J. Exp. Biomed. Sci. 2012, 18(3): 268~275 pissn : 1738-3226 Original Article Historical Control Data from 4-week Repeated Toxicity Studies in Crj:CD (SD) Rats Jung-Min Lee 1, Min-Ah Lee 1, Hyeon-Nam Do 1, Re-Ji-Na Bae 1, Mi Ju Lee 1, Myoung Jun Kim 1, Ho-Song Jang 1, Sun Hee Park 1, Hye-Yeong Lee 1, Jin Seok Kang 2, and Jong-Koo Kang 3, 1 Pathology Department, Biotoxtech Co., Ltd, Chungbuk 353-883, Korea 2 Department of Biomedical Laboratory Science, Namseoul University, Cheonan 331-707, Korea 3 Laboratory Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, Cheongju 361-763, Korea Reference ranges of standard experimental parameters are useful for comparisons in toxicology. The aim of this study was to collect data from 4-week repeated toxicity studies in Crl:CD (SD) rats, a strain widely used for toxicity and efficacy research, for establishing domestic reference values. Data on body weight, food consumption; urinalysis, hematological, and blood biochemical parameters; and organ weights were collected from 16 toxicity studies in 220 Crl:CD (SD) rats (110 males and 110 females). The studies had been performed at a single testing facility over the last 3 years and involved animals sourced from a single breeder. The findings were collated as means, standard deviations, percentages, and ranges. Urine volume, uterus weight, eosinophil, and basophil counts, and triglyceride, total bilirubin, and gammaglutamyl transpeptidase levels showed standard deviations of 30% or more. These historical control data would help to interpret the effects of test substances in routine toxicity and efficacy studies. Key Words: Crl:CD (SD) rat, Control data, Reference range, Toxicology 서 식품첨가물, 의약품및화학물질등의독성및유효성을평가하는데있어서배경자료 (historical control data) 는투여에의한영향을해석하는데실직적으로도움이된다 (Kang et al., 1995). 하지만, 이러한배경자료는동물의주령, 사육환경, 사료의종류, 계통, 측정기기, 사용된시약, 동물의스트레스및실험방법등에따라영향을받는다고알려져있다 (Cho et al., 1997; Kang et al., 2001). 안전성, * Received: February 27, 2012 / Revised: June 5, 2012 Accepted: July 4, 2012 Corresponding author: Jin Seok Kang. Department of Biomedical Laboratory Science, Namseoul University, 21 Maeju-ri, Seonghwan-eup, Cheonan, Chungnam 331-707, Korea. Tel: +82-41-580-2721, e-mail: kang@nsu.ac.kr Corresponding author: Jong-Koo Kang. Laboratory Animal Medicine, College of Veterinary Medicine, Chungbuk National University, 410 Seongbong-ro, Heungduk-gu, Cheongju, Chungbuk 361-763, Korea. Tel: +82-43-261-2607, e-mail: jkkang@cbu.ac.kr C The Korean Society for Biomedical Laboratory Sciences. All rights reserved. 론 유효성평가에수반되는시험을수행할때투여에따른영향을평가하기위하여대조군을설정하여, 그결과를비교하는기준으로사용되어왔으나, 대조군의측정치가일정하지않거나, 시험물질투여군의측정치가대조군의최소치또는최대치와근접한경우, 그결과를해석하는일은쉽지않다 (Kang et al., 2004). 그외에도통계학적으로유의성이관찰된항목이용량의존성도없이산발적으로분포하거나, 매우경미한변동이지만, 표준편차등의차이로인하여통계적인오류에기인된유의성인경우에도결과해석에방해가되는요인이된다 (Hayes AW, 2001). 따라서, 올바른결과해석을위하여, 용량반응관계의평가및다른검사항목과의연동등을종합적으로평가하는경우가많다 (Ha et al., 1995). 그러나, 관찰된결과치가정상적인생리적범위내에속하는지판단할수있는가장중요한지표는배경자료가된다. 그러므로, 안전성및유효성평가에수반되는시험을실시하는시험종사자는결과해석단계에서배경자료의충분한이해및확보가 - 268 -
중요하다 (Kang et al., 2001). 시험종사자는이러한배경자료의중요성을충분히인지하고있음에도, 국내의경우주요실험동물공급업체로부터동물의체중, 사료섭취량, 뇨검사, 혈액학적검사, 혈액생화학적검사및장기중량등에대한자료를제공받지못하는경우가많고, 외국의실험동물생산공급업체에서제공되는배경자료나문헌에의존하여판단하는경우가많다 (Oh et al., 2001). 그리고, 외국에서널리사용되는측정기기또는시약은국내유통되지않는경우도흔하므로, 외국에서제공되는배경자료를근거로판단하기에는어려움이많다. 국내의배경자료에대한연구에서는동일주령의측정치에대한성차의비교는언급되어있으나, 각항목별변동폭및참고치 (reference range) 에대한정보는찾을수없었다. 또한, 자료의수집기간이 1 년이내로짧아검사결과에영향을주는사육환경및실험방법등의영향요인들이충분하게반영되지않았다. 따라서, 우리는안전성, 유효성평가에많이사용되는 Crl:CD (SD) 랫드에대하여총 16개의 4주반복시험에서사용된대조군암수랫드의체중, 사료섭취량, 뇨검사, 혈액학적검사, 혈액생화학적검사및장기중량자료를약 3년간수집하여 10주령의암수랫드각각 110마리의각항목별변동범위및참고치를포함하여보고함으로써, 많은시험종사자들이 Crl:CD (SD) 랫드를이용한시험에결과해석을보다용이하게할수있도록도움이되고자한다. 재료및방법동물 ( 주 ) 바이오톡스텍에서 2008년부터 2011년까지실시한 4주반복투여독성시험에서 ORIENTBIO INC., Korea Crl: CD (SD) 랫드를이용한 16개시험중, 총 220마리 ( 수컷 110마리, 암컷 110마리 ) 의대조군동물을이용하였다. 검역순화반입시동물의외관검사를실시하고, 전자저울 (CP- 3202S, Sartorius AG, Goettingen, Germany) 로체중을측정하였다. 6~7일간의순화기간중에매일 1회일반증상을관찰하고, 순화기간종료일에체중을측정하고, 일반증상및체중변화를확인하여동물의건강상태를평가하였다. 사육환경동물은스테인레스철망사육상자 (260W 350D 210H (mm)) 에 1마리씩배치하여온도 19~25, 상대습도 30.0~70.0%, 환기회수 10~15회 / 시간, 명암주기 12시간 / 일 ( 오전 7시부터오후 7시 ), 조도 150~300 Lux의조건에서사육하였다. 사료는실험동물용고형사료 (Teklad Certified Irradiated Global 18% Protein Rodent Diet 2918C) 를급이기에넣어자유섭취시켰다. 투여방법주사용수 (JW Pharmaceutical, Korea) 을시험기간에따라 4주간매일오전에경구투여용존데를부착한일회용주사기 (3~5 ml) 를이용하여투여기간 1일 1회위내에강제경구투여하였다. 뇨검사투여최종주에신선뇨 ( 배설후약 3시간이내의뇨 ) 와축뇨 ( 배설후약 24시간뇨 ) 를수거하여, 단백 (protein, PRO), 당 (glucose, GLU), 케톤체 (ketone body, KET), 유로빌리노겐 (urobilinogen, URO), 빌리루빈 (bilirubin, BIL), 잠혈 (occult blood, Ery), 아질산염 (Nitrite, NIT) 은뇨화학분석기 (Miditron Junior II, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) 를이용하여측정하였다. 정량적검사로서 24 시간축뇨에대한뇨량 (urine volume) 을계측하였다. 혈액학적검사모든생존동물에대하여부검전약 18시간이상절식시킨후, 부검일에 Isoflurane으로마취하여배대동맥으로부터혈액을채취한후혈액약 1 ml을 EDTA 함유 tube에넣었다. 혈액학적검사는적혈구수 (erythrocyte count, RBC), 혈색소량 (hemoglobin, HGB), 헤마토크리트치 (hematocrit, HCT), 평균적혈구용적 (mean corpuscular volume, MCV), 평균적혈구헤모글로빈량 (mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균적혈구헤모글로빈농도 (mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), 혈소판수 (platelet, PLT), 백혈구수 (leucocyte count, WBC), 중성호성백혈구 (neutrophils, NEU), 림프구 (lymphocytes, LYM), 단핵구 (monocytes, MONO), 산호성백혈구 (eosinophils, EOS), 염기호성백혈구 (basophils, BASO), 망상적혈구 (reticulocytes, Reti) 에대하여혈구분석기 (ADVIA 120, Siemens Healthcare Diagnostics, Tarrytown, NY, USA) 로측정하였다. 또한, 응고검사는채취한혈액약 2 ml을 3.2% sodium citrate 함유 tube에넣고, 3,000 rpm으로 10분간원심분리한후혈장을채취하여, 응고시간분석기 (ACL - 269 -
Fig. 1. Changes in body weight of male and female rats. The male and female rats showed a body weight gain of 204% and 155%, respectively, from week 1 to week 4. Fig. 2. Changes in food consumption of male and female rats. Male and Female rats consumed the maximum amount of food in the experimental 4week; thereafter, food consumption reached a plateau until the end of the study. 7000, Instrumentation Laboratory, Bedford, USA) 로프로트롬빈시간 (prothrombin time, PT), 부분활성트롬보플라스틴시간 (activated partial thromboplastin time, APTT) 을측정하였다. 혈액생화학적검사혈액학적검사를수행한모든동물의배대동맥에서채취한혈액을 3,000 rpm으로 10분간원심분리한후채취한혈청을생화학분석기 (7080, Hitachi, Tokyo, Japan) 를이용하여알라닌아미노기전이효소 (alanine aminotransferase, ALT), 아스파테이트아미노기전이효소 (aspartate aminotransferase, AST), 알칼라인포스파타제 (alkaline phosphatase, ALP), 감마글루타밀트란스펩티다제 (gamma glutamyl transpeptidase, GGT), 혈액요소질소 (blood urea nitrogen, BUN), 크레아티닌 (creatinine, Crea), 총빌리루빈 (total bilirubin, T-Bili), 총단백 (total protein, TP), 알부민 (albumin, ALB), 총콜레스테롤 (total cholesterol, T-Chol), 트리글리세라이드 (triglycerides, TG), 인 (phosphorus, P), 혈당 (glucose, Glu), 칼슘 (calcium, Ca) 을측정하였다. 또한, 전해질분석기 (AVL 9181, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) 로염소 (chloride, Cl), 나트륨 (sodium, Na), 칼륨 (potassium, K) 을측정하였다. 장기중량모든동물에대하여뇌 (brain), 뇌하수체 (pituitary), 심장 (heart), 폐 (lung), 간 (liver), 비장 (spleen), 신장 (kidney), 부신 (adrenal), 고환 (testis), 전립선 (prostate), 난 소 (ovary), 자궁 (uterus) 에대하여중량을측정하였다. 단, 좌우가있는양측장기는좌우를합하여무게를측정하였다. 결과체중시험개시 1주부터 4주까지체중증가율은수컷 204%, 암컷 155% 로시험종료까지지속적으로증가하였다. 또한, 동일주령에서체중의표준편차는평균체중의 10% 이내였다. 수컷에서는시험개시부터 3주까지평균체중의 10% 이상크게증가하였으나, 시험개시 4주에서는체중의증가율이 10% 이내로감소되었다. 암컷은수컷과비교시체중의증가폭이크지않았으며, 시험개시 3주부터체중증가율이평균체중의 10% 이내로감소되었다 (Fig. 1). 사료섭취량시험개시 1주부터 4주까지의사료섭취량은암수모두시험개시 4주에서최고치를나타내었다. 평균사료섭취량은수컷 26.3 g/day부터 32.6 g/day, 암컷 20.8 g/day부터 23.6 g/day의범위였다. 또한, 시험개시 1주부터 4주까지의사료섭취량에서최소사료섭취량과최대사료섭취량의차이가가장큰주령은수컷의시험개시 3주령으로최소 25.6 g/day에서최대 40.0 g/day이었고, 암컷은시험개시 1주령이내로최소 15.5 g/day에서최대 29.5 g/day 이었다 (Fig. 2). - 270 -
뇨검사뇨검사결과양성이검출된항목은수컷의단백, 케톤체및잠혈, 암컷의단백이었다. 양성률은, 수컷 ( 단백 : 50%, 케톤체 : 3%, 잠혈 : 3%) 로암컷 ( 단백 : 6%) 과비교시높은경향이인정되었으며, 뇨량의표준편차는암수 모두평균치의 30% 이상으로변동폭이큰것이확인되었다 (Table 1). 혈액학적검사혈액학적검사결과적혈구및관련검사항목의검사치에서표준편차가평균치의 10% 미만을나타낸검사항목 Table 1. Urinalysis data Male Female N Mean ± SD Min Max N Mean ± SD Min Max U.Volume (ml) 25 9.8 ± 5.2 3.6 30 25 5.3 ± 2.3 2.2 11.1 N - ± + +++ ++++ N - ± + +++ ++++ Protein (mg/dl) 30 15 ( 50) 15 (50) 0 0 0 30 28 ( 94) 2 (6) 0 0 0 Glucose (mg/dl) 30 30 (100) 0 0 0 0 30 30 (100) 0 0 0 0 Ketone body (mg/dl) 30 29 ( 97) 1 ( 3) 0 0 0 30 30 (100) 0 0 0 0 Urobilinogen 10 10 (100) 0 0 0 0 10 10 (100) 0 0 0 0 Bilirubin (mg/dl) 30 30 (100) 0 0 0 0 30 30 (100) 0 0 0 0 Occult blood (Ery/μl) 30 29 ( 97) 1 ( 3) 0 0 0 30 30 (100) 0 0 0 0 Nitrite (mg/dl) 30 30 (100) 0 0 0 0 30 30 (100) 0 0 0 0 ( ) incidence Table 2. Hematological data Male - 271 - Female N Mean ± SD -2S.D +2S.D N Mean ± SD -2S.D +2S.D RBC ( 10 6 cells/μl) 110 7.71 ± 0.28 7.14 8.28 110 7.58 ± 0.27 7.04 8.13 HGB (g/dl) 110 14.9 ± 0.5 13.9 15.9 110 14.7 ± 0.5 13.8 15.6 HCT (%) 110 44.0 ± 1.6 40.9 47.1 110 42.4 ± 1.6 39.2 45.5 Reti (%) 65 2.7 ± 0.4 1.9 3.5 65 2.0 ± 0.3 1.3 2.7 MCV (f/l) 110 57.0 ± 1.5 54.0 60.0 110 55.9 ± 1.6 52.6 59.2 MCH (pg) 110 19.3 ± 0.6 18.1 20.5 110 19.4 ± 0.6 18.1 20.7 MCHC (g/dl) 110 33.8 ± 0.8 32.2 35.3 110 34.6 ± 0.9 32.8 36.4 PLT ( 10 3 cells/μl) 110 1266 ± 155 957 1576 110 1250 ± 166 918 1583 WBC ( 10 3 cells/μl) 110 9.13 ± 2.19 4.74 13.51 110 4.67 ± 1.26 2.14 7.20 NEW (%) 65 14.5 ± 3.6 7.3 21.7 65 16.4 ± 4.7 7.0 25.7 LYM (%) 65 81.1 ± 4.0 73.2 89.0 65 79.7 ± 4.9 69.9 89.5 MONO (%) 65 2.2 ± 0.7 0.8 3.5 65 1.9 ± 0.5 0.9 2.9 EOS (%) 65 0.8 ± 0.3 0.3 1.4 65 1.1 ± 0.4 0.3 1.9 BASO (%) 65 0.2 ± 0.1 0.0 0.4 65 0.2 ± 0.1 0.0 0.4 LUC (%) 65 1.0 ± 0.4 0.1 1.9 65 0.8 ± 0.3 0.1 1.4 PT (sec) 64 14.4 ± 0.6 13.2 15.6 60 14.6 ± 0.6 13.5 15.8 APTT (sec) 64 16.6 ± 1.9 12.7 20.5 60 16.6 ± 1.8 13.0 20.1 Fib (mg/dl) 55 344 ± 56 231 456 49 266 ± 34 198 334 RBC, erythrocyte count; HGB, hemoglobin; HCT, hematocrit; Reti, reticulocyte; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuscular hemoglobin; MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration; PLT, platelet; WBC, leukocyte; NEW, neutrophil; LYM, lymphocyte; MONO, monocyte; EOS, eosinophil; BASO, basophil; PT, prothrombin; APTT, activated partial thromboplastin time; Fib, fibrinogen
Male Table 3. Hematological data Female N Mean ± SD -2S.D +2S.D N Mean ± SD -2S.D +2S.D ALT (U/L) 110 29.0 ± 4.88 19.3 38.8 110 23.5 ± 3.4 16.6 30.4 AST (U/L) 110 83.2 ± 16.0 51.2 115.2 110 75.4 ± 12.4 50.6 100.1 ALP (U/L) 110 615.7 ± 121.9 372.0 859.4 110 354.1 ± 68.5 217.2 491.1 GGT (U/L) 20 0.94 ± 0.49 0.00 1.92 25 1.21 ± 0.63 0.00 2.46 Glu (mg/dl) 110 144 ± 14 116 172 110 134 ± 14 106 163 BUN (mg/dl) 110 12.9 ± 1.4 10.1 15.8 110 14.1 ± 1.7 10.7 17.5 Crea (mg/dl) 110 0.45 ± 0.06 0.34 0.57 110 0.47 ± 0.05 0.36 0.58 T-Bili (mg/dl) 75 0.04 ± 0.02 0.01 0.08 75 0.05 ± 0.01 0.02 0.08 T-Chol (mg/dl) 110 75 ± 15 45 105 110 85 ± 14 57 112 TG (mg/dl) 110 43 ± 17 9 78 110 16 ± 6 4 28 TP (g/dl) 110 5.7 ± 0.3 5.2 6.2 110 5.9 ± 0.3 5.4 6.4 Alb (g/dl) 110 2.5 ± 0.2 2.1 2.8 110 2.7 ± 0.2 2.3 3.2 A/G ratio 110 0.77 ± 0.09 0.59 0.94 110 0.85 ± 0.10 0.65 1.05 P (mg/dl) 65 8.05 ± 0.57 6.90 9.19 65 6.40 ± 0.58 5.24 7.56 Ca (mg/dl) 65 10.4 ± 0.3 9.8 11.1 65 10.0 ± 0.3 9.4 10.6 Na (mmol/l) 65 139 ± 1 137 142 65 139 ± 1 136 14 K (mmol/l) 65 4.7 ± 0.3 4.0 5.3 65 4.3 ± 0.3 3.8 4.8 Cl (mmol/l) 65 103 ± 1 100 106 65 105 ± 1 102 108 ALT, alanine aminotransferase; AST, aspartate aminotransferase; ALP, alkaline phosphatase; GGT, gamma-glutamyl transpeptidase; GLU, glucose; BUN, blood urea nitrogen; Crea, creatinine; T-Bili, total bilirubin; T-Chol, total chloesterol; TG, triglyceride; TP, total protein; Alb, albumin; A/G, albumin/globulin; P, phosphorus, Ca, calcium; Na, sodium; K, potassium; Cl, Chlorde 은암수 RBC, HGB, HCT, MCV, MCH 및 MCHC, 표준편차가평균치의 10% 이상 20% 미만의검사항목은암수 PLT, Reti, 백혈구백분율검사에서표준편차가평균치의 10% 미만검사항목은암수 LYM, 표준편차가평균치의 20% 이상 30% 미만의검사항목은암수 Neu, 그외의백혈구백분율검사항목은표준편차가평균치의 30% 이상이었다. 응고계검사항목에서표준편차가평균치의 10% 미만검사항목은암수 PT, 표준편차가 10% 이상 20% 미만의검사항목은 APTT, Fib이었다 (Table 2). 혈액생화학적검사혈액생화학적검사결과항목 ALP와 TG에서암수성별에의한차이 (ALP: 수컷 (615.7 ± 121.9), 암컷 (354.1 ± 68.5)), (TG: 수컷 (43 ± 17), 암컷 (16 ± 6)) 가인정되었다. 그외, 검사항목에서는암수의명확한차이가인정되지않았다. 검사항목에서표준편차가평균치의 10% 미만검사항목은암수 Na, K, Cl, P, Ca, TP 및 ALB, 표준편차가평균치의 10% 이상 20% 미만의검사항목은암수 ALT, AST, ALP, Glu, Bun, Crea, A/G ratio 및 T-Chol, 표준편차가평균치의 20% 이상 30% 미만의검사항목은암컷 T-Bili, 그외표준편차가평균치의 30% 이상이었던항목은암수 GGT, TG 및수컷 T-Bili 등이었다 (Table 3). 장기중량장기중량측정결과표준편차가평균치의 10% 미만의장기는암수뇌, 심장, 폐및고환, 표준편차가평균치의 10% 이상 20% 미만이었던장기는암수뇌하수체, 간, 비장, 신장및부신, 표준편차가평균치의 20% 이상 30% 미만이었던장기는전립선, 표준편차가평균치의 30% 이상이었던장기는자궁이었다 (Table 4). 고찰안전성, 유효성평가에많이사용되는 Crl:CD (SD) 랫드에대하여총 16개의 4주반복시험에서사용된 10주령의대조군암수랫드각각 110마리의체중, 사료섭취량, - 272 -
Table 4. Organ weights data Male Female N Mean ± SD -2S.D +2S.D N Mean ± SD -2S.D +2S.D Body Weight (g) 105 360.1 ± 28.1 303.9 416.4 105 221.0 ± 16.6 187.7 254.3 Brain (g) 105 1.95 ± 0.08 1.79 2.12 105 1.83 ± 0.07 1.68 1.98 Pituitary (g) 60 0.0112 ± 0.0013 0.0085 0.0139 60 0.0136 ± 0.0022 0.0093 0.0179 Heart (g) 105 1.18 ± 0.10 0.97 1.39 105 0.83 ± 0.08 0.66 1.00 Lung (g) 55 1.36 ± 0.10 1.16 1.55 55 1.09 ± 0.08 0.92 1.25 Liver (g) 105 10.98 ± 1.40 8.17 13.78 105 6.68 ± 0.64 5.40 7.97 Spleen (g) 105 0.72 ± 0.11 0.49 0.94 105 0.47 ± 0.07 0.33 0.62 Kidney (g) 105 2.65 ± 0.26 2.14 3.16 105 1.73 ± 0.15 1.44 2.02 Adreanl (g) 65 0.0612 ± 0.0087 0.0437 0.0787 65 0.0686 ± 0.0079 0.0528 0.0844 Testis (g) 65 3.10 ± 0.38 2.34 3.86 NA NA NA NA NA Prostate (g) 60 0.46 ± 0.10 0.26 0.66 NA NA NA NA NA Ovary (g) NA NA NA NA NA 65 0.08 ± 0.01 0.06 0.11 Uterus (g) NA NA NA NA NA 55 0.58 ± 0.20 0.19 0.98 NA: Not applicable 뇨검사, 혈액학적검사, 혈액생화학적검사및장기중량자료를수집하였다. 1주부터 4주차까지체중측정결과, 암수평균체중은수컷 302.0 ± 71.9 g, 암컷 201.7 ± 30.6 g이었다. 시험개시 1주부터 4주차까지체중증가율은수컷 204%, 암컷 155% 로시험종료까지지속적으로증가하였다. 암컷에서는시험개시 1주차에 14.8%, 수컷에서는 24.3% 증가하여 1주차의체중증가율이가장급격한것으로확인되었다. 이러한체중증가율은수컷은시험개시 4주, 암컷은 3주째부터 10% 이하로감소하였다. 이러한체중측정결과는동일주령의다른보고 (Song et al., 1990) 와유사한경향을나타내었다. 1주부터 4주차까지측정된사료섭취량측정결과, 암수평균사료섭취량은각각수컷 30.1 ± 2.5 g/day, 암컷 22.3 ± 2.1 g/day이었다. 암수사료섭취량의차이가큰주차는시험개시 3주와 4주차였으며, 체중측정결과에서도동일한주령의암수체중차이가가장크게확인되어체중과의연관성이깊다고판단되었다. 또한, 사료섭취량은각주령의표준편차가평균사료섭취량의 10% 이상 20% 이내로개체간의차이가큰것이확인되었다. 시험개시 4주째실시한뇨검사결과수컷에서는단백뇨 50%, 케톤체 3%, 잠혈 3% 가확인되었으며, 암컷에서는단백뇨 6% 만이확인되어수컷에서암컷보다양성율이현저하게높았다. 이러한검사결과는동일주령의 다른보고 (Song et al., 1990) 와유사한경향을나타내었다. 수컷에서양성률이현저하게높았던단백뇨는수컷랫드에서 α 2u -globulin이과량생산되는데기인하여단백뇨가검출되는것으로알려져있다. 이러한암수의차이는 α 2u -globulin이수컷랫드의경우간에서생산되나암컷에서는침샘에서만소량생산되는차이에근거한다 (Swenberg, 1993; Hamamura et al., 2006; Hisaharu et al., 2009; Yamada, 2009). 또한, 뇨량의측정결과에서는암수모두표준편차가 30% 이상으로개체간의차이가큰것이확인되었다. 랫드의뇨량측정치의개체차이가큰이유중에서채뇨를위하여대사케이지로이동하는것에의하여갑작스런환경변화가발생하고그로인한스트레스로뇨량이감소할수있다 (Lee, 2000). 이러한영향을줄이기위하여본연구에서는뇨의채취를위하여사용하고있는대사케이지를사용하지않고시험기간중에랫드를사육하던철망케이지에채뇨판을부착하는방법을이용하여갑작스런환경변화를제어하였다. 이러한, 방법을이용하여다른문헌 (Tanimoto, 1989) 에서의뇨량측정치보다개체간의변동폭을감소시키는것이가능하였다. 시험개시 4주째실시한혈액학적검사결과적혈구계항목 (RBC, HGB, HCT) 과적혈구지수항목 (MCV, MCH, MCHC) 의표준편차는평균치의 10% 미만으로비교적안정적이었으나, 응고계검사항목 (PT, APTT, Fib) 과백혈구계검사항목 (NEU, LYM, MONO, EOS, BASO) 에서는각 - 273 -
개체간변동폭이크게확인되었다. 혈액검사는채혈방법, 채혈부위, 측정방법등의영향을받는것으로알려져있다. 특히, 보존방법및보존기간에따라검사치의영향이인정되는응고계검사항목 (Hirata et al., 1979; Kim et al., 2000) 은측정치의영향을최소화하기위하여채혈후신속하게원심분리하여 5시간이내검사를실시하거나당일측정이불가능한경우즉시냉동상태로보존하여측정결과에주는영향을최소화할수있었다. 혈액학적검사결과를동일주령의측정결과 (Song et al., 1990; Kang et al., 1995; Kang et al., 2004) 들과유사한경향을나타내었다. 시험개시 4주째실시한혈액생화학적검사결과 ALP와 TG에서암수성별에의한명확한차이 (ALP: 수컷 (615.7 ± 121.9), 암컷 (354.1 ± 68.5)), (TG: 수컷 (43 ± 17), 암컷 (16 ± 6)) 가인정되었으며, 이러한차이는동일주령의다른보고 (Song et al., 1994; Kang et al., 1995; Kang et al., 2004) 에서도유사한경향을나타내었다. 혈액생화학적검사는검체처리, 채혈방법, 채혈부위, 마취제및검체종류등의변동요인에따른측정치의영향을많이받는것이알려져있다 (Toshihiro et al., 1978; Mariko et al., 2001). 본연구에서는채혈후경과시간에따른당분해의영향으로측정항목 glucose의측정치가감소하는것을방지하기위하여채혈후 1시간이내원심분리하여측정치에주는영향을최소화하였으며 glucose의측정결과는보고된문헌 (Tanimoto, 1989) 과비교하여측정치의변동폭을감소시키는것이가능하였다. 그외, 다른검사항목의경우측정치의차이는명확하였으나경향은유사하여측정방법에의한것으로판단된다 (Song et al., 1990; Oh et al., 2001; Kang et al., 2004). 시험개시 4주째실시한장기중량의측정결과암수동일장기의변동폭은 10% 이상 20% 미만으로암수모두유사한변동폭을확인할수있었다. 단, 암컷자궁의경우표준편차가 30% 이상으로각개체간의차이가크게확인되었으며, 이러한차이는성주기에따른영향으로판단된다. 이러한장기중량의측정결과는동일주령의다른보고 (Song et al., 1990; Kang et al., 2004) 와유사한경향을나타내었다. 본연구에서사용한모든실험방법은실험결과에영향을줄수있는변동요인을최소화하기위하여 ( 주 ) 바이오톡스텍의 SOP를준수하여실시하는것으로변동요인을최소화할수있었다. 향후, 실험에임하는시험자는신뢰성높은자료를얻을수있도록 SOP를준수하여시험 결과의변동폭을최소화하는등의노력이필요하다고생각된다. 본연구는독성시험및약효시험에서이용되고있는 Crl:CD (SD) 랫드의배경자료를제시하여연구자가시험물질에의한영향평가를위한자료로도움이되고자실시하였다. 물론본연구결과를다른기관에서실시한자료와직접적인비교를하는것은실험방법, 측정방법에의한차이로어려움이있다고판단된다. 하지만, 유사한환경에서실시한기존연구에서의 Crl:CD (SD) 랫드의비교결과유사한경향을나타냈기때문에 Crl:CD (SD) 랫드를이용한독성시험및약효시험등의배경자료로서유용하게사용할수있을거라생각된다. 본연구결과는 Crl:CD (SD) 랫드에대한체중, 사료섭취량, 혈액학적검사, 혈액생화학적검사및장기중량에대한결과를정리한자료로서각검사항목별변동폭, 참고치등을확인할수있었다. 이러한자료는향후독성시험및약리시험등에서시험물질에의한영향을판단하는데배경자료로서도움이될수있을것으로판단된다. REFERENCES Cho JH, Jeong SH, Ku HO, Kang HG, Park JM, Yun HI, Lee YS. Improved Novel Method of Blood Sample Collection via Jugular Vein in Unanesthetized Rats. Korean Lab Anim Res. 1997. 13: 117-120. Hayes AW. Principles and Methods of Toxicology, 4th ed. 2001; 1032-1033. CRC/Taylor & Francis. Hamamura M, Hirose A, Kamata E, Katoku K, Kuwasaki E, Oshikata T, Nakahara Y, Ema M, Hasegawa R. Semiquantitative Immunohistochemical Analysis of Male Rat- Specific α 2u -Globulin Accumulation for Chemical Toxicity Evaluation. J Toxicol Sci. 2006. 31: 35-47. Ha CS, Son HY, Kang BH, Cha SW, Park JI, Han SS. A Study of Hematology and Serum Chemistry in Beagle Dogs. Lab Anim Res. 1995. 11: 151-158. Hirata M, Nomura G, Tanimoto Y. Stability of Serum Components in Monkey, Dog and Rat. Exp Anim. 1979. 28: 401-404. Hisaharu Y. Evaluation methods for nephrotoxicity. Folia Pharmacol. Jpn. 2009. 133: 154-157. Kang BH, Kim IH, Kim YB, Kim YH, Lee HS, Ha CS. Reference Values of Organ Weights in Sprague-Dawley Rats. Korean J Vet Pathol. 2001. 5: 39-42. Kang BH, Kim YB, Lee HS, Kim YH, Im WJ, Ha CS. Background - 274 -
Data on Hematology, Blood Chemistry and Organ Weights for 2 Weeks and 4 Weeks Repeated-Dose Toxicity Studies Using Sprague-Dawley (SD) Rats. Lab Anim Res. 2004. 20: 134-140. Kang BH, Son HY, Ha CS, Lee HS, Song SW. Reference Values of Hematology and serum Chemistry in Ktc: Spargue-Dawley Rats. Lab Anim Res. 1995. 11: 141-145. Kim JS, Hwang SY, Chu SK, Kim IT. The Effects of Time and Temperature Variables on PT and aptt Test of Stored Plasma and Whole Blood. J Clin Pathol Exam Sci. 2000. 32: 40-47. Lee YS. Introduction to Experimental Animal. 2000. pp. 94-96. Sharon. Seoul, Korea. Mariko H, Mamoru N, Masayuki Y. Clinical Chemistry of the Animal. Influence Factors to Be Considered on Establishment of the Reference Data of ALT, AST and ALP in Rats. Japanese Journal of Clinical Chemistry. 2001. 30: 142-152. Oh SH, Do SG, Won MH, Lee JY, Kang TC, Oh YS, Suh JG. Reference Values of body weight, blood pressure, hematology and serum biochemistry in the Sprague-Dawley (SD) rats from 24 to 30 months. Lab Anim Res. 2001. 17: 275-282. Song CW, Cho KH, Han HS, Han SS. The Effects of Fasting Time on Hematological and Blood Biochemical Parameters in SD Rats. Lab Anim Res. 1994. 10: 73-80. Song CW, Hwang HS, Han SS. Studies on the Basic data of Ktc: SD Rats with Age-Body Weight, Hematology, Serum Chemistry and Urinalysis. Lab Anim Res. 1990. 6: 33-43. Swenberg JA. α 2u -Globulin Nephropathy: Review of the Cellular and Molecular Mechanisms Involved and Their Implications for Human Risk Assessment. 1993; 6: 39-44. Environ Health Perspect Tanimoto Y. Biological Reference Data Book On Experimental Animals. 1989. 95-149 Softscience Co. Tokyo, Japan Toshihiro E, Masakazu T, Sumi N. Comparative Studies on Lactate Dehydrogenase in Serum and Plasma of Rats. Exp Anim. 1978. 27: 167-175. Yamada H. Evaluation Methods for Nephrotoxicity. Folia Pharmacol Jap. 2009. 133: 154-157. - 275 -