204 HANYANG MEDICAL REVIEWS Vol. 30 No. 3, 2010 파울러자유아메바의접촉성병인기전에관여하는 nfa1 유전자 The nfa1 Gene Contributed on the Contact-dependent Pathogenic Mechanisms of Naegleria fowleri 신호준아주대학교의과대학미생물학교실 Ho-Joon Shin, Ph.D. Department of Microbiology, and Department of Molecular Science and Technology, Ajou University School of Medicine, Suwon, Korea 책임저자주소: 442-749, 경기도수원시영통구원천동산5번지 아주대학교의과대학미생물학교실 Tel: 031-219-5076, Fax: 031-219-5079 E-mail: hjshin@ajou.ac.kr cytotoxicity. The sirna decreased the expression levels of nfa1 mrna and Nfa1 protein in transfected N. fowleri trophozoites. On the immunization of mice with the rnfa1 protein, the protective immunity of host was induced. Thus, mice showed the prolonged mean survival times in PAM-developed mice. In final, the nfa1 gene and Nfa1 protein play an important role in the pathogenesis of N. fowleri infection. Key Words: Naegleria fowleri; nfa1 gene, Cytotoxicity, Protective immunity, Recombinant protein 투고일자: 2010년 6월 8 일, 심사일자: 2010년 6월 20 일, 게재확정일자: 2010년 6월 29일 Abstract 서 론 Free-living Naegleria fowleri is a causal agent of primary amoebic meningoencephalitis in mainly children and young adults. An nfa1 gene, encoding 360 bp of nucleotides, was cloned from a N. fowleri cdna library by SEREX method. By immunohistochemistry and a confocal microscope, Nfa1 protein was found in amoebic pseudopods, especially in food-cups, when amoeba was in contact with target cells. When an anti-nfa1 antibody was added to the coculture system, the cytotoxicity of N. fowleri trophozoites onto target cells was decreased, and the severe morphological destruction of rat microglial cells cocultured with N. fowleri trophozoites was reduced. In a tansfection system, an expression vector with an nfa1 gene was successful transfected into nonpathogenic N. gruberi, and transgenic N. gruberi showed the increasing in vitro 자유생활아메바(free-living amoeba) 는토양과담수에서 자유생활을하며, 자연환경에서는세균들을포식하며살아 가는아메바들로써현재까지는자유아메바 (Naegleria spp.), 가시아메바 (Acanthamoeba spp.), Balamuthia 및 Sappinia 아메바등이보고되고있다. 1 자유아메바속 (genus Naegleria) 에는약 30여종이상이있는것으로보고되고있 으며, 2 그중병원성이강한파울러자유아메바 (Naegleria fowleri) 는인체, 마우스및다른실험동물들에서원발성아 메바성수막뇌염 (primary amoebic meningoencephalitis; PAM) 을유발한다. 3-6 2008년에미국에서캠핑을갔던학생 들중 6명이집단으로파울러자유아메바에감염되어 PAM으 로사망하는사건이발생하여사회를혼란케했었으며( 세계 일보, 2009년 7월 30 일자), 현재까지세계적으로약 200 건 이상의 PAM 발생환자가보고되고있는데, 1 국내에서는파 울러자유아메바에의한 PAM 환자발생예는아직보고되고있지않다. 7 파울러자유아메바는 35 의온도에서최적으로생장하며
205 The nfa1 Gene Contributed on the Contact-dependent Pathogenic Mechanisms of Naegleria fowleri Fig. 1. Life-cycle of Naegleria fowleri. 40~50 에서도생존이가능하다. 크기가 7~20 µ m이고운 동성이매우활발한아메바형시기 (amoeboid stage), 10~18 µ m 정도의크기를갖고이중막의원형모양인포낭형 시기(cystic stage) 와일시적인편모를갖는편모형시기 (flagellate stage) 로구성되는생활사를가지고있다 (Fig. 1). 3,8 파울러자유아메바는온도, 환경, 영양상태등에따라영양 형(trophozoite) 에서포낭(cyst) 으로바뀌는데이를포낭형 성과정(encystation) 이라고하며, 반대로살기좋은환경에 서는포낭형에서영양형으로전환되는데이를탈낭과정 (excystation) 이라한다. 6 포낭형성과정에서먹이부족과건 조로부터자신을보호하는역할로써포낭화된 (encysting) 파울러자유아메바는하나의핵(nucleus) 과세포질내공포 (cytoplasmic vacuoles), 식포(food vacuoles), 수축포 (contractile vacuoles) 들을많이갖고있으며, 그중리보핵 산단백질 (ribonucleoprotein) 을포함한소포는아마도자가포식소체(autophagosome) 형공포들일것이라하였다. 9 이중막의자가포식소체가생성되면라이소솜 (lysosome) 과융합되어단백질과세포질내구성성분들을분해하게된 다. 자가포식(autophagy) 은진핵세포의진화과정에서보 존되어내려온단백질분해경로 (protein degradation pathway) 인데, 이런단백질분해경로는제한된영양상태 에있는세포의생존에반드시필요하다. 10 자가포식작용에 대한연구들은아직초보단계이지만중요한제3의병인기전 으로취급하기도한다. 포낭형성은항생제의약효를저해시 키는주요기작으로이용되는데, 아메바감염증의치료에있 어포낭형성은효과적인아메바증(amoebiasis) 치료를저 해하게되며, 반대로포낭형성을억제하면아메바감염증질환치료에더좋은치료효과를기대할수있다. 11 파울러자유아메바에의한 PAM( 원발성아메바성수막뇌 염) 은아메바에오염된물에서수영또는수상레포츠를즐 길때아메바의영양형이인체에감염되어발생되는것으로알려져있다. 12-15 12, Cerva 및 Novak (1968) 의 13 보고에따 르면체코슬로바키아에서 16명의 PAM환자가발생하였는 데같은수영장에서감염되었다고하였다. 최근의 PAM 발병 례는가정의수도물공급과도연관이있는것으로보고되고있다. 9 주요감염경로는인체의비강(nasal cavity) 을통해서이 루어지는데, 비강에들어온아메바의영양형이비강점막 (mucosal membrane) 을침입하고그후에후신경(nasal nerve) 을통하여후엽(olfactory bulb) 과뇌막을침범하면 서수막뇌염으로발전시켜감염후 7~10내에사망에이르게한다. 9 PAM을일으키는아메바의주요감염부위는중추신 경계(central nervous system) 이며, 감염후증상은격심한 두통, 식욕부진, 메스꺼움, 구토, 고열(38~40 ), 사지의기 능장애, 뇌막자극의징후, 그리고뇌염을동반한극심한증 상을일으킨다. PAM은진행정도가매우빠르고감염부위의 특수성때문에진단이어려워사망률이 95% 이상에이르고 있으며, 현재까지적절한치료와예방법은미비한상태이 1, 4, 16 다. 자유아메바의병원성유발기전 (pathogenic mecha- nisms) 은아직정확히밝혀져있지는않았지만, 숙주세포에 아메바의접촉(adhesion) 이일어난다음숙주세포사멸을 유도하는세포병변효과(cytopathic effect) 가일어난다고 보고되었다. 17, 18 파울러자유아메바는후신경을통해서중추 신경계로들어갈수있는데, sucker-like appendage (food-cup 과동일한구조로간주함) 또는 amebostome이 라는구조물을이용한식세포작용(phagocytosis) 과효소 (enzyme) 등을분비하는세포용해(cytolysis) 과정에의해 서신경조직을파괴한다. 6, 7, 9, 19-22 숙주세포의 fibronectin 을통해파울러자유아메바가부착하는데, integrin-like protein 및 protein kinase C가관여한다는것이보고되었 다. 23 세포용해에관여하는병인요소(viluence factor) 로써 는 phospholipases, 24-26 neuraminidases, 27 pore forming enzymes, 28-30 protease 31, 32 등이보고되고있다. 한편 Fritzinger 등 (2006) 은보체(complement) 의막공격복합체
206 Hanyang Medical Reviews Vol. 30 No. 3, 2010 (membrane attack complex) 및여러가지세균의독소에 의한 pore-forming protein의공격으로부터아메바의막을 보호하는 CD59-like protein 을클로닝하였다. 그외의여러 보고된논문들을정리하면파울러자유아메바의병인기전으 로는다음과같은가설이가능하다 (Fig. 2). 첫번째병인기전은접촉성병인기전 (contact-dependent pathogenic mechanism) 으로아메바세포질의분출형태 인 food-cup 구조체나 amoebostome 구조체들을형성하 여표적세포에부착하여세포파괴를유발하는과정이다 (Fig. 2A). 두번째병인기전은비접촉성병인기전(contact- independent pathogenic mechanism) 으로수용성 (soluble) 용해물질(cytolytic factor) 들을분비하여표적세 포를파괴하는과정이다(Fig. 2B). 마지막세번째는엄격하 게말해표적세포에대한병인기전은아니지만아메바의생 존에제 3 의중요한기전으로알려지고있는자가포식(auto- phagy) 과정이다(Fig. 2C). 최근에는분자생물학적기술들이발전하면서아메바의병 인기능을담당하는유전자들의클로닝이가능하게되었는 데, Fig. 2에서보듯이본연구자등에의해파울러자유아메 바로부터는 nfa1, hsp70 및 actin 유전자등이클로닝되어 22, 33, 34 병원성과의연관성등생물학적특성들이밝혀졌다. 본논문에서는파울러자유아메바의첫번째병인기전인접촉 성병인기전에관여하는유전자로보고된 nfa1 유전자 (Naegleria fowleri 로부터첫번째로클로닝되어학명의첫 글자들을따서명명됨) 에대해고찰하고자한다. 본 론 Shin 등 33 은 N. fowleri의 cdna library를구축하고 N. fowleri에대한감염혈청및면역혈청을생산하였으며, 그 것들을이용하여 immunoscreening을통해새로운유전자 를클로닝하였는데 (SEREX Method, serum reaction method 라불리움), N. fowleri의위족(pseudopodia) 특 Fig. 2. Three hypothetical mechanisms for Naegleria fowleri pathogenesis. (A) Contact-dependent mechanism. (B) Contact-independent mechanism. (C) Autophagy mechanism.
207 The nfa1 Gene Contributed on the Contact-dependent Pathogenic Mechanisms of Naegleria fowleri 히, food-cups에특이적으로발현하는것을확인하여 nfa1 유전자로명명하였다. 1. 분자생물학적특성 새로이클로닝된 nfa1 유전자의분자생물학적특성 (molecular and biological characterization) 을알아보고 자염기서열분석(sequencing data), 기존의유사유전자들 과의상동성비교(homology search) 및재조합단백질 (recombinant protein; rnfa1 protein) 을생산하였다. 1) nfa1 유전자의염기서열분석 파울러자유아메바로부터클로닝된 nfa1 유전자는 atg를 시작코돈(start codon) 으로, taa 를종료코돈(stop codon) 으로이용하는 120 개의아미노산(360bp의 DNA 염기서열) 을갖고있었다. 33 또한, 발현벡터(expression vector) 인 TOPO 벡터에 nfa1 유전자를클로닝하고 E. coli 발현시스 템을이용하여얻은재조합단백질 (recombinant protein; rnfa1 protein) 을생산하는시스템을갖추었다. 자항-Nfa1 항체(anti-Nfa1 antibody) 를생산하였으며, 면역 세포조직화학적실험(immunocytochemistry) 을시행하였 다. 1) 항-Nfa1항체생산 클로닝된 nfa1 유전자를발현하여얻은재조합단백질 (rnfa1 protein) 을마우스의복강내로 1차접종에서는 rnfa1 50 mg과 complete adjuvant를 1:1(v/v) 로섞어서주입하였 으며, 3주간격으로 2, 3차에서는 rnfa1 25 mg과 incomplete adjuvant를 1:1 (v/v) 로섞어서주입하였고, 3주후마지막 4 차에서는 rnfa1 25 mg과생리식염수를 1:1 (v/v) 로섞어서 주입하였다. 3차주입이끝난후마우스의혈액을채취하여 항체가의형성을확인한뒤항-Nfa1 다클론항체(polyclonal antibody) 로사용하였다. 20, 33 Nfa1 단백질에대한단클론항 2) 상동성비교 파울러자유아메바의 nfa1 유전자의 DNA 염기서열을 GeneBank 에등록(Accession number AF230370) 한후 기존에클로닝된유전자들로 DNA 염기서열의상동성을비 교한결과, 여러생물체의 myohemerythrin 유전자들과 26~43% 의상동성을갖고있었다. 33 Myohemerythrin은 O 2 운반단백질로알려져있는데, Nfa1 단백질이 myohemery- thrin 단백질과높은상동성을보인것은아니지만, nfa1 유 전자가아메바의생존에중요한역할을담당할것이라는것 을그당시제시하였다. 3) Nfa1 재조합단백질 클로닝된 nfa1 유전자를발현벡터인 TOPO 벡터에클로 닝하고, E. coli 발현시스템을이용하여얻은재조합단백질 (rnfa1 protein) 은 13.1 kda 의분자량을갖고있었다( 순수 정제에유용하기위해 Tag 단백질을붙인 Tag-fusion단백질 은 17.1 kda 임) (Fig. 3A). 2. 면역세포학적특성 파울러자유아메바로부터클로닝된 nfa1 유전자의면역세 포학적특성(immunocytological characters) 을알아보고 Fig. 3. SDS-PAGE and western blotting results. A) Lane 1 and 2 show a N. fowleri lysate and a recombinant His-tag fusion Nfa1 protein. Lane 3 and 4 show reacting bands by western blotting using an anti-nfa1 polyclonal antibody. B) All lanes show band patterns of recombinant His-tag fusion Nfa1 proteins with anti-nfa1 monoclonal antibody produced from various hybridoma clones. PM, prestained marker.
208 Hanyang Medical Reviews Vol. 30 No. 3, 2010 체 (monoclonal antibody) 의생산은세포융합(cell fusion) 기술인 hybridoma technique 을이용하였으며, 생산된다 클론항체와단클론항체모두13.1 kda의항원대에반응을 20, 21 보였다 (Fig. 3B). 2) 면역세포조직화학적특성 파울러자유아메바로부터클론닝된 nfa1 유전자의항원성 정도(antigenicity) 및세포내분포위치(cellular localiza- tion) 를알아보고자 anti-nfa1 다클론항체와 peroxidase 를발색효소로사용한 immunolocalization 실험결과, 33 비 병원성인그루버자유아메바 (Naegleria gruberi) 의영양형 과는전혀반응하지않았으나파울러자유아메바의영양형과 는잘반응하여종- 특이성(species-specific) 을보여주었다. 한편 in vivo 실험으로마우스에파울러자유아메바를감염 시켜얻은실험적 PAM이발생된마우스의뇌조직에서보면 anti-nfa1 항체는파울러자유마에바의영양형에잘반응되 어차후진단적항체로써의이용가치를보여주었다. 35 TEM 전자현미경을사용한관찰에서보면, 35 Nfa1 단백질은아메 바의위족과식포(food cup) 주의에주로분포하는단백질 로위족활동과연관이있는것으로보고하였다. 공초점현미 경(confocal microscope) 을이용한관찰에서보면, 20 Nfa1 단백질은아메바의위족특히, 왕성한식세포작용(phago- cytosis) 과연관이있는 food-cup 에잘발현되고있었으며, 표적세포가있을때특히 food-cup에잘발현되는것으로보 아파울러자유아메바의병원성과의연관성을보여주었다. 3. 병인유전자로써의특성 파울러자유아메바로부터클로닝된 nfa1 유전자가아메바 의병원성어떤연관성이있는지를알아보고자 in vitro 세포 독성(cytotoxicity) 실험, 유전자복제감염(gene transfec- tion) 실험및유전자발현억제(gene knock-down) 실험을 시행하였다. 1) 항-Nfa1항체와 in vitro 세포독성 파울러자유아메바의영양형(trophozoite) 은표적세포들 즉, CHO 세포(Chinese hamster ovary cells), 대식세포 (macrophage) 및신경소교세포(miroglial cell) 들을강력 20, 21, 35-38 하게파괴시킴으로써높은세포독성을갖고있다. 이러한 in vitro 세포독성실험에있어서항-Nfa1 다클론항 체또는단클론항체를공동배양시스템 (coculture system, 같은배양기용기내에아메바의영양형들과표적세포들을 혼합하여배양하는것) 에투여하면, 파울러자유아메바영양 형들의표적세포들에대한세포독성은감소된다. 20, 21, 36 전 자현미경관찰(TEM, SEM) 을통한세포독성실험에서보 면, 38 공동배양시시템에항-Nfa1 항체를처리했을때아메바 영양형들의모양이약간움추려들어표적세포에의부착능 력이떨어짐이관찰되었다. 2) 형질전환(transgenic) 아메바 클로닝된 nfa1 유전자의병원성과관련유무를확인하기 위하여, 비병원성자유생활아메바인그루버자유아메바(N. gruberi) 로 nfa1 유전자를 transfection 하는유전자복제감 Fig. 4. Confocal microscopic findings of the Nfa1 protein in Naegleria fowleri trophozoites cocultured with CHO cells (red color) for 3 hr (A) and 6 hr (B). Strong fluorescent signals were shown in the food-cups of the N. fowleri trophozoite ( 400).
209 The nfa1 Gene Contributed on the Contact-dependent Pathogenic Mechanisms of Naegleria fowleri 염(gene transfection) 시험을수행한결과, nfa1 유전자를 갖고있는 transfection vector가그루버자유아메바의세포 질로잘 transfection 됐음을형광현미경으로그리고 nfa1유 전자가염색체내로들어간것을 PCR 을통해확인하였으며, 형질전환된그루버자유아메바 (transgenic N. gruberi) 는표 39, 40 적세포에대한세포독성이약간증가하였다. 3) 유전자발현억제(gene knock-down) 파울러자유아메바의 nfa1 유전자발현이아메바자체에서 억제되었을때아메바의세포독성에어떤변화가있는지를 알아보고자, double-stranded 41 및 antisense RNA 37 와 RNAi (RNA interference) 간섭을기초로한 sirna를이용하여파 울러자유아메바의영양형 (N. fowleri trophozoites) 내로 주입시켰다. 실험결과 nfa1 유전자의발현이 knockdown 된것이관찰되었으며, 표적세포에대한세포독성을확인한 결과 nfa1 유전자의발현이억제된파울러자유아메바의세 포독성이저하됨이관찰되어, 클로닝된 nfa1 유전자가아메 바의병원성과관련이있음을보고하였다. 글로블(immunoglobulin) 항체를측정하였는데, 정상적인 마우스의혈청보다재조합 rnfa1 단백질로면역된마우스의 혈청에서 IgG (immunoglobulin G) 의수치가높아져있음 을알수있었다 (Fig. 6). 2) 실험적수막뇌염(experimental PAM) 에의한마우스 의평균사망일 파울러자유아메바의 rnfa1 단백질을마우스에면역시킨 후실험적 PAM을유발하여마우스들의사망일을관찰하였 는데, 건강한마우스그룹에서는평균사망일이 15.0일이었 고, 아메바재조합 rnfa1 단백질만으로면역시킨마우스그 룹에선평균사망일이 25.0 일이었으며, 면역을돕기위해 rnfa1 단백질을 adjuvant를같이혼합하여면역시킨마우스 그룹에서는평균사망일이 24.4 일이었다(Fig. 7). 따라서파 울러자유아메바의감염에대한 Nfa1 단백질의전처리( 면역) 가숙주에서의항체형성을유도하여마우스의평균사망일 을늘린결과를보여주어숙주의방어면역이유도되었음을 알수있었다. 4. 숙주의방어면역 파울러자유아메바로부터클로닝된 nfa1 유전자가아메바 의 food-cups을이용한식세포작용에연관되어있으며그로 인해아메바의병원성에중요한역할을담당하고있음이관 찰되어, 파울러자유아메바감염시숙주의방어면역(protec- tive immunity) 을보기위해재조합 rnfa1 단백질을마우스 에면역시킨후실험적 PAM를유발시켜마우스의사망률을 관찰함으로써숙주로써의마우스의방어면역을알아보고자 하였다 (Fig. 5). 결 론 파울러자유아메바 (N. fowleri) 는인체, 마우스및다른실 험동물들에서원발성아메바성수막뇌염(PAM) 을유발한다. 자유아메바의병원성유발기전은아직정확히밝혀지지는않 았지만, 숙주세포에아메바의접촉(adhesion) 이중요하다고 1) 면역글로블린항체(immunoglobulin antibody) 재조합 rnfa1 단백질을마우스의복강으로주입하여면역 시킨후, 면역여부를알아보기위해마우스의혈청에서면역 Fig. 5. Flow-chart of immunization and infection schedule. Fig. 6. Serum IgG level in mice immunized with the rnfa1 protein. rnfa1, recombinant Nfa1 protein; PBS, phosphate buffered saline.
210 Hanyang Medical Reviews Vol. 30 No. 3, 2010 References Fig. 7. Survival rate in mice infected intraperitoneally with N. fowleri trophozoites post immunization with the rnfa1 protein. 보고되었다. 파울러자유아메바로부터처음클로닝된 nfa1유 전자는파울러자유아메바의 cdna library로부터파울러자 유아메바에대한감염혈청및면역혈청을이용하여 immu- noscreening 을통해클로닝된새로운유전자이다. 클로닝된 nfa1 유전자는 360 bp의 DNA 염기서열을갖고있으며 13.1 kda 의분자량을갖는단백질을발현하고있다. Immuno- cytochemistry 실험결과, 파울러자유아메바의위족 (pseu- dopodia) 특히, food-cups에특이적으로발현하여아메바 의접촉성병인기전과연관성을보였으며, 항-Nfa1 항체의처 리는표적세포들에대한파울러자유아메바의세포독성을감 소시켰다. 비병원성인그루버자유아메바(N. gruberi) 에 nfa1 유전자를복제감염(transfection) 시키면형질전환된 그루버자유아메바는높아진세포독성을보였으며, sirna 등 으로파울러자유아메바자체에서 nfa1 유전자발현을억제시 키면파울러자유아메바의세포독성은감소하였다. 재조합 rnfa1 단백질을마우스의복강내로여러번주입하면파울러 자유아메바에대한면역항체가잘생성되며, 면역된마우스 에실험적으로파울러자유아메바의영양형들을감염시켜 PAM을유도하면재조합 rnfa1 단백질로면역된마우스들은 평균생존기간이연장되었다. 종합하여보면, 클로닝된 nfa1 유전자는파울러자유아메바의접촉성병인기전에중추적인 역활을담당하며더나가서는아메바의병인규명과 PAM의 진단, 치료및예방에매우유용하고중요한유전자이다. 1. Visvesvara GS, Moura H, Schuster FL. Pathogenic and opportunistic free-living amoebae: Acanthamoeba spp., Balamuthia mandrillaris, Naegleria fowleri, and Sappinia diploidea. FEMS Immunol Med Microbiol 2007;50:1-26. 2. De Jonckheere JF. Molecular definition and the ubiquity of species in the genus Naegleria. Protist 2004;155:89-103. 3. John DT. Primary amebic meningoencephalitis and the biology of Naegleria fowleri. Annu Rev Microbiol 1982; 36:101-23. 4. Ma P, Visvesvara GS, Martinez AJ, Theodore FH, Daggett PM, Sawyer TK. Naegleria and Acanthamoeba infections: review. Rev Infect Dis 1990;12:490-513. 5. Marciano-Cabral F, Cabral GA. The immune response to Naegleria fowleri amebae and pathogenesis of infection. FEMS Immunol Med Microbiol 2007;51:243-59. 6. Schuster FL, Visvesvara GS. Free-living amoebae as opportunistic and non-opportunistic pathogens of humans and animals. Int J Parasitol 2004;34:1001-27. 7. Shin HJ, Im KI. Pathogenic free-living amoebae in Korea. Korean J Parasitol 2004;42:93-119. 8. Page FC. Rosculus ithacus Hawes, 1963 (Amoebida, Flabelluidae) and the amphizoic tendency in amoebae. Acta Protozoologica 1974;13:143-55. 9. Marciano-Cabral F. Biology of Naegleria spp. Microbiol Rev 1988;52:114-33. 10. Levine B, Klionsky DJ. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev Cell 2004;6:463-77. 11. Moon EK, Chung DI, Hong YC, Kong HH. Autophagy protein 8 mediating autophagosome in encysting Acanthamoeba. Mol Biochem Parasitol 2009;168:43-8. 12. Cerva L, Novak K. Epidemic occurrence of amebic meningoencephalitis. Cas Lek Cesk 1968;107:873-6. 13. Cerva L, Novak K. Amoebic meningoencephalitis: 16
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