대한진단검사의학회지제 26 권제 6 호 2006 Korean J Lab Med 2006;26:412-7 원저 임상미생물학 vana 유전자를지닌 Vancomycin 내성장구균의 VanB 표현형발현기전 박일중 1 이위교 2 이혁민 3 용동은 4 이경원 4 김의종 5 정석훈

대한진단검사의학회지제 26 권제 6 호 2006 Korean J Lab Med 2006;26:412-7 원저 임상미생물학 vana 유전자를지닌 Vancomycin 내성장구균의 VanB 표현형발현기전 박일중 1 이위교 2 이혁민 3 용동은 4 이경원 4 김의종 5 정석훈 6 박연준 7 최태열 8 어영 9 신종희 10 이종욱 11 안지영 12 이성희 13 우건조 14 아주의대가정의학교실 1, 아주의대진단검사의학교실 2, 관동의대진단검사의학교실 3, 연세의대진단검사의학교실 4, 서울의대진단검사의학교실 5, 고신의대진단검사의학교실 6, 가톨릭의대진단검사의학교실 7, 한양의대진단검사의학교실 8, 원주의대진단검사의학교실 9, 전남의대진단검사의학교실 10, 건양의대진단검사의학교실 11, 순천향의대진단검사의학교실 12, 제주한마음병원진단검사의학과 13, 식품의약품안전청식품안전평가부식품미생물과 14 Mechanism of VanB Phenotype in Vancomycin-Resistant Enterococci carrying vana gene Il Joong Park, M.D. 1, Wee Gyo Lee, M.D. 2, Hyukmin Lee, M.D. 3, Dongeun Yong, M.D. 4, Kyungwon Lee, M.D. 4, Eui-Chong Kim, M.D. 5, Seok Hoon Jeong, M.D. 6, Yeon Jun Park, M.D. 7, Tae Yeal Choi, M.D. 8, Young Uh, M.D. 9, Jong Hee Shin, M.D. 10, Jongwook Lee, M.D. 11, Ji young Ahn, M.D. 12, Sung-Hee Lee, M.D. 13, and Gun-Jo Woo, Ph.D. 14 Departments of Family Medicine 1 and Laboratory Medicine 2, Ajou University School of Medicine, Suwon; Departments of Laboratory Medicine, University of Kwandong College of Medicine 3, Goyang; Yonsei University College of Medicine 4, Seoul; Seoul University College of Medicine 5, Seoul; Kosin University College of Medicine 6, Busan; The Catholic University of Korea College of Medicine 7, Seoul; Hanyang University College of Medicine 8, Seoul; Yonsei University Wonju University College of Medicine 9, Wonju; Chonnam National University College of Medicine 10, Gwangju; Keonyang University College of Medicine 11, Daejeon; Sooncheonhyang University College of Medicine 12, Gumi; Cheju Hanmaeum Hospital 13, Jeju; Center for Food Safety Evaluation 14, Korea Food and Drug Administration, Seoul, Korea Background : Recently, vancomycin-resistant enterococci (VRE) with the vana genotype that are susceptible to teicoplanin have been described in Japan, Taiwan, and Korea. The investigators suggested three point mutations in the putative sensor domain of vans or impairment of accessory proteins VanY and VanZ as an explanation for the VanB phenotype-vana genotype VRE. In this study, we analyzed Tn1546-like elements to determine the molecular mechanisms responsible for the impaired glycopeptide resistance of clinical VRE isolates with VanB phenotype-vana genotype from Korea. Methods : From 2001 to 2004, 28 clinical isolates of Enterococcus faecium with VanB phenotypevana genotype were collected from 8 different university hospitals in diverse geographic areas in Korea. For structural analysis of Tn1546-like elements, PCR amplifications for internal regions of Tn1546 were performed. The purified PCR products were directly sequenced with an ABI Prism 3100 DNA sequencer. Results : The sequence data of the vans regulatory gene revealed that none of the isolates had any point mutations in this gene. All 28 isolates had a complete or incomplete deletion of vany gene. Of these, 13 strains represented a complete deletion of vanz, and 2 strains showed the deletion of nucleotides near the end point of vanx. Conclusions : The mechanism of VanB phenotype-vana genotype in VRE isolates from Korea is not point mutations of vans but the rearrangements of vanx, vany and vanz. (Korean J Lab Med 2006;26: 412-7) 접수 : 2006 년 8 월 11 일접수번호 : KJLM1979 수정본접수 : 2006 년 10 월 11 일게재승인일 : 2006 년 10 월 27 일교신저자 : 이위교우 442-721 경기도수원시영통구원천동산 5 아주대학교의과대학진단검사의학교실전화 : 031-219-5785, Fax: 031-219-5778 E-mail: weegyo@ajou.ac.kr * 본연구는 2004 년식품의약품안전청에서주관한용역연구개발사업의지원으로이루어진것임. Key Words : VRE, VanB, vana, vans, vanx, vany, vanz 서 Vancomycin 내성장구균 (vancomycin-resistant enterococci, VRE) 은 1986년영국과프랑스에서처음으로보고되었고, 일년 론 412

vana 유전자를지닌 Vancomycin 내성장구균의 VanB 표현형발현기전 413 후미국에서도보고된이래발생이급격히증가하고있다 [1, 2]. 미국국가병원감염감독위원회 (National Nosocomial Infections Surveillance System, NNIS) 에서는중환자실에서분리되는장구균중 VRE의비율이 1989년에 0.4% 에서 1993년에는 13.6% 로증가하였으며, 2004년까지 31.3% 로급증하였음을보고하였다 [3, 4]. 국내에서는 1992년박등이백혈병환자의가검물에서 vancomycin에고도내성을보이는 Enterococcus durans 1주를보고하였고, 이후 1997년까지 VRE의분리빈도는매우낮았으나 1998 년부터경구용 vancomycin 사용의증가와더불어현저하게증가하고있다 [5, 6]. 장구균의 vancomycin 내성표현형 VanA, VanB, VanC, VanD, VanE 및 VanG 중에서 VanA와 VanB가임상적으로의미있으며, 일반적으로유전형과표현형이일치한다 [7-12]. 즉, vancomycin과 teicoplanin에내성을보이는 VanA형의경우 vana 유전자를, vancomycin 에는내성이나 teicoplanin에감수성인 VanB 형의경우 vanb 유전자를보유한다. 최근 VanB 표현형을보이나 vana 유전자를갖는 VanB phenotype-vana genotype VRE 가보고된바있다. Hashimoto 등 [13] 은 vana 유전형 VRE에서 teicoplanin에감수성을보이는것은 vans domain의 3개의점돌연변이가원인인것으로설명하였으며, 태국및한국에서도이와같이보고한바있다 [14, 15]. 그러나, 이와는다른원인으로 vany와 vanz의단백질들의결실혹은변형을생각할수있으며, 최근한국에서 VanB phenotype-vana genotype VRE 5예중한균주에서 vanx의부분결실을, 다른 4균주에서 vany 또는 vanz 유전자의결실이있음을보고한바있다 [16]. 본연구에서는한국에서발생하는 VanB phenotype-vana genotype VRE 의발현기전을알아보고자국내대학병원에서분리된 VanB phenotype-vana genotype VRE 균주의유전자분석및염기서열분석을통하여분자생물학적발현기전을확인하고자하였다. 대상및방법 2. 역학적연관성분석 Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) 는다음과같이시행하였다. Murray 등 [18] 이기술한바와같이 SmaI으로 25 에서처리한후 ramped pulse time을시작 1초및끝20초로하였으며, 6 V/cm, 24시간전기영동하였다. 이후 banding pattern은 Bio-Gene software (Vilber Lourmat, Marne la-valles, France) 를이용하여비가중평균결합법 (unweighted pair group method with arithmetic average, UPGMA) 법으로군집분석하여역학 적연관성을결정하였다. 3. 유전자구조분석 vana gene cluster가포함된 transposon Tn1546 내부를중복되도록증폭한후표준균주인 E. faecium BM4147[8] 과비교하는 PCR 지도화 (mapping) 를시행하였고, 증폭산물중원형 (prototype) 과비교하여크게증폭된부분에대하여 IS1216V 및 IS1542에대한 PCR을시행하여내성유전자의구조를분석하였다. 4. 유전자염기서열분석및핵산부합법 (Nucleic acid hybridization) 유전자변형이발생한부위및 vans domain에대한유전자염기서열분석및핵산부합법을시행하였다. PCR 증폭산물을전기영동한후에한천으로부터 GENECLEAN kit (Qbiogene Inc, Carlsbad, CA, USA) 를이용하여추출한후, ABI Prism 3100 DNA SEQUENCER (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) 를사용하여염기서열을분석한후, DNASIS v2.6 (Hitachi Software, San Francisco, CA, USA) 를이용하여내성유전 자의구조를판독하였다. 유전자결실부위확인을위하여 Tn1546 내부증폭산물을이용하여핵산부합법을시행하였다. 1. 연구대상및세균동정 결 과 2001년 1월부터 2004년 12월까지전국 8개대학병원에서수집한디스크확산법상표현형이 VanB 형인 VRE 28균주를대상으로하였다. 각균주는 vancomycin 6 mg/l을함유한 brain heart infusion agar를이용하여선택한천배지법으로 vancomycin 내성여부를검색하였고, VRE로검색된모든균주에대하여기존의수기법, API 20 STREP (biomerieux, Hazelwood, MO, USA) 및 Vitek system (biomerieux) 을이용하여동정하였다. 각균주의 vancomycin, teicoplanin 최소억제농도 (minimum inhibitory concentration, MIC) 측정을위하여 E-test를시행하였다 [17]. 1. 세균동정및최저발육저지농도대상균주 28균주모두 E. faecium으로동정되었다. E-test 에의한 MIC 검사결과 vancomycin에대하여는대상균주모두고도내성이었고, teicoplanin에대하여는감수성혹은중간이었다 (Table 1). 2. 유전적형별분석 PFGE를이용한 28균주의유전적형별분석결과역학적으로연관성이없었다 (Fig. 1).

414 박일중 이위교 이혁민외 12 인 Table 1. MICs of vancomycin and teicoplanin for clinical VRE isolates with VanB phenotype-vana Isolates Species Vancomycin MIC (mg/l) 3. 유전자구조및염기서열분석 MIC (mg/l) Teicoplanin Susceptibility Susceptibility J1 E. faecium >256 R 16 I J2 E. faecium >256 R 16 I J3 E. faecium >256 R 12 I J4 E. faecium >256 R 12 I J5 E. faecium >256 R 12 I J6 E. faecium >256 R 12 I J7 E. faecium >256 R 16 I J8 E. faecium >256 R 16 I J9 E. faecium >256 R 4 S J10 E. faecium >256 R 12 I J11 E. faecium >256 R 8 S J12 E. faecium >256 R 24 I J13 E. faecium >256 R 16 I J14 E. faecium >256 R 16 I J15 E. faecium >256 R 1 S J16 E. faecium >256 R 24 I J17 E. faecium >256 R 16 I J18 E. faecium >256 R 24 I J19 E. faecium >256 R 16 I J20 E. faecium >256 R 24 I J21 E. faecium >256 R 2 S J22 E. faecium >256 R 12 I J23 E. faecium >256 R 1 S J24 E. faecium >256 R 8 S J25 E. faecium >256 R 12 I J26 E. faecium >256 R 8 S J27 E. faecium >256 R 6 S J28 E. faecium >256 R 16 I Abbrebiations: R, resistant; I, intermediate; S, susceptible. 28균주의 vans 유전자에대한염기서열분석결과변이여부를관찰할수없었다 (Fig. 2). vana gene cluster의유전자변형부위의염기서열을분석하여 28균주모두 가 vanx-vany intergenic region (nt8625-9051) 에삽입되면서 vany 및 vanz 유전자완전결실혹은부분결실을확인하였다. 이중 13균주 (J2, J9, J14, J15, J20, J22, J24, J25, J27, J28, J10, J12 및 J16) 는 가 vana gene cluster 중 nt8712, nt8832 및 nt8845 위치에삽입되면서 nt9355까지총 523-643 bp의염기손실이발생하여 vany의부분결실 (220-340 bp) 이있었고, BY* 로구분하였다. 다른 13균주 (J1, J4, J5, J13, J6, J7, J8, J11, J18, J19, J23, J21 및 J17) 에서는 의삽입에의한 vany 및 vanz의완전결실을관찰할수있었고, B* 로구분하였다. 나머지 2균주 (J3, J26) 는 vanx의마지막위치 (nt8624) 인근인 nt8649와 nt8694에서의삽입에의한손실이있었으며, BX* 로구분하였다. Orf2-vanR intergenic region에삽입된삽입서열 (insertional sequences, IS) 의종류에따라추가분류하였다. 즉, 가 100% 1/03.J1 1/04.J2 1/08.J6 1/05.J3 1/10.J7 1/06.J4 1/07.J5 3/06.J17 2/03.J9 2/04.j10 2/07.J12 2/05.J11 4/08.J26 2/10.J14 4/02.J21 2/08.J13 3/03.J15 3/07.J18 3/09.J20 3/04.J16 2/02.J8 4/03.J22 4/04.J23 3/08.J19 4/06.J25 4/05.J24 4/09.J27 4/10.J28 90% 80% 70% 60% Fig. 1. Dendrogram of E. faecium isolates with VanB phenotypevana. To produce the dendrogram, the banding patterns of E. faecium isolates were interpreted by Dice analysis and analysis by the unweighted pair group method with arithmetic averages. BM4147 Bd Bv Bs Bn BYd BYv BYs BXv orf1 orf2 vanr vans vanh vana vanx vany vanz J1:8712 1089 J4, J13:8745 IS1542 3925 J5:8724 817 IS1542 3925 3932 IS1542 3925 1089 IS1542 3925 J20:8745 817 J22, J25, J27, J28:8712 IS1542 3925 J24:8832 3932 IS1542 3925 715 IS1542 3925 J6, J7, J23:8712 J8, J11, J19:8731 J21:8839 J17:9010 J2, J14:8712 J9,J15:8745 J10, J12:8721 J16:8731 J3:8694 J26:8649 9355 9355 J10, J16:9355 J12:9233 8832 Fig. 2. The genetic maps of Tn1546 types of E. faecium isolates with VanB phenotype-vana genotype from Korean hospitals. The positions of genes and open reading frames (orf1 and orf2) and the direction of transcription are marked by dark arrows at the top. The inverted triangles represent IS elements. The positions of the first nucleotide upstream and the first nucleotide downstream from the IS insertion sites are depicted. Solid arrows indicate the transcriptional orientation of the inserted IS elements. Deletions are indicated by dotted lines.

vana 유전자를지닌 Vancomycin 내성장구균의 VanB 표현형발현기전 415 IS1542에순방향으로삽입된군은 *d (Bd 및 BYd) 로, 가IS1542에역방향으로삽입된군은 *v (Bv, BYv 및 BXv) 로, IS1542만삽입된군은 *s (Bs 및 BYs) 로, IS의삽입이없었던군은 Bn으로구분하였다 (Fig. 2). 고찰 VRE의내성형중 VanA형은 vancomycin (MIC, 64 mg/ L) 과 teicoplanin (MIC, 32 mg/l) 에획득성, 유도성내성을보이며 [19], 많은연구가이루어져있다 [8]. 이와같은 glycopeptide에대한고도내성은접합에의해서내성수여자에게전달된다. VanA 표현형의발현을위한유전정보는 Tn1546에의하여운반되며이러한전위유전단위 (transposons) 의확산이임상적으로동정되는장구균에서 glycopeptide에대한고도내성을유발하는것이알려져있다 [20]. Tn1546은 10.4 kb 크기로총 9개의단백을암호화하며, 4개의기능성그룹으로나누어진다. 즉, 치환기능의 open reading frames (orf1, orf2), 유전발현을조절하는 vanr, vans, 실제내성발현을유발하는효소인 depsipeptide를암호화하는 vanh, vana, vanx, 그리고내성에필수적이지는않으나펩티도글리칸합성에관여하는 vany와 vanz로나누어진다 [8, 21, 22]. VRE의 glycopeptide에대한내성기전은다음과같다. Glycopeptide를 protein kinase인 VanS의막횡단부위의외부고리에서감지하고, VanS의 cytoplasmic histidine 잔류물 (residue) 의자가인산화후 phosphoryl group이반응조절인자 (response regulator) 인 VanR의 aspartate 잔류물로전이된다. 인산화된 VanR 은 vanh의 promotor sequence에부착하여전사를일으켜 VanH 를생산한다. 이어서 VanH의 -ketoreductase가 pyruvate를환원하여 D-Lac 을생성한다. VanA는변형된특이도를갖는 D-Ala- D-Ala ligase로서 VanH에의하여생성된 D-Lac에 D-Ala를연결한다. 이후 D-Ala-D-Lac 전구체는 UDP-N-acetyl muramide tripeptide에결합한다. 그러나, 일반적으로장구균의염색체에존재하는 D-Ala-D-Ala ligase에의하여정상적인 D-Ala-D-Ala 전구체도생성되는데, 이렇게생성된 D-Ala-D-Ala 전구체는 Zn 2+ -dependent dipeptidase인 VanX에의하여제거된다. 따라서세포벽의전구체는대부분내성형으로구성된다. 또한 VanY 는 accessory carboxypeptidase로서 VanX에의하여제거되지않고세포질내에존재하는 D-Ala-D-Ala 잔류물이포함된 pentapeptide를제거하는역할을한다. 마지막으로 VanZ는저농도 teicoplanin 내성에관여한다고알려져있으나정확한기능은아직명확히밝혀져있지않다 [8]. VRE의유전형과표현형은일반적으로일치한다. 즉, vancomycin과 teicoplanin에내성을보이는 VanA형의경우 vana 유전자를, vancomycin에는내성이나 teicoplanin에감수성인 VanB 형의경우 vanb 유전자를보유한다. 그러나, 최근 VanB 표현형 을보이나 vana 유전자를가지는경우가일본, 태국그리고한국등에서보고되고있다 [13-16]. Hachimoto 등 [13] 은 VanB phenotype-vana genotype VRE의발생기전으로내성발현초기단계를담당하는 vans domain의 3점돌연변이로설명하고있다. 즉, vana 유전자의발현조절을담당하는 VanS는환경내 vancomycin의존재유무를감지하여책임조절자인 VanR에게신호를전달한다. 이후 VanR이활성화되어 VanHAX의합성을유발한다 [8]. 내성발현의초기단계를담당하는 vans의 3점돌연변이는 VanS의아미노산치환을유발하고, 이에따른 teicoplanin 에대한반응의손실이 teicoplanin에대한내성감소를유발하는것으로설명하고있다. 이후중국및한국에서 vans domain의 3 점돌연변이에의한 VanB phenotype-vana genotype VRE 발생을보고한바있다 [14, 15]. 본연구의 teicoplanin에대한 MIC 검사에서모든균주가 teicoplanin에감수성혹은중간을보여, 28균주모두 VanB phenotype-vana genotype VRE로확인되었다. VanB phenotypevana genotype VRE 28균주에서 vans domain의유전자돌연변이는없었으며, 이를통하여한국에서발생하는 VanB phenotype-vana genotype VRE는일본및중국과는달리 vans domain의유전자돌연변이가아닌다른기전임을알수있었다. VanB phenotype-vana genotype VRE 28균주중 26균주에서 vany 의유전자변형을관찰할수있었다. 이중 13개균주 (J2, J9, J14, J15, J20, J22, J24, J25, J27, J28, J10, J12 및 J16) 에서는 가 nt8712, nt8832 및 nt8845 위치에삽입되면서 nt9355까지총 523-643 bp의염기손실이발생하여 vany의부분결실 (220-340 bp) 이관찰되었다. 이러한결과는기존한국에서보고된 VanB phenotype-vana genotype VRE 5예 [16] 와유사하다. 또한, vany 유전자변형을관찰할수있었던 26균주중 13균주 (J1, J4, J5, J13, J6, J7, J8, J11, J18, J19, J23, J21 및 J17) 에서는 IS- 1216v의삽입에의한 vany 및 vanz의완전결실을발견할수있었다. 저농도 teicoplanin 내성에관여하는것으로알려져있는 vanz 역시 teicoplanin 내성발현에역할을할수있다는가능성은제시되었지만, vanz 유전자만의변형이발생한균주가관찰되지않아vanZ의손실이 VanB phenotype-vana genotype VRE 를유발했는지의여부는확인할수없었다. VanB phenotypevana genotype VRE 2개균주 (J3 및 J26) 에서 vanx의마지막위치인 nt8624와인접한 nt8649와 nt8694에서손실이확인되었다. 이러한손실이 vanx 유전자발현에영향을주어 VanB 표현형발생을유발한것으로추정된다. 본연구결과를통하여한국의 VanB phenotype-vana genotype VRE의발생기전이일본및중국과는다르며, 의삽입과정과동반된 vanx, vany 및 vanz 유전자손실이주된기전임을확인할수있었다. 또한 VanB phenotype-vana genotype VRE에대한대처는아직그임상적의의가정확히알려져있지않아, VanA형 VRE에준한치료가필요하고생각되며, 향후 teicoplanin 투여가능성및생체내감수성에대한연구가필요

416 박일중 이위교 이혁민외 12 인 하다고사료된다. 요약배경 : 최근일본, 중국및한국에서 teicoplanin에감수성인 vana 유전형 vancomycin 내성장구균 (VRE) 이보고되었다. 그기전으로 vans domain의 3점돌연변이와부단백인 VanY 혹은 VanZ의결여로보고된바있다. 본연구에서는 Tn1546의분석을통하여한국에서의 VanB phenotype-vana genotype VRE 의분자생물학적기전을밝히고자하였다. 방법 : 2001년부터 2004년까지전국에산재한 8개대학병원에서분리된 VanB phenotype-vana genotype Enterococcus faecium 28균주를대상으로하였다. Tn1546의구조분석을위해 PCR 을시행하였고, 정제된 PCR 산물을이용하여염기서열분석을하였다. 결과 : 총 28균주의 VanB phenotype-vana genotype VRE 모두에서 vans domain 의점돌연변이가관찰되지않았지만 vany 유전자의부분혹은완전결실이관찰되었다. 이중 13균주에서 vanz 유전자의결실이동반되었다. 또한 2균주에서 vanx의끝인접부분의염기손실이확인되었다. 결론 : 한국에서발생하는 VanB phenotype-vana genotype VRE의발생은 vans domain의 3점돌연변이에의한것이아닌 vanx, vany 및 vanz의재배열에의한것임을알수있었다. 참고문헌 1. Leclercq R, Derlot E, Duval J, Courvalin P. Plasmid-mediated resistance to vancomycin & teicoplanin in Enterococcus faecium. N Engl J Med 1988;319:157-61. 2. Uttley AH, Collins CH, Naidoo J, George RC. Vancomycin-resistant enterococci. Lancet 1988;1:57-8. 3. Centers for Disease Control and Prevention. Nosocomial enterococci resistance to vancomycin-united States, 1989-1993. MMWR Morb Mortal Wkly Rep 1993;42:597-9. 4. National Nosocomial Infections Surveillance System. National Nosocomial Infections Surveillance (NNIS) System Report, data summary from January 1992 through June 2004, issued October 2004. Am J Infect Control 2004;32:470-85. 5. Park JW, Kim YR, Shin WS, Kang MW, Han KJ, Shim SI. Susceptibility tests of vancomycin-resistant enterococci. Korean J Infect Dis 1992;24:133-8.( 박지원, 김양리, 신완식, 강문원, 한경자, 심상인. Vancomycin내성 enterococci에대한감수성검사. 감염 1992;24:133-8.) 6. Shin JW, Yong D, Kim MS, Chang KH, Lee K, Kim JM, et al. Sudden increase of vancomycin-resistant enterococcal infections in a Korean tertiary care hospital: possible consequences of increased use of oral vancomycin. J Infect Chemother 2003;9:62-7. 7. Cetinkaya Y, Falk P, Mayhall CG. Vancomycin-resistant enterococci. Clin Microbiol Rev 2000;13:686-707. 8. Arthur M and Courvalin P. Genetics and mechanisms of glycopeptide resistance in enterococci. Antimicrob Agents Chemother 1993; 37:1563-71. 9. Leclercq R, Dutka-Malen S, Duval J, Courvalin P. Vancomycin resistance gene vanc is specific to Enterococcus gallinarum. Antimicrob Agents Chemother 1992;36:2005-8. 10. Perichon B, Reynolds P, Courvalin P. VanD-type glycopeptide-resistant Enterococcus faecium BM4339. Antimicrob Agents Chemother 1997;41:2016-8. 11. Fines M, Perichon B, Reynolds P, Sahm DF, Courvalin P. VanE, a new type of acquired glycopeptide resistance in Enterococcus faecalis BM4405. Antimicrob Agents Chemother 1999;43:2161-4. 12. McKessar SJ, Berry AM, Bell JM, Turnidge JD, Paton JC. Genetic characterization of vang, a novel vancomycin resistance locus of Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother 2000;44:3224-8. 13. Hashimoto Y, Tanimoto K, Ozawa Y, Murata T, Ike Y. Amino acid substitutions in the vans sensor of the vana-type vancomycin-resistant enterococcus strains result in high-level vancomycin resistance and low-level teicoplanin resistance. FEMS Microbiol Lett 2000;185: 247-54. 14. Lauderdale TL, McDonald LC, Shiau YR, Chen PC, Wang HY, Lai JF et al. Vancomycin-resistant enterococci from humans and retail chickens in Taiwan with unique VanB phenotype-vana genotype incongruence. Antimicrob Agents Chemother 2002;46:525-7. 15. Eom JS, Hwang IS, Hwang BY, Lee JG, Lee YJ, Cheong HJ, et al. Emergence of vana genotype vancomycin-resistant enterococci with low or moderate levels of teicoplanin resistance in Korea. J Clin Microbiol 2004;42:1785-6. 16. Lee WG, Huh JY, Cho SR, Lim YA. Reduction in glycopeptide resistance in vancomycin-resistant enterococci as a result of vana cluster rearrangements. Antimicrob Agents Chemother 2004;48:1379-81. 17. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. 7th ed. Approved standard M7-A7. Wayne, Pa: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2006. 18. Murray BE, Singh KV, Heath JD, Sharma BR, Weinstock GM. Comparison of genomic DNAs of different enterococcal isolates using restriction endonucleases with infrequent recognition sites. J Clin Microbiol 1990;28:2059-63. 19. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. Sixteenth informational supplement, M2-A9 and M7-A7. Wayne, PA: Clinical and Laboratory

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