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Cloning

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α α α α α

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cdna의신장반응이저해된다. 이와같이 AMV 유래 RTase 와 MoMLV 유래 RTase 는모두일장일단을가지나필자는 MoMLV 유래 RTase 를선호한다. 또두효소는최적 ph, 최적염농도등에서도차이가있으므로주의해야한다. 최근 Myers 등은 RTase 활성과 PCR

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고품격 cdna 합성을위한 RT Kit M-MLV RTase 의 RNase H domain 에 mutation 시키므로 RNase H activity 를낮추고, mrna 의 degradation 을방지하여 cdna 합성효율을높임 d... qpcr RT Kit 의 cdn

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Cloning=Clontech In-Fusion Cloning

Pharmacotherapeutics Application of New Pathogenesis on the Drug Treatment of Diabetes Young Seol Kim, M.D. Department of Endocrinology Kyung Hee Univ

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국문초록 약물수송체 (Drug transporter) 는여러장기에분포되어있으며, 약물의흡수, 분포와배설에크게기여한다. 또한약물수송체를유도하거나저해하는약물상호작용 (Drug-drug interaction) 은약물대사의변화에중요한역할을한다. 이때문에미국 FDA는약물상호작용에많은영향을미치는약물수송체 7가지를선정하여, 신약개발과정에서후보물질이이들수송체의기질혹은저해제로작용하는지조사단계가필요하다고명시하고있다. 약물상호작용은 in vivo 상으로관찰하는것이가장정확하나, 비용도많이들뿐더러위험하므로그에앞선 in vitro 실험으로불필요한 in vivo 실험을방지할필요가있다. 따라서 rat의 in vitro 약물상호작용평가체계가구축되어있다면 rat과 human의 in vitro 자료의상관성을이용하여, 직접적으로구하기힘든 human에서의 in vivo 상호작용결과를예측하는데큰도움이될것으로기대된다. 본실험에서는그러므로 FDA 선정 7가지수송체중하나인 MDR1 (P-glycoprotein) 에해당하는 rat에서의 mdr1a를 cloning 하기로하였다. Rat mdr1a가많이발현된 liver RNA로부터 Reverse transcription과 PCR(Polymerase Chain Reaction) 을통해 mdr1a를 coding하는부분을증폭시켰다. 그리고 PCR을통해얻은 mdr1a DNA를 pcdna5/frt vector 내로 cloning 하였다. 완성된 rat mdr1a clone을 MDCK II/FRT cell에 transient하게 transfection하였고, RT-PCR을통하여 mrna 1

발현을확인하였다. 이어서 function study를하였는데, mock cell과 mdr1a transfected MDCK II/FRT cell 간에유의적인 function의차이를관찰하지못하였다. 여러원인이존재할수있는데, 이를보완하면 stable한 rat mdr1a-mdck II/FRT cell line을확보할수있을것이라생각된다. 확보한 rat mdr1a cell line은후에신약개발단계에서약물상호작용평가에쓰일수있을것으로기대된다. 주요어 : mdr1a, cloning, 약물상호작용 학번 : 2012-21610 2

목차 국문초록... 1 1. Introduction... 5 1.1. 약물수송체 (Drug transporter)... 5 1.2. MDR1 (P-glycoprotein; ABCB1)... 5 1.3. Rat mdr1a... 6 1.4. 약물상호작용 (DDI)... 7 1.5. In-vitro studies... 9 2. Materials... 12 3. Methods... 14 3.1. Reverse transcription (RT)... 14 3.2. Polymerase Chain Reaction (PCR)... 15 3.3. PCR purification... 17 3.4. Enzyme digestion and Ligation... 17 3.5. Transformation... 19 3.6. Liquid culture... 19 3.7. Miniprep... 20 3.8. Sequencing... 20 3.9. Transient Transfection... 21 3.10. RT-PCR... 22 3.11. Function test... 23 3

4. Results... 26 5. Discussion... 30 6. Reference... 33 Abstract... 35 4

1. Introduction 1.1. 약물수송체 (Drug transporter) 약물수송체는체내의여러조직에다양한정도로분포되어있고, 약물과같은외인성및내인성물질의흡수 (Absorption), 분포 (Distribution), 배설 (Excretion) 에중요한역할을하는막단백질이다. 수많은연구들에의해서, 약물수송체는약물의안정성 (safety) 과유효성 (efficacy) 에있어서중요한역할을한다고알려져있다. 따라서, 약물개발단계에서는 [ 그림1] 에서표시된것처럼장 (intestine), 간 (liver), 신장 (kidney) 의상피세포, 그리고혈액뇌장벽 (blood-brain barrier) 의내피세포에발현된약물수송체들에대한자세한관찰이필요하다.(Giacomini, Huang et al. 2010) 총 400 개이상의막수송체들이존재하는데, 이를특성에따라서두개의 superfamily로나눌수있다 ; ATP-binding cassette(abc), SLC(solute carrier). 약물수송체는약물대사효소 (drug metabolizing enzyme) 와더불어약물상호작용 (drug-drug interaction; DDI) 의관점에서도중요성이부각되고있다. 1.2. MDR1 (P-glycoprotein; ABCB1) P-glycoprotein (P-gp) 는 ATP-binding cassette family에속하는 transporter로서, 인간에서는 ABCB1 gene으로부터발현된다. P-gp는 5

MDR1(multidrug resistance 1) 이라고도불린다. MDR1은 efflux pump 로작용하는데 ( 그림 2), ATP를가수분해하여얻어지는에너지로약물을능동수송한다. 이름에서도알수있듯이, MDR1은다중약물에내성을나타내는암세포에발현되어있고, 이외에도간, 신장, 소장, 뇌등의정상조직세포에도발현되어있다. MDR1은약물의생체내이용률 (oral bioavailability), 분포 (distribution), 배설 (excretion) 에중요한역할을한다는사실이동물실험을통해서입증되었다. 수많은약물들이 MDR1 의기질로써수송되는데, 이들중다수는또한 Cytochrome P450(CYP) 3A4의기질이기도하다. MDR1 기질로는 docetaxel, paclitaxel 등의항암제와, diltiazem 등의고혈압약, digoxin과같은항부정맥제등이있다. (Marzolini, Paus et al. 2004) 이처럼많은약물들을기질로가지고있는 MDR1은양친매성 (amphiphilic) 물질들을방출 (efflux) 시킴으로써다수약물의약물동태 (pharmacokinetics) 와조직분포 (tissue distribution) 에영향을미칠수있다. 그러므로예기치않은약물동태의변화와, 원치않는임상적결과를확인하기위해서약물개발의초기단계에서 MDR1과약물의상호작용은반드시고려되어야한다. (Ambudkar, Kim et al. 2008) 1.3. Rat mdr1a 6

사람의 MDR1은 1280개의아미노산으로이루어져있고, 간세포의모세담관 (liver bile canaliculi), 신장의근위세뇨관 (kidney proximal tubules) 의 apical side, 대장과소장 (large and small intestine), 혈액뇌장벽 (blood-brain barrier; BBB), 대뇌피질 (cortex), 해마 (hippocampus), 소뇌 (cerebellum), 척수 (spinal cord), 고환 (testes), 자궁내막 (endometrium) 과태반 (placenta) 등에발현이되어있다. (Marzolini, Paus et al. 2004) 그반면에 rat에서는 MDR1이 mdr1a(abcb1a) 와 mdr1b(abcb1b) 두가지의형태로존재하며, 분포양상도다르다. Rat에서는심장 (heart), 폐 (lung), 흉선 (thymus) 과비장 (spleen) 에는비슷한정도의 mdr1a와 mdr1b가둘다발현되어있다. 그러나, 장, 혈액뇌장벽 (BBB) 과혈액고환장벽 (blood-testes barrier; BTB) 에는 mdr1a만발현되어있고, 부신 (adrenal gland), 임신한자궁 (uterus), 난소 (ovaries) 에는 mdr1b만발현되어있다. Rat의 mdr1a gene sequence는인간의 MDR1과 86.6% 의높은일치율을보이고, rat mdr1b는인간의 MDR1과 80.4% 의일치율을보인다. (Ambudkar, Kim et al. 2008) 1.4. 약물상호작용 (DDI) 최근들어약물수송체로인한상호작용사례들이보고되면서, 특히신 약개발단계에서각종약물수송체와의약물상호작용연구의중요성이커 7

지고있는추세이다. 어떤약물수송체의저해제나유도체로작용하는약물을동일한약물수송체의기질로작용하는약물과동시투여시, 기질약물의체내동태양상이크게변할수있다. (U.S department of Health and Human Services 2012) 예를들어서, efflux 약물수송체인 MDR1(P-gp) 는많은약물상호작용 (DDI) 에관여한다. 강심배당체인 digoxin은신장 (kidney) 에서사구체여과 (glomerular filtration) 과능동분비 (active secretion) 로배설된다. MDR1은 Digoxin의체내약물동태에중요한역할을한다는여러연구가보고되었다. (Kawahara, Sakata et al. 1999) 좁은치료지수 (therapeutic index) 를가지고있는 digoxin은심각한부작용을초래할수있다. 그렇기때문에 MDR1에의한 digoxin과다른약물과의상호작용은주의깊게관찰되었다.(li, Anderson et al. 2006) 항부정맥제인 quinidine은 MDR1의저해제로작용하여, 기질인 digoxin과동시투여시 [ 그림 3] 에서보듯이혈중 digoxin의농도를 2-3배높이게된다. 이런경우, digoxin 중독증상이나타나므로투여시주의를기울여야한다. 최근, transporter로인한약물상호작용 (DDI) 들이관찰되면서, FDA에서는주요하게작용하는 transporter 7가지를선정하여, 약물개발시이들 transporter와의작용을자세히관찰하도록권고하였다. 선정된 7가지 transporter에는 SLC transporter 5가지 (OATP1B1, OATP1B3, OAT1, OAT3, OCT2) 와 ABC transporter 2가지 (p-gp, BCRP) 가있 8

다. FDA 에서는약물개발시, 약물이 transporter 의기질이나저해제로 작용하는지조사가필요하다고명시했다. (U.S department of Health and Human Services 2012) 1.5. In-vitro studies 약물상호작용을평가할때에는임상적인약물동태학적 data와함께, in vitro study 결과가유용하게쓰일수있다. In vitro study 결과는추가적인 in vivo study를사전에차단하는 screening system으로작용할수있고, 임상적인실험 design의기본을제공하는역할도한다. (U.S department of Health and Human Services 2012) 그러므로, in vivo 실험에앞선 in vitro 실험에쓰일 transporter system의필요성이있다. 또한, rat의 in vitro 약물상호작용평가체계가구축되어있다면 rat과 human의 in vitro 자료의상관성을이용하여, 직접적으로구하기힘든 human에서의 in vivo 상호작용결과를예측하는데큰도움이될것으로기대된다. 따라서, 본실험에서는 FDA 선정 7가지수송체중하나인 MDR1 (P-glycoprotein) 에해당하는 rat에서의 mdr1a를 cloning 하기로하였다. 9

[ 그림 1] 주요장기에분포하는약물수용체 (Giacomini, Huang et al. 2010) 10

[ 그림 2] P-gp(MDR1) 의구조와기능 (Marzolini, Paus et al. 2004) [ 그림 3] Plamsa 와 brain 에서 digoxin 을단독투여하였을때와 digoxin 과 quinidine 동시투여하였을때농도그래프 (Fromm, Kim et al. 1999) 11

2. Materials Rat liver total RNA (Takara) Primescript 1st strand cdna Synthesis Kit (Takara) Ex taq polymerase (Takara) Phusion High-Fidelity PCR Kit (Thermo Scientific) WelPrep Gel Extraction Kit (Welgene) WelPrep Plasmid Miniprep Kit (Welgene) CoreOne PCR Purification Kit (Corebio) The Original TA Cloning Kit pcr 2.1 vector (invitrogen) pcdna5/frt vector (invitrogen) 10xM buffer, KpnI, XhoI (Takara) DNA ligation mix <Mighty mix> (Takara) E.coli HST08 Premium Competent Cells (Takara) AbleK Competent Cells (Agilent Technologies) SURE2 Competent Cells (Agilent Technologies) MAX Efficiency Stbl2 Chemically Competent Cells (invitrogen) S.O.C. media (Takara) LB media <Tryptone 5g, NaCl 5g, Yeast extract 2.5g in 500ml, 고체배지인경우 agarose 첨가 > (Beckton-Dickinson) MDCK II/FRT cell 12

FuGENE HD DNA transfection reagent (Promega) RNeasy Mini Kit (Quiagen) [ 3 H]digoxin (Perkin elmer) Digoxin (Sigma) Bradford reagent (Biobasic) Transport media <Hank s Balanced Salts 9.7g, HEPES 2.38g, Glucose 1.95g, NaHCO3 0.35g in 1L TM> (Sigma) 13

3. Methods 3.1. Reverse transcription (RT) Rat의 mdr1a가존재하는 rat liver total RNA(Takara) 를 source로하여 cdna를얻을수있는 reverse transcription 반응을진행하였다. Primescript 1 st strand cdna Synthesis Kit(Takara) 를사용하였고, 반응에필요한 material과조건은각각아래 [ 표 1], [ 표 2] 와같다. [ 표 1] Reaction mixture required for Reverse transcription(rt) Materials Volume( μl ) RNase free water 6 First step dt primer 1 dntp 1 Rat liver total RNA 2 5X buffer 4 Second step inhibitor 0.5 RTase 1 FDDW 4.5 Total 20 14

[ 표 2] Condition of Reverse transcription (RT) Temperature ( ) Time(min) First step 65 5 Ice incubation 1 Second step 42 60 95 5 3.2. Polymerase Chain Reaction (PCR) Reverse transcription 반응으로부터얻은 cdna를 template로하여얻고자하는부분의 DNA만증폭시키기위하여 PCR반응을진행하였다. Rat mdr1a의 CDS는 86번부터 3904번까지였는데, 이를포함하도록 primer 를제작하였다. 제작시, forward primer 의 5 end 에는 KpnI site 를붙였고, reverse primer 의 5 end 에는 XhoI site 를붙였다. PCR 반 응에사용된 primer, 반응에필요한 materials 그리고반응조건은각각 아래 [ 표 3], [ 표 4], [ 표 5] 와같다. PCR 은 Takara 의 Ex Taq 를사용하여진행하였다. [ 표 3]PCR 에사용된 primer 15

Primer Forward primer Reverse primer Sequence 5 -CGA GGT ACC GTA GAG ACA CGT GAG GTC GTG-3 5 -GTT CTC GAG TAA CAT CTC GCA TGG TCA CAG-3 [ 표 4]PCR Reaction mixture Materials Volume ( μl ) RNase free water 14.15 10x buffer 2 dntp 1.6 cdna 1 Primer(forward/reverse) 0.5/0.5 Ex Taq polymerase 0.25 Total 20 [ 표 5]Condition of PCR reaction Temperature ( ) Time Cycles 94 5 min 1 94 30 sec 62 30 sec 72 5 min 30 72 10 min 1 16

3.3. PCR purification PCR 반응후젤전기영동을통해서 DNA 크기를확인하였다. 약 4000bp정도의 band로크기가맞는것을확인하였고, PCR purification kit(corebio) 을사용하여불순물을제거하고 PCR product을높은순도로얻었다. 3.4. Enzyme digestion and Ligation Purification을거친 PCR product을 KpnI과 XhoI으로 double digestion을하였고, pcdna5/frt vector( 그림 4) 도마찬가지로 KpnI 과 XhoI으로 double digestion을하였다. [ 그림 4] pcdna5/frt vector map marked with digestion sites 17

Double digestion 반응은아래 [ 표 6] 과같은조성으로 mixture 를만 들어 37 에서 1 시간동안 incubation 을진행하였다. [ 표 6] Double digestion mixture Materials KpnI XhoI 10x M buffer DNA FDDW Total Volume 1 μl 1 μl 2 μl 1 μg up to 20 μl 20 μl Double digestion을통해얻은 linear 한형태의 DNA insert와 pcdna5/frt vector를 ligation하여 circular하게만들었다. Ligation mixture는아래 [ 표 7] 과같은조성으로만들어 16 에서 2시간동안 ligation 반응을진행하였다. [ 표 7] Ligation mixture Materials pcdna5/frt vector DNA Amount 25fmol = x μl 250fmol = y μl 18

Ligation mix(takara) Total (x+y) μl Between 10 and 20 μl 3.5. Transformation Ligation 반응을통하여얻은 circular한형태의 vector를 competent e.coli cell안으로 Transformation을하였다. 실험에사용한 competent cell은 invitrogen의 MAX efficiency Stbl2 chemically competent cell 이었다. Transformation은다음과같은순서로진행되었다. 가장먼저, prechilled EP tube에 Stbl2 competent cell 30μl와 ligation mix 10μl을넣고얼음상에서 30분간 incubation을하였다. 이후, 42 수욕상에서 25초동안 heat shock을진행하였고, 바로얼음상에서 2분동안 incubation을하였다. S.O.C medium을 400μl를첨가한후에실온에서 2시간동안 shaking을하였다. 이때, 실온은 20~25 사이로유지하였다. 끝으로배양된 e.coli cell을 100μg / ml ampicillin이첨가된 LB 고체배지에 spreading 하였고, 이를실온에서이틀이상배양하면서 colony가생기는지관찰하였다. 3.6. Liquid culture Transformation 결과 colony 가나타난경우 liquid culture 을진행하였 19

다. Liquid culture는 ampicillin 2.5μl (100μg/ ml ) 를첨가한 LB media 5ml에 white tip으로 colony를떠서 tip채로 media에넣었다. 그리고실온에서하루동안 shaking incubation을하여액체배지상에서다량의 E.coli를확보하였다. 3.7. Miniprep 얻은 Liquid culture product에 Welgene의 miniprep kit을사용하여 miniprep 과정을진행하였다. Kit를사용하여 cell을 lysis하고이어서 neutralization 함으로써 plasmid DNA를얻을수있었다. 결과물을 gel 에 loading 하고 ladder와함께전기영동을하여대략의크기를파악하였다. 3.8. Sequencing Miniprep 결과목표로하는 product와비슷한크기가관찰되면, 이를외부업체를통하여전체 sequence 분석을하였다. Rat mdr1a의큰크기때문에한번에 sequence 분석이되지않아서분석용 primer 5개를추가적으로제작하여 sequencing을의뢰하였다. Sequencing을통하여전체적인 sequence와 mutation의여부를확인하였다. 20

3.9. Transient Transfection 본실험에서는 Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell의 chromosome에 FRT site를삽입하여본실험실에서만든 MDCKII/FRT 세포를사용하였다. MDCK cell line은다자란후에 monolayer를형성하고, 자체적으로발현하고있는 transporter가적은특성을지니고있다.(cereijido, Ehrenfeld et al. 1980) Promega 사에서공급하는 FuGENE HD DNA transfection reagent 를사용하여 transfection을진행하였다. 우선 24 well plate 에본실험실에서만든 MDCKII/FRT cell 을 5x10 5 cell/well 의농도로 seeding 을한후, 37 C, 5% CO 2 incubator 에서하 루동안배양하여세포의 confluency 가 70~90% 정도되는지를현미 경을통해확인하였다. Transfection mixture를만들기위한 DNA : transfection reagent의비율을 1 : 3으로제조하였다. 먼저 DNA의경우 rat의 mdr1a gene이삽입된 pcdna5/frt vector 1 μg과 pog44 vector 1 μg을준비하였다. 여기에 transfection reagent를 6μl를넣고나머지를 serum-free media로채워총 100μl의 transfection mixture를제조하였다. 대조군으로서앞의과정에서 rat의 mdr1a gene이삽입된 pcdna5/frt vector 대신에 rat의 mdr1a gene이삽입되지않은 pcdna5/frt 21

vector를넣어같은방법으로 transfection mixture를제조한후, 30분간상온에서 incubation하였다. 이후각실험군마다 well에각각 13μl씩의 transfection mixture를넣었다. 7개의 well을준비하여 6개의 well을 uptake 실험에사용하고, 1개의 well을 RT-PCR실험에사용하 였다. 다음실험을위하여 24 시간동안 37 C, 5% CO 2 incubator 에서 배양하였다. 3.10. RT-PCR Transfection을통해 MDCKII/FRT cell에 rat mdr1a가발현되었는지 RT-PCR을통해 mrna 수준에서확인해보았다. mrna 확인을위해서 Quiagen의 RNeasy Mini Kit을사용하여세포내 RNA를추출하였다. 추출한 RNA를 template로하여 RT-PCR을진행하였고, 이에사용될 primer는아래 [ 표 8] 과같이제작하였다. Control로는 housekeeping gene인 canine GAPDH을사용했고, 이의 primer는아래 [ 표 8] 과같이제작하였다. [ 표 8] Primers for RT-PCR Gene Direction Primer Rat Forward 5 - ACTGCCTGAGAAATACAACA-3 22

mdr1a GAPDH Reverse Forward Reverse 5 -GTTCTCGAGTAACATCTCGCATGG TCACAG-3 5 -AACATCATCCCTGCTTCCAC-3 5 -GACCACCTGCTCAGTGT-3 3.11. Function test Transfection을통해 MDCKII/FRT 세포에 mdr1a가발현이되어작동을하는지를살펴보았다. Mdr1a은기질이되는물질을세포내부에서외부로수송하는 efflux 수송체이다. Mdr1a를 transfection 하지않은세포와, mdr1a을 transfection한세포에서기질물질이수송되는양을측정하여비교하였다. 또한 mdr1a의작동에영향을미치는 inducer 물질을기질물질과동시에각세포에처리하여기질물질의수송에어떤영향을미치는지를알아보았다. 세포내에 uptake되어남아있는기질물질의양을측정하여, 남아있는기질물질의양이적을수록 mdr1a에의해더많은양의기질물질이수송되어 efflux된것으로가정하고, 각세포의수송능력을비교하였다. 기질물질로는 digoxin을사용하였고,(kim 2002) inducer로 rifampicin을사용하여 digoxin과동시에처리하였을경우 mdr1a의활성이증가하는지실험하였다. 앞선 transfection 과정에서대조군 (pcdna5/frt transfected 23

MDCKII/FRT cell) 과실험군 (mdr1a-pcdna5/frt transfected MDCKII/FRT cell) 을준비하였다. Transfection 한후하루를배양하여 70~90% 의 confluency를보이는것을확인하고 uptake실험을진행하였다. 먼저배지를제거하고두차례에거쳐 PBS로남아있는배지를세척하였다. 그리고 TM(Transport media) 을넣고 30분동안 37 에서 pre-incubation을하였다. 약물은아래 [ 표 9] 와같이준비를하였다. 기질로는 1 μm digoxin을사용하였고, 여기에분석을위한방사성동위원소물질로서 [ 3 H]digoxin (Perkin elmer) 을준비한기질물질농도의 10% 가되도록하여첨가하였다. 사용한 [ 3 H]digoxin의농도는 1 Ci/L, specific activity는 29.8 Ci/mmol이었다. Inducer로는 rifampicin (Sigma) 을 1 mm으로준비하여사용하였다. [ 표 9] rat mdr1a function test Cell Type 약물 Volume Mock cell (MDCKII/FRT) MDCKII/FRTrat mdr1a Mock cell (MDCKII/FRT) Digoxin Digoxin Digoxin + Rifampicin 250 μl 24

MDCKII/FRT- rat mdr1a Digoxin + Rifampicin 30분의 preincubation이끝나면실험장소를방사성동위원소실로옮기고, TM을제거한후, 위와같이준비한약물을각 well에 200 μl씩가하고 10분동안 37 에서 incubation을하였다. 이후약물을제거하고, 4 정도의차가운 PBS로 washing을세번하였다. 그리고각 well당 0.2N NaOH를 500μl씩가하여세포를 lysis시켰다. Sample의분석은 lysate 400μl씩취하여여기에 1 ml의 cocktail 액을섞고, LSC로분석하였다. 끝으로 BCA assay로단백량을측정하여 well 마다발생할수있는 cell 수의차이로인한오차를보정하였다. 25

4. Results Rat liver total RNA를 source로하여 reverse transcription 반응을진행하였고, 그결과 cdna를얻었다. 이 cdna를 template로하여 PCR 을진행한결과, 아래 [ 그림 5] 에표시한것과같이약 4000bp 정도의위치에서 band를확인할수있었다. 본실험에서제작한 primer로 PCR을할경우, 3861bp의 DNA를얻게되기때문에 product 크기의일치함을확인할수있었다. [ 그림 5] Rat mdr1a PCR result 크기확인을한후에 PCR purification 과정을통하여불순물을제거하 고 PCR product 을높은농도로얻을수있었다. Purification 을한 rat mdr1a 와 pcdna5/frt vector 를각각 KpnI 과 XhoI 을사용하여 26

double digestion을하였고, 둘을 ligation하였다. 이렇게 subcloning 한 product를 MAX Efficiency Stbl2 competent cell에 transformation하여실온에서이틀동안 incubation을한결과적은수의 colony을얻을수있었다. 생성된 colony들을떠서 liquid culture를하였고, miniprep 을진행한후 gel을내려 size확인을하였다. 이중하나가원하는크기여서정확한 sequence를확인하기위하여 sequencing을의뢰하였다. Sequence 분석결과, 65번부터 3926번까지전체가성공적으로 pcdna5/frt vector내로삽입된것을확인할수있었다. 그러나 CDS 상에서아미노산을변화시키는 mutation 네개를각각 670, 1064, 2099, 2850번의위치에서관찰하였다. ( 그림 6) [ 그림 6] Sequence 내에발생한 mutation 670 1064 2099 27

2850 이렇게완성된 rat mdr1a를 MDCKII/FRT cell에 transient 하게 transfection을하고 monolayer하게배양하였다. Transfection한 cell 의추출한 RNA로부터 RT-PCR을진행한결과는아래 [ 그림 7] 과같다. [ 그림 7] Rat mdr1a cell line RT-PCR result 위의그림에서왼쪽열부터차례대로 ladder, mdr1a, 공 vector 를나타 내고, 오른쪽두열은 GAPDH 를나타낸다. GAPDH band 의확인을통 하여 RT-PCR 반응이성공적으로진행됐음을확인하였다. 크기 363bp 28

Uptake amount (pmole/ug/ml) 의 rat mdr1a 확인용 RT-PCR 의결과로부터 rat mdr1a 의 mrna 가 발현했다는것을알수있었다. Function study 결과는아래 [ 그림 8] 과같았다. rat mdr1a와 mock cell(wild type MDCKII/FRT cell) 간 digoxin uptake는거의차이를보이지않았다. Inducer인 rifampicin을함께처리했을때는 digoxin의 uptake가조금증가하였으나, t-test 결과, rat mdr1a에기질만처리한경우와 rat mdr1a에 inducer 인 rifampicin을동시에처리한경우, 둘간의 p-value는 0.122로유의적인차이가없었다. [ 그림 8] MDCKII/FRT-rat mdr1a function study 결과 0.025 0.02 0.015 0.01 0.005 0 mock rat mdr1a mock + rifampicin rat mdr1a + rifampicin 29

5. Discussion 약물상호작용연구에서약물수송체의중요성이부각됨에따라미국 FDA에서는주의깊은관찰이필요한주요약물수송체 7가지를선정하였다. 본연구에서는, 이 7가지약물수송체중의하나인 p- glycoprotein에중점을두어 p-glycoprotein의 rat에서존재하는형태인 mdr1a의 in vitro system을구축하였다. 이는신약개발초기단계에서 p-glycoprotein의영향을예측하는데에도움을줄것으로사료된다. 본실험에서는, rat liver total RNA 단계로부터 cloning을진행하였다. Rat mdr1a cloning은성공적으로진행되어 pcdna5/frt vector내로삽입되었고, MDCK II/FRT cell에 transient하게 transfection하였다. Rat mdr1a의발현을확인하기위하여 mrna 측면에서와 function 측면에서평가를하였다. mrna 측면에서의확인을위해 transfected cell 에서추출한 RNA로부터 RT-PCR을진행하였고, 실험결과 mrna의발현을확인하였다. 그러나 function study에서는 mock cell과 rat mdr1a transfected cell 간에기질인 digoxin uptake amount 차이가거의나지않았다. 이뿐아니라 mdr1a transfected cell에기질만처리한경우와 mdr1a transfected cell에기질과 inducer인 rifampicin을동시에처리한경우를 t-test한결과, p-value가 0.122로유의적인차이가없다는결과가나왔다. Function test 에서두드러진차이가나타나지않은결과는여러요인으 30

로설명이가능하다. 첫째, mrna 발현은되었지만, function이나타나지않는다는점에의하면 sequence내에존재하는 4개의 mutation으로인해 protein 발현에영향을미쳤을가능성이있다. Mutation을모두 reference sequence대로수정하고그이후의단계를진행하면더정확한결과를얻을수있을것이다. 두번째가능한원인으로 transient하게 transfection 하였기때문에한계가있을것이라생각된다. Transfection을하고 24시간후에 function study을진행하였기에단백질을발현하기에는시간이너무짧았을가능성도있다. Stable한 cell line으로다시실험을한다면다른결과를기대해볼수있을것이라생각된다. 마지막으로 inducer를기질과함께처리한경우와기질만단독으로처리한경우 uptake 실험간에유의적인차이가없는것은 incubation time을원인으로제시할수있다. 본실험에서는약물처리후 incubation을 10분동안진행하였는데, mdr1a가 efflux transporter 인점을감안하면 incubation time을다소길게설정하여야더정확한실험결과를얻을것이라생각된다. 이는약물이세포내로들어갔다가나오는시간을고려하여도출해낸결론이다. 이부분들을보완하여 stable한 cell line을구축한다면실제 mdr1a의 function을나타내는 in vitro system을얻을수있을것이라생각한다. MDCK II/FRT cell 에 rat mdr1a 를발현시킨 in vitro system 은 uptake study 를통한약물상호작용연구에활용가능할것이다. 또한 rat 31

mdr1a의 in vitro와 in vivo data간의상관성으로부터 human p- glycoprotein이약물상호작용에미치는영향을예측하는데에도움이될것이라기대된다. 궁극적으로 rat mdr1a in vitro system은신약개발시 screening system으로작용하여적합한약물후보군을결정하는데에적용이가능하고, 효율적인신약개발에기여할것으로사료된다. 32

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Abstract Cloning and Expression of rat mdr1a (p-glycoprotein) in MDCK cells Inyoung Lee Department of Pharmaceutics College of Pharmacy Seoul National University Drug transporters are distributed widely in various organs and contribute greatly in the absorption, distribution and elimination of drugs. On top of that, drug-drug interactions that induce or inhibit drug transporters play an important role in drug metabolism. Based on these reasons the US FDA selected seven drug transporters that affect drug-drug interaction most immensely and stated that thorough inspection studying whether the developing drug acts as a substrate or inhibitor of any of these drug transporters is required in the early drug development phase. Drug-drug interactions are the most accurate when observed in vivo. However, human in-vivo 35

studies are not only expensive but can also be hazardous and thus, in-vitro studies preceding in-vivo studies are necessary to prevent needless experiments in-vivo. If an in-vitro system of rat mdr1a is established to evaluate drug-drug interaction, in-vivo drug-drug interactions in human could be predicted using the correlation of rat in-vitro and rat in-vivo data. In this study, mdr1a, the corresponding part of human MDR1 (p-glycoprotein) in rat, was chosen to be cloned amongst the seven transporters selected by the FDA. Rat mdr1a was cloned and transiently transfected to MDCKII/FRT cells. Results from RT-PCR showed that mrna was expressed. However, function study results showed no significant difference in the function between the mock cell and mdr1atransfected cell. There are several possible reasons for this result and supplementation of these would lead to the establishment of the stable rat mdr1a-mdckii/frt cell line. The rat mdr1a cell line is expected to be practically useful in predicting drug-drug interaction in the early phase of drug development. Key Words: mdr1a, cloning, drug-drug interaction Student Number: 2012-21610 36