은작용이있다 " 고하였다. 보이차는장기간복용하여도부작용이없다. 프랑스에서의임상실험결과지방신진대사촉진에효과적으로작용하며, 혈액중의알코올함량을저하시키고, 항균작용이있으며, 콜레스테롤및혈뇨산을저하시킨다고알려져있다 (Park et al., 2004). 포도상구균은포도상구균과에속하는그람양성구균의총칭이며, 이들균종중식중독의원인이되는것은혈장응고표소인 coagulase를생산하는황색포도상구균 (Staphylococcus aureus) 으로, 이균은여러가지감염증을일으키는가장중요한균종이며다른균종은기회감염균이다. 황색포도상구균은우리나라식중독발생통계에서뿐만아니라전세계적으로도주요식중독의발생원인균으로알려져있다 (Bean et al., 1996; Pan et al., 1997). 또한저항성이강하여공기, 토양등의자연계에광범위하게분포하며건강한사람과동물의피부등에도상존하고있어식품으로의오염경로도매우다양하다 (Kim et al., 1989). 리스테리아균 (Listeria monocytogenes) 은자연계에널리분포되어있으며유제품, 육제품, 그리고특히수산식품에서도많이발견되고있는세균이며그람양성의단간 - 21 -
Table 1. Kind of Puer Teas for experiments No. Sample name 1 Tong Shun xiang (15~20 years) 2 Qizi bing 3 04181 (2006) 4 qīng bǐng (2003) 5 puer tea (3~5 years) 6 shúbǐng (2001~2002) 7 shúbǐng qīng bǐng (2004) 8 Puer tea (10 years) 9 04181 (2008) 10 04081 (2008) 11 03081 (2008) 균으로포자및캡슐은형성하지않는다 (Kim, 1992). 리스테리아균은리스테리아감염증 (listeriosis) 의발생을유발하는데이는사람, 소, 양, 돼지, 가금류등을감염시켜감염된동물의젖이나변을통해균이환경에퍼지게된다. 이를사람은오염된식품의섭취나감염된동물과의접촉을통해감염된다. 이와같은음식물섭취로인하여발생하는식중독을보이차를통해방지하고자생육저해환 (clear zone) 생성유무를확인하여식중독균의위험에서벗어나고자한다. 그러나국내 외대부분의연구가녹차에대한것인반면에보이차에대한연구는그다지많지않은실정이다. 발효식품이건강에좋다는결과는여러연구에서익히알려진사실이기에본연구를통해보이차연구와발효식품연구의기초자료를축적하고자한다. 재료및방법재료본실험의공시재료인보이차는다부문화예술원 ( 경상북도칠곡군소재 ) 에서 Table 1에나타낸바와같이 11종의시료를받아실험에사용하였다. 보이차의제조번호에서앞의두숫자는보이차의생산시작년도를, 맨뒤의숫자는공장대표번호를, 가운데두숫자는보이차의급수를나타낸다. 04081 (2008) 은쿤밍차공장에서 0~8등급의보이차로 2004년에생산을시작하여 2008년도에수확한종류라는것이다. 사용균주본실험에사용한균주는한국생명공학연구원생물자 원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC) 에서분양받은식중독공시균주 2종인황색포도상구균과리스테리아균을사용하였다. 배지는 Trypticase soybroth (TS) 와 Brain Heart Infusion Agar (BHI) 는 Difco (USA) 의제품을사용하였고, 4 에서보관하면서 3주마다계대배양하여실험에사용하였다. 시료의추출시료추출은열수추출을하였다. 50 ml tube에각각의시료 2 g씩넣고용매 20 ml를넣었다. 용매는 hot plate 위에서 100 까지가열하여사용하였다. Shaking incubator 에서시험관을기울여서 80 rpm으로 60 에서 1시간동안섞어주면서시료를추출하였다. 보이차추출물은 Whatman No.2 여과지를사용하여 1차여과과정후 pore size 0.45 μl syringe 용멸균필터로 2차여과과정후사용하였다. 항균력측정실험에앞서황색포도상구균과리스테리아균을 TS 액체배지와 BHI 액체배지에서 18시간배양한다음, 고체배지와 soft 배지를준비하였다. 총 11종의시료농축액을가지고항균활성을측정하였다. 11종의보이차원액 250 μl를각각 2배, 5배로 speed vac concentrator에서 1시간정도농축하여시료를준비하였다. 또한 5배로농축된시료를 121 에서 10분간고압멸균하여시료를준비하였다. Soft 배지를 30~45초정도열을가해녹인후, 15 ml 시험관에 3 ml씩담고황색포도상구균과리스테리아균을 5 μl를접종하였다. 균이접종된시험관을고체배지에골고루편평해지도록붓고굳을때까지놓아두었다. 보이차 2배농축액 (200 mg/ml) 과 5배농축액 (500 mg/ml) 을각각 25 μl에 paper disc를넣어 10분간반응하여배지위에올려두고 36시간배양하여생육저해환 (inhibitory zone) 을확인하였다. 또한 ph에서도환이생성되는지알아보기위해 11종의보이차원액 500 μl를 10배로농축하여얻은 25 μl에 ph 2, ph 7, ph 10의 tris-buffer를각각 25 μl씩섞어서 paper disc를넣어 10분간반응하였다. Soft 배지를각각 30~45초정도열에가해녹인후, 15 ml 시험관에 3 ml 씩담고황색포도상구균과리스테리아균 5 μl를접종하였다. 균이접종된시험관을고체배지에골고루편평해지도록붓고굳을때까지놓아두었다. Paper disc를배지위에올려두고 36시간배양하여생육저해환을확인하였다. - 22 -
A B C Fig. 1. Antibacterial activity of Puer tea extract to S. aureus and L. monocytogenes. (A) two-fold concentrated Puer tea extract (200 mg/ml) (B) five-fold concentrated Puer tea extract (500 mg/ml) (C) five-fold concentrated Puer tea extract after autoclaving sterilization. Numbers represent samples used for the experiments. 총폴리페놀함량측정보이차열수추출물의총폴리페놀함량은 Folin-Denis (AOAC, 2005) 방법을일부변형하여비색정량하였다. 보이차추출물을희석하여희석액을 60 μl에 2배희석한 phenol 시약 (Folin regent) 60 μl를넣은후, 3분간정치하고 10% sodium carbonate (10% Na 2 CO 3 ) 60 μl를첨가하여혼합한후 30 incubator에서 1시간정치하였다. Spectra max 340pc microplate readers기를이용하여 700 nm에서흡광도를측정하였다. 기준물질은 galic acid 를이용하여표준곡선을작성한후이검량곡선으로부터시료중의총폴리페놀함량을구하였다. 결과및고찰농도별항균력측정본연구에서는보이차농축추출물이황색포도상구균과리스테리아균에대하여항균력을가지고있는지알아보기위해측정해본결과거의모든시료에대해서생육저해환 (clear inhibitory zone) 이생성되는것을알수있다. 2배농축시황색포도상구균의경우, 6번시료에서가장큰저해환을나타났으며 3번, 8번, 10번의시료가그다음 으로저해환이크다는것을알수있었다. 리스테리아균의경우에서도황색포도상구균과마찬가지로 6번시료에서가장큰저해환을확인할수있었다 (Fig. 1A). 따라서 2배농축액의실험결과를바탕으로 6번, 8번, 10번시료를선택하여 5배농축액으로실험한결과황색포도상구균의경우, 8번 < 10번 < 6번의순으로저해환이크다는것을알수있었으며, 리스테리아균의경우, 2배농축시와유의한결과를보였다 (Fig. 1B). 전체적으로황색포도상구군에대해리스테리아균보다항균력이강한것을확인할수있었다 (Fig. 1B). 또한 5배농축액을고압 멸균하여배양한후실험을한결과 5배농축시실험결과와유사하게나타났다 (Fig. 1C). 따라서보이차추출물이고압 멸균하여도안정하다는것을알수있었다. ph별항균력측정 ph별로실험한결과, 황색포도상구균의경우, ph 2와 ph 7에서는큰효능이없었지만, ph 10에서모든시료에서저해환이나타났음을확인할수있었다 (Fig. 2). 리스테리아균의경우, ph 10에서 6번, 8번, 10번시료에서만선별적으로항균력을가짐을확인할수있었다 (Fig. 3). 따라서황색포도상구균의경우, 리스테리아균보다크고 - 23 -
Fig. 4. Total contents of polyphenol compounds in 11 Puer tea samples. Numbers represent samples used for the experiments. ( %: total contents) 물질의성분이단백질이아닌폴리페놀이라고생각되어진다. Fig. 2. Antibacterial activity of Puer tea extract to S. aureus along with ph conditions. Numbers represent samples used for the experiments. CE; crude extract 총폴리페놀함량분석폴리페놀성물질은식물계에널리분포되어있는 2차대사산물중의하나로다양한구조와분자량을가진다. 그리고항산화작용, 항혈전작용, 고지혈증및지방간억제작용등의활성을가지고있는데보이차의총폴리페놀함량은 Fig. 4와같다. 보이차시료 11개의폴리페놀함량은약 3~9% 의함유량을보였다. 그중폴리페놀함량이가장높은것은 10번시료로 100 g당 8.68% 의폴리페놀을함유하고있음을확인할수있었으나, 1번시료에서는 100 g당 3.46% 로가장낮은폴리페놀함유량을가지는것을확인할수있었다. 앞으로폴리페놀과항균력과의관계에대해좀더실험을넓혀가야할것으로생각된다. REFERENCES Fig. 3. Antibacterial activity of Puer tea extract to L. monocytogenes along with ph conditions. Numbers represent samples used for the experiments. CE; crude extract 뚜렷한 clear zone을생성하였는데이는보이차의성분이리스테리아균보다황색포도상구균을더효과적으로생육을저해한다고생각되어진다. 만일보이차의항균물질이단백질이라면온도와 ph의영향으로변성이될수있는데높은온도에서도항균력이나타는것으로보아항균 Bean NH, Goulding JS, Lao C, Angulo FJ. Surveillance for foodborne disease outbreaks-united State, 1988-1992. Mob Mortal W Rep. 1996. 45: 1-66. Kim DH, Kwon KR, Lee KH, Ju YR, Oh KS, Kang HS. Studies on staphylococcal food-poisoning and enterotoxin prosactivity. Report of National Institute of Health 1989. 26: 111-121. Kim DR, Kwak GS, Jeong SM, Lee SC, Ha JU. Comparison of the antioxidative abilities of commercial gal geun tang. J Kor Soc Food Sci Nutr. 2003. 32: 728-732. Kim JH. Listeria monocytogenes. J Agric Sci. 1992. 6: 229-257. Pan TM, Wang TK, Lee CL, Chien SW, Horng CB. Food-borne disease outbreaks due to bacteria in Taiwan, 1986 to 1995. J - 24 -
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