생체분자의 질량분석 실험

생체분자의질량분석실험 1. 실험목표 질량분석법의사용과그응용분야가날로확대되어감에따라질량분석기의사용법과원리, 질량분석스펙트럼의해석등질량분석법의이론적인배경이해와실습이목적이있다. 질량분석실험을통해작은단백질또는펩타이드의배열순서와리피드의구조를확인하는방법론을학습한다. 2. 이론적배경 2-1. Electrospray Ionization 특정분자를질량분석하기위해서는이분자의운동을조절할수있는형태인이온으로변환시켜야한다. 중성분자를이온으로변환시키는방법은크게 dd electron EI (electron impact) 방법과 Even electron soft ionization 방법이있다. EI 방법의경우, 텅스텐필라멘트에전류를흘려주어, 필라멘트의온도를높여줌으로써열전자 (thermal electrons) 을발생시키고, 이열전자를약 ~70 ev 로가속시켜중성분자와 (M) 충돌시켜이를 dd-electron 을가진양성분자로, 즉 M+, 만드는방법이다. 하지만, 이방법의단점을중성분자가충분히휘발성이어야기체상태로만들수있어, 이방법론을사용할수있다. 주로휘발성이강한유기분자의경우, 이방법론을사용하여이온화시킬수있다. 하지만, 최근에크게각광받고있는생명물질, 즉단백질또는 DNA와같은분자들은비휘발성분자이기때문에다른이온화방법이필요하다. 이와같은비휘발성분자를기체상태의이온으로만드는방법으로써 Electrospray Ionization (ESI) 방법과 MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) 방법이약 10 여년전에개발되었으며, 이공로로 Tanaka씨와 Fenn 교수가 2002 년노벨화학상을수여받았다. 이들두방법은위의EI 방법에비해중성분자에에너지를적게주는방식이기에이를 Soft Ionization method 라고부른다. 이실험에서이용될 ESI 방법은비휘발성분자를수용액 : 메탄올 : 아세트산혼합물에약 ~20 μm 농도로녹이고, 이용액에높은전압을걸어주며, 이를다시용액펌프를이용하여밀어줌으로써이온기체화할수있다. 이때,

아세트산의양성자가 (H+) 중성분자의산소또는질소원자에부착됨으로써양성전기를띠게되며, 이때이를 (M + nh) n+ 라고표기한다. 이 ESI 방법을이용할경우, 복수의양성자가중성분자에부착될수있으며, 이때에는복수의전기를띠게된다. 이현상들은다음의그림 1 에자세히표현되어있다. 그림 1. 전기분부경계면에서의이온방울형성 2-2 Ion trap Mass Analyzer 이온포집관은기체상태음이온이나양이온이포집관내에생성된전기장에서한 동안붙잡을수있는장치이다.

중앙에도우넛모양의고리형전극과한쌍의덮개형전극으로이루어진다. 가변성라디오진동수전위가고리형전극에걸리고두덮개형전극은그라운드로되어있다. 적당한 m/z 값을갖는이온은고리형전극주위의공간안에서일정한궤도로돌게된다. 라디오주파수전위가증가함에따라무거운이온의궤도는안정화되고가벼운것은불안정해져서고리전극의벽에충돌한다. 이온포집분석계는자기장이나사중극자기기보다튼튼하고, 작고, 값도싸다. 그림 2. 시판되는간단한이온포집관의단면도 2-2. Tandem Mass Spectrometry 질량분석기를이용해서기체화된시료를 fragmentation 하는것은여러가지이유가있다. 시료의구조분석, 단백질의염기서열분석, modified site 위치분석등다양한방법으로다양한목적에사용된다. 그중가장널리쓰이는방법인 Collision gas를이용한 CID (Collisionally Induced Dissociation, 혹은 CAD, Collisionally Activated Dissocaion) method가존재하는데, 이방법은분석하고자하는물질에영향을미치지않는 N 2, Ar, He 등을 collision gas 로이용하여시료분자에충돌을가함으로서분자내의내부에너지를증가시켜분자내의가장약한결합을끊는방법이다. 이렇게생성된이온분자들은각각 b, y ion 이라고명명하는데이두이온들은앞으로단백질의염기서열및단백질구조분석에있어서매우유용하게사용된다. 단백질의염기서열을구성하고있는각각의아미노산은 peptide bonding으로이루어져있는데, 이 peptide bonding이끊어지면서각각 N-terminal에서부터읽으면 b ion이, C-terminal에서부터읽으면

y ion이되는것이다. 다시말해, 같은부분이잘라져도어디서부터읽느냐에따라검출되는 m/z 값은서로다른결과로나타나는것이다. 이러한방법말고도 electron 을이용한 ECD (Electron Capture Dissociation), laser 를이용한 IRMPD (Infrared Multiphoton Dissociation) 방법이있다. 질량분석기에응용되는다양한 tandem MS 방법은그목적에따라다양하게사용될수있지만사용가능한방법이기기자체에따라제한적으로응용될수있으므로다양한방법을다양한질량분석기를통해사용함으로이에대한활용도를증가시킬수있다. 그림 3. Melittin 3+ ion 의 CAD 스펙트럼 위의스펙트럼에서보듯이 CAD 방법을이용하면 b, y ion 들만생성된다. 이러한 스펙트럼을분석함으로써단백질이나펩타이드의서열을분석할수있을뿐만 아니라단백질이나펩타이드의구조정보까지제공해준다.

그림 4. MS/MS 스펙트럼을해석하는것은작은퍼즐조각을맞추는것과흡사하다. MS/MS 스펙트럼에서얻어지는작은조각들사이의질량차을얻으면, 특정한숫자들을얻을수있게된다. 이들특정한숫자들은 20 개아미노산에해당하는숫자들이며, 이들로부터펩타이드들의시퀀스를알아낼수있다. Peptide Fragmentation Peptide: S-G-F-L-E-E-D-E-L-K MW 88 145 292 405 534 663 778 907 1020 ion ion MW b 1 S GFLEEDELK y 9 1080 b 2 SG FLEEDELK y 8 1022 b 3 SGF LEEDELK y 7 875 b 4 b 5 b 6 b 7 y 6 y 5 y 4 y 3 y 2 SGFL EEDELK 762 SGFLE EDELK 633 SGFLEE DELK 504 SGFLEED ELK 389 b 8 SGFLEEDE LK 260 SGFLEEDEL K 147 b 9 y 1

De Novo Interpretation Amino-Acid Residual MW Amino-Acid Residual MW A Alanine 71.03712 M Methionine 131.04049 C Cysteine 103.00919 N Asparagine 114.04293 D Aspartic acid 115.02695 P Proline 97.05277 E Glutamic acid 129.04260 Q Glutamine 128.05858 F Phenylalanine 147.06842 R Arginine 156.10112 G Glycine 57.02147 S Serine 87.03203 H Histidine 137.05891 T Threonine 101.04768 I Isoleucine 113.08407 V Valine 99.06842 K Lysine 128.09497 W Tryptophan 186.07932 L Leucine 113.08407 Y Tyrosine 163.06333 충돌에의해 specific bond cleavage 가광범위하게일어나게되는데, 이것의메커니즘은 아래와같이설명되어질수있다. 충돌에의해 Fragmentation 이일어나는원리는 아래에서묘사된 Potential energy curve 위에서설명되어질수있다. 버퍼개스와의 충돌에의해내부에너지가 vibrational energy 의형태로조금씩누적되며, 이것의결과로써 최종적으로가장약한화학결합이끊어지게된다. 이러한원리에의해, 충돌유발법에서는 specific cleave 가잘생성됨을이해할수있다. Collisional Activation Slow heating Electronic Excitation + VE Energy sudden activation Ion trap FTICR IRMPD MALDI TF-TF Vibrational Excitation Wysocki et al., Mass spectrometry of peptides and proteins Methods, 35 (2005) 211-222.

3-1. 전기분무이온화방법을위한 capillary tip 만들기 3-1-1. 실험개요 전기분무이온화 (Electrospray Ionization) 방법을이용하기위해필수적인 capillary tip 을직접제작한다. 이는 capillary 의 pore size 가수 μm 에서수 pm 까지다양한크기의 tip 을제작하여전기분무화방법에있어서가장효율이높은 tip 을제작하기위함이다. 만약 tip 의 pore size 가너무작으면 tip 이빈번하게막힐수있으므로적당한 pore size 로전기분무가잘되도록제작하는것이중요하다. 3-1-2. 실험준비물 Capillary tubing (360 μm D, 75 μm ID), Diamond Scriber, Tubing cutter, Torch, 접착력이강한테이프, Stand, 현미경, 그림 5. Tip 을제작하기위해필요한도구들

3-1-3. 실험방법 1 Tubing 을적당한길이 ( 약 10~15 cm) 로자른다른다음테이프를 이용하여스탠드에수직방향으로단단하게고정시킨다. 그림 6. 테이프로단단히고정시킨 tubing 2 테이프로고정시킨위치로부터약 4 cm 떨어진곳에 torch 로가열하고 다른한손으로는 tubing 의끝을잡는다. ( 매우뜨거우므로주의할것! 화상위험!)

그림 7. torch 로만들고자하는부분을가열한다. 3 Torch 로가열하여자르면 tubing 이두부분으로나뉘게되는데테이프로 고정시킨윗부분은끝이뾰족하므로테이프로잘감싸서버리고, 아랫부분은 현미경을이용하여준비해놓은 diamond scriber 를이용하여자른다. 3-2. ESI MS spectrum 및이에대한해석 3-2-1. Peptide 의 ESI 스팩트럼 아래그림은 H 2 :MeH:Acetic acid (49:49:1/v:v:v) 로묽힌 20 μm 의 venom melittin 의 ESI 스펙트럼으로분자량이다소크기때문에다중전하를띄는 m/z

값을나타난다. 각각의 m/z 값들은서로다른 M 값을가지는것이아니라 하나의분자량에대한다중전하를나타낸다는것을간단한계산을통하여알수 있다. 그림 8. Venom melittin 의 ESI 스펙트럼 3-2-2. 지질혼합물에대한 ESI 스펙트럼 아래의그림은돼지의뇌에서추출한지질혼합물에대한 ESI 스펙트럼이다. 질량분석기는위와같이다양한물질의혼합물인지질혼합물에대한정보를다양한범위에서보여주고있다. 이러한혼합물에포함되어있는각각의물질을어떻게규명하는가에대한방법을다음에서알아보도록하자.

그림 9. 지질혼합물에대한 ESI 스펙트럼 3-3. 단백질에대한구조분석 3-3-1. 실험개요 최근인간게놈의염기서열지도가완성됨에따라이에대한기능을완벽히파악하고자하는노력이가속화되고있다. DAN 의 transcription 이후에단백질생성에따른세포내의기능및구조에대한연구로프로테오믹스라는분야의학문이각광을받고있다. 이러한학문에있어서없어서는안될것중의하나가바로질량분석기이다. 기존의단백질을검출하는 2D-gel electrophoresis 등다양한방법이있지만질량분석기는검출되는질량값과 tandem MS 로얻어지는질량값을이용해해당단백질을 identify 할뿐만아니라 unknown 단백질의염기서열에대한정보까지제공할수있다. 본실험에서는간단한염기서열을갖는단백질을이용해서이에대한염기서열과이에대한질량분석스펙트럼을해석해보고자한다. 3-3-2. 실험준비물 단백질 (Venom melittin, Substance P, Bombesin, Angiotensin 등 ), Spatula, 3 차증류수, Methanol, Eppendorf tube, Pipette

3-3-3. 실험방법 1 준비한단백질을 H 2 :MeH:AA (49:49:1/v:v:v) 에 20 μm 로묽힌다. (AA - Acetic acid) 2 syringe 에용액을넣고유속을 0.5 μl/min 으로하여밀어주고질량분석기를이용하여검출한다. 3 N 2 gas를이용한 tandem MS 하고각각의단백질의염기서열을규명한다. 4 이론적인값과비교하기위해아래의웹주소에있는소프트웨어를사용한다. (https://prosightptm.scs.uiuc.edu/) 그림 10. Ion Predictor s/w 의염기서열입력란

그림 11. 임의의서열을입력했을때계산되는 b, y, c, z ion 값들 3-3-5. 분석방법 1 얻어진 CAD 스펙트럼을분석하여각각의 m/z 값에해당하는질량값을엑셀에테이블로작성한다. 2 ProSight PTM 에단백질의염기서열을입력하여해당염기서열의이론적인 b, y ion 값들을계산한다. 3 엑셀에입력한질량값과웹사이트에서얻어진질량값을서로비교하면서실험에서얻어진값들에대한 b, y ion 들을각각표시한다. 3-4. Tandem MS 를이용한지질의구조규명 3-4-1. 실험개요 일반적으로지질은생체내세포막에존재하는중요한물질로서체내에너지저장, 세포막의중요구성물질등의역할을하고있다. 또한이러한역할뿐만아니라 Alzheimer 나다른지질관련질병들의발병원인과치료에대한원천연구로서지질에대한연구가활발하게진행중이다. 이에따라질량분석기를

이용한 tandem mass spectrometry (Tandem MS) 로이러한지질의구조를 규명하는데본실험의목적이있다. R 1 C CH 2 R 2 C CH CH 3 - H 2 C P H 2 C H 2 C N + CH 3 CH 3 그림 12. Phosphatidylcholine 의구조 R 1 C CH 2 R 2 C CH - C - H 2 C P H 2 C C H NH 3 + 그림 13. Phosphatidylserine 의구조 3-4-2. 실험준비물 지질추출물 (Phosphatidylcholine, Phosphatidylserine 등 ), CHCl 3, Methanol, Spatula, Eppendorf tube, Pipette 3-4-3. 실험방법 1 준비된지질을각각 CHCl 3 :MeH (2:1/v:v) 에 20 μm로만들고, 만든용액의 1% 에해당하는 formic acid를넣는다. 2 syringe 에용액을넣고유속을 0.5 μl/min 으로하여밀어주고질량분석기를이용하여검출한다. 3 N 2 gas를이용한 tandem MS 하고각각의지질의구조를규명한다. 4 얻어진지질의질량값을 web database search 를통하여검증하고이에대한구조를최종확인한다.

5 또다른 web database 인 www.lipidmaps.org 를이용하여검색을해본다. 그림 14. http://lipidsearch.jp 의메인 search 화면

그림 15. 특정 m/z 값을입력했을때나타나는지질후보군 그림 16. www.lipidmaps.org 의 tool 에있는 s/w 초기화면

그림 17. 특정 m/z 값을입력했을때나타나는후보군들 3-4-4. 분석방법 1 1 차적으로지질의 head group 이떨어진 m/z 값을찾아야한다. 이를통해 databased 에서검색되는다양한종류의지질중특정종류로종을압축할수있다. 2 미리계산해둔지질의 chain 에해당하는질량값으로 CAD 스펙트럼에서지질의 chain 을규명할수있다. 3 규명된 chain 의길이와지질의종류를종합하여 database 에서얻어진결과와동일한값의지질후보군을찾아낸다. 4 lipidsearch 와 lipidmaps 는약간은서로다른정보를제공해주므로혼돈하지말고두 database 를같이검색해야한다.