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pissn 1229-1153 / eissn 2465-9223 J. Food Hyg. Saf. Vol. 33, No. 5, pp. 354~360 (2018) https://doi.org/10.13103/jfhs.2018.33.5.354 Journal of Food Hygiene and Safety Available online at http://www.foodhygiene.or.kr LC-MS/MS 를이용한견과류중트리코테센계곰팡이독소 10 종동시분석법개발 김단비 박지수 유미영 * 한국식품연구원 Method Development for Determination of Trichothecene Mycotoxins in Nuts by LC-MS/MS Dan-Bi Kim, Ji-Su Park, and Mi-Young Yoo* Korea Food Research Institute, Wanju, Jeonbuk, Korea (Received August 8, 2018/Revised August 26, 2018/Accepted September 12, 2018) ABSTRACT - This study presents a method validation for extraction and quantitative analysis of trichothecene mycotoxins in nuts based on quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe (QuEChERS) approach for extraction and enhanced matrix removal (EMR)-lipid-disperive-SPE (d-spe) cleanup method, with detection and quantification by high-performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) in positive- and negative-ion modes. Linearity, precision, and accuracy were validated for LC-MS/MS methods. Results obtained with LC-MS/MS were linear, with correlation coefficient (R 2 ) of 0.998. Limits of detection and quantification for mycotoxins were 0.41-3.57 µg/kg and 1.23-10.82 µg/kg, respectively. Intra- and inter-day precisions (RSD, %) were 0.40-8.44% and 1.93-12.46%, respectively. Results indicated to be rapidly and accurately identifying trichothecene mycotoxins and may be used as a suitable safety management method for nuts and nuts related commodities. Key words : Trichothecene mycotoxins, Nuts, QuEChERS, LC-MS/MS, Analytical method 곰팡이독소는식품의저장, 가공, 유통과정중에생성되는곰팡이의 2차대사산물로서사람이나가축에게서세포독성, 발암성, 변이유발원등직접적으로질병을유발하거나생장저하, 면역기능저해, 체중감소등간접적으로작용한다 1-4). 트리코테센계 (trichothecene) 곰팡이독소는 Fusarium 속곰팡이가생산하는독소로서주요독소로는데옥시니발레놀 (deoxynivalenol), 니발레놀 (nivalenol), 제랄레논 (zearalenone), 푸모니신 (fumonisine) 등이있다. 트리코테센계곰팡이독소는밀, 보리, 옥수수, 견과류등에서빈번히발생하며, 국내뿐아니라전세계적으로오염사례에대한연구가꾸준히보고되고있다. 또한, T-2 독소, HT-2 독소, 3-acetyl deoxynivalenol (3-ACDON), 15-acetyl deoxynivalenol (15-ACDON) 및 fusarenon-x (FUS-X) 등다양한트리코테센계독소에대한오염수준및분석법에대한연구가보고되고있다 5-6). 트리코테센계곰팡이독소 *Correspondence to: Mi-Young Yoo, Food Analysis Center, Korea Food Research Institute, 245, Nongsaenmyeong-ro, Iseo-myeon, Wanju-gun, Jeollabuk-do 55365, Korea Tel: 82-63-219-9087, Fax: 82-63-219-9280 E-mail: myyoo@kfri.re.kr 는구조적으로 9번탄소와 10번탄소사이의이중결합과 12번탄소와 13번탄소에에폭시그룹을가지는세스퀴테르펜에폭사이드로서매우안정적인형태의화합물이며, 끓이기, 발효, 분쇄등과같은가공및저장과정의높은온도에서도쉽게분해되지않는다고알려져있다 7). 곰팡이독소를분석하는대표적인방법으로는효소면역분석법 (enzyme-linked immunospecific assay, ELISA), 액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatography, HPLC), 기체크로마토그래피 (gas chromatography, GC) 등이있으나, 최근에는기존분석법의비용, 시간, 감도등의문제점을보완한빠르고간편한 QuEChERS (quick, easy, cheap, effective, rugged and safe) 전처리법과질량분석기를이용한고감도분석법에대한연구가보고되고있다 8-10). 최근건강한삶에대한국민들의관심이증가로간식의트랜드가바뀌면서불포화지방산등이풍부한견과류와견과류를활용한가공제품의소비량이급증하고있으며, 이러한소비자의기호를반영하듯견과류의수입규모도매년증가하고있다. 따라서, 본연구에서는견과류중트리코테센계곰팡이독소 QuEChERS 전처리조건및분석법을개발하고그유효성을검증하고자한다. 354

Method Development for Determination of Trichothecene Mycotoxins in Nuts by LC-MS/MS 355 Materials and Methods 실험재료본실험에서는견과류중트리코테센계곰팡이독소분석을위하여국내에서도생산되는대표적인견과류인땅콩을선정하였으며, 실험에사용된땅콩은국내각지역별및중국, 미국, 베트남, 태국에서생산된것을구입하여사용하였다. 모든시료는분쇄기로균질화한후밀봉하여냉동보관하여실험에사용하였다. 표준폼및시약트리코테센계표준폼인 nivalenol (100 μg/ml), deoxynivalenol (100 μg/ml), fusarenon X (100 μg/ml), 15- acetyldeoxynicalenol (100 μg/ml), 3-acetyldeoxynivalenol (100 μg/ml), verrucarol 및 neosolaniol (100 μg/ml) 은 Sigma-Aldrich사 (St. Quentin Fallavier, France) 로부터구입하였으며, diactoxyscirpenol (100 μg/ml) 은 Romer Labs (Tulln, Austria), HT-2 toxin (100 μg/ml) 및 T-2 toxin (100 μg/ml) 은 Biopure (Tulln, Austria) 에서구입하여사용하였다. Acetonitrile은 Merch사 (Frankfurt, Germany) 의제품을사용하였다. QuEChERS 전처리시추출단계에서사용되는 magenesium sulfate, sodium chloride, sodium citrate, sodium hydrogencitrate sesquihydrate 및 formic acid는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA) 로부터구입하였으며, C 18 및 primary-secondary amine (PSA) sorbent 는 Agilent Technologies사 (Santa Clara, CA, USA) 에서구입하였다. 정제수는 Mili-Q ultrapure water purify-cation system을이용한 18.2 MΩcm 수준으로정제된증류수를사용하였다. 표준용액조제트리코테센계표준폼 10종중 verrucarol을제외하고는표준원액으로하고, verrucarol은 100 mg을정밀히칭량하여 100 ml 용량플라스크에넣고아세토니트릴을가하여완전히혼합후 100 ml로정용하여 1,000 mg/l가되도록하였다. 다음 10종의표준원액들을아세토니트릴로 0.5~150 μg/kg의농도가되도록 5단계희석하여혼합표준용액으로하였으며, 이를이용하여검량선을작성하였다. 시료추출땅콩에존재하는트리코테센계곰팡이독소를분석하기위하여단시간에많은시료를처리할수있는 QuEChERS 방법을응용하였다 11). 시료 4g을정밀히칭량하여증류수 20 ml를가한후교반하고, 1% formic acid가함유된 84% 아세토니트릴 20 ml를넣어교반한다. 다시이액에 4g MgSO 4, 1 g NaCl, 1.0 g sodium citrate 및 0.5 g disodium citrate sesquihydrate로구성된 QuEChERS kit를첨가하고 mechanical shaker를이용하여 15분동안추출한다. 이후 8000 rpm에서 10분간원심분리를하였으며분리한상층액 4mL를정제과정에이용하였다. 정제방법최적화본연구에서는견과류중트리코테센계곰팡이독소에적합한정제과정을선택하고 dispersive-spe (d-spe) 법과 EMR-Lipid-dSPE법을회수율실험을통하여비교하였다. d-spe를이용한정제법은 QuEChERS 추출액중상층액 ( 아세토니트릴층 ) 4 ml에 0.6 g의 MgSO 4, 0.2 g의 C 18, 0.4 g 의 PSA solvent를넣어준후상온에서 15분동안충분히교반시킨후, 10000 rpm에서 10분동안원심분리하고상층액을 0.2 μm syringe filter로여과하여 LC-MS/MS 시험용액으로하였다. EMR-Lipid-dSPE 정제법은 EMR-LipiddSPE tube에증류수 5mL를첨가하여활성화시킨후 QuEChERS 추출물중상층액 4mL를첨가한다음 1분동안충분히교반하고, 5000 rpm에서 3분간원심분리후상층액 5mL를 EMR-Lipid polish tube (1:4, NaCl: MgSO 4 ) 에옮겨교반한다. 이후 5000 rpm에서 3분간원심분리하고상층액을 0.2 μm syringe filter로여과하여시험용액으로하였다. 기기분석트리코테센계곰팡이독소를분석하기위해 Agilent LC 1200 HPLC system (Agilent technologies, USA) 가부착된 Table 1. Analytical conditions of LC-MS/MS for trichothecene mycotoxins Parameter Condition Ionization mode Electrospray ionization (ESI, positive and negative swiching mode) Column Imtack C 18 (2.0 mm I.D 50 mm, 3 µm) Flow rate 300 µl/ml Injection Volume 5 µl Mobile phase A: 0.1% formic acid in distilled water B: 0.1% formic acid in acetonitrile Time (min) 0.0 1.0 6.0 6.5 10.0 A (%) 100 90 20 100 100 B (%) 0 10 80 0 0 Analysis mode Curtain gas 25 Collision gas Medium Ion spray voltage Source temperature Ion source gas 1 Ion source gas 2 +5500 V (positive mode) 4500 V (negative mode) 550 o C 50 psi 50 psi

356 Dan-Bi Kim, Ji-Su Park, and Mi-Young Yoo 4000 QTRAP mass spectrometer (AB Sciex, USA) 를이용하였고, 분석용컬럼은 Imtack C18 (2.0 mm I.D 50 mm, 3 μm, USA) 를이용하였다. 이동상은 0.1% formic acid가포함된증류수와 0.1% formic acid가포함된아세토니트릴을이용하여 gradient 조건으로분석하였으며 Table 1과같다. 이동상의유속은 300 μl/min으로하였으며, injection volume은 5μL로하였다. 질량분석기로는전기분무이온화 (Electrospray Ionization, ESI) 방식을사용하였으며, 각독소들의최적분석조건들이다르므로 negative mode와 positive mode에서 MRM (multiple reaction monitoring) 방법을사용하여분석의최적조건을설정하였다. LC-MS/ MS기기에대한조건은 Table 1에나타내었다. 시험법유효성검증본연구에사용된분석법은 의약품등시험방법밸리데이션에대한가이드라인 에준하여특이성 (specificity), 직선성 (linearity), 정밀성 (precision), 정확성 (accuracy), 검출한계 (limit of detection, LOD, S/N = 3) 및정량한계 (limit of quantitation, LOQ, S/N = 10) 로유효성검증을실시하였다 12). Results and Discussion 최적기기분석조건확립곰팡이독소의경우국내설정된기준의단위가 μg/kg, mg/kg와같이낮은수준으로고감도분석이요구되기때문에시료의간섭물질에영향을받지않고선택성이높은액체크로마토그래프-질량분석기 (Liquid Chromatograph- Tandem Mass spectrometer, LC-MS/MS) 를분석기기로선정하였다. 트리코테센계곰팡이독소 10종에대하여분자이온의확인을위하여 nivalenol은 negative mode(-) 에서 Q1 scan을실시하였고, 다른 9종은 positive mode(+) 에서 Q1 scan을실시하였다. 또한분석대상물질의 m/z [M-H] 및 [M+H] + 에해당하는피크를확인한후, declustering potential (DP), entrance potential (EP), collision energy (CE) 및 collision cell exit potential (CXP) 를조절하여가장좋은감도를나타내는 product ion을정량이온 (quantification ion) 으로선정하였으며, 다음으로나타나는 product ion을정성이온 (cofirmation ion) 으로분석조건을설정하였다 (Table 2). 트리코테센계곰팡이독소 10종에대해선정된 precussor ion과 product ion은기존의연구들과대부분일 Table 2. MRM data acquisition parameters of LC-MS/MS procedure for trichothecen mycotoxins Ion mode Mycotoxins Abbreviations Precursor ion (m/z) Negative Nivalenol NIV 357.10 Positive Deoxynivalenol DON 297.20 Fusarenon X FUS-X 355.30 15-Acetyldeoxynivalenol 15-ACDON 339.10 3-Acetyldeoxynivalenol 3-ACDON 339.30 Verrucarol VER 267.20 Neosolaniol NEO 400.20 Diacetoxyscirpenol DAS 384.30 HT-2 toxin HT-2 447.30 Product ion (m/z) DP (V) 1) EP (V) CE (V) CXP (V) 281.00 Q2) 50.00 10.00 18.00 13.00 202.80 C3) 50.00 10.00 24.00 11.00 249.10 Q 50.00 10.00 15.00 12.00 231.00 C 50.00 10.00 15.00 12.00 175.20 Q 23.93 6.28 36.97 11.91 247.00 C 54.06 4.23 12.44 16.40 261.10 Q 50.00 10.00 20.00 10.00 137.10 C 50.00 10.00 20.00 10.00 231.10 Q 70.92 4.88 16.88 3.21 213.20 C 78.99 7.85 20.29 2.94 231.00 Q 52.88 8.88 15.30 4.38 249.20 C 51.13 8.99 13.66 5.99 215.20 Q 66.30 4.05 20.81 12.07 185.10 C 68.85 4.95 30.92 9.87 105.10 Q 72.83 4.58 58.82 4.01 306.90 C 77.88 4.11 17.19 6.27 345.00 Q 98.67 9.98 27.37 21.87 285.40 C 94.98 9.90 29.49 15.86 215.30 Q 72.62 5.58 27.92 12.16 T-2 toxin T-2 484.40 185.20 C 76.09 5.57 30.72 10.00 1) DP: declustering potential, EP: entrance potential, CE: collision energy, CXP: collision cell exit potential 2) Q: Quantification ion 3) C: Confirmation ion

Method Development for Determination of Trichothecene Mycotoxins in Nuts by LC-MS/MS 357 Fig. 1. LC-MS/MS chromatogram of trichothecen mycotoxins. 치하였다 13-14). 확립된기기분석조건으로확인한각성분의크로마토그램은 Fig. 1 에나타내었다. 추출및정제방법의확립분석대상성분의최적추출용매를선택하는데있어서용해도와극성도는매우중요한요인이된다. 본연구에서는 QuEChERS 추출법을사용하는기존문헌에서트리코테센계곰팡이독소를추출하는데주로사용되는아세토니트릴을용매로선정하였다. 또한 matrix effect를최소화하기위하여유지를비롯한비간섭물질에대한정제과정을실시하였다. 특히, 견과류의경우지방함량이약 50% 이상으로지질로인한간섭이분석물질을정확히분석하는데방해요인으로작용될수있다. 따라서본연구에서는정제방법최적화를위하여 d-spe법과 EMR-Lipid-dSPE 법에대하여저, 중, 고 3가지농도로회수율비교실험을수행하였다. d-spe 정제법은 QuEchERS 추출과함께주로병행되는실험법으로견과류중토코페롤류와시토스테롤류분석연구에서 71~116% 의회수율을나타내었다 15). 그러나, 본연구에서는 d-spe 정제과정은 FUS-X. NEO, VER의 3 종류의곰팡이독소에서만 70% 이상의회수율 을나타내었다. 반면, EMR-Lipid-dSPE의경우트리코테센계곰팡이독소 10종에대하여 70% 이상의회수율을나타내었다. 이와유사하게식물성오일중농약분석법연구에서도 PSA, zirconium dioxide-based sorbent (Z-Sep) 및 EMR-Lipid의회수율을비교한결과 EMR-Lipid에서 213개의농약중 83% 가 70~120% 이상의회수율을나타 내었다 16). 이는 EMR 흡착제가물에의해활성화가된후소수성상호작용이증대되어지질을효과적으로제거하는특성을나타내기때문이다 17). 따라서견과류의트리코테센계곰팡이독소를분석에는 EMR-Lipid-dSPE 정제법이적합하다고판단하고이를정제방법으로선택하여실험을수행하였다 (Table 3). 표준곡선의직선성과상관계수확인견과류에서의트리코테센계곰팡이독소 10종표준용액은아세토니트릴을이용하여 5포인트의농도로희석하여위의제시한 LC-MS/MS 조건으로분석하였다. 직선성은 0.50~150.00 μg/kg의농도범위에서상관계수 (R 2 ) 값이 0.998 이상으로우수한직선성을나타내었다 (Table 4).

358 Dan-Bi Kim, Ji-Su Park, and Mi-Young Yoo Table 3. Comparison of different clean-up procedures for nut sample Spiking levels d-spe Recovery (%) EMR-LipiddSPE NIV 12.50-50.00 31.84-58.02 73.01-74.01 DON 18.75-75.00 30.65-59.14 73.67-90.78 FUS-X 18.75-75.00 87.18-98.90 82.35-88.36 15-ACDON 04.00-16.00 50.20-62.42 67.06-81.20 3-ACDON 04.00-16.00 40.77-50.42 79.31-83.21 VER 02.00-8.00 65.72-90.65 72.44-91.01 NEO 02.00-8.00 84.75-116.14 76.26-87.30 DAS 02.00-8.00 23.02-60.10 88.24-89.57 HT-2 12.50-50.00 34.68-51.24 65.17-88.87 T-2 12.50-50.00 46.00-66.60 72.48-88.07 로나타났으며, EU 가이드라인의 RSD R 30% 에적합하였다. 회수율을이용한정확성확인정확성을확인하기위하여회수율을측정하였다. 회수율은트리코테센계곰팡이독소가검출되지않은땅콩에 10 종의혼합표준용액을저, 중, 고의농도로처리하여 LC- MS/MS로분석하여검출되는농도를확인하였다. 그결과 Table 5에서보는바와같이혼합표준용액에대한회수율은 81.84~96.87% 로앞서실험한예비실험회수율보다높은결과를나타내었다. 이는표준용액의처리농도와 EMR-lipid의활성화차이에기인한것으로판단된다. 본분석법은 Codex 가이드라인에서권장하는회수율 70~120% 및분석오차 20% 미만에충족하는결과로분석법으로서적합함을확인하였다. 검출한계및정량한계검출한계는시료중존재하는분석물질의검출가능한최저한계를뜻하며, 정량한계는정량값으로나타낼수있는최소량을의미한다. 검출한계는 3.3s/S (s: standard deviation of y-intercepts of regression analysis, S: slope of a calibration curve) 의수식에의해산출한결과 0.41~3.57 μg/kg로나타났으며, 정량한계는 10s/S (s: standard deviation of y-intercepts of regression analysis, S: slope of a calibration curve) 의수식에의해산출한결과 1.23~10.82 μg/kg로나타났다 (Table 4). 정밀성확인정밀도를확인하기위하여 10종의혼합표준용액을 3가지농도로첨가하여 3반복으로수행하였으며, 일내 (intraday) 와일간 (inter-day) 분석한결과를상대표준편차 (Relative Standard Deviation, RSD) 로나타내었다 (Table 5). Intra-day 와 inter-day 변이계수는각각 0.40~8.44% 및 1.93~12.46% 국내유통땅콩중트리코테센계곰팡이독소함량개발한시험법의적용을위하여국내생산되는대표적인견과류중하나인땅콩을선택하였으며, 각지역별및수입품에대하여실험을수행하였다. 총 26종의땅콩에대하여트리코테센계곰팡이독소를분석한결과 (Table 6), 충청북도에서생산된땅콩 1종에대해서만 deoxynivalenol 이검출되었으며, 검출량은 71.56 μg/kg로나타났다. 이는중국에서유통되는곡류및견과류의 doexynivalenol 오염 도를조사한결과와유사한것으로땅콩의경우시료 95 개에서 19.0% 의검출률을나타내었으며, 검출범위는 8.7~559.0 μg/kg로나타났다 18). 현재견과류의경우 deoxynivalenol에대한품질관리기준은없으나국내곡류및그것을단순처리한것, 옥수수및그것을단순처리한것, 시리얼류, 영아용조제식등에대한기준 (0.2~1 mg/kg 이하 ) 보다는낮은오염도를나타내었다. 따라서추후견과류중트리코테센계곰팡이독소모니터링조사를통한안전관리기준확보가필요한것으로판단된다. Table 4. Correlation coefficients of the calibration curves, and detection (LOD) and quantitation (LOQ) limits Linearity Range Slope Intercept Correlation coefficient (R 2 ) LOD LOQ NIV 3.13-100.00 550.461 528.657 0.999 2.63 7.96 DON 4.69-150.00 319.634 2.106 1.000 1.11 3.36 FUS-X 4.69-150.00 184.056 35.063 0.999 1.78 5.40 15-ACDON 1.00-2.00 693.167 227.393 0.999 0.92 2.79 3-ACDON 1.00-32.00 1491.966 1365.771 1.000 0.84 2.53 VER 0.50-16.00 1478.580 414.909 0.999 0.66 1.99 NEO 0.50-16.00 1891.518 1169.138 0.999 0.41 1.23 DAS 0.50-16.00 2726.751 40.697 0.999 0.75 2.26 HT-2 3.13-100.00 256.287 320.703 1.000 0.57 1.74 T-2 3.13-100.00 2312.883 1729.088 0.998 3.57 10.82

Method Development for Determination of Trichothecene Mycotoxins in Nuts by LC-MS/MS 359 Table 5. Recoveries of trichothecen mycotoxins from peanut spiked at three different concentration NIV DON FUS-X 15-ACDON 3-ACDON Concentration Intra-day (n = 3) RSD (%) Inter-day (n = 9) Recovery (%) Concentration Intra-day (n = 3) RSD (%) Inter-day (n = 9) Recovery (%) 100.00 3.21 3.63 91.23 ± 2.91 25.00 2.66 2.99 92.61 ± 2.45 25.00 5.63 5.24 90.35 ± 4.97 VER 6.25 2.29 2.81 92.47 ± 2.05 6.25 2.35 3.40 89.69 ± 4.22 1.56 2.29 2.55 92.15 ± 1.84 75.00 3.31 5.98 95.45 ± 7.38 20.00 2.04 3.23 93.26 ± 2.86 18.75 0.50 3.83 91.97 ± 3.60 NEO 5.00 4.70 4.29 94.44 ± 2.59 4.69 6.00 10.24 84.56 ± 5.67 1.25 5.06 12.46 88.98 ± 2.81 75.00 2.49 4.88 87.53 ± 1.10 20.00 6.86 5.65 93.64 ± 6.09 18.75 3.57 5.89 90.90 ± 3.30 DAS 5.00 5.19 5.46 91.06 ± 3.12 4.69 1.42 3.88 91.69 ± 2.74 1.25 8.44 8.87 84.63 ± 5.86 50.00 1.94 4.14 85.19 ± 1.52 100.00 0.40 1.93 90.82 ± 3.38 12.50 4.42 3.97 85.51 ± 4.17 HT-2 25.00 5.66 6.88 81.84 ± 2.99 3.13 6.39 8.69 88.48 ± 4.48 6.25 4.59 5.35 91.31 ± 5.02 50.00 0.84 2.74 93.10 ± 1.56 100.00 3.38 7.02 92.94 ± 4.29 12.50 6.76 6.69 95.59 ± 2.41 T-2 25.00 5.74 3.74 96.77 ± 4.78 3.13 6.59 9.03 86.69 ± 5.25 6.25 3.27 5.47 96.87 ± 3.05 Table 6. Amount of trichothecen mycotoxins in nuts Country Korea Region Tested sample Analyte NIV DON FUS-X 15-ACDON 3-ACDON VER NEO DAS HT-2 T-2 Gangwon 1 N.D 1) N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Chungnam 6 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Chungbuk 3 N.D 71.56 ± 4.42 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Gyeonggi 2 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Jeonnam 2 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Jeonbuk 2 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Gyeongnam 2 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Gyeongbuk 2 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Jeju 1 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D China Mydriasis 1 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Jilin 1 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Vietnam - 1 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D Thailand - 1 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D USA - 1 N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D N.D 1) N.D: Not detected Acknowledgement 본논문은 2018년도과학기술정보통신부재원으로한국식품연구원의지원 (E0187200-01) 을받아수행된연구성과입니다. 국문요약견과류중에있는트리코테센계곰팡이독소오염도를조 사하기위하여 LC-MS/MS를이용한정확성과신뢰성을동시에확보할수있는분석방법을개발하였다. 견과류중트리코테센계곰팡이독소는 QuEChERS 추출및 EMR- Lipid-dSPE 정제과정을통하여분석에사용되었다. 검량선작성을위하여트리코테센계곰팡이독소 10종에대하여 2.00~75.00 μg/kg의범위로혼합표준용액을제조하여실험하였으며, 상관계수는모두 0.998 이상으로높은직선성을나타내었다. 분석방법의검출한계는 0.41~3.57 μg/kg로나타났으며, 정량한계는 1.23~10.82 μg/kg로나타났다. 또한

360 Dan-Bi Kim, Ji-Su Park, and Mi-Young Yoo 트리코테센계곰팡이독소 10종에대하여각각저, 중, 고 3가지농도로처리하여회수율실험을수행한결과 81.84~ 96.87% 로나타났다. 확립된분석법으로견과류중땅콩을대상으로오염도를조사한결과 1종에서 deoxynivalenol이검출되었다. 이러한결과를바탕으로확립된시험법은견과류중트리코테센계곰팡이독소분석에적합함을확인할수있었으며견과류중트리코테센계곰팡이독소검출가능성을확인한바보다다양한종류의견과류에대한모니터링조사가필요한것으로판단된다. References 1. Minervini, F., F. Fornelli, K. M. Flynn.: Toxicity and apoptosis induced by the mycotoxins nivalenol, deoxynivalenol and fumonisin B1 in a human erythroleukemia cell line. Toxicology in Vitro, 18(1), 21-28 (2004). 2. Bennett, J. W., Klich, M.: Mycotoxins. Clin. Microbiol. Rev. 16, 497-516 (2003). 3. Lei, M. Y., Zhang, N. Y., Qi, D. S.: In vitro investigation of individual and combined cytotoxic effects of aflatoxin B1 and other selected mycotoxins on the cell line Porcine Kidney 15. Exp. Toxicol. Pathol., 65, 1149-1157 (2013). 4. Luongo, D., Severino, L., Bergamo, P., De Luna, R., Lucisano, A., Rossi, M.: Interactive effects of fumonisin B1 and alphazearalenol on proliferation and cytokine expression in Jurkat T cells. Toxicol in Vitro, 20, 1403-1410 (2006). 5. Li, Y., Zhang, J., Mao, X., Wu, Y., Liu, G., Song, L., Cao, X.: High-sensitivity chemiluminescent immunoassay investigation and application for the detection of T-2 toxin and major metabolite HT-2 toxin. J. Sci. Food and Agric., 97(3), 818-822 (2017). 6. Desmarchelier, A., Tessiot, S., Bessaire, T., Racault, L., Fiorese, E., Urbani, A., Mottier, P.: Combining the quick, easy, cheap, effective, rugged and safe approach and cleanup by immunoaffinity column for the analysis of 15 mycotoxins by isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry. J. Chromatog. A, 1337, 75-84 (2014). 7. Thompson, W. L., Wannemacher Jr, R. W.: Structure-function relationships of 12, 13-epoxytrichothecene mycotoxins in cell culture: comparison to whole animal lethality. Toxicon, 24(10), 985-994 (1986). 8. Soleimany, F., Jinap, S., Rahmani, A., Khatib, A.: Simultaneous detection of 12 mycotoxins in cereals using RP-HPLC- PDA-FLD with PHRED and a post-column derivatization system. Food Add. Cont., 28(4), 494-501 (2011). 9. Goryacheva, I. Y., Saeger, S. D., Eremin, S. A., Peteghem, C. V.: Immunochemical methods for rapid mycotoxin detection: Evolution from single to multiple analyte screening: A review. Food Add. Cont., 24(10), 1169-1183 (2007). 10. Azaiez, I., Giusti, F., Sagratini, G., Mañes, J., & Fernández- Franzón, M.: Multi-mycotoxins analysis in dried fruit by LC/ MS/MS and a modified QuEChERS procedure. Food analytical methods, 7(4), 935-945 (2014). 11. Kim, S., Lee, S., Nam, T. G., Seo, D., Yoo, M.: Comparison of a newly developed liquid chromatography with tandem mass spectrometry method and enzyme-linked immunosorbent assay for detection of multiple mycotoxins in Red pepper powder. J. Food Prot., 80(8), 1347-1354 (2017). 12. Guideline for the validation drug analysis procedure (Ministry of food and Drug Safety B1-2012-2-013, 2012). 13. Habler, K., Gotthardt, M., Schüler, J., Rychlik, M.: Multimycotoxin stable isotope dilution LC-MS/MS method for Fusarium toxins in beer. Food Chem., 218, 447-454 (2017). 14. Amirahmadi, M., Shoeibi, S., Rastegar, H., Elmi, M., Mousavi Khaneghah, A.: Simultaneous analysis of mycotoxins in corn flour using LC/MS-MS combined with a modified QuEChERS procedure. Toxin Reviews, 1-9 (2017). 15. Delgado-Zamarreño, M. M., Fernández-Prieto, C., Bustamante-Rangel, M., & Pérez-Martín, L.: Determination of tocopherols and sitosterols in seeds and nuts by QuEChERSliquid chromatography. Food Chem., 192, 825-830 (2016). 16. Vázquez, P. P., Hakme, E., Uclés, S., Cutillas, V., Galera, M. M., Mughari, A. R., Fernández-Alba, A. R.: Large multiresidue analysis of pesticides in edible vegetable oils by using efficient solid-phase extraction sorbents based on quick, easy, cheap, effective, rugged and safe methodology followed by gas chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromat. A, 1463, 20-31 (2016). 17. Farè, F., Dei Cas, M., Arnoldi, S., Casagni, E., Visconti, G. L., Parnisari, G., Roda, G.: Determination of methyldibromoglutaronitrile (MDBGN) in skin care products by gaschromatography-mass spectrometry employing an enhanced matrix removal (EMR) lipid clean-up. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 120(4), 1700525 (2018). 18. Sun, J., Wu, Y.: Evaluation of dietary exposure to deoxynivalenol (DON) and its derivatives from cereals in China. Food Cont., 69, 90-99 (2016).