감사단 얀대한임상병리사회지 : 제 19 권제 1 호 1987 Toluidine Blue-O 를이용한 DNase activity 에관한연구 신홍전문대학임상병리과 최승구설웹향대미교의규권종암뱀과향천리 섭 채박인Study of Toluidine Blue O-Mediated T

감사단 얀대한임상병리사회지 : 제 19 권제 1 호 1987 Toluidine Blue-O 를이용한 DNase activity 에관한연구 신홍전문대학임상병리과 최승구설웹향대미교의규권종암뱀과향천리 섭 채박인Study of Toluidine Blue O-Mediated Techniques for DN ase Detection Choi Seung Gu Department 01 Cli,γz. Pathology Shinheung Junior College K won Choung Kyu Departηzent 01 Microbiology, Soonchunhyang University Park In Jae Department 01 Cliη. Pathology, Soo η chunhyang Hospital = Abstract= The TBO studies were performed with various concentrations of dye to determine the optimal concentration for both bacterial growth and detection of DN ase activity. 1. v. vμ lnijicus no discernible indicating DN ase activity were evident from all concentration TBO. v. parahaemolyticμs showed pinkzone of TBO from 0.1%-0.025% DNase activity exhibited by 0.075% and 0.05% TBO were at maximal levels for V. parahaemolyticus DNase-positive organism. A. hydrophila showed pinkzone of TBO from 0.25% to 0.005% when the 0.005% TBO solution was used, DN ase activity was difficult to observe because the colors were too faint. 2. Effect of TBO on bacterial growth. A. hydrophila showed very little or no inhibition of growth at any concentration of TBO from 0.5%-0.005%. V. parahaemolyticus was inhibited completely when dye concentrations exceeded 0.075% but showed no inhibition in the presence of 0.025% TBO. V. νμ ln 짜 cμs was inhibited completely when dye concentrations exceeded 0.025 % but showed no inhibition in the presence of 0.01% TBO. -156-

3. Detection of DN ase activity with TBO in coporated in to the DN ase test agar affected the ability to detect DN ase ability. v. vuln 껴 :cus growth when dye concentration of TBO from 0.01% to 0.005% but no discernible pinkzones indicating DN ase activity were evident. V. parahaemolyticus showed positive reaction significantly on TBO containing DNase agar. from 0.05% to 0.005%. The production of DN ase by V. parahaemolyticμs was partially masked on plates containing 0.05% TBO. A. hydγophila showed positive react significant on from 0.25% to 0.005% TBO containing DNase agar. 1. 서론 Toluidine blue 0 ( 이하 TBO) 변형색소의특성은 DNase 생성하는셰균을검출하는데이용된다. DNase 검사방법은 DNase agar 에서자란접락 위에 0.1% TB06) 를점적하는방법과 0.01% TBO 를함유한 DNase agar 에서 DNase 생성끌을검출 하는방법이사용되었다 1 싫, 6, Streitfeld plate-f1ooding 볍 6) 에의하면 TBO 농 도를 0.1% 에서 0.05% 로낮추면착색정도를쉽게 조절할수있고과도한착색으로인한 DNase 양성 반응이받는방해를줄일수있으며또한미약한 DNase 반응이라도더민감하게검출할수있다. TBO 를혼합시킨 DNase agar 방법에서 TBO 색 소함량을감소시키면일부세균의 DNase 활성을증 가시키므로 DNase 양성반응을더정확하게알수 있다. 본실험의목적은 TBO 를함유한 DNase agar 에 서 DNase 생성을정확하게검출함은물론 TBO 의 최적농도를결정하는데있다. 또한 TBO 를이용한 정적법에서 DNase 활성을검출하기에필요한 TBO 의최척농도를결청하는데있다. 11. 실험재료및방법 본실험에서사용된균주는충남 S 병원에서 1986 년 7, 8, 9 월에검출된것이다. 굵주는 V. vμ lnificus ( 4 예 ), V. parahaemolyticμs(14 예 ), A. hydγophila (5 예 ) 를이용하였 고 blood agar 에서 35 0 C 에서 18 시간배양한후실험 에이용했다. DNase 검사용배지는 Difico 회사제 품을지시에따라제조하 DNase agar 에접종 하는집락의양은 loop 를이용하여집락의상층부분 이나 slant 위에서자란접략을살짝접촉한후 DNase agar 에접종하 TBO 정적에의한 DNase 활성검출법을위하여사용된 TBO 의농도는 0.5, 0.25, 0.1, 0.075, 0.05, 0.025, 0.01, o. 0075, 0.005% 로희석하여사용했다. DN ase agar plates 에 V. vμlμ 힘 cμs 와 V. parahaemolyticus 맺 A. hydrophila 권주흘정종하여 35 0 C 에서 24 시간배양했다. 배양시킨후한방울의 TBO 용액을 plate 에정적 (f1 ood) 해서 30 분기다린 후 royal-blue 배경에서집락주위의밝은 pinkqj 를 양성반응으로판정하였고배경색조가변하지않으 면 DNase 음성반응으로판정하 TBO 를함유한 DNase 배지에서의 DNase 실험법 은색소농도를 o. 5, 0. 25, 0.1, 0. 075, 0. 05, O. 025, 0.01, 0.0075, 0.0005% 의 9 단계로희석하여 배지에첨가시켜고압멸균후사용하 V. vul:η ificus, V. parahaemolyticμs 및 A. hydrophila 균주를접종하여 35 0 C 에서 24 시간배양 하 DNase 생성균주는 royal-blue 배경에서접 락주위에밝은 pink 대가나타나면양성반응이고, 배 경의색조가변하지않으면 DNase 음성으로판정하 川. 실험성적 TBO 를이용한 DNase activity 캠샤에서 TBO 로 정적하는방법은 V. parahaemolyticus 는 0.075-0. 05%, TBO 농도에서 pinkqj 가가장선명하였고검 출율이높았다. V. vuln 휩 cμs 는양성반응이전혀나타나지않았 고, A. hydrophila 는 0.5% 를제외한 0.25- O. 005% 의 TBO 농도에서 DNase 생성하는것을보여 주고있으나 0.0075% 와 0.005% 에서는양성반응인 pink 대를확인하기가어려웠다. TBO 는함유된 DNase agar 에서균주성장효과의 성적은 table 2 와같다. V. parahaemolyticus 는 0.05% 의 TBO 에서 42% 양성이고, 0.0025-0.005% TBO 농도에서 100% 성장을보였으므로 TBO agar 에서최척의성장농도 는 o. 025-0. 005 % 임을알수있다. V. vμ ln 쩌 cus 는 0.01%-0.005% 에서성장했고퍼

Table 1. DN ase detection by flooding DN ase test agar with TBO Organism Activity detected with dye concentration (%) 0.5 0.25 0.1 0.07 0.05 0.025 0.01 0.0075 0.005 V. parahaemolyticμs + (4) + (14) + (14) + (11) V. vμlη ificus A. hydrophila +(5) + (5) + (5) + (5) +(5) + (5) + + Table 2. Growth on TBO-containing DN ase plates Organism Growth with final dye concentration (%) 0.5 0.25 0.1 0.075 0.05 0.025 0.01 0.0075 0.005 V. parahaemolyticμs (14) NG NG NG NG + (6) + (14) + (14) + (14) + (14) V. vμ lnificus (4) NG NG NG NG NG NG + (4) + (4) + (4) A. hydrophila (5) NG +(5) + (5) +(5) + (5) + (5) + (5) + (5) + (5) 2NG: No growth Table 3. Detection of DNase activity with TBO-containing DNase plates Organism Activity detected with final dye concentration (%) V. parahaemolyticμs (14) V. vuln 쩍 cus (4) 0.5 0.25 0.1 A. hydγophila (5) 十 (5) +(5) 0.07 0.05 0.025 0.01 0.007 0.005 十 (4) + (14) + (14) + (14) + (14) 十 (5) + (5) +(5) + (5) + (5) +(5) A. hydrophila 는 0.25-0.005% TBO 농도에서성 장을보여주 TBO 를함유한배지에서의 DNase 활성검출방법 의결과는 table 3 과같으며 V. parahaemolyticμs 는 0.05-0.005% TBO 농도에서양성을보였는데 V. vμ lnificus 는 0.5-0.005% TBO 전농도에서 음성을보이고있어서 V. parahaemolyticus 보다 DNase 활성이미약한것을알수있었다. 또한 A. 껴 drophila 는 0.25-0.005% TBO 농도 에서 pink~ 를형성하여양성반응을보였으며, V parahaemo lyticus 와 V. vuln 쩌 cus 보다 DNase 활성 이강한것으로나타났다. IV. 고안및고찰 변형색소인 TBO 는다른물질과 3, 4) 흔합되면본래 의정색성착색분광이나변색성착색분광을보인다. TBO 는가수분해되지않은 DNA 가존재할때 royal blue 를나타내며가수분해된 DNA 가존재할 경우는색의분광을 pink 로바꾸어주는 mononucleotide 나 oligonudeotide 와의복합물을형성한다, 1,7) Bright pink 는 TBO 의변색성염색양상이다. 그 러므로 medium 내로합성된 DNA 를가수분해하는 DNase 생성균들은 agar 의색을 royal blue 에서 bright pink 로바꾸어준다. ]AMES 등은 0.1% TBO 농도는 TBO 점적법을 사용했을경우 DNase 활성을결정하는최적농도가 아니며, 0.075 와 0.05% 의농도에서모든 DNase 양 성균주의활성이가장잘나타난다고보고하였다 1, 6) 본실험에서도 V. parahaemolyticus 경우 O. 075% 와 0.05% 의농도에서최적의양성반응을나타 냈다. 또한 A. hydrophila 는 0.25-0.005% 의 TBO 농도에서양성반응을보여주고반면에, V. Uμlη ificus 에서 0.5-0.005% 의 TBO 전농도에서 양성반응을볼수없었다. 이는균주마다의 DNase 활성이다르기때문인것으로샤료된다. 반면 V. vμlη 껴 ~cus 경우 TBO 함유 DNase 배지 방법을이용하여 DNase 활성을검출하려는시도는 -158-

만족하지못하였으며, 그이유는 TBO 색소가함유 한배지에서의성장도가미약하고 TBO 의과도한 착색으로인하여 pink 색이분명하게나타나지않기 때문이다. Janes 등 1) 은 TBO 를함유한 DNase 배지상에서 세균의성장빛 DNase 활성검출이 0.025- O. 0025% 의농도에서최적의반응을나타냄을보고하 였으며본실험에서도 V. parahaemolyticus 는 O. 05-0.005% 농도에서성장을하고 DNase 양성반 응을보여서 JAMES 등의연구와거의일치하 A. hydrot 새 zila 에서는 0.25-0.005% 까지성장및 양성반응을보였고, V. vμ ln 힘 cus 는 0.025% 이상 에서성장이완전억제되었으며 0.01%, 0.0075%, 0.005% TBO 농도에서약한양성반응을보였으며 DNase 반응은 9 개의각기다른 TBO 농도에서검 출하지못했다. TBO 점적방법에서는종전의 0.1% 보다는대체적 으로 0.075%, 0.05% 의 TBO 농도를이용하는것 이좋은것으로나타났으며, TBO 를함유한 DNase 배지에서세균의성장은 TBO 의농도 0.01-0. 005% 에서최적을보이고 DNase 생성의최적 TBO 농도는 0.01-0.005% 로나타났다. 본실험에서 DNase 활성의강한정도는 A. hydrophila 가가장강하고, V. vulnificus 와 V parahaemo lyticμs 경우 TBO 점적법과 TBO 를함 유한 DNase 배지법모두다른보고자와일치하 그리고 A. hydrophila 의 DNase 생성의활성이강 하여어떠한 TBO 농도에서도잘검출되기때문에 TBO 농도는 0.25-0.005% 까지어느것을사용해 도무방하다고생각되나 TBO 농도가낮은것이판 독하기쉬운것으로사료된다. V. 결론 충남 S 병원에서 1986 년 7, 8, 9 월에분리한 V. Uμ ln 힘 cμs(4 예 ), V. parahaemolyticμs(14 예 ), A hydrophila ( 5 예 ) 를가지고 TBO 점적법과 TBO 를 DNase 배지에혼합시키는방법으로 DNase 활성을 측정했다. TBO 에대한연구는세균의성장과 DNase 활성 측정을위한최적색소농도를결정하기위하여다양 한색소농도를가지고시행하 1. TBO 를 DNase 배지에점적시키는방법의결 과는 0.5% 상의 TBO 용액에서는 DNase 활성을 볼수없으며모든배지가 dark blue 였고, 0.5% 미 만의 TBO 용액에서는 DNase 활성을다양하게보여 m ω주었다. V. vμlη 힘 cus 는 TBO 전농도에서 pink 대를볼 수없었고, V. parahaemolyticus 는 0.1% 에서 O. 25% 까지 pink~ 를형성하여양성반응을보이고최 적농도는 0.075% 와 0.05% A. hydrophila 는 0.25% 에셔 0.005% 까지양성반 응을보이고있으나 0.0075% 와 0.005% 에서는 TBO 농도가너무낮아양성반응의확인이곤란하 2. TBO 함유배지에서의세균의발육상태는 A. hydrophila 0.25%-0.005% 범위의어떤 TBO 농도에서도성장이억제되지않았고 V. parahaemolyticμs 에서는 0.075% 이상일때는성장이완전 히억제되고 0.025% 이하에서는아무런억제현상이 없었다. V. vulη 힘 cμs 는 0.025% 이상에서는성장이완전 히억제되고 0.01% 이하에서는아무런억제가없 다. 3. TBO 를함유한 DNase 배지에서의 DNase 활 성검출법에서 TBO 의농도는 DNase 활성검출능력 에영향을끼친다. V. vμ lnificus 경우 TBO 를함유한 DNase agar plate 에서 o. 01-0. 005 % 까지성장을하나 DNase 활성을보이는분명한 pink q] 는확인할수없었다. V. parahaemolyticus 에의한 DNase 생성은 O 05-0.005% 까지양성반응을보였고, 0.05% TBO 농도에서는부분적으로 DNase 생성의양성반응이 가리워지는경향이있다. A. hydrophila 경우 0.25-0.005% 까지 DNase 생성을나타내는 pink q] 의양성반응을볼수있었 다. 잠고문헌 1. J. Waller, Susan L. Hodel and Raon. N uti : Improvement of two toluidine blue 0 -mediated technique for DN ase detection. J ournal of Clinical Microbi 이 ogy, 195-199, 1985. 2. Lachica, R. V. F., C. Genigeorgis, and P. D. Hoeprich: Metachromatic agar-diffusion methods for detecting Staphylococcal nuclease activity. Appl. Microbiol. 21 585-587, 1971. 3. MacFaddin, J. F. : Biochemical tests for identification of mdeical bacteria, 2nd ed., p. 103. The Williams & Wilkins Co.,

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