대한진단검사의학회지 : 제 24 권제 6 호 2004 Korean J Lab Med 2004; 24: 진단면역학 전신성홍반성루푸스에서자가항체에의한호중구세포자멸사의증가 원동일 서장수 김현숙 1 경북대학교의과대학진단검사의학교실, 연세대학교의과대학진단검사의학교실

대한진단검사의학회지 : 제 4 권제 6 호 4 Korean J Lab Med 4; 4: 45-14 진단면역학 전신성홍반성루푸스에서자가항체에의한호중구세포자멸사의증가 원동일 서장수 김현숙 1 경북대학교의과대학진단검사의학교실, 연세대학교의과대학진단검사의학교실 1 Autoantibody-Induced Apoptosis of Neutrophils in Systemic Lupus Erythematosus Patients Dong-Il Won, M.D., Jang Soo Suh, M.D., and Hyon-Suk Kim, M.D. 1 Department of Laboratory Medicine, Kyungpook National University School of Medicine, Daegu; Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine 1, Seoul, Korea Background : In patients with systemic lupus erythematosus (SLE), serum factors play a role in the apoptosis and necrosis of neutrophils. We intended to verify that autoantibodies including anti-dsdna antibody are one of the factors. We also investigated the potential usefulness of simultaneous flow cytometric measurement of cytotoxicity and autoantibody binding to neutrophils in SLE sera for evaluation of disease activity. Methods : A total of 8 sera from 48 patients with lupus nephritis (LN), 19 patients with SLE without LN, 35 patients with rheumatoid arthritis (RA) and 4 healthy males were studied. Whole blood from healthy males mixed with test sera was incubated. Autoantibody binding, apoptosis and necrosis of neutrophils were measured by flow cytometry using IgG-FITC and 7-aminoactinomycin D after a -hour incubation period or after adjustments of incubation conditions. The results were expressed as the test/healthy control ratio of measured values, and the correlations between these results and anti-dsdna antibody levels were investigated. Results : IgG mean fluorescence intensity (MFI) ratio was 1.±.3, 1.6±1.6,.±1.5 and 4.8± 7.5 in the healthy, RA, SLE and LN group, respectively, and showed a significant increase in the LN group when compared with the healthy group (N= in each group, P<.5). Apoptosis & necrosis ratio was 1.±., 1.±.5, 1.6±1. and.6±1.9 in each of the above 4 groups, and showed a significant increase in the LN group when compared with the healthy (P<.5) and RA group (P<.1). By immunofluorescence microscopy, increased nuclear reactivities on neutrophils by autoantibody binding were observed in 1 (6%) of LN sera. All three correlations between anti-dsdna antibody level, apoptosis & necrosis ratio and IgG MFI ratio were significant (P<.5). Preincubation with DNA extracts decreased both IgG MFI ratio and apoptosis & necrosis ratio significantly (N=5, P<.5). Conclusions : Our findings confirm the previous reports of increased neutrophil apoptosis in the peripheral blood of patients with SLE. This study indicates that anti-dsdna antibody or other antinuclear antibodies in sera are associated with an active increase in the apoptosis and necrosis of neutrophils as well as simple binding to neutrophils. This may suggest that autoantibodies increase the exposure of autoantigen DNA and exacerbate autoimmunity in the pathogenesis. Although further studies are needed, we suggest that measuring the cytotoxicity and autoantibody binding to neutrophils in SLE serum simultaneously by flow cytometry should be a useful test for evaluation of disease activity. (Korean J Lab Med 4; 4: 45-14) 접수 : 4 년 7 월 19 일접수번호 : KJLM1776 수정본접수 : 4 년 1 월 1 일교신저자 : 김현숙우 1-75 서울시서대문구신촌동 134 연세의료원진단검사의학과전화 : -361-5863, Fax: -364-1583 E-mail: kimhs54@yumc.yonsei.ac.kr Key Words : lupus, Anti-dsDNA antibody, Autoantibody, Lupus nephritis, Neutrophil, Apoptosis, Necrosis 45

46 원동일 서장수 김현숙 서론말초혈액에서순환중인호중구는수명이수시간밖에되지않으며, 이후비장이나간으로들어가세포자멸사 (apoptosis) 를거쳐죽게된다. 세포자멸사가일어난호중구는항호중구세포질항체 (antineutrophil cytoplasmic antibody, ANCA) 연관질환과전신성홍반성루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE) 같은자가면역질환에서면역원의주요공급원으로알려져있다 [1]. 세포자멸사는세포막투과도의증가와세포막지질의변화등세포막에다양한변화를일으킨다 []. 호중구에서는종양괴사인자 (tumor necrosis factor, TNF) 등의시토카인 (cytokine) 전처치없이장시간배양만으로자발적인세포자멸사가유도되는데, 특히세포막에 ANCA 항원이표현되므로 [1, 3, 4] 자멸사호중구 (apoptotic neutrophils) 를이용하여세포내항원에대한자가항체를검출할수있다 [5]. SLE에서어떤자가항체는세포내로침투하여세포내혹은핵내항원에결합하여 [6], 세포기능을변화시키거나세포자멸사에대한부신호 (accessory signal) 를유발하여세포자멸사를유도한다고한다 [7]. 생리적인자가항체는자가반응성림프구를자멸사시켜서면역관용을유지하고자가면역질환을예방하는역할을한다 [8]. 그러나자가항체가친화성숙 (affinity maturation) 을하게되면병원성항체 (antibody, Ab) 로작용하고 [9], 세포자멸사를항진시켜세포자멸사소체 (apoptotic body) 로부터과도하게자가항원이노출되면면역관용에영구적인손상을초래한다. 즉, 다량의 nucleosome이자가반응성 T 세포에루푸스특이자가항원을제공하면, 유전적소인이있는사람의경우다클론성 B 세포자극이일어나고항 dsdna 항체를포함한자가항체가형성되어자가면역질환이유도되어지속된다 [1]. SLE 환자의말초혈액에서는순환중인호중구 [1, 11], 림프구 [1, 13], 단구 [14] 의세포자멸사가증가되어있다고보고되고있다. 이는단구의청정기능의장애가한원인이며, 혈청내요소가단구의포식작용을저해하는것으로추측하였으나, 그요소와정확한기전이무엇인지아직불확실하다 [15]. 또한포식세포가인식하는데필요한분자나수용체가결핍되어포식작용에장애가생기는기전도제시되고있는데특히, 세포외기질분자에대한표면수용체인 CD44의표현이호중구에감소되어대식세포의인식능력과청정기능에지장을준다는최근보고도있다 [16]. 대식세포의청정기능의장애가혈구의세포자멸사를증가시킨다는가설외에, 자가항체가직접세포내로침투하여세포자멸사를촉진시킨다는가설도있는데, 이런작용을하는자가항체의특이성으로는항 dsdna 항체 [8, 9, 17], 항 RNP 항체 [18], 항 SSB/La 항체 [19] 등이보고되고있다. SLE에서자가항체와루푸스신염 (lupus nephritis, LN) 의관계를설명하는여러가설이있다. 일부항 dsdna 항체가 cardiolipin과같은다른자가항원과교차반응을하듯이 [, 1] 자가항체가조직항원에교차반응으로직접결합하여면역침전물을 형성할수있는데 [], 예를들면신장에서자가항체가사구체기질과기저막항원뿐만아니라사구체간질세포와내피세포에직접결합하여침착과염증을유발한다고한다 [3, 4]. 한편 nucleosome의유리가 SLE의유도와신장병변의시작모두에중요하며 [5], nucleosome이 anti-chromatin Ab와복합체를형성하여 heparan sulfate를통하여사구체기저막에부착하여 LN을유발한다고하였다 [6]. 또한, nucleosome중양전하인 histone 성분이사구체모세혈관벽의음전하부위에결합되면이식항원 (planted antigen) 으로작용하여여기에순환중인항 dsdna 항체혹은 anti-nucleosome Ab가결합한다고한다 [5]. 한편, SLE에서호중구가림프구나단구보다수적인면이나생존기간면에서더중요하다고하였다 [15]. 저자들은자가면역질환환자의혈청과정상인호중구의장시간배양실험을통해세포내항원에대한 ANA, ANCA 등의자가항체의반응을조사한바있는데, SLE에대한민감도가 95% 로높았고호중구에대한 IgG-FITC의평균형광강도 (mean fluorescence intensity, MFI) 분석에서강양성군은루푸스신염이동반되어있었으므로, MFI 정량분석도임상적으로의의가있었다. 이실험결과에대한설명으로 SLE 자가항체가호중구의세포자멸사를촉진시키고이런호중구는세포막투과도가증가하여다시세포내로자가항체투과와결합이더욱증가하기때문인것으로추측하였다 [5]. 본연구에서는 SLE 환자에서호중구에대한세포자멸사와괴사등세포독성과자가항체결합의증가가혈청성분에의한것인지알아보기위하여 1) SLE 혈청과배양한건강인호중구의세포자멸사및괴사가건강인혈청보다증가하는지, ) SLE 혈청에서배양한호중구에자가항체결합이증가한다면세포자멸사, 괴사와관련이있는지알아보고, 3) 이런현상의이유로혈청요인, 특히항 dsdna 항체와같은자가항체의역할을증명하고자하였다. 또한, 이와더불어질병활성도를평가하기위한검사로서유세포분석법으로 SLE 혈청에서호중구에대한세포독성과자가항체결합을동시에측정하는것이유용한지그가능성을조사하였다. 대상및방법 1. 대상경북대학교병원류마티스내과에내원한루푸스신염환자 48명 ( 남 : 여 5:43, 8±9 세 ), 루푸스신염이없는 SLE 환자 19명 ( 모두여성, 31±1 세 ), 질환대조군으로서류마티스관절염 (rheumatoid arthritis, RA) 환자 35명 ( 남 : 여 5:3, 4±1 세 ) 및건강대조군으로서수혈경력이없는 3대의건강한남성 4명 (33±9 세 ) 에게서얻은총 8개의혈청을대상으로하였다. SLE 환자중요단백이 5 mg/ 일이상이거나, 요시험지봉검사에서 회이상 1+ 이상의단백뇨가있는경우루푸스신염군으로분류하였다.

전신성홍반성루푸스에서호중구세포자멸사 47. 방법 1) 전혈배양 기질로사용할호중구는따로분리하지않고, 대신유세포분석시 호중구표지자항체가결합된세포만수집 (acquisition) 하는 electronic gating 기법을사용하였다. 시험하고자하는혈청 L 를 Falcon 시험관에넣고 antibiotic-antimycotic (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) 1% 를첨가하였다. 기질호중구로서혈액형이 O형인 3대건강남성의말초혈액을 heparin 시험관에채혈하여전혈을 1 L씩분주하였다. Annexin V-FITC/propidium iodide (PI) 이중염색실험에서는 dextran 침강법과 plasma-percoll (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden) discontinuous density-gradient centrifugation법으로호중구만분리하여분주하였다. 이혼합물을 37, 5% CO 배양기에서 시간배양하였다. 매일괄 (batch) 실험마다건강대조로서 6명의건강인혈청을함께시험하였다. ) 면역형광염색배양후전혈을 phosphate buffered saline 3 ml로 4회세척하였다. 호중구 gating을위한항체로 CD13-PE (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) 혹은 CD45-RPE-Cy5 (Dako, Carpinteria, CA, USA) 를사용하였다. 세포내항원의표현을측정하기위하여호중구의대표적인세포내항원인 MPO에대한항체 MPO-PE (Dako) 를사용하였다. 세포자멸사및괴사를측정하기 위하여 Fas 수용체에대한항체인 CD95-FITC (Dako) 와핵산염료인 7-aminoactinomycin D (7-AAD, Becton Dickinson) 를사용하였다. 세포자멸사및괴사가일어난세포는세포막변화로 SSC-Height Counts 1, 8 6 4 Neutrophil Gate 1 1 1 1 1 3 1 4 CD 13 PE Fig. 1. Neutrophil gate. During acquisition, CD13-PEnegative cells were excluded from acquisition based on CD13-PE threshold. 5 H 4 LN 3 Apop Nec 1 H LN 1 1 1 1 1 3 1 4 1 1 1 1 1 3 1 4 7-AAD A IgG FiTC B Fig. 3. The examples of fluorescence histogram: (A) 7-AAD, (B) IgG- FITC. Solid line represents a healthy case and dotted line a lupus nephritis case. In 7-AAD histogram Apop and Nec regions represent apoptotic and necrotic neutrophils, respectively. Abbreviations: 7-AAD, 7-aminoactinomycin D; H, healthy; LN, lupus nephritis. 7-AAD가침투되어핵에염색이되고, 그형광은유세포분석기 3 번째형광 (fluorescence 3, FL3) 지표 (channel) 로검출할수있다. 세포자멸사및괴사측정을위한다른방법으로, annexin V- FITC와 PI (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) 로이중염색하였다. 자가항체의결합을측정하기위하여 FITC-conjugated goat antihuman IgG [H+L, F(ab ) fragment] (Jackson Immunoresearch Lab., West Grove, PA, USA) 를사용하였다. 시약항체의비특이결합을평가하기위하여각제조사별 isotype-matched irrelevant IgG를사용하였다. 목적에따라시약항체들을형광이중복되지않도록조합하여세척한전혈과 4 에서 3분간항온후 1회더세척하고 7-AAD 를넣고4 에서 1분항온후유세포분석기로측정하였다. 적혈구를용혈시키지않는비용혈전혈법 (unlysed whole blood preparation) 을사용하였다. 3) 유세포분석 (flow cytometry, FCM) 유세포분석기는 FACSCalibur를사용하였고 Cellquest 프로그램을사용하여수집및분석하였다. 검사전 Calibrite bead와 Facscomp 프로그램으로장비를조정하였다 ( 모두 Becton Dickinson). 수집시관문 (acquisition gate) 의역치 (threshold) 를 FL 혹은 FL3으로조정하여 CD13-PE 혹은 CD45-RPE-Cy5가결합된세포의 events만수집하였다. Scatter plot과 CD13-PE/side scatter (SSC) plot 혹은 CD45-RPC-Cy5/SSC plot에서호중구영역으로 gating하여각검체당 5, events를수집하였다 (Fig. 1). 수집후분석에서, 호중구에대한해당시약항체의형광히스 IgG FITC 1 4 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 4 1 1 1 1 1 3 1 4 7-AAD A 7-AAD B Fig.. The examples of 7-AAD/IgG-FITC plot: (A) a healthy case, (B) a lupus nephritis case. Abbreviation: 7-AAD, 7-aminoactinomycin D. CD95 FITC 1 4 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 4 1 1 1 1 1 3 1 4 7-AAD A Annexin Y-FITC B Fig. 4. A representative case of lupus nephritis. (A) 7-AAD/CD95- FITC plot. CD95 expression was similar in 3 groups. (B) Annexin V-FITC/PI plot. Annexin V + PI - and annexin V + PI + were regarded as apoptotic and necrotic, respectively. Abbreviations: 7-AAD, 7-aminoactinomycin D; PI, propidium iodide. PI

48 원동일 서장수 김현숙 토그램이정규분포에가까운경우기하평균을, 그렇지않은경우중간치 (median) 를 MFI로하였다. 일괄실험간에기질호중구의변이에따른각시약항체의반응성을표준화하기위해평균형광강도비 (MFI ratio) 를사용하였는데, 이것은시험혈청의 MFI 를동시에시험한 6개건강대조의 MFI 평균치로나눈값이다. 세포자멸사와괴사에대한측정치를표준화하기위해, 마찬가지로 7-AAD 히스토그램에서세포자멸사군과괴사군의합의백분율에대하여시험혈청의값을건강대조의값으로나누어세포자멸사와괴사비 (apoptosis & necrosis ratio) 를구하였다. 자가항체의결합과세포자멸사와괴사를동시에측정하기위하여 IgG-FITC, CD13-PE 및 7-AAD로삼색염색후 7-AAD/IgG-FITC plot 에서분석하였다 (Fig., 3). 7-AAD 히스토그램에서호중구를 3개군으로나누었고, 7- AAD/CD95-FITC plot에서세군간 CD95 표현은큰차이가없었지만 (Fig. 4A), 7-AAD 반응이가장약한군은생존군, 중간군은세포자멸사군, 강한군은괴사군으로분류하였다. 세포자멸사와괴사측정을위한다른방법으로, 순수분리한호중구에대한 annexin V-FITC/PI plot에서호중구의세포자멸사 (annexin V + PI - ) 와괴사 (annexin V + PI + ) 의비율을구하였다 (Fig. 4B). 4) 차단실험 (blocking experiments) 혈청내항 dsdna 항체를흡착제거하기위하여 LN 환자혈청을 DNA 추출물로전항온처리 (preincubation) 한후이혈청의 호중구에대한반응을측정하였다. Genomic DNA의분리는 Wizard genomic DNA purification kit (Promega, Madison, WI, USA) 를사용하였다. Microcentrifuge 시험관에건강인전혈 3 L와 lysis 용액 1 ml를가하여적혈구를용혈시키고원심분리하여상청액을제거하였다. 백혈구층만남을때까지이과정을반 MFI Ratio 1 4 MPO CD95 IgG Apoptosis & Necrosis Ratio 6 4 복한후 1 ml의 nucleic lysis 용액을가한후 1 ml의단백질침전용액을넣어원심분리하여단백질을제거하였다. Isopropanol 1.5 ml를첨가하여 DNA를침전시키고 1, g에서 3분간원심분리하였다. 상청액을버리고 1 ml의 7% ethanol을넣어세 척후건조시켰다. 분리된 DNA 는시험관당약 5-15 g 에해당되 며, 이양은대략 1 international units (IU) 가량의항 dsdna 항체를중화할수있는양이었다 ( 자료미제시 ). 분리된 DNA가들어있는시험관은실험전까지 4 에서보관하였다. 이시험관에시험할혈청 1 L를가하고 37 에서 1시간동안전항온처리하였다. 원심분리후상청액을취하여적당한배지양이되도록건강인혈청 1 L와혼합한다음, 이후마찬가지방법으로호중구와배양하였다. 전항온처리를하지않은대조군으로같은검체의 LN 혈청 1 L를건강인혈청 1 L와혼합하여함께시 험하여비교하였다. 5) 면역형광현미경법 (immunofluorescence microscopy, IFM) 상기와같이시험관내에서배양한전혈을 lysis 용액으로적혈구를용혈시키고 4회세척하였다. IFM용 anti-human immunoglobulin-fitc (Sigma-Aldrich) 로염색하고 1회세척후 Shandon Cytospin Cytocentrifuge (Thermo, Woburn, MA, USA) 로슬라이드에백혈구박막을만들고형광현미경으로관찰하였다. 6) 항 dsdna 항체농도측정 15 I-labelled dsdna 추적자를사용하는 Trinity anti-dsdna Kit (Trinity Biotech, Bray, Ireland) 를사용하여방사면역법으로측정하였다. 추적자와시험혈청을항온배양후면역글로불린이결합된추적자를 ammonium sulfate로침전시켰다. 원심분리후상청액을버리고남아있는추적자의양이항 dsdna 항체의 % 6 5 4 3 1 Healthy LN Healthy RA SLE LN Healthy RA SLE LN Apoptosis Necrosis Fig. 5. The MPO, CD95 and IgG reactivity of healthy donor neutrophils incubated with the sera of 4 groups for hours. Data are means±sd of sera, respectively. See the material and methods for the MFI ratio. P<.5 versus healthy group. Abbreviations: RA, rheumatoid arthritis, SLE, systemic lupus erythematosus; LN, lupus nephritis; MPO, myeloperoxidase; MFI, mean fluorescence intensity. Fig. 6. Apoptosis & necrosis ratio detected by 7-aminoactinomycin D. Healthy donor neutrophils were incubated with the sera of 4 groups for hours. Data are means ±SD of sera, respectively. See the material and methods for the apoptosis & necrosis ratio. P<.5 versus healthy group. Abbreviations: RA, rheumatoid arthritis, SLE, systemic lupus erythematosus; LN, lupus nephritis. Fig. 7. Percentage of apoptosis and necrosis detected by annexin V and propidium iodide. Healthy donor neutrophils were incubated with healthy and LN sera for hours. Data are means±sd of 1 sera, respectively. P<.5 versus healthy group. Abbreviation: LN, lupus nephritis.

전신성홍반성루푸스에서호중구세포자멸사 49 농도에직접적으로비례하는원리를이용하여측정하였다. 7) 통계자료는평균 ± 표준편차로나타내었다. 여러군간비교에는분산분석다중비교 (Scheffe s test) 를, 두군간비교는 Mann-Whitney test를시용하였으며, 쌍을이룬두군의비교시 Wilcoxon signed ranks test를하였다. P<.5이면통계적으로유의한것으로판정하였다. 결과 혈청에서건강인호중구를 시간배양한후호중구의 MPO 와 CD95의표현과 IgG 결합에대하여측정하였다. 네군에서 CD95 MFI ratio는각각 1.±.1, 1.±.1, 1.±.1, 1.1±.로각군간유의한차이를발견할수없었다 (P=.15). MPO MFI ratio 는각각1.±.1, 1.1±.5, 1.3±.7, 1.9±1. 으로 LN군에서건강인군에비하여유의하게증가하였는데 (P<.1), MPO 표현의증가는호중구자멸사증가로인한세포내항원의표현의증가를뜻한다. IgG MFI ratio는각각 1.±.3, 1.6±1.6,.±1.5, 4.8 ±7.5 로 LN군에서건강인군에비하여유의하게증가하였는데 (P<.5, Fig. 5), IgG-FITC 반응의증가는자가항체결합의증가를뜻한다. 1. 각군혈청과 시간배양한건강인호중구에서각표지자의측정 1) MPO와 CD95의표현및IgG 결합측정 SLE와 LN 환자의혈청의호중구에대한영향을조사하기위하여, 네군즉, 건강인, RA, SLE 및 LN군으로부터얻은각 MFI Ratio 5 4 3 1 MPO CD95 IgG 5 1 15 Incubation Time (hours) Fig. 8. The sequential changes of MPO, CD95 and IgG reactivity by lupus nephritis sera. Data are means±sd of 5 sera. P<.5. Abbreviations: MPO, myeloperoxidase; MFI, mean fluorescence intensity. ) 7-AAD에의한세포자멸사와괴사측정네군의각 혈청에서 apoptosis & necrosis ratio는각각 1. ±., 1.±.5, 1.6±1.,.6±1.9 로 LN 군에서건강인군 (P< IgG MFI Ratio 6 5 3 1 P<.5 P<.5 3 min with LN hrs with LN hrs with H & 3 min with LN Fig. 9. The IgG-FITC reactivity according to 3 methods of incubation. The left bar is the case of incubation with LN sera for 3 minutes, the middle bar with LN sera for hours and the right bar with healthy sera for hours followed by with LN sera for 3 minutes. Significantly increased IgG MFI ratio was seen only in the middle bar. Data are means±sd of 3 sera, respectively. Abbreviations: H, healthy; LN, lupus nephritis; MFI, mean fluorescence intensity. A B Fig. 1. Indirect immunofluorescence microscopy. IgG-FITC staining of neutrophils incubated with lupus nephritis serum for hours. Increased nuclear reactivity was seen in 1/ lupus nephritis sera. (A) 1, (B) 1,.

41 원동일 서장수 김현숙.5) 과 RA 군 (P<.1) 에비하여유의하게증가하였다 (Fig. 6). 정상인호중구의장시간배양이필요함을말해준다. 3) Annexin V-FITC/PI 이중염색에의한세포자멸사와괴사측정 CD95 표현에대하여네군간유의한차이를발견하지못했으나, 건강인군과 LN군각 1 혈청에대한 annexin V/PI 이중염색에서호중구의자멸사 (annexin V + PI - ) 백분율은각각 36.3± 7.4, 46.4±7.8 (P<.5) 이었고, 괴사 (annexin V + PI + ) 백분율은각각 1.9±.3, 16.±5.9 (P<.5) 이었다. 즉, LN군에서세포자멸사와괴사모두유의하게증가하였다 (Fig. 7).. LN 혈청과배양한건강인호중구에서배양조건별각표지자의측정 3) LN 혈청희석에따른 IgG MFI의변화 LN 혈청을건강인혈청으로희석을많이할수록 IgG MFI가감소하였다. 즉, 혈청총량중 LN 혈청이차지하는백분율 (%LN) 이, 1,, 3, 5, 7, 1% 인희석혈청에대하여 IgG MFI 는각각 161, 167, 11, 7, 56, 379, 35로측정되어, 선형적으로유의한관련성이있었다 (IgG MFI=.8%LN+156, r=.87, P<.5). LN 혈청의병적효과가건강인혈청의보충으로완전히소멸되지않고희석만되므로, 이효과는혈청내특정정상성분의과소때문은아닌것으로해석할수있다. 3. 호중구자멸사와항 dsdna 항체와의관계 LN 혈청의호중구에대한효과가배양조건의변화에따라어떻게변하는지조사하였고, 또한이효과가혈청내특정성분의결핍때문인지혹은과다때문인지추정하였다. LN 혈청에서건강인호중구를장시간배양시세포자멸사, 괴사, 자가항체결합을증가시키는원인중하나가항 dsdna 항체임을증명하는실험을하였다. 1) 배양시간별측정치의변화다섯 LN 혈청에서호중구를 3분, 4시간, 8시간, 1시간, 16시간및 시간배양후각측정치의변화를조사하였다. MPO, IgG 결합에대한 MFI ratio는배양시간과유의한양의상관성 ( 각각 r=.454, r=.6) 이있었으나 ( 둘다 P<.5), CD95와배양시간의상관성은유의하지않았다 (r=.143, P=.611, Fig. 8). ) 단시간과장시간배양의 IgG MFI ratio 비교 3 LN 혈청에서 3분만배양한경우 (1.4±.4) 와건강인혈청과 시간배양한후다시 LN 혈청과 3분배양한경우 (1.4±1.1), 두경우모두처음부터 LN 혈청과 시간배양한경우 (.4±.6) 에비하여 IgG MFI ratio의유의하게감소하였다 ( 각각 P<.5, P<.5, Fig. 9). 이자료는결과 1과같은 LN 혈청의호중구에대한작용은호중구의정상적인자발적세포자멸사 (spontaneous apoptosis) 를통한결과가아니고, 능동적으로촉진된세포자멸사에의한결과이며, 세포자멸사촉진을위하여 LN 혈청과 1) 면역형광현미경법 (IFM) LN 혈청에서주로핵부위에강한형광이관찰되는호중구가증가하였다 (Fig. 1). LN 혈청중 1 혈청 (6%) 에서건강인혈청에비하여이런호중구가증가된것으로판정할수있었다. 이는 LN 혈청과호중구의배양에서주로핵부위에자가항체의결합이증가하였음을뜻하므로, 그자가항체의주요표적항원이핵내항원임을시사한다. ) 항 dsdna 항체농도, apoptosis & necrosis ratio 및 IgG MFI ratio 상호간상관성 SLE 및 LN 혈청에서항 dsdna 항체농도와 apoptosis & necrosis ratio 간에상관계수는.49이었고 (P<.5), 항 ds- DNA 항체와 IgG MFI ratio 간에상관계수는.344이었고 (P<.5), apoptosis & necrosis ratio와 IgG MFI ratio 간에상관계수는.358이었다 (P<.5). 즉, 세측정치간세관계모두유의한상관성이있었다 (Fig. 11). Apoptosis & Necrosis Ratio 8 y=.9x+1.739 6 4 4 6 8 1, 1, anti-dsdna Antibody (IU/mL) A anti-igg MFI Ratio 3 y=.76x+3.115 1 4 6 8 1, 1, anti-dsdna Antibody (IU/mL) B antii-igg MFI Ratio 3 y=1.1394x+1.365 1 4 6 8 Apoptosis & Necrosis Ratio C Fig. 11. The correlations among anti-dsdna antibody level, apoptosis & necrosis ratio and IgG MFI ratio. (A) anti-dsdna antibody level vs. apoptosis & necrosis ratio (N=7, mixed cases). (B) anti-dsdna antibody level vs. IgG MFI ratio (N=14, mixed cases). (C) apoptosis & necrosis ratio vs. IgG MFI ratio (N=11, mixed cases). All three correlations among three measurements were significant (P<.5). Abbreviation: MFI, mean fluorescence intensity.

전신성홍반성루푸스에서호중구세포자멸사 411 IgG FITC 1 4 1 3 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3 1 4 1 1 1 1 1 3 1 4 7-AAD A 7-AAD AB Fig. 1. A representative case of successful blocking of lupus nephritis serum by DNA extracts: (A) No preincubation (B) Preincubation with DNA extracts. Preincubation blocked apoptosis, necrosis and autoantibody binding of neutrophils prominently. Abbreviation: 7-AAD, 7-aminoactinomycin D. Apoptosis & Necrosis Ratio 4 3 1 without with DNA Preincubation A IgG MFI Ratio Fig. 13. The decrease of apoptosis & necrosis ratio (A) and IgG MFI ratio (B) by preincubation with DNA extracts. Data are means ±SD of 5 sera, respectively. P<.5 versus control. 18 15 1 9 6 3 without with DNA Preincubation B 3) DNA 추출물에의한차단효과 LN군중항 dsdna 항체농도가비교적높은 ( 평균 149 IU/ ml) 5개혈청을선택하여, 각혈청에서 DNA 추출물로전항온처리를하지않은경우와전항온처리를한경우를서로비교하였다 (Fig. 1, 13). Apoptosis & necrosis ratio는전항온처리를하지않은경우평균.±1.6 에서전항온처리를한경우평균 1.4±.7로유의하게감소하였다 (P<.5). 각혈청에서전항온처리에의하여측정치가 7% 이하로감소한경우를의미있는것으로본다면, apoptosis & necrosis ratio가유의하게감소한경우는 1 혈청 (48%) 이었다. IgG MFI ratio의평균치도전항온처리에의하여 7.4±9.에서 3.3±3.9 로유의하게감소하였고 (P<.5), 측정치가 7% 이하로감소한경우는 1예 (4%) 이었다. 따라서 4-5% 의 LN 혈청에서 DNA 추출물에의하여항 ds- DNA 항체가흡착되어자가항체결합, 세포자멸사와괴사가감소하는것으로해석할수있었고, 이경우혈청중 DNA 에특이성이높은자가항체가항체결합은물론이고세포자멸사, 괴사의주원인이었다는것을시사한다. 고찰본연구의주요실험에서는적혈구를직접용혈시키거나분리하지않았고, 또전체백혈구에서호중구를따로분리하지않는비용혈전혈법을사용하였다. 대신호중구표지자인 CD13을사용하여 electronic gating을사용하였는데, 이방법은용혈, 분리과정중발생하는호중구의활성화 [4] 를방지하고실험술식을단순화하여안정된결과를얻을수있는장점이있었다. 호중구의세포자멸사는 Fas 수용체에의해중재되는데, 호중구가혈중순환에서제거되어나오면급격히 Fas를표현하고 [1], Fas ligation이일어나면세포표면전반에 phosphatidyl serine이표현된다 [7]. Yang 등 [4] 은건강인전혈을 4시간배양후 annexin V/PI 이중염색을통하여호중구에서세포자멸사가유의 하게증가함을보고하였고, Courtney 등 [1] 은말초혈액에서순환중인호중구에 Fas 표현이 SLE군과 RA군에서건강인에비하여유의하게증가해있었으나 SLE군과 RA군사이에는유의한차이가없다고보고하였다. 본연구에서 LN 혈청에서배양한호중구에서세포자멸사의표지자인 CD95 (Fas) 의증가는발견할수없었으며, CD95의표현은배양 1시간에최고치를보이다가이후감소하는경향이있었다 (Fig. 8). 한편, 항 dsdna 항체에의한세포자멸사에서 phosphatidyl serine 반전과같은표면의변화를검출하는것은가능하나, 이과정이세포내에서유발되어세포막 CD95 Fas/Fas 배위자기전을우회하여일어나는것으로추측한보고도있고 [7], 또이과정이 차괴사로빠르게진행되는 dysregulated apoptosis이라고기술한보고도있다. 본연구에서 annexin V/PI에의한세포자멸사측정에서건강인군과 LN군간유의한차이를보였으나, CD95 측정에서유의한차이를보이지않은것은이때문으로생각된다. 그러나 CD95 표현증가를관찰하지못한정확한이유를알려면세포자멸사에대한다른검출법을추가한연구가도움이될것으로생각된다. SLE 치료약제로투여되는 glucocorticoids나다른면역억제제가시험할혈청중에잔존하는경우본실험에서어떤영향을미쳤는지는조사하지않았으나, glucocorticoids는오히려호중구자멸사를억제하며 [8], Ren 등 [15] 의보고에서도이들약제의사용에따른세포자멸사비율과대식세포포식작용에유의한차이를발견하지못하였다고하였다. 또한, estradiol과 progesterone과같은성호르몬의영향으로여성에서남성보다말초혈액호중구의자멸사가감소된다고하는데 [9], 본연구에서대부분여성환자로부터얻은루푸스혈청에서건강인남성혈청보다기질호중구의자멸사및괴사가유의하게증가하였으므로, 질환요인에비하면성별요인은무시할수있을것으로생각된다. 최적배양시간의경우, 16-시간대에정상혈청에비하여 LN 혈청의측정치증가가가장컸고, 그이후에는측정치의차이가줄어드는경향을보였다 ( 자료미제시 ). 이는배양을과도하게오래하면괴사가일어난세포의비율이증가하여측정치의분별력이떨어지기때문인것으로생각된다. 자발적인세포자멸사가일어난호중구로 ANCA를검출한보

41 원동일 서장수 김현숙 고 [1] 도있다. 본연구에서도호중구의자발적자멸사유도만으로각질환별자가항체결합정도의차이를검출할수있는지알아보기위하여 시간정상혈청으로배양하여자발적세포자멸사가일어난호중구에 3분만 LN 혈청으로배양하여항체를결합시키는실험을하였다. 이경우처음부터 LN 혈청과 시간배양한경우보다 IgG MFI ratio의감소가유의하였다. 이결과는 LN 혈청의자가항체가자발적으로세포자멸사가일어난후의호중구에단순히결합만하는것이아니고, 호중구와장시간접촉을통하여능동적인세포자멸사와괴사를유발하고이런호중구는세포내혹은핵내항원이노출되어다시자가항체결합이증가됨을말해준다. 호중구에자멸사가일어나면 MPO 같은 ANCA 항원이세포막으로이동하거나세포외로분비된다. 따라서 IFM 법으로 ANCA 를검출할때자멸사호중구를이용하는경우세포표면에서형광이관찰된다 [1, 4]. SLE 환자, 특히 LN 환자에서 p-anca가비교적흔한것으로알려져있으나 [3], 본연구의 LN 혈청의 IFM법판독에서세포표면혹은세포질내의형광이두드러진경우는발견되지않았다. 그가능한원인들로, 우선 ANCA 표준검사술식에서호중구를 ethanol이나 formalin으로고정하는데, 본연구의실험에서는고정과정이없었으므로 MPO에의한세포질내반응을기대할수없었다. 또한 LN 혈청에서장시간배양으로자발적이아닌 dysregulated apoptosis가일어나 MPO가세포표면에표현되는것이감소하거나세포외로분비되었을가능성이있다. LN 혈청에서주로핵부위에형광이강하게관찰되는호중구가증가하였는데, 이는호중구에침투한자가항체가핵에결합하였기때문에자가항체의표적항원이세포질내항원이아닌핵내항원인것으로해석할수있었다. DNA 추출물에의한차단실험에서시험할혈청은항 dsdna 항체가높은혈청으로선정하였는데 ( 평균 149 IU/mL), DNA 전항온처리에의하여전체 5 LN 혈청의평균 IgG MFI ratio와 apoptosis & necrosis ratio는유의하게감소하였고, 각혈청에서보면약반수에서감소가일어난것으로볼수있었으나, 일부혈청에서는차단현상이거의일어나지않았다. 그이유로는, 시험관당사용한 DNA 추출물 5-15 g은약 1 IU의항 dsdna 항체를흡착할수있는양으로 ( 자료미제시 ), 계산상 1 L 혈청당 1 IU/mL 농도까지완전히흡착할수있으므로, 사용한 DNA 의양이일부혈청에서부족하였던것으로생각된다. 그밖에, 항 dsdna 항체검사법에서사용된 dsdna와본연구에서추출한 DNA의항원성이차이가있거나, 전항온처리를한후에도혈청중 dsdna 이외 histone, nucleosome 등에대한특이성을가진항체가남아있었을가능성등을생각할수있을것이다. Fas뿐만아니라혈청중다른여러요인들도호중구자멸사를조절한다. 이들은주로시토카인으로서, interleukin-1 (IL-1 ), IL-4, IL-6, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor 및 granulocyte colony-stimulating factor 등은세포자멸사를지연시키고, TNF 는세포자멸사를유도한다. SLE에서이들시토카인의혈청내과다혹은부족이호중구의세포자멸사및이차괴 사를촉진시키거나, lectins, v 3 (vitronectin receptor), thrombospondin (TSP), CD36 (TSP receptor), phosphatidylserine receptors, scavenger receptors, CD14 (LPS receptor), ATPbinding cassette protein 1, 보체와같은인식분자나포식세포수용체중하나이상이결핍되거나이상이있어자멸사호중구에대한포식작용이저하될것으로추측하였다 [15]. 항 dsdna 항체가세포에직접결합후침투하여장애를초래하는것에대한여러보고가있다. 즉, 사구체내피세포 [31] 나, 혈관간세포 [3] 에결합, 투과하여세포자멸사혹은세포독성을유발하며, 호중구에서 IL-8 유전자표현을상향조절하고세포자멸사를촉진한다고한다 [33]. 한편항 dsdna 항체이외에도 anti- SSB/La Ab도호중구에결합및침투하여세포자멸사촉진, 포식작용억제, IL-8 생산을항진시킨다고하였다 [19]. 본연구에서도시험관내에서 LN 혈청내의자가항체특히항 dsdna 항체는건강인호중구의세포자멸사와괴사를유발하고, 그렇게되면호중구세포내혹은핵내항원이노출되므로더욱자가항체의결합이증가하여 IgG MFI ratio가증가한것으로해석할수있었다. 한편생체내에서도이런현상이일어난다면, 자가항체가표적세포의자멸사를증가시켜세포자멸사소체나 nucleosome의유리를증가시키고이것이다시면역원이되어자가면역성을더욱악화시킬것이다. 따라서 SLE 환자가질병유발요인에노출된후이런악순환이반복되는발병기전에의하여질병활성도가증가하는것으로추측할수있다. Ren 등 [15] 은 SLE 환자에서대식세포가자멸사호중구를포식하는능력이저하되는데이는질병활성도와상관성을가지며, SLE 혈청은건강인대식세포의자멸사를촉진시키고자멸사호중구의제거를하향조절하는반면, 건강인혈청은 SLE 대식세포의자멸사호중구의포식을증가시키나, SLE 환자세포의자체의자멸사와이차괴사증가를막지못하는것을관찰하고, 대식세포의내재적결함같은유전적요인과혈청요인모두 SLE에서호중구자멸사에대한조절장애의원인으로추측하였다. 본연구에서 SLE 에서질병활성도에관련하여호중구의세포자멸사와괴사가증가한다는이전보고 [1, 11, 15] 를확인하였고, 이현상이이미알려진대식세포의청정기능저하기전 [15, 16] 에더하여, 자가항체의능동적역할에의한세포자멸사와괴사기전도있음을증명하였다. 본연구에서이런자가항체의특이성중하나가항 ds- DNA 항체임을 DNA 추출물에의한차단실험을통하여증명하였지만, 항 dsdna 항체를순수정제하거나단클론항체를이용하여실험한다면항 dsdna 항체의역할을더명확히확인할수있을것으로기대된다. 또한, 다른특이성의항핵항체들도세포자멸사와괴사를유발할가능성이있다. 실제로, 항 dsdna 항체이외에 anti-ssb/la Ab가 SLE에서호중구의기능장애와호중구감소증의원인임을관찰하고그밖에 ribosomal P, HLA 분자등과같은다른자가항원 / 자가항체체계도그원인일가능성을추정한최근보고 [19] 도있으므로, 항 dsdna 항체를포함하여각특이성의항핵항체별로호중구에대한세포자멸사와괴사의역할을

전신성홍반성루푸스에서호중구세포자멸사 413 조사하는연구도필요할것으로생각된다. 또한, 단구도자가항체에의한세포자멸사와괴사의표적세포가되므로 [14, 15] 인식분자나수용체이상뿐만아니라자가항체도대식세포포식작용장애의원인이될것으로생각된다. 본연구에서 anti-igg와 7-AAD를이용한호중구의세포자멸사와괴사, 자가항체결합동시측정은 LN 관련혹은 SLE 질병활성도를반영하는검사로서가능성을보였는데, 그근거로서, SLE 군과달리 LN군이건강인군과비교하여측정치의상승이유의하였고, LN 혈청희석실험에서도희석에따라측정치가유의하게감소하였고, 이미 SLE 활성도를반영하는검사로알려진항 ds- DNA 항체농도와의상관성이유의하였다. 그러나이검사가 SLE 질병활성도를평가하는데유용하다는것을확인하려면실제 SLE Activity Measure score와의상관성조사가필요할것으로생각된다. 결론적으로, 본연구에서 SLE 환자에서말초혈액호중구의세포자멸사가증가함을확인하였고, 혈청중의항 dsdna 항체혹은다른항핵항체가호중구에단순히결합할뿐만아니라능동적으로호중구의자멸사와괴사를증가시킴을알수있었다. 이결과는자가항체가자가항원인 DNA의노출을증가시켜자가면역성을다시악화시키는발병기전을추정할수있게한다. 추가연구가필요하겠지만, SLE 혈청에서호중구에대한세포독성과자가항체결합을유세포분석법으로동시측정하면질병활성도를평가하는데유용한검사가될수있을것으로생각된다. 에비하여유의하게증가하였다 ( 각각 N=, P<.5). 네군에서세포자멸사와괴사비 (apoptosis & necrosis ratio) 는각각 1.±., 1.±.5, 1.6±1.,.6±1.9 로서루푸스신염군에서건강인군 (P<.5) 과류마티스관절염군 (P<.1) 에비하여유의하게증가하였다. 루푸스신염혈청 개중 1개혈청 (6%) 에서면역형광현미경법으로자가항체에의한호중구의핵부위염색이증가한것으로관찰되었다. 항 dsdna 항체농도, apotosis & necrosis ratio 및 IgG MFI ratio 세측정치에서세관계모두유의한상관성이있었다 (P<.5). 또한 DNA 추출물로전항온처리 (preincubation) 하여 IgG MFI ratio와 apoptosis & necrosis ratio 모두유의하게감소하였다 (N=5, P<.5). 결론 : 본연구에서 SLE 환자의말초혈액호중구의세포자멸사가증가함을확인하였고, 혈청내항 dsdna 항체혹은다른항핵항체가호중구에단순히결합할뿐만아니라능동적으로호중구의자멸사와괴사를증가시킴을알수있었다. 이결과는자가항체가자가항원인 DNA의노출을증가시켜자가면역성을다시악화시키는발병기전을추정할수있게한다. 추가연구가필요하겠지만, SLE 혈청의호중구에대한세포독성과자가항체결합을유세포분석법으로동시에측정하는것은질병활성도를평가하는데유용한검사가될수있을것으로생각된다. 참고문헌 요약배경 : 전신성홍반성루푸스 (systemic lupus erythematosus, SLE) 환자에서는혈청성분에의해호중구에대한세포자멸사와괴사가증가한다고알려져있다. 본연구에서는그성분중하나가항 dsdna 항체등의자가항체임을증명하고, 또한질병활성도를평가하기위한임상검사로서 SLE 혈청에서호중구에대한세포독성과자가항체결합을동시에측정하는검사법이유용한지그가능성을조사하였다. 방법 : 루푸스신염 (lupus nephritis, LN) 환자 48명, LN이없는 SLE 19명, 류마티스관절염 (rheumatoid arthritis, RA) 환자 35명및건강한남자성인 4명으로부터얻은총 8개의혈청을대상으로하였다. 시험할혈청에건강인의전혈을가하여배양하였다. 시간배양후혹은배양조건을변화시켜호중구에대한자가항체결합과세포자멸사, 괴사에대하여 IgG-FITC와 7-aminoactinomycin D를사용하여유세포분석법으로측정하였고, 결과는측정치의시험 / 건강대조비 (ratio) 로써나타내었다. 이결과와항 dsdna 항체와의관계를조사하였다. 결과 : IgG 평균형광강도 (mean fluorescence intensity, MFI) 비 (MFI ratio) 는건강인군, RA군, SLE군, LN군에서각각 1.±.3, 1.6±1.6,.±1.5, 4.8±7.5 로서루푸스신염군에서건강인군 1. Gilligan HM, Bredy B, Brady HR, Hebert MJ, Slayter HS, Xu Y, et al. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies interact with primary granule constituents on the surface of apoptotic neutrophils in the absence of neutrophil priming. J Exp Med 1996; 184: 31-41.. Ormerod MG. Flow cytometry in the study of apoptosis. In: Ormerod MG, ed. Flow cytometry 3rd ed. New York: Oxford University Press; : 35-47. 3. Harper L, Ren Y, Savill J, Adu D, Savage CO. Antineutrophil cytoplasmic antibodies induce reactive oxygen-dependent dysregulation of primed neutrophil apoptosis and clearance by macrophages. Am J Pathol ; 157: 11-. 4. Yang JJ, Tuttle RH, Hogan SL, Taylor JG, Phillips BD, Falk RJ, et al. Target antigens for anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies (AN- CA) are on the surface of primed and apoptotic but not unstimulated neutrophils. Clin Exp Immunol ; 11: 165-7. 5. 원동일, 허운보, 서장수, 이원길, 김현숙. 장시간항온호중구에대한항체의유세포분석에의한검출. 대한진단검사의학회지 3; 3: 336-44. 6. Shmerling RH. Autoantibodies in systemic lupus erythematosus-- there before you know it. N Engl J Med 3; 349: 1499-5. 7. Ruiz-Arguelles A and Alarcon-Segovia D. Novel facts about an old marker: the LE cell. Scand J Clin Lab Invest Suppl 1; 35: 31-7. 8. Alarcon-Segovia D, Llorente L, Ruiz-Arguelles A. The penetration

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