(12-072).fm

Polymer(Korea), Vol. 36, No. 6, pp. 789-794 http://dx.doi.org/10.7317/pk.2012.36.6.789 ISSN 0379-153X(Print) ISSN 2234-8077(Online) PLGA 다공성지지체에함침시킨 DBP 젤의연골재생효과 ; In Vivo 실험 이윤미 심초록 이유정 김하늘 조선아 송정은 이동원 강길선 전북대학교유기신물질학과, BIN 융합공학과, 고분자나노공학과 (2012년 6월 27일접수, 2012년 8월 29일수정, 2012년 8월 29일채택 ) Effect of Demineralized Bone Particle Gel Penetrated into Poly(lactic-co-glycolic acid) Scaffold on the Regeneration of Chondrocyte; In Vivo Experiment Yun Mi Lee, Cho Rok Shim, Yujung Lee, Ha Neul Kim, Sun A Jo, Jeong Eun Song, Dongwon Lee, and Gilson Khang Dept. of Advanced Organic Materials Engineering, Dept. of BIN Fusion Tech., and Dept. of PolymerNano Sci. & Tech., Chonbuk National University, 567 Baekje-daero, Deokjin, Jeonju 561-756, Korea (Received June 27, 2012; Revised August 29, 2012; Accepted August 29, 2012) 초록 : 생체적합성및생분해성의장점을지닌 PLGA 는우수한기계적성질과분해속도를조절할수있는장점을가지고있지만소수성으로인해세포의초기부착률이낮고, 지지체내부에영양액의공급이원활하지않다. 본연구에서는이러한단점을보완하고자탈미네랄화된골분 (DBP, demineralized bone particle) 젤을 PLGA 지지체에함침시켰다. 다양한형태의지지체압축강도를측정한결과 PLGA/DBP 지지체가연골과비슷한강도를가지고있었으며, 이를바탕으로 DBP 젤을함침시킨 PLGA/DBP 젤지지체를제작하였다. 연골세포를파종하여 in vivo 실험을진행하였고조직화정도를확인하기위해 H&E, Safranin-O, Alcian blue, Collagen type I 및 Collagen type II 염색을실시하였다. 그결과 DBP 를함침시킨 PLGA 지지체에서 GAG, Collagen type I 및 Collagen type II 의높은발현과조직화를보여연골조직으로대체할수있는가능성을확인하였다. Abstract: Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) has been most widely used due to its advantages such as good biodegradability, controllable rate of degradation and metabolizable degradation products. We manufactured composite scaffolds of PLGA scaffold penetrated DBP gel (PLGA/DBP gel) by a simple method, solvent casting/salt leaching prep of PLGA scaffolds and subsequent soaking in DBP gel. Chondrocytes were seeded on the PLGA/DBP gel. The mechanical strength of scaffold, histology (H&E, Safranin-O, Alcian-blue) and immunohistochemistry (collagen type I, collagen type II) were performed to elucidate in vitro and in vivo cartilage-specific extracellular matrices. It was better to keep the characteristic of chondrocytes in the PLGA/DBP gel scaffolds than that PLGA scaffolds. This study suggests that PLGA/DBP gel scaffold may serve as a potential cell delivery vehicle and a structural basis for in vivo tissue engineered cartilage. Keywords: PLGA, demineralized bone particle(dbp), gel, chondrocyte. 서 의학의발전으로고령인구가증가하고그로인한질병들도늘어나고있다. 대표적인노인성질환인퇴행성관절염은비만, 고된노동, 스포츠활동이나교통사고로인해발생한다. 1 연골은혈관, 신경, 림프관이없기때문에손상후세포를보충받을수없어재생이되지않는다. 손상이심한경우자가연골이식, 줄기세포이식, 자가연골세포배양이식및인공연골을 론 To whom correspondence should be addressed. E-mails: gskhang@jbnu.ac.kr; dlee@chonbuk.ac.kr 이식하는방법이있다. 2 조직공학은손상또는기능을상실한조직과장기를바이오기술을이용하여복원, 재생또는대체하여정상적인기능을수행할수있도록하는학문으로최종목표는조직및장기생성이다. 3 일반적으로결손조직의재생은세포와생체분자를지지체에파종하고이를충분히배양시켜신체에이식하는방식으로진행되며이때세포, 생체분자, 지지체사이의상호작용은성공적인조직재생의중요한요소로작용한다. 특히지지체는이식된세포가조직및장기로재생되는결정적환경을제공하는요소이다. 4,5 지지체는세포의부착과증식및고유의표현형을유지하고세포외기질을분비하여분화된 789

790 이윤미 심초록 이유정 김하늘 조선아 송정은 이동원 강길선 조직재생을촉진시켜야한다. 또한체내에이식된후에도주변조직과융화가잘되고일정기간이지나면안전하게흡수또는분해되어이물질을남기지않는우수한생체적합성을가져야한다. 6-9 다공성지지체는영양분과부산물이안팎의소통을통해세포의생존을유지하기위해충분한크기와수를유지해야한다. 수분함량과세포유착은세포의원래환경을만들기위해필요하고, 체내에이식된후에도주변조직과융화가잘되어야하며일정기간이지난후에안전하게흡수, 분해하여이물질로남지않아야한다. 10,11,16 생체적합성지지체로가장많이사용되고있는생분해성고분자는폴리락타이드 (PLA), 폴리글리콜라이드 (PGA) 및이들의공중합체인 PLGA 로서미국의식품의약안전청에서허가를받았으며, 분자량과화학적구성성분을조절함으로써분해기간을조절할수있는장점을가지고있다. 12,13 그러나 PLGA 는소수성인특징을가지고있어세포, 조직, 혈액친화성에있어좋지않은영향을미치고, 지지체내부의영양액의공급이원활하지않는경향이있다. 탈미네랄화골분 (DBP, demineralized bone particle) 은콜라겐, 잔류칼슘, 프로테오글리칸및유기물질의분해성분등으로구성되어있으며염증반응을감소시켜광범위하게임상에적용되는천연재료이다. DBP 는 1965 년 Urist 의연구에서시작되어사람의골내치주낭에 DBP 를사용하였고이식골부위에생겨난신생골에서조골세포가존재함을확인하였다. 14,15 DBP 는탈회를통해이식재내광화물이제거되어그내부에존재하는교원질이나성장인자, 특히골형태형성단백질 (BMP) 을노출시킴으로써골유도능을증가시키고연골분화를유도하는역할을한다고알려져왔다. 이러한특성때문에 DBP 는치과학, 척추, 뼈그리고악안면외과에서임상용으로광범위하게사용되는생체활성천연재료이다. 5,15,17,18 선행연구에서젤형태의 DBP 를함침시킨 PLGA 지지체 (PLGA/DBP gel) 를제조하여 in vitro 상에서연골재생효과를확인하고자 GAG, 콜라겐합성량, 세포독성평가, SEM 분석, RNA 분리및 RT-PCR 을수행하여 DBP 가함침된 PLGA 지지체가연골세포의성장에긍정적으로영향을미쳐안정되게연골을조직화할수있음을확인하였다. 19 따라서본연구에서는 PLGA 지지체, DBP 젤을함침시킨 PLGA/DBP 젤지지체, DBP 스폰지에연골세포를파종한후압축강도를측정하여연골적용에적합한강도를확인하였고, PLGA/DBP 젤지지체에서연골세포의형태학적변화와프로테오글리칸및콜라겐의발현정도를관찰하기위해 in vivo 상에서면역조직화학염색을통해조직공학적지지체로의응용에적합한지를확인하였다. 실 험 시약및재료. 생분해성고분자인 PLGA(lactic; glycolic 몰 비, 75/25, Resomer RG756S, Boehringer Ingelheim Pham, Germany) 는평균분자량이 90000 g/mole 인것을사용하였다. 또한염화나트륨은다공생성물질로사용하였으며 250~355 µm 크기를사용하였다. 메틸렌클로라이드등의모든화학약품과유기용매는 HPLC 등급을사용하였다. DBP 제조. DBP 는소의대퇴부를사용하여 Urist 방법으로제조하였다. 14,15 소의대퇴골과경골을채취하여원위골단부, 근위골단부, 골막과골수및연조직을깨끗이제거한후에탄올로세척하여잘게파쇄하였다. 분쇄된뼈를클로로포름과메탄올의혼합용매로지방을제거한후아세톤으로건조시켰다. 0.5 N HCl 용액으로탈미네랄화과정을거친후인산완충용액 (PBS, ph 7.3-7.4; Sigma Chem. Co., St. Louis, MO, USA) 으로 ph 7.4 로조절하여동결건조시켰다. DBP 는액체질소내에서동결분쇄 (SPEX 6700, USA) 하여약 180 µm 크기이하의분말형태로얻었다. 21 DBP 젤및 DBP 스폰지제조. 3% 아세트산과 0.1% 펩신 (Sigma) 을함유한용액에 20 wt% 의 DBP 을첨가시켜상온에서 48 시간동안교반시켜 DBP 젤을제조하였다. 위의방법에따라제조된 DBP 젤을 24 well 에분주한후냉장 4 시간, 냉동 4 시간보관후 -80 o C 에서 24 시간동안급랭시킨후동결건조하여 DBP 스폰지를제조하였다. 위의방법에따라제조된 DBP 스폰지를 1- 에틸 -(3,3- 다이메틸아미노프로필 ) 카보이미드하이드로클로라이드용액 (EDC, Sigma) 으로상온에서 24 시간동안경화시켰고, 3 차증류수로여러번세척하여 EDC 용액을완전히제거한후다시 -80 o C 에서 24 시간동안급랭시킨후동결건조하여 DBP 스폰지를제조하였다. PLGA 다공성지지체제조. 천연재료인 DBP 젤을생체활성이전혀없는 PLGA 지지체에새로운생체활성을부여하기위함과동시에생체조직공학적연골로응용하기위해용매염추출법으로제조하였다. PLGA 1 g 을메틸렌클로라이드 4mL 에용해한후 250~355 µm 크기가되도록다공생성물질인염화나트륨을분자체로걸러 9 g 첨가하고이들을균일하게혼합하였다. 용해된혼합물을직경 7mm 및두께 3mm 의실리콘몰드에넣은후잔류용매를제거하기위해프레스를이용하여상온에서 60 kgf/cm 2 의압력으로 24 시간동안시행한후 3 차증류수에서 48 시간용출을하였다. 24 시간동결을한후 8 mtorr, -55 o C 조건에서 24 시간동안동결건조하였다. 사용전까지냉동상태에서보관하였다. 이들의제조과정모식도를 Figure 1(a) 에나타내었다. DBP 젤을함침시킨 PLGA/DBP 젤지지체제조. 20 wt% DBP 젤을지지체당 1mL 씩 PLGA 지지체위에함침시킨후 4 o C 에서 24 시간동안보관하고 24 시간동안진공건조하여 DBP 젤이 PLGA 다공내로잘침투될수있도록유도하였다. 건조된지지체는 1- 에틸 -(3,3- 다이메틸아미노프로필 ) 카보이미드하이드로클로라이드용액 (EDC, Sigma) 으로상온에서 24 시간동안경화시켰고, 3 차증류수로여러번세척하여 EDC 폴리머, 제 36 권제 6 호, 2012 년

PLGA 다공성지지체에함침시킨 DBP 젤의연골재생효과 ; In Vivo 실험 791 Figure 1. Fabricating process of PLGA and PLGA/DBP gel scaffolds: (a) Solvent casting/salt leaching; (b) penetrating method. 용액을완전히제거하였다. -80 o C 에서 24 시간동안급랭시킨후동결건조하여 PLGA 다공안에가교된스폰지형태의 DBP 매트릭스가형성되도록하였다. 이들의제조과정모식도를 Figure 1(b) 에나타내었다. 17 연골세포분리및배양. 연골세포는 4 주령의뉴질랜드흰색토끼의무릎관절에서분리하여사용하였다. 무균상태에서관절을노출시켜연골조직만채취후인산완충용액 (PBS, ph 7.3-7.4; Sigma, USA) 으로여러번세척한후 0.25 wt% 의콜라게네이즈 A 형 (Roche, USA) 용액으로 12 시간동안 37 o C, 5% CO 2 하에서조직을분해하였다. 조직이담긴용액을 70 µm 의나이론메쉬로거른후원심분리하여 DMEM 과 F- 12 혼합배양액에 10% 우태혈청 (FBS, Gibco, USA), 1% 항생제 (100 units/ml 페니실린과 100 µg/ml 스트렙토마이신 ), 200 mm L- 글루타민 (Gibco, USA), 50 µg/ml 아세크로빈산 (Sigma, USA), 15 mm HEPES 완충용액 1 M(Gibco, USA) 이함유된배양액으로현탁액을만든후세포배양플라스크에분주하여 37 o C, 5% CO 2 조건에서배양하였다. 배양액은 3 일에한번씩교체해주었으며, 계대배양 1 회째것을사용하였다. 연골세포파종및지지체이식. 용매추출법으로제작한지지체를알코올로멸균하여 PBS 로 3 번세척하였다. 연골세포 는계대배양 1 회째에트립신 (Gibco, USA) 을이용하여수확하였으며지지체당 1 10 6 cell/ 지지체농도로파종하여상기의배양액으로정적배양하였다. 조직학적평가를위해서배양후 2 주째에지지체를 4 주령된 Balb-c 누드마우스피하에이식하고 1, 2, 3 및 6 주가지난후지지체를적출하여실험하였다. 압축강도측정. PLGA 지지체, DBP 를첨가한 PLGA/DBP 지지체, DBP 스폰지및 DBP 젤을함침시킨 PLGA/DBP 젤지지체의물리적인강도를확인하기위해만능물성측정기 (FTC, Sterling, Virginia, USA) 를이용하여압축강도를분석하였다. 지지체의설정값은표적거리 1.5 mm, 시험속도 1mm/min, 압축력 0.5 N 으로적용하였다. 조직면역학적평가. 지지체내부에존재하는세포의분포양상과세포의모폴로지를확인하기위하여핵을 Hematoxylin (YD Diagnostics, korea) 으로, 세포질을 Eosin(Showa, Japan) 으로염색을하였으며, 연골에서많이발현되는세포외기질중수분을함유하는글리코스아미노글라이칸 (sgag) 의발현정도를확인하기위하여 Safranin-O(Showa, Japan) 염색을실시하였고, 연골세포가분비하는산성점액물질을증명하기위해 Alcian blue(sigma, USA) 염색을실시하였다. 또한연골에서특이적으로발현되는제 I, II 형콜라겐 (Calbiochem EMD Bio Sciences Inc., La Jolla 1:90) AEC 방법으로발현여부를확인하였다. 누드마우스피하에이식하고 1, 2, 4 및 6 주에적출한지지체는 24 시간동안 10% 포르말린 (Sigma, USA) 으로고정하였다. 그후파라핀조직처리를하여블록을제조하고표본가공기 (Thermo, Electron Corporation, UK) 로조직슬라이드를얻었다. 이조직은각각염색후현미경 (Nikon, Japan) 으로관찰하였다. 결과및토론 압축강도측정. 연골의손상에서재생을유도할때지지체를사용하기위해서는일정한정도의강도를가지고있어야이식후에도하중을견딜수있어야한다. 따라서연골의재생에있어서이식후에얼마만큼의강도를지니는지확인하기위해압축강도를측정하여그결과를 Figure 2 에나타내었다. PLGA 지지체와스폰지는강도가너무높거나너무낮게나타남으로 PLGA/DBP 젤지지체가연골조직으로적절할것으로사료된다. 이는 DBP 젤을함침시킨후동결건조된 PLGA/DBP 젤지지체의 DBP 젤이스폰지형태로변하여 PLGA 지지체보다 PLGA/DBP 젤지지체의압축강도가낮은결과를보였을것이라고사료된다. 또한모든지지체세포가파종된것이강도가조금더낮은경향성으로무른연골과비슷한성향으로보이고있다. 6 주차에세포를파종하지않은 PLGA/DBP 젤지지체의압축강도가낮아졌지만연골세포를파종한 PLGA/DBP 젤지지체는 1 주에서 6 주까지일정한 Polymer(Korea), Vol. 36, No. 6, 2012

792 이윤미 심초록 이유정 김하늘 조선아 송정은 이동원 강길선 Figure 2. Compressive strength of PLGA and PLGA/DBP gel scaffolds, and DBP sponge seeded chondrocyte during cultivation period. Peak load analysis between at 1, 2, 4, and 6 weeks. 강도를나타내었다. 이는연골세포의세포외기질형성과관계가있다. 연골세포의세포외기질은콜라겐, sgag 를함유하고있으며, 외부의힘으로부터조직의일정한형태를유지시키기때문에이와같은결과가얻어졌을것이라고사료된다. 20,22 또한전연구의콜라겐과 sgag 합성량과부합한결과임을확인하였다. 이를바탕으로 PLGA 지지체에 DBP 젤을함침시킨지지체를제조하여 in vivo 상에서의세포외기질의함량을확인하기위해실험을진행하였다. 지지체적출. 연골세포를 PLGA 지지체와 PLGA/DBP 젤지지체에파종한지지체를일주일동안배양하였다. 배양한지지체를누드마우스피하에이식한후 1, 2, 4 및 6 주후에적출한사진을 Figure 3 에나타내었다. 6 주에가까울수록두 지지체의크기가작아짐을확인하였다. 이는조직의형태를유지하도록도와주는세포외기질분비가원활히일어나고분해율이적절하여 PLGA 지지체와 PLGA/DBP 젤지지체가 in vivo 상에서조직화되었을것이라고사료된다. 23,24 조직면역학적평가. 연골은콜라겐과프로테오글리칸, 단백질성분으로구성되어있다. 선행연구를통하여 in vitro 에서콜라겐과 sgag 함량을측정한결과 PLGA/DBP 젤지지체에서높은함량을확인하였다. 따라서본연구에서는이를증명하기위해 in vivo 환경에서지지체내의세포의형태와분포양상을확인하기위하여이식후 1, 2, 3 및 6 주에지지체를적출하여 H&E, Safanin-O, Alcian Blue, 제 I, II 형콜라겐염색을실시하였다. H&E 와 GAG 의생산됨을확인하기위한 Safanin-O 염색및연골세포가분비하는산성점액물질을증명하기위해 Alcian Blue 염색을실시하여 Figure 4 에나타내었다. H&E 염색에서 1 주에는두지지체가비슷한결과를보였으나 2 주부터염색범위가 PLGA 지지체보다는 PLGA/DBP 젤지지체에서넓게형성되었으며, 3 주및 6 주째에 PLGA 지지체보다 PLGA/ DBP 젤지지체에서연골세포의표지인라쿠나의형성이더욱선명하였고, 고르게분포한세포영역이눈에띠게증가하였다. Safranin-O 염색은 sgag 의양이많을수록오렌지색의발색이좋고범위가넓어진다. Safrinin-O 염색을통해 PLGA 지지체보다 PLGA/DBP 젤지지체에서 sgag 의함량이높은것으로보아지지체안에파종한연골세포가많은 sgag 를분비해세포외기질을형성하고그로인해지지체의조직화를유도했을것이라고사료된다. Alcian blue 염색을통해연골세포의성장을확인하였다. H&E 와 Safrinin-O 와같이시간이지남에따라발현정도가점차적으로증가함을보였고 PLGA/DBP 젤지지체에서더높은발현을확인하였다. 하지만, 6 주째에 PLGA 지지체는거의발현되지않은반면 PLGA/ DBP 젤지지체는그양상이훨씬더뚜렷하게나타났다. 이를통해 PLGA 지지체에서연골세포의초기성장은우수함 Figure 3. Gross morphology of scaffolds after implantation and post-harvest after (A) 1; (B) 2; (C) 4; (D) 6 weeks. 폴리머, 제 36 권제 6 호, 2012 년

PLGA 다공성지지체에함침시킨 DBP 젤의연골재생효과 ; In Vivo 실험 793 Figure 5. Photomicrographs from immunohistochemistry for Type I/II collagen sectioning of nude mice subskin harvest site. Figure 4. Histological evaluation of cartilage constructs: (a) H&E; (b) Safranin-O; (c) Alcian blue. 을보였지만장기간보았을때는 PLGA/DBP 젤지지체에서연골세포의성장이우수함을확인할수있었다. 25-27 연골의주요성분인콜라겐의발현을확인하기위하여면역조직화학염색을실시하였고이를 Figure 5 에나타내었다. 염색결과 PLGA 지지체에서는시간에따른변화가거의보이지않았지만 PLGA/DBP 젤지지체는각시점에서단독의 PLGA 지지체보다발현정도가뛰어나면서시간이지남에따라증가하는양상을보였다. 또한제 I 형과제 II 형콜라겐을비교했을때제 II 형콜라겐이진하고넓게분포되어있음을확인할수있었다. 이는연골세포의세포외기질에제 II 형콜라겐이많이함유하고있어이와같은결과를나타냈을것이라고사료된다. 28,29 이로써 PLGA/DBP 젤지지체에서연골세포의조직화가뛰어남을확인하였다. DBP 젤을함침한지지체에서더좋은결과를보인것은 DBP 에다량함유된뼈형성단백질이연골세 Polymer(Korea), Vol. 36, No. 6, 2012

794 이윤미 심초록 이유정 김하늘 조선아 송정은 이동원 강길선 포의부착과성장하기에좋은환경을제공했을것이라고사료된다. 결 본연구는 in vivo 환경에서 PLGA 지지체와 DBP 젤을함침시킨 PLGA 지지체의연골재생효과를확인하고자하였다. 압축강도를통해 DBP 젤을함침시킨 PLGA/DBP 젤지지체가많은세포외기질을분비하고있음을확인하였다. 생체내에서연골의세포외기질은외부의힘으로부터보호하는역할을하며, 조직공학적인지지체의역할의생체내에들어가서조직화가되어손상된조직을대신하는것이다. 지지체를누드마우스등피하에이식후적출한결과 PLGA 지지체와 DBP 젤을함침시킨 PLGA 지지체모두어느정도의형태를유지하면서조직화됨을확인하였다. 또한 in vivo 환경에서세포외기질분비를염색을통해확인한결과 PLGA 지지체보다 DBP 젤이함침된 PLGA 지지체에서제 I 형콜라겐과제 II 형콜라겐그리고 sgag 의발현이높음을염색을통해확인할수있었다. 본연구에서사용한연골세포는유리연골로제 I 형콜라겐보다는제 II 형콜라겐을더많이함유하고있다. 제 I, II 형콜라겐염색을통해제 II 형콜라겐의발현이더많음을확인하였다. 이를통해연골세포가지지체안에서형태를변형하지않고유지하고있음을확인할수있었다. 이로써 PLGA 지지체보다 DBP 가포함된 PLGA/DBP 젤지지체에서연골세포의조직화가우수하였다. 이는 DBP 가함유하고있는뼈형성단백질과같은뼈형성 / 연골형성사이토카인이연골형성에긍정적인영향을주었을것이라고사료된다. 또한 DBP 는다양한형태로응용이가능하기때문에뼈또는연골에관한조직공학적연구에적합할것이라고예상된다. 본연구를바탕으로세포를파종하지않은 PLGA/DBP 젤지지체를이식하여 DBP 젤과연골세포의연골형성효과를확인하는실험을진행중이며정량적평가를할예정이다. 감사의글 : 본연구는농림수산식품부 (112007-05-1-SB010), 보건복지가족부 (A040003) 및 WCU (R31-20029) 의연구지원에의하여이루어졌으므로이에감사드립니다. 론 참고문헌 1. J. K. Mouw, N. D. Casw, R. E. Guldberg, A. H. K. Plaas, and M. E. Levenston, Osteoarthr. Cartil., 13, 828 (2005). 2. C. Song, J. M. Kim, B. Y. Sung, Y. B. Kong, and K. H. Ra, J. Korean Orthop. Assoc., 44, 210 (2009). 3. S. Munirah, S. H. Kim, B. H. I. Ruszymah, and G. Khang, Eur. Cell. Mater., 15, 41 (2008). 4. J. W. Jang, C. W. Han, M. S. Kim, S. H. Cho, H. B. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 28, 382 (2004). 5. S. J. Yoon, S. H. Kim, H. J. Ha, Y. K. Ko, J. W. So, M. S. Kim, Y. I. Yang, G. Khang, J. M. Rhee, and H. B. Lee, Tissue Eng. Part A, 14, 539 (2008). 6. W. Xia, W. Liu, L. Cui, Y. Liu, W. Zhong, D. Liu, J. Wu, K. Chua, and Y. Cao, J. Biomater. Res. B, 71B, 373 (2004). 7. W. Linbo and D. Jiandong, Biomaterials, 25, 5821 (2004). 8. D. Rossella, C. Claudia, G. Ida, M. Tiziana, and C. Bice, Polym. Degrad. Stab., 95, 694 (2010). 9. Y. Kang, Y. S. Song, Y. E. Kim, S. C. Oh, J. E. Song, D. Lee, and G. Khang, Inter. J. Tissue Regen., 3, 21 (2012). 10. A. Atala, J. Endourol., 14, 49 (2008). 11. W. B. Tsai, C. H. Chen, J. F. Chen, and K. Y. Chang, J. Mater. Sci. Med., 17, 337 (2006). 12. O. J. Lee, J. M. Lee, H. J. Jin, and C. H. Park, Inter. J. Tissue Regen., 1, 68 (2010). 13. T. Yoshioka, N. Kawazoe, T. Tateishi, and G. Chen, Biomaterials, 29, 3438 (2008). 14. M. R. Urist, Science, 150, 893 (1965). 15. C. B. Huggins and M. R. Urist, Science, 167, 896 (1970). 16. S. H. Kim, K. S. Park, B. S. Choi, H. J. Ha, J. M. Rhee, M. S. Kim, Y. S. Yang, H. B. Lee, and G. Khang, Adv. Exp. Med. Biol., 585, 167 (2006). 17. Y. M. Lee, C. R. Shim, Y. J. Lee, J. E. Song, J. W. Bea, Y. L. Kim, D. Lee, and G. Khang, Inter. J. Tissue Regen., 3, 13 (2012). 18. H. N. Park, J. B. Lee, and I. K. Kwon, Inter. J. Tissue Regen., 1, 10 (2010). 19. W. Y. Ahn, H. L. Kim, J. E. Song, D. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 35, 499 (2011). 20. J. H. Lee, S. J. Park, H. J. Chun, and C. H. Kim, Inter. J. Tissue Regen., 1, 1 (2010). 21. S. K. Lee, H. K. Hong, S. J. Kim, Y. K. Kim, Y. S. Song, Y. Ha, D. Lee, and G. Khang, Polymer(Korea), 34, 398 (2010). 22. H. Lu, T. Hoshiba, N. Kawazoe, and G. Chen, Biomaterials, 32, 2489 (2011). 23. F. A. Maspero, K. Ruffieux, B. Muller, and E. Wintermantel, J. Biomed. Mater. Res., 26, 89 (2002). 24. B. Bolland, J. M. Kanczler, P. J. Ginty, S. M. Howdle, K. M. Shakesheff, D. G. Dunlop, and R. Coreffo, Biomaterials, 29, 3221 (2008). 25. W. L. Murphy, M. C. Peters, D. H. Kohn, and D. J. Mooney, Biomaterials, 21, 2251 (2000). 26. L. A. Solchaga, J. S. Temenoff, J. Gao, A. G. Mikos, A. I. Caplan, and V. M. Goldberg, Osteoarthr. Cartil., 13, 297 (2005). 27. T. H. Kim, J. H. Ko, S. J. Kim, and Y. H. Park, Inter. J. Tissue Regen., 2, 1 (2011). 28. B. M. C. Gutierrez, Z. Y. G. Carvajal, M. Jobbagy, F. Rubio, L. Yuste, F. Rojo, M. L. Ferrer, and F. Monte, Adv. Funct. Mater., 17, 3505 (2007). 29. S. Mizuno, C. Lycette, C. Quinto, and J. Glowacki, Mater. Res. Soc. Symp. Proc., 252, 133 (1992). 폴리머, 제 36 권제 6 호, 2012 년