ORIGINAL ARTICLE http://dx.doi.org/10.15263/jlmqa.2015.37.4.214 Clinical Study of Non-Invasive Prenatal Testing Using Next-Generation Sequencing Dong Hee Seo 1,2, Dae- Yeon Cho 1, Jihun Kim 1, So Young Kim 2, Sung Eun Cho 2, and Mijin Oh 1 1 LabGenomics Clinical Research Institute and 2 LabGenomics Clinical Laboratories, Seongnam, Korea Corresponding author: Dong Hee Seo LabGenomics Clinical Research Institute, 700 Daewangpangyoro, Bundang-gu, Seongnam 13488, Korea Tel: +82-31-628-0730 Fax: +82-31-628-0701 E-mail: seo2023@nate.com Background: Serological prenatal screening tests are widely used to detect fetal chromosomal abnormalities such as Down and Edward syndromes. After determining the presence of fetal cell-free DNA in maternal blood, the non-invasive prenatal test (NIPT) coupled with next-generation sequencing has been performed in other countries, therefore, we developed a domestic NIPT technology. Methods: The results of genomics-based NIPT performed between April and May, 2015 were analyzed. Maternal blood samples were collected in a specific Cell-Free DNA BCT tube. The samples were then massively sequenced using MiSeq and NextSeq 500 (Illumina Inc., USA) using LabGenomics laboratory-developed libraries. Chromosomal abnormalities were analyzed using a bioinfomatics algorithm. Results: A total of 464 cases were analyzed. The samples of 12 subjects had to be collected again because of a low fetal DNA fraction in the initially obtained samples. Among the 456 cases for which fetal genome results were obtained, 436 had a low risk of trisomy, 12 had a high risk for Down syndrome, two had a high risk for Edward syndrome, and four had sex chromosomal aneuploidy, showing that the positive percentage of chromosomal abnormalities was 4.4%. All 12 cases with high risk for Down syndrome were confirmed as having trisomy 21 by amniocentesis. Conclusions: Our laboratory-developed genomics-based NIPT showed high positive predictive value, therefore, NIPT may be replaced by our own developed method. (J Lab Med Qual Assur 2015;37:214-218) Key Words: Non-invasive prenatal test, Trisomy, Cell-free DNA, Fetal DNA fraction pissn: 2384-2458 eissn: 2288-7261 Received July 14, 2015, Revision received September 16, 2015, Accepted September 17, 2015 서론 산모의혈청생화학적표지자와태아의목덜미투명대 (nuchal translucency) 초음파검사를이용해다운증후군, 에드워드증후군등태아의염색체이상유무를알기위한산전선별검사가국내에서널리이용되고있다 [1]. 혈청검사로는임신초기 pregnancy associated plasma protein A와 β-human chorionic gonadotropin (hcg) 를보는이중표지자검사, 임신중기알파태아단백 (alpha-fetoprotein [AFP]), hcg, unconjugated estriol을보는삼중검사, 삼중검사에 inhibin A 를추가한사중검사 (quad test), 그리고최근에는통합선별검사 (integrated screening test) 가비침습적산전선별검사 (noninvasive prenatal test, NIPT) 로사용되고있다 [2,3]. 이들산전선별검사에서양성을보이는경우양수천자또는융모막천자를통해염색체검사로태아의염색체이상여부를확인하고있다. 하지만혈청선별검사는위양성률이높다는단점이있고, 양수천자는침습적시술로인한산모의높은심리적부담, 태아소실등의문제점이있다. 이에최근에산모의혈액에존재하는태아의유리핵산 (cell free DNA) 으로산전진단을하는소위유전체기반비침습적산전검사 (genomics-based 214 Copyright 2015 Korean Association of External Quality Assessment Service
noninvasive prenatal testing) 가소개되었다 [4]. 유전체기반 NIPT는기존혈청산전선별검사들에비해위양성률이낮고산모의말초혈액을이용하는검사이기때문에안전하다는장점이있다. 산모혈액내의태아유리핵산을이용한유전학적검사는 1997 년 Lo 등 [5] 에의해처음으로성공하였다. 이후유전자분석기법의발달로차세대염기서열분석법을이용한 NIPT 가가능하게되어현재 Sequenom, Verinata Health, Ariosa Diagnostics, Natera 등의유전체분석회사들에의해상업화된서비스가제공되고있다 [6,7]. 유전체기반 NIPT는대용량염기서열분석 (massively parallel sequencing) 법으로산모및태아유래의 DNA 분절을증폭하여전산화된생물정보학 (bioinformatics) 을이용하여해당염색체의상대적인발현양을통계적으로분석한다 [8]. 유전체기반 NIPT가신의료기술행위이기때문에국내에서는아직까지임상검사로서시행되지못하고있으며, 국외유전체분석회사에의뢰하고있다 [9]. 이에랩지노믹스의학연구소에서는자체기술로유전체기반 NIPT를개발하여임상시험을진행하였으며 [10], 의료기관을방문한산모의동의를구하여연구용으로검사를시행하여그결과를보고하고자한다. 재료및방법 2015년 4월부터 5월까지본의학연구소에의뢰된 464건의유전체기반 NIPT 결과를분석하였다. 본유전자검사에동의한산모의혈액은전용용기인 Streck (Omaha, NE, USA) 사의 Cell-Free DNA BCT 튜브에채혈되어본의학연구소에운송된후, 혈장 2 ml을사용하여핵산이추출되었다. 자체개발한검사프로토콜을이용하여 MiSeq (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) 과 NextSeq 500 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) 기기로전체유전체에대용량염기서열검사를시행한후, 생물정보학알고리즘을이용하여태아의염색체이상을분석하였다. 21번, 18번, 13번염색체의상대적인비율을계산하여 Z-점수를이용하여위험도를평가하였다 [10]. 염색체이상의확인검사로는해당산모로부터양수를채취하여염색체분석검사를시행하였다. 본연구는기관생명윤리위원회로부터 2013년 7월에연구승인을받았으며 (R-2013-03), 검사기술을개발한후에 2015년 4월에산모의동의를얻어검사를진행하였다. 유전체기반 NIPT를위한혈액채혈시산모의임신주수는 10주부터 24주까지분포하였고, 10주가 18명, 11 주 31명, 12주 95명, 13주 33명, 14주 8명, 15주 24명, 16주 77 명, 17주 105명, 18주 33명, 19주 10명, 20주이상이 13명, 임 신주수를알수없는경우가 18 명이었다. 결과 총 464 건의유전체기반 NIPT 의뢰건중에서 12 건은산모 혈액내태아분획 (fetal fraction) 이낮아서재검을위해재 채혈이요구되었다. 재검이시행된 12 건중 11 건은삼배수체 (trisomy) 저위험군으로결과가나왔고, 한건은검사결과를 얻지못했다. 464 건의검사의뢰건중 7 건은용혈등으로재검 이요구되었으나, 의뢰측에서검사진행을원하지않아검사가 취소되었다. 검사결과를얻지못한 8 건을제외하고, 태아유전체의 NIPT 분석결과가나온 456 건의검사중 436 건 (95.6%) 은염색체삼 배수체저위험군으로, 12 건 (2.7%) 은다운증후군고위험군, 2 건 (0.4%) 은다운증후군중위험군, 2 건 (0.4%) 은에드워드증 후군고위험군, 4 건 (0.9%) 은성염색체이상으로양성을보여 검사의양성률은 4.4% 였다. 성염색체이상은 XO 터너증후군 이 2 건, 그리고 XXY, XXX 증후군이각한건이었다. 유전체기반 NIPT 에서다운증후군고위험군을보인 12 건 모두, 양수검사를통해 21 번염색체의삼배수체가확인되었 다. 따라서본의학연구소에서개발한유전체기반 NIPT 의양 성예측률 (positive predictive value) 은다운증후군고위험군 을기준으로했을때 100% 를보였다. 다운증후군중위험군을 보인 2 건에서는양수염색체검사상 1 건은다운증후군을, 1 건 을정상소견을보였다. 유전체검사에서성염색체이상으로터 너증후군을보인 1 건에서는양수검사를통해터너증후군염색 체이상이확인되었으며, 나머지 3 건에서는양수결과를확인 할수없었다. 유전체기반 NIPT 에서저위험군을보인산모의 분만시이상은확인할수없었다 (Table 1). Table 1. Results of non-invasive prenatal test tested by next-generation sequencing and amniocentesis Confirmation by amniocentesis Category No. of cases Not Positive Negative available Low-risk 436 436 Middle-risk 2 of trisomy 21 1 1 12 of trisomy 21 12 0 High-risk 2 of trisomy 18 2 4 of sex chromosome aneuploidy 1 3 www.jlmqa.org J Lab Med Qual Assur 2015;37:214-218 215
고찰 산모혈액속의태아유리 DNA는약 150 bp 길이의짧은핵산분절로태반에서유래한다. 태아유리 DNA는산모혈액내의전체유리 DNA의약 10% 를차지하며, 임신 4주째부터산모의혈액에나타나기시작하여, 임신 10주에는약 4% 를차지한다 [11]. 태아유리 DNA는분만후 2시간이후에는검출되지않는다 [12]. 산모혈액내의약 10% 의태아유리 DNA 에서 1.5배증가한삼배수체를확인하는데에통상적인유전자증폭검사로는어려움이있었고, 차세대염기서열분석법이가능해지면서이를이용한유전체기반 NIPT 산전검사가현실화되었다. 국내에서는 2011년에 Yang 등 [13] 이처음으로산모혈액내의태아유리핵산에대해 SRY 유전자, Rh D 유전자검사를시행한연구가보고되어있다. 다운증후군등태아의염색체이상의위험도를파악하기위한노력이 1980년중반까지는산모의나이나가족력을고려하여양수천자를통한침습적염색체검사로주로시행되었다. 1984년 Merkatz 등 [14] 이다운증후군산모에서 AFP이감소되어있다는것을보고한이후로모든연령의산모에서혈청학적표지자를이용한비침습적산전선별검사가시행되고있다. 유전체기반 NIPT가검사민감도가높고위양성률이낮지만미국산부인과학회에서는 35세이상산모, 혈청학적선별검사양성, 삼배수체이상의과거력을가진산모등고위험군산모에서산전선별검사로사용할것을권장하고있다 [15]. 미국에서는양수천자의비용이유전체기반 NIPT 산전검사비용보다많이높아서고위험군산모에서유전체기반 NIPT 산전검사법적용이확산되고있지만국내에서는그반대의상황이라서아직활성화되고있지않다. 유전체기반 NIPT 검사가의뢰되는경향을보면해외에의뢰하는경우에는검사비용의부담으로인해의뢰건수가월 30건미만으로일정수준을유지하였지만 [9], 국내에서시행했을때는의뢰건이약두달만에 400건이상이본의학연구소에의뢰되었다. 유전체기반 NIPT 산전검사의검사정확도가높기때문에저위험군산모에서의연구결과가축적되면태아의삼배수체이상이의심되는경우양수검사를대체할수있다는전망도있다. 본의학연구소에의뢰된 456건의유전체기반 NIPT 검사중 20건이검사양성을보여 4.4% 의검사양성률을보였다. Han 등 [16] 에의하면국내임신중기양수천자의염색체이상이 3.1% 로보고되어있으며, 본연구의 NIPT 검사양성률도이와비슷한수준을보였다. 본연구에서는 NIPT 검사양성의경우양수천자결과를확인하였는데, 다운증후군고위험군의경우양수염색체검사에서모두 21번삼배수체가확인되었 다. 에드워드증후군양성 2건의경우는양수천자는시행되지않았지만, 초음파검사상에드워드증후군이의심되어 NIPT를시행한경우여서검사양성의결과를어느정도신뢰할수있었다. 외국에서도 NIPT의양성예측률이높은것으로보고되어있는데, Bianchi 등 [17] 은 1,914명의산모를대상으로한연구에서다운증후군에대한혈청학적선별검사의양성예측률이 4.2% 인데반해유전체기반 NIPT의경우 45.5% 였다고보고하고있다. 본연구에서는중위험군이상의다운증후군양성을기준으로하면검사의양성예측률은 92.9% (13/14건) 를보였다. 본의학연구소에의뢰된 8 건 (1.7%) 에대해서는유전체기반 NIPT 결과를얻지못했다. 이는검체혈액내 fetal fraction 이낮아서검사에실패한것으로추정되며, 유전체기반 NIPT 산전검사의검사실패율은 1-5% 로보고되어있다 [11]. 저위험군을보인산모의분만시결과는추적할수없었지만, 검사를시행한대상자로부터본의학연구소에태아이상소견이아직접수되지않고있어서검사의위음성률은낮을것으로기대된다. 본의학연구소에서개발한유전체기반 NIPT 산전검사를우리는 Momguard 검사로명명하였다. Momguard 검사는자체개발한유전체정보분석자동화 / 최적화플랫폼인 GeneBro 플랫폼을이용하여검사가진행된다. 결과정확도에결정적인영향을미치는유리 DNA 분획결정에서산모의임신주수, 상염색체, 성염색체의상대비율및성특이유전자 (sex specific gene) 등의정보와다양한시뮬레이션을통해산출된실험적보정계수를반영하는고유의앙상블알고리즘 (ensemble algorithm) 을적용하여정확한검사결과를제공한다. 또한임상시험을거쳐확보한통계치와분포를이용하여표준점수를계산하고, 임계치이상의결과를판정한다. 미국아리오사의 Harmony 검사는표적유전체염기서열분석법과 fetal-fraction optimized risk of trisomy evaluation (FORTE) 생물정보학알고리즘를사용한다. FORTE 알고리즘은태아염색체를이배수체로가정하는모델과태아염색체를삼배수체로가정하는모델의교차비 (odds ratio) 를이용하여삼배수체위험도를산출하는통계알고리즘으로검사의분석정확도를향상시키는것으로보고되어있다 [18]. 유전체기반 NIPT 산전검사는태아의개방성신경관결손증의위험도를알수없기때문에현재널리사용되고있는사중검사등혈청학적산전선별검사도지속적으로필요하다고본다. 또한태아염색체의수적인이상이외의구조적인이상등은검출할수없는한계를가지고있어서양수천자를통한염색체검사의필요성은여전히존재한다 [10]. 다만태아의삼배수체이상이예상되는상황에서산모가양수천자를두 216 J Lab Med Qual Assur 2015;37:214-218 www.jlmqa.org
려워하는경우등에서양수천자를시행하기전에비침습적으로한번더선별할수있는검사로유전체기반 NIPT를이용할수있을것이다. 유전체기반 NIPT가저위험군결과를보이면염색체이수성확인을위해양수검사를추가적으로시행할필요는없다고본다. 양수검사를이렇게유전체기반 NIPT 산전검사로추가적으로염색체이수성을선별을하게되면위양성률이높은혈청학적선별검사양성으로인해양수천자를시행하는경우를줄일수있을것이다. 벨기에와네덜란드에서는 2013년 4월에유전체기반 NIPT 산전검사가도입된후 2013년 12월까지 3,000예의미국아리오사의 NIPT검사인 Harmony 검사가시행되었다고한다 [19]. 유전체기반 NIPT 산전검사가신의료기술로인정받아국내에서일상적인검사로시행된다면검사건수가증가할것으로예상되며이로인해침습적인양수천자시술경우가줄어들것으로기대된다. 결론적으로본의학연구소에서개발한유전체기반 NIPT는높은검사양성예측률을보여해외로의뢰되고있는 NIPT를대체할수있을것으로여겨진다. REFERENCES 1. Hwang D. The recent trend of prenatal screening. J Genet Med 2008;5:7-14. 2. Kim S, Kim YH, Min WK. Prenatal serum marker screening in Korea: survey results. Korean J Lab Med 2007;27:28-33. 3. Yi DY, Jung B, Kang MS, Huh JY, Paek JY, Cha DH, et al. The evaluation of integrated test as an antenatal screening test for Down s syndrome in Korea. Lab Med Online 2011;1:10-8. 4. Morain S, Greene MF, Mello MM. A new era in noninvasive prenatal testing. N Engl J Med 2013;369:499-501. 5. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, et al. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997;350:485-7. 6. Margulies M, Egholm M, Altman WE, Attiya S, Bader JS, Bemben LA, et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 2005;437:376-80. 7. Yang JI. Clinical application of non-invasive prenatal testing using cell free fetal DNA. J Korean Med Assoc 2014;57:771-9. 8. Lim JH, Park SY, Ryu HM. Non-invasive prenatal diagnosis of fetal trisomy 21 using cell-free fetal DNA in maternal blood. Obstet Gynecol Sci 2013;56:58-66. 9. Seo DH, Cho SE, Kwak JR. An experience of using the Harmony test for genomics-based non-invasive prenatal testing. J Lab Med Qual Assur 2015;37:44-6. 10. Lee MY, Cho DY, Won HS, Hwang AR, Jeong B, Kim J, et al. Performance of Momguard, a new non-invasive prenatal testing protocol developed in Korea. Obstet Gynecol Sci 2015;58:340-5. 11. Gekas J, Langlois S, Ravitsky V, Audibert F, van den Berg DG, Haidar H, et al. Identification of trisomy 18, trisomy 13, and Down syndrome from maternal plasma. Appl Clin Genet 2014;7:127-31. 12. Lo YM, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang AM, Hjelm NM. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet 1999;64:218-24. 13. Yang YH, Han SH, Lee KR. Noninvasive prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA in maternal plasma: clinical applications. J Genet Med 2011;8:1-16. 14. Merkatz IR, Nitowsky HM, Macri JN, Johnson WE. An association between low maternal serum alphafetoprotein and fetal chromosomal abnormalities. Am J Obstet Gynecol 1984;148:886-94. 15. American College of Obstetricians and Gynecologists Committee on Genetics. Committee Opinion No. 545: Noninvasive prenatal testing for fetal aneuploidy. Obstet Gynecol 2012;120:1532-4. 16. Han SH, An JW, Jeong GY, Yoon HR, Lee A, Yang YH, et al. Clinical and cytogenetic findings on 31,615 mid-trimester amniocenteses. Korean J Lab Med 2008;28:378-85. 17. Bianchi DW, Parker RL, Wentworth J, Madankumar R, Saffer C, Das AF, et al. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening. N Engl J Med 2014;370:799-808. 18. Sparks AB, Struble CA, Wang ET, Song K, Oliphant A. Noninvasive prenatal detection and selective analysis of cell-free DNA obtained from maternal blood: evaluation for trisomy 21 and trisomy 18. Am J Obstet Gynecol 2012;206:319.e1-9. 19. Willems PJ, Dierickx H, Vandenakker E, Bekedam D, Segers N, Deboulle K, et al. The first 3,000 Non-Invasive Prenatal Tests (NIPT) with the Harmony test in Belgium and the Netherlands. Facts Views Vis Obgyn 2014;6:7-12. www.jlmqa.org J Lab Med Qual Assur 2015;37:214-218 217
차세대염기서열분석법을이용한비침습적산전검사임상연구서동희 1,2 조대연 1 김지훈 1 김소영 2 조성은 2 오미진 1 1 랩지노믹스의학연구소, 2 랩지노믹스임상검사센터 배경 : 산전에다운증후군, 에드워드증후군등태아의염색체이상을알기위해혈청학적산전선별검사가널리사용되고있다. 산모혈액내태아의유리유전체의존재가밝혀진후차세대염기서열분석법을이용한비침습적산전검사 (non-invasive prenatal test, NIPT) 가국외에서시행되고있어서국내기술을개발하였다. 방법 : 2015 년 4 월부터 5 월까지랩지노믹스의학연구소에의뢰된 464 건의유전체기반 NIPT 결과를분석하였다. 산모의혈액은전용용기인 Streck (Omaha, USA) 사의 Cell-Free DNA BCT 튜브에채혈되었고, 자체개발한라이브러리를이용하여 MiSeq 과 NextSeq 500 (Illumina Inc., USA) 기기로대용량염기서열검사를시행한후생물정보학알고리즘을이용하여태아의염색체이상을분석하였다. 결과 : 총 464 건의의뢰건중에서 12 건은산모혈액내태아분획이낮아서재채혈이요구되어재검이시행되었다. 태아유전체검사결과가나온 456 건의검사중 436 건은삼배수체저위험군으로, 12 건은다운증후군고위험군으로, 2 건은에드워드증후군고위험군, 4 건은성염색체이상으로양성을보여검사양성률은 4.4% 였다. 양수천자확인검사에서다운증후군고위험군 12 건모두 21 번염색체의삼배수체가확인되었다. 결론 : 본의학연구소에서개발된유전체기반 NIPT 는높은검사양성예측률을보여해외로의뢰되고있는 NIPT 검사를대체할수있을것으로여겨진다. (J Lab Med Qual Assur 2015;37:214-218) 교신저자 : 서동희우 )13488 경기도성남시분당구대왕판교로 700, 랩지노믹스의학연구소 Tel: 031)628-0730, Fax: 031)628-0701, E-mail: seo2023@nate.com 218 J Lab Med Qual Assur 2015;37:214-218 www.jlmqa.org