Rhinology online ML Comm Korean J Otorhinolaryngol-Head Neck Surg 2010;53:349-53 / DOI 10.3342/kjorl-hns.2010.53.6.349 pissn 2092-5859 / eissn 2092-6529 The Demonstration of Bacterial Biofilm and It s Impact on Postoperative Course in Patients with Chronic Rhinosinusitis Jin-Woong Choi 1, Sung-Tae Seo 1, Sun-Gui Kim 1, Yong-Min Kim 1,2 and Ki-Sang Rha 1,2 1 Department of Otolaryngology-Head and Neck Surgery, 2 Research Institute for Medical Sciences, Chungnam National University School of Medicine, Daejeon, Korea 만성비부비동염에서 Biofilm 이수술후경과에미치는영향 최진웅 1 서성태 1 김선귀 1 김용민 1,2 나기상 1,2 충남대학교의학전문대학원이비인후과학교실, 1 의학연구소 2 Received February 23, 2010 Revised May 12, 2010 Accepted May 13, 2010 Address for correspondence Ki-Sang Rha, MD, PhD Department of Otolaryngology- Head & Neck Surgery, Chungnam National University School of Medicine, 33 Munhwa-ro, Jung-gu, Daejeon 301-721, Korea Tel +82-42-280-7698 Fax +82-42-253-4059 E-mail ksrha@cnu.ac.kr Background and ObjectivesZZBacterial biofilm is thought to contribute to the progression and persistence of chronic rhinosinusitis. There are many studies which demonstrate these structures on chronic rhinosinusitis (CRS), but the majority of the studies just focus on the documentation of their presence and the method for identification. There are also a few researches that show the impact of biofilm on postoperative surgical outcomes. In this study, we demonstrated bacterial biofilm in CRS patients and determined whether they affect clinical courses and outcomes after surgery. Subjects and MethodZZThe mucosa of ethmoid bulla was obtained during endoscopic sinus surgery from 21 CRS patients. Fluorescent microscope and scanning electron microscopy (SEM) were used for the determination of biofilm. The outcomes of the surgery were evaluated by endoscope every two weeks for 6 months. Preoperative symptom scores, CT scores, and the post operative results were compared between patients with biofilm and patients without biofilm. ResultsZZBacterial biofilm were seen in 13 (62%) of the 21 CRS patients. A statistical association existed between the presence of biofilm and the worsened preoperative symptom scores, but the preoperative CT scores were not related to the presence of biofilm. Patients with biofilm had long-lasting postoperative mucosal inflammation and a prolonged healing time, and these differences have statistical significance. ConclusionZZThis study showed that the presence of bacterial biofilm were significantly correlated with worsening preoperative symptom scores and the prolonged postoperative recovery time. Therefore, bacterial biofilm may play an important role in the recalcitrant and resistant nature of CRS. Korean J Otorhinolaryngol-Head Neck Surg 2010;53:349-53 Key WordsZZChronic rhinosinusitis Biofilm. 서론 만성비부비동염의발생원인및병태생리는아직까지명확하게밝혀져있지않다. 자연구의폐쇄와세균감염외에도진균감염, 초항원 (superantigen), 알레르기반응, 표피세포에관여하는유전자이상, 부비동의골염 (osteitis) 등 이만성비부비동염의발생에관여할것으로생각되며, 최근에는 Biofilm 이만성비부비동염의재발과염증악화등에관여할것이라는연구결과가보고되고있다. 1-5) 주변환경이세균들의생존에부적합한경우세균들은스스로만들어낸다당류기질 (polysaccharide matrix, glycocalyx) 에둘러싸인채구조화된집락 (microcolony) 을이 Copyright c 2010 Korean Society of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 349
Korean J Otorhinolaryngol-Head Neck Surg 2010;53:349-53 루는데이것을 biofilm 이라고한다. Biofilm 은주로생체표면, 죽은조직의표면또는생체에쓰이는의료기구의표면에서발견된다. 6,7) 그동안 biofilm 은비뇨생식기감염및카테터감염 (catheter infection), 치성감염, 낭포성섬유증 (cystic fibrosis) 등에서지속적인감염과항생제치료에저항하는원인으로알려져왔으며, 6,7) 이비인후과영역에서도중이환기관 (ventilation tube) 이나인공와우 (cochlear implant) 삽입후발생하는염증에서 biofilm 형성이관찰되었으며, 일부만성중이염이나편도및아데노이드질환에서반복적인감염을일으키고치료에저항하는원인중의하나로생각되고있다. 8-13) 최근몇몇연구에서 biofilm 이만성비부비동염환자에서발견되어, biofilm 이만성비부비동염의염증과정을악화시키는역할을할것으로생각되고있다. 그러나대부분의연구는만성비부비동염환자의부비동점막에서 biofilm 이존재하는지여부에초점을맞추고있으며, biofilm 의존재와임상양상이나수술후결과와의상관관계에대한연구는거의보고되어있지않다. 따라서본연구에서는만성비부비동염환자에서 biofilm 을검출하고, biofilm 이검출된환자들에서 biofilm 의존재유무가질환의임상양상과수술결과에어떤영향을미치는지알아보고자하였다. 대상및방법 대상 2007년 11월부터 2008년 1월까지만성비부비동염으로부비동내시경수술을받은환자중수술후 6개월까지정기적으로외래에서경과관찰이가능한 21명을대상으로하였다. 이중남자가 15명여자가 6명이었고나이는 11~75 세 ( 평균 37.7세 ) 였다. 모든환자에서비용이동반되어있었다. 만성비부비동염은 2003년에 Chronic Rhinosinusitis Task Force에서정한 3개월이상지속되는화농성비루, 비폐색, 후비루, 두통, 후각장애등의증상과내시경으로관찰한비강소견및부비동전산화단층촬영 (ostiomeatal unit computed tomography, OMU-CT) 결과로진단하였다. 3) 수술전 1개월이내에전신적항생제및스테로이드를사용한환자와진균성부비동염, 후비공비용, 해부학적이상이있는환자는제외하였다. 수술전증상의정도는 7개의항목으로구성되어있는 five point ranking scale questionnaire를이용하여각항목에대해 0=증상이없음 (no complaint), 1=경증 (mild), 2=증등도 (moderate), 3 =중증 (severe), 4=너무심해서괴롭다 (intolerable) 로점수화하였다. 14) Lund-MacKay scoring system을이용하여모든환자의 OMU-CT 에서관찰되는부비동상태의점수로좌우평균치를구하였다. 15) 조직의채취및 Biofilm 분석내시경하에서먼저구상돌기를제거하여사골봉소를노출시킨후사골겸자를이용하여사골봉소를통째로제거하여얻었다. 조직에서뼈를제거하여점막만을얻은후두개로나누어표본을만들고각각형광현미경 (fluorescent microscope) 과주사전자현미경 (scanning electron microscope, SEM) 으로 biofilm 형성유무를관찰하였다. 형광현미경채취한사골봉소점막을즉시알루미늄금속박편 (aluminum foil) 으로둘러싼후액화질소에바로담가냉각시킨후 -70 의온도에서보관하였다. -20 의 cryoworker 에서 10 μm 두께로절편을만든후 70% acetone 으로고정하였다. 고정된절편을 phosphate-buffered saline(pbs) 으로 3차례세척한후우선 15 μm 의 Propium iodide 로 5분간염색하였다. 그후다시 PBS 로세척한후 50 μg/ ml의 Concanavalin A fluorescein isothiocyanate(fi- TC)(C7642; Sigma-Aldrich Inc, MO, St. Louis, USA) 로 5분간염색하였다. 이후다시 PBS 로세척한후 Olympus IX 70 inverted microscope(olympus, Tokyo, Japan) 을이용하여 biofilm 을분석관찰하였으며 Olympus DP Controller software 를이용하여사진촬영하였다. 형광현미경에서 Propium iodide와 Concanavalin A로이중형광염색을했을때 biofilm 을구성하는세균이나주변점막세포가빨강형광을띠며다당류기질은녹색형광을띠기때문에 biofilm 은빨강형광과녹색형광이겹쳐보이게된다. 이렇게이중형광이관찰되는경우를 biofilm 양성군으로하였다. 5,9) 주사전자현미경조직절편을세절한후 2.5% glutaraldehyde(in ph 7.4, 0.1M phosphate buffer, 4 ) 에 2~4시간동안전고정하고완충액 (0.1M phosphate buffer, ph 7.2) 으로 10분씩 3회세척한후, 1% osmium tetroxide(in ph 7.2, 0.1M phosphate buffer, 4 ) 에 2시간동안후고정하였다. 다시같은완충용액으로세척한후 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% 의 4 에탄올용액에서탈수처리하여 isoamyl acetate로치환하고 critical point dryer로건조시킨후, 350
Bacterial Biofilm in Chronic Rhinosinusitis Choi JW, et al. SC502 sputter coater를 이용하여 20 nm 두께로 도금한 차로 나타내었다. 각각의 측정치를 biofilm이 관찰된 만성 후 주사전자현미경(HITACHI S-4300N, Tokyo, Japan) 부비동염 환자군과 관찰되지 않은 환자군에서 2-표본 비 으로 관찰하고 사진촬영하였다. 모수적 검정의 Mann-Whitney 검정(Mann-Whitney U Biofilm을 구성하고 있는 세균들은 SEM에서 관찰해 보 Test)를 이용하여 비교 분석하였다. 두 군의 수술 후 경과 면 구형으로 나타나며 대부분 집락을 이루고 있다. 또한 세 는 Fisher s exact test를 통해 분석하였다. 통계프로그램 균들이 만들어낸 다당류기질들과 water channel 등을 포 은 SPSS version 14.0(SPSSInc. IL, Chicago, USA)를 함하여 다형성의 삼차원적 구조로 나타난다. 이러한 특징 이용하였고. 유의수준은 0.05 미만으로 하였다. 적인 삼차원적 구조들이 세균들의 군락 주위에 같이 관찰되 9,16) 이번 연구는 본 병원의 임상시험심사위원회(institutional review board, IRB)의 승인 후에 시행하였다. 는 경우를 biofilm 양성군이라고 하였다. 결 수술 후 결과에 대한 평가 과 수술 후 2주마다 비강의 상태를 내시경으로 관찰하여 염 증과 부종이 없는 정상인 경우와 염증이 있거나 부종이 지 Biofilm의 검출 속되는 경우로 나누어 기록하였다. 점막이 정상보다 비후되 형광현미경 또는 주사전자현미경에서 biofilm이 관찰되는 어 있는 경우, 용종이 관찰되는 경우 및 분비물의 성상이 경우를 양성군으로 하였다. 총 21명의 환자 중 13예(62%) 점액성이거나 농성인 경우를 비점막의 염증 상태라 판정하 에서 biofilm이 관찰되었다(Figs. 1 and 2). 형광현미경과 였고 반면에 점막의 비후가 관찰되지 않거나 점막부종이 소 주사전자 현미경에서 각각 11예(52%)와 9예(42%)가 관 실되어 정상화된 경우 및 소량의 장액성 분비물이 관찰되 찰되었으며 이 중 7예(33%)는 두 가지 현미경 모두에서 거나 관찰되지 않는 경우를 치유라 판정하고 그때까지 걸 관찰되었다. 리는 기간을 기록하였다. Biofilm의 형성과 수술 전 임상적 지표의 관계 통계 처리(Statistic analysis) 수술 전 환자들의 증상을 Five point ranking scale ques- Biofilm 양성인 환자군과 음성인 환자군의 증상 점수, tionnaire을 이용하여 점수화했을 때 biofilm이 관찰된 만 Lund-MacKay 점수, 그리고 치유 기간을 평균값±표준편 성 비부비동염 환자들의 평균 증상 점수는 17.3±2.4이었 Fig. 1. Fluorescent micrograph showing bacterial biofilms. Polysaccharide matrix (green, white arrow) overlying mucosal cell (red) can be seen. A B Fig. 2. Scanning electron micrographs of sinus tissue from chronic rhinosinusitis. Bacterial colonies with spherical shape (black arrow) on the mucosa surface are observed ( 4,000)(A). In another patient, tower structures (white arrow) and water channel (white arrowhead) within polysaccharide matrix (open arrow) demonstrating a bacterial biofilm overlying mucosa and loss of cilia (black arrow) are seen ( 10,000) (B). www.jkorl.org 351
Korean J Otorhinolaryngol-Head Neck Surg 2010;53:349-53 Table 1. Comparison of CRS patients without biofilm and CRS patients with biofilm CRS patient without biofilm (n=8) CRS patient with biofilm (n=13) p value Age (mean±sd) 30.1±16.4 42.3±23.2 Gender (M:F) 7:1 9:4 Symptom score (mean±sd) 14.1±3.0 17.3±2.4* 0.037 Lesion and extent of surgery Lund MacKay score (mean±sd) MEF (3) MEFS (5) 8.6±2.2 MEF (5) MEFS (8) 8.2±3.2 1 0.78 Healing time (weeks)(mean±sd) 11.6±5.8 20.3±5.0* <0.001 M: maxillary sinus, E: ethmoid sinus, F: frontal sinus, S: sphenoid sinus, CRS: chronic rhinosinusitis Table 2. Postoperative endoscopic results of CRS patients without biofilm and CRS patients with biofilm Post operative period (month) CRS patients without biofilm (n=8) No inflammation Ongoing inflammation or edema CRS patients with biofilm (n=13) No inflammation Ongoing inflammation or edema p value 1 1 7 00 13 0.235 2 3 5 01 12 0.253 3 5 3 03 10 0.164 4 7 1 04 09 0.024 5 8 0 04 09 0.005 6 8 0 13 00 CRS: chronic rhinosinusitis 고 biofilm 이관찰되지않은만성비부비동염환자에서는 14.1±3.0 이었다. Biofilm 이있는환자군에서보다증상이더심하였고이는통계적으로유의했다 ( p=0.037). Lund- MacKay 점수는 biofilm 이있었던군에서는 8.2±3.2, biofilm 이없었던군에서는 8.6±2.2으로 Lund-MacKay 점수와 biofilm 의유무와는통계적으로유의한상관관계가없었다 ( p=0.78). 상악동, 사골동과전두동에염증이있는경우는 biofilm 이없는군에서 3예, biofilm 이있는군에서 5 예였고상악동, 사골동, 전두동과접형동인경우는각각 5예, 8예였다. 병변의범위와 Biofilm 의유무와도유의한상관관계가없었다 ( p=1)(table 1). Biofilm 형성과수술후경과수술후내시경으로추적관찰하였을때 biofilm 이관찰된환자군은그렇지않은군에비해술후 4개월, 5개월에염증이지속되는환자가유의하게많았다 (Table 2). 그리고 biofilm 이관찰되지않았던환자들은술후 5개월에모두치유되었으나 biofilm 이관찰되었던환자군에서는 13 명중 9예에서염증혹은부종이관찰되었다. Biofilm 이관찰되지않았던환자군은수술후점막이정상으로회복되는데 11.6±5.8 주가소요되었으나, biofilm 이있었던환자군은 20.3±5.0 주가소요되어 biofilm 이검출된환자의치유기간이통계적으로유의하게길었다 ( p<0.001). 고찰 만성비부비동염환자의비점막에서 biofilm 의검출빈도는연구자에따라다양하게보고되고있다. Prince 등 4) 은 157명의만성비부비동염환자에서 28.6% 의빈도로 biofilm 이검출된다고보고하였고 Psaltis 등 5) 은공초점레이저주사현미경 (confocal laser scanning microscope, CLSM) 으로관찰한결과 44% 의환자에서 biofilm 이검출된다고하였다. 또한 Sanclement 등 2) 은 SEM을이용하여 24명의만성비부비동염환자의 80% 에서 biofilm 을관찰하였다. 점막이나어떠한조직또는물체의표면에부착한세균들은미세군락을형성하며세균상호간에수로 (water channel) 등을통해신호전달과영양분을공급하는조직화된군집을이루며스스로다당류기질을생성하여 biofilm 을형성한다. 이러한 biofilm 을관찰하는방법으로는 SEM 또는투사전자현미경 (transmission electronic microscope, TEM) 등의전자현미경을이용하는방법과 CLSM 을이용하는방법그리고형광제자리보합법 (fluorescence in situ hybridization, FISH) 방법등이있다. SEM 은다당류기질등의 3차원적구조물을고배율로관찰할수있는장점을가지고있다. 그러나조직표본을제작할때소요되는시간이길며알데하이드나에탄올을사용하기때문에 biofilm 의다당류기질이탈수 (dehydration) 되어구조적변형을야기할수있다. 또한분석시단순점액 (mucus) 과혼동할수있는단점이있 352
Bacterial Biofilm in Chronic Rhinosinusitis Choi JW, et al. 다. TEM 은다당류기질내에좀더깊이존재하는세균들을 2차원적으로검출할수있으나 SEM 과마찬가지로표본제작에서탈수의과정을거쳐조직구조를변형시킬수있으며, 절편이 60~90 nm로초극박 (ultrathin) 이어서존재하는 biofilm 을찾아내지못할수있다. 2,16) Ha 등 16) 은이러한 TEM 의단점때문에 TEM 으로만 biofilm 을검출하는것은잘못된방법이라고하였다. 반면 CLSM은조직표본제작과정이짧고고정이나탈수등의과정을거치지않아조직손상이적다. 또한핵산 probe 를사용하기때문에점액과 biofilm 을구별하는데용이하다. 이러한점때문에 Psaltis 등 5) 은 CLSM을 biofilm의검출방법중에가장효과적인방법이라고하였다. FISH 는미리검출될예상균주에맞는 probe를써야한다는단점이있어 probe 이외의균주에의한 biofilm 을측정할수없는단점이있다. 현재까지 biofilm 검출의표준화된방법은없으며이러한관찰방법의차이에따라 biofilm 의검출빈도가달라질수있다. 본연구에서는 SEM 에서발견이되거나또는형광현미경에서발견이되는경우를 biofilm 양성군이라고하였는데이는 SEM 의조직처리과정으로발생할수있는위음성을보완하기위해서두가지의검출방법을사용하였다. SEM 과형광현미경을이용하여관찰한결과 62% 의환자에서 biofilm 이발견되어 Prince 등 4) 이나 Psaltis 등 5) 보다높은검출률을보였다. 만성비부비동염의수술후결과에영향을미치는요인에대한많은연구가보고되고있다. Mark 와 Shamsa 17) 는과거부비동수술여부와 CT score 가수술후경과와관련이있다고하였고, Lawson 18) 은천식이수술후질환의재발과관련이있다고하였다. 그러나 biofilm 유무와만성비부비동염의수술후경과를비교한연구는 40예의만성비부비동염환자를대상으로한 Psaltis 등 19) 의연구이외에는보고된바가없다. Psaltis 등은 biofilm이있는환자군이 biofilm 이관찰되지않은환자군에비해수술전시행한 CT score 가더나쁘고수술후증상및점막상태가호전되는데더오래걸렸다고보고하였다. 본연구에서는 Psaltis 등의연구와달리 biofilm 유무와수술전 CT score 와는연관이없었다. 그러나수술후 6개월까지 2주단위로수술후점막상태를비교했을때 biofilm 이관찰되었던만성비부비동염환자에서점막부종이좀더지속되는양상을보였고치유될때까지걸리는시간도길어 biofilm 형성이수술후치유과정에도영향을미칠것이라고생각하였다. 또한수술후 biofilm 양성군에서는경과관찰중좀더적극적인생리식염수세척 (saline irrigation) 을시행하여물리적제거를시도하였는데, 이러한처치에도불구하고치유기간이 biofilm 음성군에비해유의하게길게나타나 biofilm 이수술후경과에영향을미치는것으로생각된다. 본연구의대상자들은병변의범위가상악동, 사골동및전두동을포함하고있었으며 13명의환자들은접형동까지병변이있는범비부비동염을보였다. 따라서수술의범위도사골동절제술이모두포함되어있어수술후결과의판정은전반적인비강내점막의상태를수술자본인이관찰하여평가하였다. 수술한사람과경과관찰한사람이동일인이기때문에경과관찰중에편견 (bias) 이발생할수있다는제한점이있다. REFERENCES 1) Ferguson BJ, Stolz DB. Demonstration of biofilm in human bacterial chronic rhinosinusitis. Am J Rhinol 2005;19(5):452-7. 2) Sanclement JA, Webster P, Thomas J, Ramadan HH. Bacterial biofilms in surgical specimens of patients with chronic rhinosinusitis. Laryngoscope 2005;115(4):578-82. 3) Benninger MS, Ferguson BJ, Hadley JA, Hamilos DL, Jacobs M, Kennedy DW, et al. Adult chronic rhinosinusitis: definitions, diagnosis, epidemiology, and pathology. Otolaryngol Head Neck Surg 2003;129 (3 Suppl):S1-32. 4) Prince AA, Steiger JD, Khalid AN, Dogrhamji L, Reger C, Eau Claire S, et al. Prevalence of biofilm-forming bacteria in chronic rhinosinusitis. Am J Rhinol 2008;22(3): 239-45. 5) Psaltis AJ, Ha KR, Beule AG, Tan LW, Wormald PJ. Confocal scanning laser microscopy evidence of biofilms in patients with chronic rhinosinusitis. Laryngoscope 2007;117(7):1302-6. 6) Costerton JW, Stewart PS, Greenberg EP. Bacteral biofilms: a common cause of persistent infections. Science 1999;284(5418):1318-22. 7) Potera C. Forging a link between biofilms and disease. Science 1999; 283(5409):1837, 1839. 8) Galli J, Ardito F, Caló L, Mancinelli L, Imperiali M, Parrilla C, et al. Recurrent upper airway infections and bacterial biofilms. J Laryngol Otol 2007;121(4):341-4. 9) Kania RE, Lamers GE, Vonk MJ, Huy PT, Hiemstra PS, Bloemberg GV, et al. Demonstration of bacterial cells and glycocalyx in biofilms on human tonsils. Arch Otolaryngol Head Neck Surg 2007;133(2): 115-21. 10) Fergie N, Bayston R, Pearson JP, Birchall JP. Is otitis media with effusion a biofilm infection. Clin Otolaryngol Allied Sci 2004;29(1): 38-46. 11) Antonelli PJ, Lee JC, Burne RA. Bacterial biofilms may contribute to persistent cochlear implant infection. Otol Neurotol 2004;25(6):953-7. 12) Pawlowski KS, Wawro D, Roland PS. Bacterial biofilm formation on a human cochlear implant. Otol Neurotol 2005;26(5):972-5. 13) Ehrlich GD, Veeh R, Wang X, Costerton JW, Hayes JD, Hu FZ, et al. Mucosal biofilm formation on middle-ear mucosa in the chinchilla model of otitis media. JAMA 2002;287(13):1710-5. 14) Damm M, Quante G, Jungehuelsing M, Stennert E. Impact of functional endoscopic sinus surgery on symptoms and quality of life in chronic rhinosinusitis. Laryngoscope 2002;112(2):310-5. 15) Lund VJ, Mackay IS. Staging in rhinosinusitus. Rhinology 1993;31 (4):183-4. 16) Ha KR, Psaltis AJ, Tan L, Wormald PJ. A sheep model for the study of biofilms in rhinosinusitis. Am J Rhinol 2007;21(3):339-45. 17) Mark SC, Shamsa F. Evaluation of prognostic factors in endoscopic sinus surgery. Am J Rhinol 1997;11(3):187-91. 18) Lawson W. The intranasal ethmoidectomy: an experience with 1.077 procedures. Laryngoscope 1991;101(4 Pt 1):367-71. 19) Psaltis AJ, Weitzel EK, Ha KR, Wormald PJ. The effect of bacterial biofilms on post-sinus surgical outcomes. Am J Rhinol 2008;22(1):1-6. www.jkorl.org 353