별지제 11 호서식 과제번호 12162 식품안 003 용역연구개발과제최종보고서 단위과제명과제명주관연구기관주관연구책임자 국문 영문 식품안전관리선진화 식품중천연색소 ( 첨가물 ) 분석법확립연구 Study on the development of analytical method for natural colors of food additives 기관명소재지기관장 전남대학교광주광역시북구용봉로 77 김윤수 성명소속및부서전공 신태선영양식품학전공식품분석 총연구기간 2012 년 2 월 15 일 ~ 2012 년 11 월 30 일 ( 9.5 개월 ) 총연구개발비 70,000 천원 연구년차연구기간연구개발비 1 차년도 2012 년 2 월 15 일 ~ 2012 년 11 월 30 일 70,000 천원 2 차년도년월일 ~ 년월일천원 관계규정과모든지시사항을준수하면서이용역연구개발연구사업을성실히 수행하고자다음과같이용역연구개발과제최종보고서를제출합니다. 2011 년 11 월 30 일 주관연구책임자 : 신태선 ( 서명또는인 ) 주관연구기관장 : 전남대학교 ( 직인 ) 식품의약품안전청장또는식품의약품안전평가원장귀하 - 1 -
편집순서 1 : 겉표지 최종보고서 12161 식품안 003 식품중천연색소 ( 첨가물 ) 분석법확립연구 Study on the development of analytical method for natural colors of food additives 전남대학교 식품의약품안전평가원 - 2 -
주의내용 주 의 1. 이보고서는식품의약품안전청에서시행한용역연구개발과제의최종 보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시식품의약품안전청에서시 행한용역연구개발과제의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개 하여서는아니됩니다. 4. 이보고서내용을신문, 방송, 참고문헌, 세미나등에인용시에는 해당주관부서또는연구책임자와사전에상의하여주시기바랍 니다. - 3 -
편집순서 2 : 제출문 제출문 식품의약품안전청장 / 식품의약품안전평가원장귀하 이보고서를 식품중천연색소 ( 첨가물 ) 분석법확립연구 / 신태선 ) 과제의최종보고서로제 출합니다. 2012. 11. 30 주관연구기관명 : 전남대하교 주관연구책임자 : 신태선 제 1 세부과제명 : ( 제 1 세부연구기관 / 세부과제책임자 ) : 제 2 세부과제명 : ( 제 2 세부연구기관 / 세부과제책임자 ) : 제 3 세부과제명 : ( 제 3 세부연구기관 / 세부과제책임자 ) : - 4 -
간지 편집순서 3 목 차 Ⅰ. 총괄연구개발과제요약문 1. 국문요약문 3 2. 영문요약문 5 Ⅱ. 총괄연구개발과제연구결과제1장총괄연구개발과제의연구목적및필요성 7 제2장총괄연구개발과제의연구내용및방법 12 제3장총괄연구개발과제의최종결과및고찰 37 제4장총괄연구개발과제의연구성과 231 제5장총괄주요연구변경사항 232 제6장총괄참고문헌 233 제7장총괄첨부서류 244-1 -
간지 편집순서 4 : 총괄연구과제의연구결과 총괄연구개발과제연구결과 색지로작성하여쉽게구분될수있도록함 - 2 -
편집순서 5 : 요약문 ( 국문 ) Ⅰ. 총괄연구개발과제요약문 국문요약문 과제명 식품중천연색소 ( 첨가물 ) 분석법확립연구 주관연구기관전남대학교주관연구책임자신태선 연구기간 2012 년 2 월 15 일 ~2012 년 11 월 30 일연구비 ( 원 ) 70,000,000 저자 성명 소속 천연색소 ( 식품첨가물 ) 43종에대한용해도, 안전성등을검토하여이들을플라보노이드, 카로티노이드, 안트라퀴논, 기타색소등 4 계통으로분류하였다. 유통중인식품첨가물천연색소를 24품목을구입하고계통분류에따라박층크로마토그래피 (TLC) 와액체그로마토그래피 (HPLC) 에대한동시분석법을확립하였다. 플라보노이드계천연색소는적양배추색소, 베리류, 카카오색소, 포도과피색소, 자주색옥수수색소, 루틴색소, 자주색고구마색소, 적무색소등 8종이며, 파프리카색소, 안타토색소, 마리골드색소등 3품목천연색소는카로티노이드계통으로분하였다. 또한락색소, 코치닐색소, 홍화황색소는안트라퀴논계통으로, 치자황색소, 고량색소, 심황색소, 비트레드는기타천연색소로분류하고이들에대한다양한용매에대한용해도를측정하였다. 플라보노이드색소의동시분석을위한 TLC의분석조건으로 TLC 박막과전개용매는 C 18 과 acetonitrile:10% formic acid(1:1) 을사용하였으며 HPLC에대한 column과이동상은역상 column과 methanol을사용하였다. 카로티노이드색소의분리를위해서 TLC의조건으로 silica gel과 ethyl acetate: methanol: water(3:1:1) 을사용하였다. HPLC의 column과이동상조건으로 C 18 column과 acetone을사용하였다. 안트라퀴논색소에대한 TLC의조건으로 C 18 박막과 2-Butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 (1: 1: 1) 을사용하여최적조건을확립하였다. 이색소에대한 HPLC 조건으로 C 18 column과 acetonitrile을사용하여천연색소를분리하였다. 기타색소에대한 TLC 분석조건은안트라퀴논색소와같았으며 HPLC 조건은안트라퀴논과유사하였다. 이들의조건을이용하여천연색소를사용한시판식품 (54건) 을구입하여천연색소실태조사를하였다. 중심단어식품첨가물천연색소분석법박층크로마토그래피액체크로마토그래피 - 3 -
주관연구책임자의견 본연구는최근국내외 ( 일본, 미국, 유럽연합, JECFA 등 ) 식품중천연색소분석법자료및특성을조사한다. 천연색소식품첨가물에대해용해도, 안정성, 화학적구조등을고려하여계통별로분류하한다. 시판중인천연색소를구입하여계통에따라전처리방법을확립한다. 전처리방법 연구의범위 에대해재현성, 회수율, 검출한계등을조사하여최종전처리방법을확 립한다. 또한천연색소를계통별로 thin layer chromatography(tlc) 와 high performance liquid chromatography(hplc) 에대한동시분석법을 확립한다. 확립된 TLC 및 HPLC 분석법을적용하여국내유통가공식품 중천연색소의실태조사를행한다. 연구의한계점 인용시주의사항 주관부서연락처식품의약품안전평가원첨가물포장과 ( XXXXXXXXXXXXX ) - 4 -
편집순서 6 : 요약문 ( 영문 ) Summary Title of Project Study on the development of analytical method for natural colors of food additives Institute Chonnam University Project Leader Shin Tae-Sun Project Period 2012. 2.15~2012. 11.30 Project Budget 70,000,000 Name Institute Authors Natural color(food additives) 43 items were classified into four groups such as flavonoid, carotenoid, anthraquinone, miscellaneous. Twenty-four items of commercially available natural color additives were purchased and thin-layer chromatography (TLC) and liquid thereby chromatography (HPLC) for simultaneous determination method according to the classified four groups has been established. Flavonoid color include red cabbage color, berries color, cacao color, grape skin color, maize morado color, rutin, purple sweet potato color, and red radish color, and carotenoid colors were oleoresin paprika color, annatto extract, tagetes extract. Lac color, cochineal extract and carthamus yellow color belong to anthraquinone color. Miscellaneous color include gardenia yellow, kaoliang color, turmeric color, beet red. Sample pretreatment such as solid phase extraction for each groups has been established. The conditions of TLC and HPLC for the simultaneous analysis for four group colors were developed and established. TLC conditions for flavonoid were RP-C18 plate and a mixture of acetonitrile:10% formic acid(1:1) as a developing solvent. HPLC analysis for flavonoid were conducted with C18 reversed column and methanol containing 10% formic acid as a mobile phase. Foods used natural color food additives were purchased and analyzed by TLC and HPLC methods which were established by this study. Key Words Food addditives Natural color analytical method TLC HPLC - 5 -
Opinion of Principal Investigator Scope Recent data researched on natural color analytical method and characteristics by Japan, the United States, European Union, JECFA were collected. Food additives of natural color by considering the stability, solubility, chemical structure, etc. are classified. Commercially available natural colors were purchased and sample pretreatment method were developed according to characteristics of natural color. The reproducibility, recovery, limit of detection, limit of quantification were investigated. Thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC) for simultaneous assay of natural colors were established. The developed methods were tested with processed food used natural color. Limitation none Direction For Citation none Supervisory Office Food safety evaluation department Food Additives & Packaging Division ( XXXXXXXXXXXXX ) - 6 -
Ⅱ. 총괄연구개발과제연구결과 제1장총괄연구개발과제의목적및필요성제1절총괄연구개발과제의목표 1.1.1 연구필요성우리나라의급속한산업화와경제발전으로인하여경제수준이향상됨에따라생활양식및식습관의변화를초래하며이에따라식품에대한소비자들요구가다양화되었고또한점차식품의소비가서구화되었다. 이에부응하여식품제조업계는다양한가공식품을개발함으로서가공식품및인스턴트식품의수요는급격히증가하는추세이다. 특히소비자에의한식품의선택은식품의맛, 색깔, 향에의하여주로좌우되기때문에가공식품의보급과수요에비래하여식품첨가물의사용량이매년증가하는추세를보이고있다. 한편소비자들의기호가화학적합성첨가물을기피하고천연첨가물을선호하는경향이높아지고있으며특히천연첨가물의수요증가와더불어천연착색료의사용도증가고있는추세이다. 색소란색깔을나타낼수있는가시광선의파장영역인 350-750nm 범위에서파장을흡수를할수있는유기또는무기화합물을말한다. 색소의분류는용도, 사용목적등에따라다양하지만주요분류내용은원료에따는분류, 용해되는성질에따른분류, 허가여부에따는분류, 천연과합성에따른분류등으로구분할수있다. 천연색소는동물성색소와식물성색소, 바이오기술을이용한색소등이있다. 동식물계에있어서밀감, 인삼, 붉은연어, 난황등에함유된황색, 홍색, 등색을나타내는색소는 β-carotene, β-apo-carotenal 등같은물질로 carotenoid류에속하고 annatto에서얻어지는 bixin, norbixin, 심황에서얻어지는 curcumin, flavin계색소로 riboflavin, 치자과실과 saffran 꽃의암술머리건조물에서추출정제되는 crocin 등이있다. 이들중에서심황색소성분 curcumin과 riboflavin을제외한나머지는전부 carotenoid계이다. 식품산업발달에따른다양한종류의가공식품개발과더불어식품첨가물의소비도비례해서증가하고있는실정이다. 식품첨가물의과학적사후관리방안확립의일환으로식품의약품안전청에서는식품위행검사기관에서활용할수있는 식품중식품첨가물분석 에대한공정시험법의개발과확립을꾸준히진행하여왔다. 2003년 8월초판을발간을시작으로새로이확립된시험법이지속적으로추가되고있다. 천연색소첨가물은 2003년 8월락색소, 치자황색소, 코치닐추출색소, 카라멜색소, 홍국적색소분석법이처음으로수재되었고 2004년 12월에는안나토색소, 홍화적색소, 황화황색소분석법이추가로수록되었으며 2005년 12월에는고량색소, 루 - 7 -
틴, 사프란색소및심황색소가수록되어총 12종천연색소첨가물이 ( 분석법은 11개분석법 ) 식품중식품첨가물분석 에수록되어있다. 천연색소는합성착색료에비하여색의선명함이부족하고원료물질에특성에따른고유의맛과향을지니고있어식품의풍미에영향을주는것이단점이다. 그러나안정성과천연색소들이갖는생리기능성의장점도있기때문에천연색소의사용이급격히증가하는추세에있다. 그러나천연색소를위화 (adulteration) 의목적으로사용되는경우가있어천연색소의사회문제를야기시키고식품산업의혼란을초래할수있어이러한문제를미연에방지하기위해서는천연색소의사후품질관리와감시를용이하게할수있는천연색소분석법의효율성을높이는것이다. 현재식품첨가물공전에수재된천연색소는총 43품목있다. 이의성분구조나용해도에의해분류하면 flavonoid계, carotenoid계, anthraquinone계, betacyanin계, monasin계, iridoid배당체, curcuminoid계, melanin계와이들이외에스피룰리나, 김색소, 카라멜색소등이있다. Flavonoid계에는베리류색소,, 포도과즙색소, 포도과피색소, 적양배추색소, 자주색옥수수색소, 피칸너트색소, 카카오색소, 감색소, 고량색소, 타마린드색소, 무궁화색소, 시아너트색소, 자주색고구마색소, 자주색참마색소, 차즈기색소, 적무색소, 홍화적색소, 홍화황색소, 루틴, 양파색소, 백단향색소등 21품목이있으며 carotenoid계색소로파프리카추출색소, 안나토색소, 토마토색소, 치자황색소, 사프란색소, 마리골드색소, 알팔파추출색소, 파피아색소, 가재색소, 크릴색소등 10품목이있다. 또한 anthraquinone계의코치닐색소, 락색소, monasin계의홍국적색소, 홍국황색소, betacyanin계인비트레드, iridoid계인치자적색소, 차자청색소, curcuminoid계인심황색소, melanin계인오징어먹물색소가있다. 그외에스피룰리나, 김색소, 카라멜색소등이있는데이들은구조상유사한계통들을유사한화학적, 물리적성격을띰으로분류에따라분석법을확립할수있다. 따라서천연색소의계통에따라용해도, 물리적성격등물리화학적특성이유사한천연물은동일한조건으로 TLC나 HPLC로분석할수있다. 천연색소첨가물은식품에대해한계사용량이규정되어있지않아정량적으로분석법을확립할필요는없다. 그러나이들의천연색소에대한사후품질관리와감시를용이하기위해서는효율적으로정성할수있는분석법이시급히확립되어야할것이다. 본연구과제에서는천연색소첨가물의용해도, 안정성, 화학적특성에의하여천연색소를분류하며이를토대로색소추출, 전처리용매, 색소의흡광도등을고려하여 TLC나 HPLC로동시에분석할수있도록천연색소를분류한다. 분류된천연색소는계통별로 TLC와 HPLC로동일조건에서분리할수있는조건을확립하고자한다. 더불어확립된동시분석법을활용하여 - 8 -
시판중인가공식품중에천연색소의함량을분석하여천연색소의사용실태를조사하여야한다. 요약 소비자들의기호가화학적합성첨가물을기피하고천연첨가물을선호하는경향이높아지고있으며특히천연첨가물의수요증가와더불어천연착색료의사용도증가고있는추세이다. 천연색소첨가물은 2003년 8월락색소등 5 품목의분석법이처음으로수재되었고, 2004년 12월에 3품목, 2005년 12월에는 4품목의분석법수록되어총 12종천연색소첨가물이 ( 분석법은 11개분석법 ) 식품중식품첨가물분석 에수록되었다. 현재식품첨가물공전에수재된천연색소는총 43품목있다. 이의성분구조나용해도에의해분류하면 flavonoid계, carotenoid계, anthraquinone계, betacyanin계, monasin계, iridoid 배당체, curcuminoid계, melanin계와이들이외에스피룰리나, 김색소, 카라멜색소등이있다. 같은계통의천연색소는동일한방법으로전처리하여동일한조건의 TLC나 HPLC방법으로분리정성할수있는천연색소동시분석법이개발되어야한다. 따라서, 본연구를통하여천연색소에대한효율적선진분석법의확립과더불어국내유통되고있는가공식품중에천연색소의함량을분석하여천연색소의사용실태를조사하여야한다. 소비자들에게천연색소의안전성및신뢰성을유지하기위해서는천연색소의사후관리가능동적으로대처되어야하며이를위하여효율적인계통별천연색소동시분석법이연구및확립되어야한다. - 9 -
1.1.2 총괄연구개발과제의목표달성도 연구개발추진내용연구목표달성도 (%) 국내외식품중천연색소 ( 첨가물 ) 분석법자료및특성조사 1) 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 100 식품중천연색소 ( 첨가물 ) 계통별전처리법확립 - 천연색소표준품확보 - 용해도, 안정성을검토하여천연색소의계통별분류 - 천연색소의계통별 solid phase extraction (SPE) 전처리법확 100 100 100 립 식품중천연색소 ( 첨가물 ) 계통별 TLC 분석법확립 100 식품중천연색소 ( 첨가물 ) 계통별 TLC 분석법확립 100 국내유통식품중천연색소 ( 첨가물 ) 실태조사 ( 확립된식품중분석법을적용하여국내유통가공식품중천연 100 색소실태조사 ) - 연구과제제안서 (RFP) 내용과연구개발계획서의연구계획에따라추진목표치를 100% 도출하였음. - 천연색소식품첨가물을계통별로분류하고이들에대한전처리법, TLC 분석조건, HPLC 분석조건등을확립하여효율적으로식품중천연색소를정성적으로확인하는방법을마련하였음. - 10 -
1.1.3 총괄국내 외기술개발현황가. 국내연구동향 (1) Park, Y.H. 1996: RP-HPLC에의한 monascin 분리 (2) Park, Y.H., et al., 1997: monascin을 RP-HPLC 분리 (3) Lee T.S., et al., 2001: monascin과 ankaflavin을분리 정제후 RP-HPLC로분리 (4) Kim, H.Y., et al., 2002: 식품중의 curcumin를 TLC로정성 (5) Kim, H.Y., et al., 2002: 식품중의안나토색소를 TLC로정성 (6) Kim, H.-Y., et al., 1999: 식품중치자색소함유량조사 (7) Park Y.S., et al., 2001: crocetin, crocetin을 HPLC로분리 (8) Kim, Y.S., et al., 2008: TLC에의한 crocein 검색 나. 국제연구동향 (1) Keim, M.A., et al., 2006: Cacao 의 procyanidins 을 HPLC 를이용하여분리와정 제 (2) Natsume, M., et al., 2000; Cacao liquor, cocoa, chocolate 의 polyphenol 을순 상과역상 HPLC 를이용하여분리 (3) Cooper, K.A., 2007: Cocoa 의주요 polyphenol 을역상 UHPLC 로분리정제. (4) Hammerstone, J.F.., et al.,: HPLC-MS 에의한 cocoa 와 chocolate 에서 polyphenol 분리 (5) Valianou L., et al., 2009: Carminic acid 추출법및 HPLC 분석법 (6) Karapanagiotis I., et al., 2008: Carminic acid 을 HPLC 에의한분석 (7) Serrano A., et al., 2011: Carminic acid 을 HPLC-PDA 에의한분석 (8) Lech K., 2011: 추출법및 HPLC 에의한 carminic acid 분석법확립 (9) Tsuda, T., et al., 1994: Tamarind (Tamarindus indica L.) 의종자로부터항산화 물질분리 (10)Sudjaroen, Y., et al., 2005; Tamarind (Tamarindus indica L.) 의종자로부터 phenolic 항산화물질분리 (11)Marangoni, A, et al., 1988: Tamarindus indica 의종자에대한성분조성분석 (12)Bhattacharva, S., 1994: Tamarind (Tamarindus indica) kernel 로생산한상품의 특성조사 1.1.4 총괄연구개발과정에서수집한국외과학기술정보 가. 천연색소의분석응용 - C30 역상 column 에의한 carotenoid 동시분석 :Downey M.O Journal of Chromatography A, 1201, 43 47 (2008) - HPLC/ion trap MS 에의한 falvonoid 계색소분리 :Arapitsa, et al. Food Chemistry 109, 219 226 (2010) - Capillary electrophoresis 에의한색소분리 :Hauang, H.Y et al., Journal of Chromatography A, 995 29 36 (2003) 나. 천연색소추출 - 11 -
- Accelerated solvent extraction(ase) 의색소추출 :Breithaupt D.E Food Chemistry 86 449 456 (2011) - 12 -
제2장총괄연구개발과제의내용및방법제1절국내외식품중천연색소 ( 첨가물 ) 분석법자료및특성조사 최근제외국의천연색소분석법자료및특성조사는선진각국의홈페이지를주기적으로검색함으로서조사하였는데먼저제외국의분석법자료를검색한후한국식품첨가물공정해설서나식품중식품첨가물분석법과비교분석하여최근에자료를기초로하여천연색소특성과천연색소분석법을확립하는데자료로활용하였다. 2.1.1 한국식품첨가물공전에는식품첨가물의정의, 함량, 성상, 확인시험, 순도시험, 정량법 ( 색가 ), 사용기준의항목으로첨가물에대한상세한정보를제공하고있다. 더불어식품첨가물공정해설서 ( 배포 ) 판에는각식품첨가물에대하여제외국과성분규격비교표를작성하여제외국과우리나라의성분규격을한눈에비교할수있게개정되었으며또한식품첨가물분석법도제외국의시험법을비교하였다. 일본의식품첨가물규격사항은공정서 8판을사용하였으며미국은 Food Chemical Codex 6판을사용하였다. 본연구에서는식품첨가물공정해설서를통하여일본, 미국, 유럽, JECFA의천연색소첨가물에대한분석법이수록되어있는지조사하였다. 2.1.2 일본일본의식품첨가물공정서 8판은 2007년 9월 11일개정된것으로현재까지최신판이출판되지않았으며영문판은 7판으로보급되고있었다. 공정서는개정되지않았으나홈페이지를통하여식품첨가물의삭제, 변경규격, 분석법등을조사할수있다. 식품첨가물공정서에수록된천연색소첨가물에대한분석법을조사하였고, 최근분석법에대한동향을일본후생위생노동성의홈페이지 http://www.mhlw.go.jp/english/topics /foodsafety/foodadditives/index.html 에서검색하였다. 2.1.3 미국 (FCC, Food Chemical Codex) 미국의식품첨가물성분규정은 FCC에수록되어있고최신판이 2009년 6월에 7판이출판되었고마지막추가보증판이 (3rd supplement) 2010년 12월에출판되었다. FCC는식품첨가물에일반적연구정보와부록으로구성되어있으며식품첨가물의배열은알파벳순서로되어있다. 내용을살펴보면식품첨가물의화학식, 분자량, CAS 번호, 기능, 정의, 포장, 저장, 성분표시방법등에대하여수록하고있으며 INS번호, IR 스펙트럼, 화학구조식도추가적으로수록된식품첨가물도있어첨가물에많은정보를얻을수있는책자중에하나이다. FCC에우리나라의식품첨가물에등재되어있는천연색소 43 품목과일치하는품목을조사하였고최근첨가물에대한동향은 http://www.usp.org/fcc/ - 13 -
에서검색하였고수로 FCC 7 판을중심으로분석법및특성에대한정보를수집하였다. 2.1.4 JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) JECFA는식품첨가물에대한정보를 FCC와유사하게수록하고있다. 식품첨가물에대한동의어, 정의물성, 용도, 특징, 순도, 개별중금속에대한규격, 실험방법, 순도시험등정보를알려준다. FAO JECFA Monographs Vol.4에분석법시험절차, 실험용액등상세히수록되어있으며이수록되어있으며최근개정된개정판은등록되어있으며 JECFA의홈페이지에서 down받을수있다. JECFA에대한시험법개정등은 http://www.fao.org/ag/agn/jecfa-additives/index.html? show Synonyms =1에서다운로드받을수있어이들의정보를이용하여천연색소첨가물에대한분석법자료를수집하였다. 2.1.5 유럽 (EU) 유럽은 16개국회원국에의해구성된 EU 커뮤니티의식품안전기준규격을따르도록규정하고있으며식품첨가물에대한성분규정과위원회의결정사항은 web-site 에공지되어있다. 이 web-site: http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_ index_en.html 에서성분규정을 down load할수있게되어있다. 유럽의식품첨가물에대한규정은정의, 물질확인, 순도등을간단히규정하고있다. 유럽은다른국가와달리성분규정에대한시험방법이따로수록되어있지않고각규정에대한시험은 validation 절차만을수록하고있어분석자가직접실험에대한조건을완전히설정하여실험방법에대한 validation 을하고이에따라식품첨가물을분석해야한다. 또는각실험법에대한 method 를구입하여사용할수있다. 제 개정사항은 web-site 에실려있어항상제 개정사항현황을파악할수있으며추가적인자료는 down 받거나 web-site 를통하여구매할수있다. 본연구에서는공개된천연색소분석법을활용하여분석법을자료를수집하였다. 2.1.6 일반문헌조사천연색소분석및특성관련된논문, 연구보고서, 서적등의자료는본대학중앙도서관의국내외논문검색 DB를이용하였으며, 국회도서관, RISS4U, PMC Journal, National Digital Science Libray 등을통하여수집하였다. - 14 -
제2절식품중천연색소 ( 첨가물 ) 계통별전처리법확립 2.2.1 천연색소별용해도, 안정성등검토식품첨가물천연색소는화학적구조측면에서큰분류 flavonoid 계, carotenoid 계, anthraquinone 계, betacyanin 계, monasin 계, iridoid 배당체, curcuminoid 계, melanin계로분류할수있으며이들에속하지않은스피룰리나, 김색소, 캬라멜색소을기타색소로하여분류할수있다. flavonoid 계는베리류색소, 포도과즙색소, 포도과피색소, 적양배추색소, 자주색옥수수색소, 키칸너트색소, 카카오색소, 감색소, 고량색소, 타마린드색소, 무궁화색소, 시아너트색소, 자주색고구마색소ㅗ, 자주색참마색소, 차즈기색소, 적무색소, 홍화적색소, 홍화황색소, 루티색소, 양파색소, 백단향색소등 21 품목이며주로 anthocyanin 계색소이다.. Carotenoid 계색소는파프리카색소, 안나토색소, 토마토색소, 치자황색소, 사프란색소, 마리골드색소, 알팔파추출색소, 파피아색소, 가재색소, 크릴색소등 10품목이있다, anthraquinone 계는코치닐색소, 락색소, betacyanin 계는비트레드색소, monasin 계는홍국적색소, 홍국황색소, iridoid 배당체는치자적색소, 치자청색소, curcuminoid 계는심황색소, Melanin계는오징어먹물색소로분류할수있다. 이외에스피룰리나색소, 김색소, 카라멜색소등이있다. 이들에대한계통별용해도와안정성, ph에대한색소의변색등을표로정리하였다. 2.2.2 국내유통되는천연색소검색천연색소의표준품을구입하기위하여국내에유통중인색소를 2009년, 2010년, 2011년품목제조보고서를활용하여조사하였으며천연색소를사용하는식품품목명과품목수를조사하였다. 이들의통계를활용하여천연색소첨가물과국내유통식품중천연색소첨가물실태조사에필요한식품을선정하였다. 2.2.3 천연색소표준품구입품목제조보고서를참고하여 MSC, 에이원카프, 두비산업, 남영 F&C의생산 유통업체에서 24 품목천연색소를구입하여시료전처리법확립및 TLC, HPLC 분석법에사용하였다. 천연색소는파프리카추출색소, 치자황색소, 코치닐추출색소, 홍국적색소, 락색소, 치자청색소, 적양배추색소, 홍화황색소, 고량색소, 안나토색소, 심황색소, 자주색고구마색소, 베리류색소, 포도과피추출색소, 비트레드, 스피룰리나청색소, 카카오색소, 적무색소, 오징어먹물색소, 자주색옥수수색소, 마리골드색소, 치자적색소, 루틴을구입하였다. 2.2.4 전처리법확립 가. 일반시약및용매 - 15 -
본연구에사용한모든시약은특급시약을구입하여사용하였고, methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, hexane 추출용매는 HPLC급 (Burdic & Jackson, Ulsan, Korea, 또는 J.T. Baker, Mallinckrodt, Baker, Inc, Phillipsburg, N.J, USA) 을사용하였다. 증류수는 Milli-Q ultrapure Water purification system (Millipore Co., USA) 에의해 18.2 MΩ 수준으로정제된물을사용하였다. 나. Flavonoid계천연색소전처리천연색소전처리는계통별로분류하여 flavonoid 계, carotenoid 계, anthraquinone 계, 기타색소등으로나누어실시하였다. Flavonoid 계천연색소의최적전처리방법을확립하기위하여다음과같은다양한조건으로실험을하여보았다. 최종확립된전처리방법은결과및고찰에서기술하였다. (1) 시약및기구 1 Vacuum Manifold: Supelco Co. Bellefonte, PA, USA) 2 Solid phase extraction(spe) tube (Phenomenex, Torrance, CA, USA) - Sorbent(Reversed phase): Strata C18, Phenyl - Mass: 30mg, 60mg, 100mg, 200mg, 500mg, 1000mg, - Volume: 1mL, 3mL, 6mL, 12mL - Particle Size: 60μm - Pore size: 50Å 3 Solvent - Acetonitrile, methanol, ethyl acetate, ethanol - Trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid. (2) Flavonoid 천연색소시료용액추출 Flavonoid 계천연색소는 10mg을증류수, methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, hexane 등의 10mL 용매로녹여, 침전유무, 색의농도, 색깔의투명도등을비교하여가장잘녹는용매를색소추출용매로사용하였다. 용매추출및농축은자외선이완전히차단된곳에서행하며농축은 35 에서 20 mbar 이하에서행하여빠른속도로농축해야색소의파괴를최소화할수있다. 농축후다시추출물을용해할때에는최소한의양으로시료를녹이는것이회수율을높일수있으며증류수에잘녹을때에 methanol 보다물로녹이는것이회수율을높일수있다. Flavonoid 계색소로베리류색 - 16 -
소, 자주색고구마색소, 포도과피추출색소, 적양배추색소, 자주색옥수수색소, 적무색소, 카카오색소, 루틴, 홍화황색소, 고량색소등이있다. 1 고형식품 ( 캔디, 빵, 빙과류등 ) 시료 10g에 0.1% formic acid 50ml를넣어교반하여용해하였다. 이용액이진한경우, 1000 g 로 10분간원심분리하고여과하였다. 여과액을건고한후약 3mL 물또는 methanol 로용해하여 SPE 전처리시료로사용하였다. 떡과같이점도가높은식품은동결건조한후분말화하여사용한다. 2 혼합음료및유음료시료 10g에헥산 25ml를넣어추출하였다. 이조작을 3회반복하여지방을제거하고원심분리 (1000 g, 10분 ) 하여상층액수용액층을여과하였다. 여과액을건고한후 3mL 물또는 methanol 로용해하여 SPE 적용시료로사용하였다. 3 젤리시료 20g에 0.1% formic acid 50mL를더해 10분간 homogenizing 한다음 1000 g 로 10 분간원심분리하고여과하였다. 여과액을건고한후약 3mL 물또는 methanol 로용해하여 SPE 적용시료로사용하였다. 4 음료및액기스시료 10g을여과액을건고한후약 3mL 물또는 methanol 로용해하여 SPE 적용시료로사용하였다. 5 초콜릿시료 10g에 hexane 20mL 과 0.1% formic acid 10mL을가하고잘혼합한후, 원심분리 (1000 g, 10분 ) 하였다. 상등액 hexane 층을제거하고 (3회), 액상층을분리하여건고한후 3mL 물또는 methanol 로용해하여 SPE 적용시료로사용하였다. (3) Solid phase extraction(reversed phase packing) 에의한 Flavonoid 계천연색소전처리 1 Tube washing: 증류수, methanol, ethanol 2 Tube Conditioning: 증류수, methanol, ethanol 3 Sample adsorption: SPE 시료 sample 4 Washing tube: 증류수, methanol 5 Elution compounds: methanol, ethanol (4) 농축 농축은 35 에서 20 mbar 이하에서행하여빠른속도완전히건고하고약 1mL 로증류 수또는 methanol 로다시용해한후 0.22μm membrane filter 로여과하여 TLC 또는 - 17 -
HPLC 분석용시료로사용하였다. 다. Carotenoid 계천연색소전처리 Carotenoid계천연색소의최적전처리방법을확립하기위하여다음과같은다양한조건으로실험을하여보았다. 최종확립된전처리방법은결과및고찰에서기술하였다. (1) 시약및기구 1 Vacuum Manifold: Supelco Co. (Bellefonte, PA, USA) 2 Solid phase extraction(spe) tube (Phenomenex, Torrance, CA, USA) - Sorbent(normal phase): Si-1(Silica), CN, NH2 - Mass: 30mg, 60mg, 100mg, 200mg, 500mg, 1000mg, - Volume: 1mL, 3mL, 6mL, 12mL - Particle Size: 60μm - Pore size: 50Å 3 Solvent - Methanol, ethyl acetate, ethanol, acetone, hexane - 1% ammonium solution (2) Carotenoid 천연색소시료용액추출 Carotenoid 계천연색소는 10mg을증류수, methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, hexane 등의 10mL 용매로녹여, 침전유무, 색의농도, 색깔의투명도등을비교하여가장잘녹는용매를색소추출용매로사용하였다. 용매추출및농축은자외선이완전히차단된곳에서행하며농축은 35 에서 20 mbar 이하에서행하여빠른속도로농축해야색소의파괴를최소화할수있다. Carotenoid 계색소로파프리카색소, 안타토색소, 마리골드색소을사용하였다. 1 천연색소고형첨가물 1g 식품첨가물에 acetone (or ethanol) 10mL을가하고 10분간 sonication한후 1000 g 로에서 10분간원심분리하고, 상등액을분리하여건고한후 5mL ethyl acetate (or hexane) 에녹여 SPE 적용시료로사용하였다. 2 천연색소액상첨가물시료 10g을여과하고감압농축기로건고한후 5mL ethyl acetate (or hexane) 에녹여 SPE 적용시료로사용하였다. 3 고체식품시료 10g에 ethyl acetate 30mL, 10% HCl 3mL, 물 10mL을가하고, 10분간잘혼합한 - 18 -
다음 1000 g 로에서 10분간원심분리하였다. Ethyl acetate 층을분취하여여과하고건고한후약 5mL ethyl acetate (or hexane) 에녹여 SPE 적용시료로사용하였다. 4 음료및액상식품시료 10g에 ethyl acetate 30mL, 10% HCl 3mL을가하고, 5분간잘혼합한다음 1000 g 에서 10분간원심분리하였다. Ethyl acetate 층을분취하여여과하고건고한후 5mL ethyl acetate (or hexane) 에녹여 SPE 적용시료로사용하였다. (3) Solid phase extraction(normal phase packing) 에의한 Flavonoid 천연색소전처리 1 Tube washing: Ethyl acetate, hexane 2 Tube Conditioning: Hexane 3 Sample adsorption: SPE 시료 sample 적용 4 Washing tube: Hexane 5 Elution compounds: Methanol, ethyl acetate, 1% ammonium solution (4) 농축농축은 35 에서 20 mbar 이하에서행하여빠른속도완전히건고하고 1mL methanol 또는 acetone 으로다시용해한후 0.22μm membrane filter로여과하여 TLC 또는 HPLC 분석용시료로사용하였다. 라. Anthraquinone계천연색소전처리 Anthraquinone계천연색소의최적전처리방법을확립하기위하여 polyamide gel을흡착제로사용하면서다음과같은다양한조건으로실험을하여보았다. 최종확립된전처리방법은결과및고찰에서기술하였다. (1) 시약및기구 1 Vacuum Manifold: Supelco Co. Bellefonte, PA, USA) 2 Polyamide gel (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA) - Sorbent: Polyamide gel (C 6 H 11 NO)n - Mass: 2g - Tube volume: 30mL - Particle Size: 50-150μm 3 Solvent - 1.2% acetic acid in methanol, 50% methanol in water - 혼합용액 : 2% ammonia solution: ethanol(1:1) - 19 -
(2) Anthraquinone계천연색소시료용액추출 Anthraquinone계천연색소는 10mg을증류수, methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, hexane 등의 10mL 용매로녹여, 침전유무, 색의농도, 색깔의투명도등을비교하여가장잘녹는용매를색소추출용매로사용하였다. 용매추출및농축은자외선이완전히차단된곳에서행하며농축은 35 에서 20 mbar 이하에서행하여빠른속도로농축해야색소의파괴를최소화할수있다. Anthraquinone의천연색소로락색소, 코치닐색소를사용하였다. 1 고형식품 ( 캔디, 빵, 빙과류등 ) 시료 10g에 50% methanol 20ml, 10% 염산 5ml 및 Hexane 20ml를넣어, 10분간잘혼합한다음 1000 g 에서 10분간원심분리한후상층의 hexane을제거하고아래층의수용액층 (methanol+ 증류수 ) 혼합액을분리하였다. 다시 50% methanol 30mL을가하여잘혼합하고위와같이원심분리한후수용액층을모아 ph가 3-4로조정하고 polyamide gel에흡착시료로사용하였다. 2 유제품 ( 유음료등 ) 시료 10g에 50% methanol 20ml, 20% 염산 2ml 및 Hexane 20ml를넣어, 10분간잘혼합한다음 1000 g 에서 10분간원심분리한후상층의 hexane을제거하였다. 지방이많이함유하는식품은 hexane으로지방을추출하여제거하였다. 아래층의수용액층 (methanol+ 증류수 ) 혼합액을분리하였다. 다시증류수 10mL을가하여잘혼합하고위와같이원심분리한후물층만추출하여모은다. ph가 3-4로조정한다음, polyamide gel 에흡착시료로사용하였다. 3 젤리의경우잘게분쇄한시료 10g에 50% methanol 20ml, 10% 염산 5ml을가하고 10분간 sonicator 로용해한다음여과하였다. 여과액을 ph가 3-4로조정한다음, polyamide gel에흡착시료로사용하였다. 4 음료의경우시료 10g을여과하고여과액을 ph가 3-4로조정한다음, polyamide gel에흡착시료로사용하였다. (3) Solid phase extraction에의한 Favonoid 천연색소전처리 1 Sample washing: 증류수 2 Washing tube: 증류수, methanol, 3 Elution compounds: 혼합용액 : 2% ammonia solution: ethanol(1:1) - 20 -
(4) 농축 농축은 35 에서 20 mbar 이하에서행하여빠른속도완전히건고하고 50% methanol 1mL 로다시용해한후 0.22μm membrane filter 로여과하여 TLC 또 는 HPLC 분석용시료로사용하였다. 마. 기타천연색소전처리기타천연색소의최적전처리방법을확립하기위하여다음과같은다양한조건으로실험을하여보았다. 최종확립된전처리방법은결과및고찰에서기술하였다. (1) 시약및기구 1 Vacuum Manifold: Supelco Co. Bellefonte, PA, USA) 2 Solid phase extraction(spe) tube (Phenomenex, Torrance, CA, USA) - Sorbent(Reversed phase): Strata C18, Phenyl - Mass: 30mg, 60mg, 100mg, 200mg, 500mg, 1000mg, - Volume: 1mL, 3mL, 6mL, 12mL - Particle Size: 60μm - Pore size: 50Å 3 Solvent - Acetonitrile, methanol, ethyl acetate, ethanol - Trifluoroacetic acid, acetic acid, formic acid. (2) 기타천연색소시료용액추출기타천연색소는천연색소는 10mg을증류수, methanol, ethanol, acetone, acetonitrile, hexane 등의 10mL 용매로녹여, 침전유무, 색의농도, 색깔의투명도등을비교하여가장잘녹는용매를색소추출용매로사용하였다. 용매추출및농축은자외선이완전히차단된곳에서행하며농축은 35 에서 20 mbar 이하에서행하여빠른속도로농축해야색소의파괴를최소화할수있다. 기타천연색소로고량색소, 비트레드, 심황색소, 치자황색소을사용하였다. 1 천연색소및고형식품 ( 캔디, 빵, 빙과류등 ) 시료 10g에 10% 염산 5ml, 50% 메탄올 20ml를넣어 10분간 sonication한다음, 1000 g으로 10분간원심분리하였다. 50% methanol층을분취하였다. 다시 50% methanol 20mL을가하고위와같이원심분리하여 methanol층을모은다. 이용액을여과한후감압농축기로건고하고 50% methanol을사용하여약 5mL로용해하여 SPE 적용시료로사용하였다. - 21 -
2 액상식품 10g 을여과하고건고한후 50% methanol 을사용하여약 5mL 로희석하여 SPE 적용시료로사용하였다. (3) Solid phase extraction(reversed phase packing) 에의한기타천연색소전처리 1 Tube washing: 증류수, methanol, ethanol 2 Tube Conditioning: 증류수, methanol, ethanol 3 Sample adsorption: SPE 시료 sample 4 Washing tube: 증류수, methanol 5 Elution compounds: methanol, ethanol (4) 농축 농축은 35 에서 20 mbar 이하에서행하여빠른속도완전히건고하고약 1mL 로증류수또는 methanol 로다시용해한후 0.22μm membrane filter 로여과하 여 TLC 또는 HPLC 분석용시료로사용하였다. 제3절식품중천연색소 ( 첨가물 ) 계통별분석법확립실험내용및방법에서실험에사용했던다양한조건을열거하고최종적으로확립된천연색소분석법은연구결과및고찰에서서술하였다. 2.3.1 TLC를이용한천연색소계통별분석법가. Flavonoid계천연색소의 TLC 분석법 (1) Thin layer chromatography plate(tlc plate) 다음과같은 TLC plate를사용하여천연색소의분리를실험하여보았다. 1 Cellulose TLC (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA) 2 TLC Silica Gel 60 RP-18F254S (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA) (2) 전개용매조성다음은각 TLC plate에대하여실험하였던전개용매들이다. 1 Cellulose TLC 의전개용매조성 - n-butanol : water: acetic acid = 3: 2: 1 - Ethanol: methanol: water: acetic acid = 3: 2: 1: 0.5 - Acetone: ethyl acetate: formic acid in water = 1: 1: 2-22 -
2 TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S의전개용매조성 - Acetonitrile : 5% acetic acid in water = 1: 1 - Methanol: 10% formic acid in water = 2: 1 - Ethanol: 2% trifluoroacetic acid in water = 1: 1 - Acetonitrile: 10% formic acid in water = 1: 1 - Acetonitrile: 10% formic acid in water = 4: 6 나. Carotenoid계천연색소의 TLC 분석법다음과같은 TLC plate를사용하여천연색소의분리를실험하여보았다. 1 HPTLC Silica gel 60 (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) or TLC Silica gel 60 (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) 2 TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) 3 Cellulose TLC (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) (1) 전개용매조성다음은각 TLC plate에대하여실험하였던전개용매들이다. 1 HPTLC Silica gel 60 (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) - Butanol : methanol: water = 4: 2: 1 - Ethyl acetate: methanol: water = 3: 1: 1 - Ethyl acetate: methanol: acetone: water =3: 1: 1: 1 2 TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S의전개용매조성 - Acetonitrile : methanol: 0.5% formic acid in water = 3: 2: 1 - Butanol: ethanol: 10% Na 2 SO 4 = 2: 1: 2-2-Butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 = 1:1:1 - Butanol: n-propanol: ethyl acetate: water = 2 : 4 : 1: 3 3 Cellulose TLC 의전개용매조성 Butanol: acetic acid: water = 4: 0.1: 2 다. Anthraquinone계천연색소의 TLC 분석법 (1) Thin layer chromatography plate(tlc plate) 다음과같은 TLC plate를사용하여천연색소의분리를실험하여보았다. 1 Cellulose TLC (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA) 2 TLC Silica Gel 60 RP-18F254S (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA) - 23 -
(2) 전개용매조성다음은각 TLC plate에대하여실험하였던전개용매들이다. 1 Cellulose TLC 의전개용매조성 - n-butanol : water: acetic acid = 4: 2: 0.1 - Ethanol: methanol: water: acetic acid = 5: 2: 0.1 - Acetone: ethyl acetate: 5% formic acid in water = 1: 2: 1 2 TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S의전개용매조성 - Acetonitrile : 5% acetic acid in water = 5: 6 - Methanol: 5% formic acid in water = 5: 3 - Ethanol: 5% trifluoroacetic acid in water = 1: 1-2-Butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 = 1: 1: 1 라. 기타천연색소 TLC의분석법 (1) Thin layer chromatography plate(tlc plate) 다음과같은 TLC plate를사용하여천연색소의분리를실험하여보았다. 1 Cellulose TLC (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA) 2 TLC Silica gel 60 (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) 3 TLC Silica Gel 60 RP-18F254S (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA) (2) 전개용매조성다음은각 TLC plate에대하여실험하였던전개용매들이다. 1 Cellulose TLC 의전개용매조성 - n-butanol : water: acetic acid = 4: 2: 2 - Acetone: ethyl acetate: 5% formic acid in water = 2: 2: 1 2 TLC Silica gel 60 (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) - Ethyl acetate: methanol: water = 5 :5: 1 - Butanol : methanol: water = 4: 3: 1 3 TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S의전개용매조성 - Acetonitrile : acetic acid in water = 5: 6-2-Butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 = 1:1:1-24 -
2.3.2 HPLC를이용한천연색소계통별분석법가. HPLC에의한 flavonoid계천연색소분석 (1) 시약및 HPLC 실험에사용한이동상은 HPLC급 methanol과 formic acid은 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 사의제품을사용하였다. Shimadu HPLC system(shimadzu Co., Tokyo, Japan) 을사용하였으며이 system 은 Shimadzu LC-20AD pump, Shimadzu CTO-20AC oven, Shimadzu Sil-20AC auto-sampler, Shimadzu CBM-20A system controller, LC Workstation software 으로 구성되었다. 분석용 column 은 Luna C18(2) (Phenomenex, Torrance, CA. USA) 를사용하였다. (2) HPLC 분석법이동상의 gradient 조건은연구결과및고찰에기술되어있다. 1 Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm 2 Column 온도 : 35, 3 이동상이동상 A: 10% formic acid in Methanol 이동상 B: 10% formic acid in H 2 O 4 유속 : 0.34ml/min 5 주입량 : 1-10μL 6 검출기 : PDA(200nm-700nm) 나. HPLC에의한 carotenoid계천연색소분석 (1) 시약및 HPLC 실험에사용한이동상은 HPLC급 acetone과 formic acid은 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 사의제품을사용하였다. Shimadu HPLC system(shimadzu Co., Tokyo, Japan) 을사용하였으며이 system 은 Shimadzu LC-20AD pump, Shimadzu CTO-20AC oven, Shimadzu Sil-20AC auto-sampler, Shimadzu CBM-20A system controller, LC Workstation software 으로 구성되었다. 분석용 column 은 Luna C18(2) (Phenomenex, Torrance, CA. USA) 를사용하였다. (2) HPLC 분석법 이동상의조건은연구결과및고찰에서기술하였다. 1 Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) - 25 -
Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm 2 Column 온도 : 35, 3 이동상이동상 A: Acetone 이동상 B: 0.1% formic acid in H 2 O 4 유속 : 0.34ml/min 5 주입량 : 1-10μL 6 검출기 : PDA(200nm-700nm) 다. HPLC에의한 anthraquinone계천연색소분석 (1) 시약및 HPLC 실험에사용한이동상은 HPLC급 Acetonitrile과 formic acid은 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 사의제품을사용하였다. Shimadu HPLC system(shimadzu Co., Tokyo, Japan) 을사용하였으며이 system은 Shimadzu LC-20AD pump, Shimadzu CTO-20AC oven, Shimadzu Sil-20AC auto-sampler, Shimadzu CBM-20A system controller, LC Workstation software 으로 구성되었다. 분석용 column 은 Luna C18(2) (Phenomenex, Torrance, CA. USA) 를사용하였다. (2) HPLC 분석법이동상의조건은연구결과및고찰에서기술하였다. 1 Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm 2 Column 온도 : 35, 3 이동상 : 이동상 A: 10% formic acid in Acetonitrile 이동상 B: 10% formic acid in H 2 O 4 유속 : 0.34ml/min 5 주입량 : 1-10μL 6 검출기 : PDA(200nm-700nm) 라. HPLC에의한기타천연색소분석 (1) 시약및 HPLC 실험에사용한이동상은 HPLC급 Acetonitrile과 formic acid은 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 사의제품을사용하였다. Shimadu HPLC system(shimadzu - 26 -
Co., Tokyo, Japan) 을사용하였으며이 system 은 Shimadzu LC-20AD pump, Shimadzu CTO-20AC oven, Shimadzu Sil-20AC auto-sampler, Shimadzu CBM-20A system controller, LC Workstation software 으로 구성되었다. 분석용 column 은 Luna C18(2) (Phenomenex, Torrance, CA. USA) 를사용하였다. (2) HPLC 분석법이동상의조건은연구결과및고찰에서기술하였다. 1 Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm 2 Column 온도 : 35, 3 이동상이동상 A: 0.1% formic acid in Acetonitrile 이동상 B: 0.1% formic acid in H 2 O 4 유속 : 0.34ml/min 5 주입량 : 1-10μL 6 검출기 : PDA(200nm-700nm) 2.3.3 재현성, 회수율, 검출한계등검토가. 루틴의 validation (1) 시약및 HPLC 실험에사용한이동상은 HPLC급 methanol과 formic acid은 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 사의제품을사용하였다. Shimadu HPLC system(shimadzu Co., Tokyo, Japan) 을사용하였으며이 system 은 Shimadzu LC-20AD pump, Shimadzu CTO-20AC oven, Shimadzu Sil-20AC auto-sampler, Shimadzu CBM-20A system controller, LC Workstation software 으로 구성되었다. 분석용 column 은 Luna C18(2) (Phenomenex, Torrance, CA. USA) 를사용하였다. (2) HPLC 분석법이동상의조건은연구결과및고찰에서기술하였다. 1 Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm 2 Column 온도 : 35, 3 이동상 : Gradient program 이동상 A: 10% formic acid in Methanol - 27 -
이동상 B: 10% formic acid in H 2 O 4 유속 : 0.34ml/min 5 주입량 : 1-10μL 6 검출기 : PDA(200nm-700nm) Table 1. HPLC gradient program for lutin Time Ethanol Water 0.01 10 90 88 30 70 90 100 0 115 100 0 116 10 90 132 10 90 135 Stop (3) 표준용액제조루틴 (Wako co. Osaka, Japan) 제품을구입하여사용하였다. 루틴 (Rutin trihydrate, Fluka 84082) 표준품을정확히칭량하고메탄올에용해하여 2~50 μg/ml의농도로조제하여사용하였다. (4) 검량선의작성각농도로조제된루틴표준용액 2μl를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하여얻어진피크의면적으로부터검량선을작성하였다. (5) 정량시험용액 2μl를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입한다. 얻어진시험용액피크의머무름시간과루틴표준용액의머무름시간을비교해서정성분석을실시하고얻어진검량선과비교하여검체중루틴의함량을산출하였다. (6) 기기검증및방법검증루틴을 0, 2, 5, 10, 25, 50 µg/ml의농도로표준용액을제조하여 HPLC 분석결과나온 peak area를이용하여검출한계, 정량한계및상관계수 (R 2 ) 를산출하였다. 또한사탕, 식빵, 사이다에첨가하여 flavonoid계색소전처리방법으로전처리하는과정에서루틴의농도가 0, 10, 50, 100 µg/ml이되도록루틴표준용액을첨가하였다. 이때나온 HPLC peak area로부터루틴의함량을산출한후회수율및재현성을산출하였다. - 28 -
나. Bixin( 안나토색소의주성분 ) 의 validation (1) 시약및 HPLC 실험에사용한이동상은 HPLC급 Acetone과 formic acid은 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 사의제품을사용하였다. Shimadu HPLC system(shimadzu Co., Tokyo, Japan) 을사용하였으며이 system 은 Shimadzu LC-20AD pump, Shimadzu CTO-20AC oven, Shimadzu Sil-20AC auto-sampler, Shimadzu CBM-20A system controller, LC Workstation software 으로 구성되었다. 분석용 column 은 Luna C18(2) (Phenomenex, Torrance, CA. USA) 를사용하였다. (2) HPLC 분석법이동상의조건은연구결과및고찰에서기술하였다. 1 Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm 2 Column 온도 : 35, 3 이동상 : Gradient program 이동상 A: Acetone 이동상 B: 0.1% formic acid in H 2 O 4 유속 : 0.34ml/min 5 주입량 : 1-10μL 6 검출기 : PDA(200nm-700nm) Table 2. HPLC gradient program for bixin Time Acetone Water 0.01 35 65 1 55 45 32 64 36 34 85 15 88 96 4 90 100 0 115 100 0 116 35 65 132 35 65 140 Stop - 29 -
(3) 표준용액제조 Bixin(Wako Co. Osaka, Japan) 제품을구입하여사용하였다. Bixin의표준품은 norbixin과혼합되어있어 Preparative HPLC를이용하여 30mg을정제하였다. 정제된 Bixin을정확히칭량하고메탄올에용해하여 2~50 μg/ml의농도로조제하여사용하였다. (4) 검량선의작성각농도로조제된 bixin 표준용액 2μl를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하여얻어진피크의면적으로부터검량선을작성하였다. (5) 정량시험용액 2μl를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입한다. 얻어진시험용액피크의머무름시간과 bixin 표준용액의머무름시간을비교해서정성분석을실시하고얻어진검량선과비교하여검체중 bixin의함량을산출하였다. (6) 기기검증및방법검증 Bixin을 0, 2, 5, 10, 25, 50 µg/ml의농도로표준용액을제조하여 HPLC 분석결과나온 peak area를이용하여검출한계, 정량한계및상관계수 (R2) 를산출하였다. 또한사탕, 식빵, 사이다에첨가하여 carotenoid계색소전처리방법으로전처리하는과정에서 bixin의농도가 0, 10, 50, 100µg/mL이되도록 bixin 표준용액을첨가하였다. 이때나온 HPLC peak area로부터 bixin의함량을산출한후회수율및재현성을산출하였다. (7) Preparative HPLC에의한 Bixin 정제표준물질 bixin을 1000ppm 농도로 methanol에용해하고 Shimadzu Preparative HPLC를이용하여다음과같은조건으로순수정제분리하였다. 1 HPLC 구성 Pump: Shimadzu LC-6AD Detector: Photodiode array detector, Shimadzu SPD-M20A Degasser: Shimadzu DUG-20A3 Oven: Shimadzu CTO-20A Autosampler: Shimadzu SIL-20A Fraction collector: Shimadzu FRC-10A System controller: CBM-20A Software: Shimadzu LCsolution (ver.1.22sp) Valve: FCV-20AH2, FCV-20AH6-30 -
2 HPLC 분석조건 - Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna 5μ C18(2) 100A (21.2mm 250mm) - Column 온도 : 35, - 이동상 : Gradient program 이동상 A: 0.1% formic acid in methanol 이동상 B: 0.1% formic acid in H 2 O - 유속 : 7ml/min - 주입량 : 200μL - 검출기 : PDA(200nm-700nm) Table 3 Gradient program for preparative HPLC Time Methanol Water 0.01 86 14 42 87 13 43 100 0 56 100 0 57 86 14 70 Stop Fig. 1. Chromatogram of bixin for purification standard. 1: norbixin, 2: bixin - 31 -
다. Carminic acid( 코치닐색소의주성분 ) 의 validation (1) 시약및 HPLC 실험에사용한이동상은 HPLC급 Acetonitrile과 formic acid은 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 사의 제품을 사용하였다. Shimadu HPLC system(shimadzu Co., Tokyo, Japan) 을사용하였으며이 system은 Shimadzu LC-20AD pump, Shimadzu CTO-20AC oven, Shimadzu Sil-20AC auto-sampler, Shimadzu CBM-20A system controller, LC Workstation software으로 구성되었다. 분석용 column은 Luna C18(2) (Phenomenex, Torrance, CA. USA) 를사용하였다. (2) HPLC 분석법 이동상의조건은연구결과및고찰에서기술하였다. 1 Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm 2 Column 온도 : 35, 3 이동상 : Gradient program 이동상 A: 10% formic acid in acetonitrile 이동상 B: 10% formic acid in H 2 O 4 유속 : 0.34ml/min 5 주입량 : 1-10μL 6 검출기 : PDA(200nm-700nm) Table 4. HPLC gradient program for carminic acid Time Acetonitrile Water 0.01 98 2 88 80 20 90 0 100 115 0 100 116 98 2 132 98 2 135 Stop (3) 표준용액제조 실험에사용한 carminic acid 표준물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., U.S.A) 사 의제품을사용하였다. Carminic acid 표준품을정확히칭량하고메탄올에용해하여 - 32 -
2~60 μg/ml의농도로조제하여사용하였다. (4) 검량선의작성각농도로조제된 carminic acid 표준용액 2μl를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하여얻어진피크의면적으로부터검량선을작성하였다. (5) 정량시험용액 2μl를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입한다. 얻어진시험용액피크의머무름시간과 carminic acid 표준용액의머무름시간을비교해서정성분석을실시하고얻어진검량선과비교하여검체중 carminic의함량을산출하였다. (6) 기기검증및방법검증 Carminic acid을 0, 2, 5, 10, 30, 60 µg/ml의농도로표준용액을제조하여 HPLC 분석결과나온 peak area를이용하여검출한계, 정량한계및상관계수 (R2) 를산출하였다. 또한사탕, 식빵, 사이다에첨가하여 anthraquinone계색소전처리방법으로전처리하는과정에서 carminic acid의농도가 0, 10, 50, 100 µg/ml이되도록 carminic acid 표준용액을첨가하였다. 이때나온 HPLC peak area로부터 carminic acid의함량을산출한후회수율및재현성을산출하였다. 라. Curcumin( 심황의주성분 ) 의 validation (1) 시약및 HPLC 실험에사용한이동상은 HPLC급 Acetonitrile과 formic acid은 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 사의제품을사용하였다. Shimadu HPLC system(shimadzu Co., Tokyo, Japan) 을사용하였으며이 system은 Shimadzu LC-20AD pump, Shimadzu CTO-20AC oven, Shimadzu Sil-20AC auto-sampler, Shimadzu CBM-20A system controller, LC Workstation software으로구성되었다. 분석용 column은 Luna C18(2) (Phenomenex, Torrance, CA. USA) 를사용하였다. (2) HPLC 분석법이동상에대한조건은연구결과및고찰에서기술하였다. 1 Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm 2 Column 온도 : 35, 3 이동상 : Gradient program 이동상 A: 0.1% formic acid in acetonitrile 이동상 B: 0.1% formic acid in H 2 O 4 유속 : 0.34ml/min - 33 -
5 주입량 : 1-10μL 6 검출기 : PDA(200nm-700nm) Table 5. HPLC gradient program for curcumin Time Acetonitrile Water 0.01 98 2 88 50 50 90 0 100 115 0 100 116 98 2 132 98 2 135 Stop (3) 표준용액제조실험에사용한 curcumin 표준물질은 Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo., U.S.A) 사의제품을사용하였다. Curcumin 표준품을정확히칭량하고메탄올에용해하여 1~40 μ g/ml의농도로조제하여사용하였다. (4) 검량선의작성각농도로조제된 curcumin 표준용액 2μl를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입하여얻어진피크의면적으로부터검량선을작성하였다. (5) 정량시험용액 2μl를상기의조건에따라고속액체크로마토그래피에주입한다. 얻어진시험용액피크의머무름시간과 curcumin 표준용액의머무름시간을비교해서정성분석을실시하고얻어진검량선과비교하여검체중 curcumin의함량을산출하였다. (6) 기기검증및방법검증 Curcumin을 0, 1, 5, 10, 20, 40 µg/ml의농도로표준용액을제조하여 HPLC 분석결과나온 peak area를이용하여검출한계, 정량한계및상관계수 (R2) 를산출하였다. 또한사탕, 식빵, 사이다에첨가하여 anthraquinone계색소전처리방법으로전처리하는과정에서 curcumin의농도가 0, 10, 50, 100 µg/ml이되도록 curcumin 표준용액을첨가하였다. 이때나온 HPLC peak area로부터 curcumin의함량을산출한후회 - 34 -
수율및재현성을산출하였다. (7) Preparative HPLC 에의한 curcumin 정제 시판 curcumin 표준물질은표준물질 curcumin 외에도 bisdemethoxycurcumin 과 demethoxycurcumin을함유하고있어 preparative HPLC로정제하여사용하였다. 표준물질을 1000ppm 농도로 methanol에용해하고 Shimadzu Preparative HPLC를이용하여다음과같은조건으로순수정제분리하였다. 1 HPLC 구성 Pump: Shimadzu LC-6AD Detector: Photodiode array detector, Shimadzu SPD-M20A Degasser: Shimadzu DUG-20A3 Oven: Shimadzu CTO-20A Autosampler: Shimadzu SIL-20A Fraction collector: Shimadzu FRC-10A System controller: CBM-20A Software: Shimadzu LCsolution (ver.1.22sp) Valve: FCV-20AH2, FCV-20AH6 2 Preparative HPLC 분석조건 - Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna 5μ C18(2) 100A (21.2mm 250mm) - Column 온도 : 35, - 이동상 : Gradient program 이동상 A: 0.1% formic acid in acetonitrile 이동상 B: 0.1% formic acid in H 2 O - 유속 : 7ml/min - 주입량 : 200μL - 검출기 : PDA(200nm-700nm) - 35 -
Table 6. Gradient program for preparative HPLC Time Methanol Water 0.01 40 60 40 50 50 42 100 0 67 100 0 58 86 60 82 Stop mau 3000 2000 2 3 1000 0 1 0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 min Fig. 2. Chromatogram of mixture of curcumin for purification). 1: bixdemethoxycurcumin, 2: demethoxycurcumin, 3. curcumin Fig. 2 의 chromatogram 과같이 3 개의 peak 를모두분획하였다. 3 번 peak 가목적 성분인 curcumin 이다. 1000ppm 의농도시료를 500μL 을주입하여 100 회주입하 여 curcumin 을분획하여약 30mg 의 curcumin 을정제하였다. - 36 -
제 4 절국내유통식품중천연색소첨가물실태조사 2.4.1 천연색소를사용한국내유통식품선정천연색소를식품첨가물로사용한식품중확립된 TLC 및 HPLC 분석법활용하여실태조사를위하여 2009년부터 2011년품목제조보고서를활용하였다. 먼저품목제조보고서에서천연색소별로식품품목을분류하고분류한품목중에서많이사용한식품을각색소에서 3-5 품목을선정하여실태조사를하였다. 2.4.2 첨가물실태조사 구입한가공식품은천연색소의계통에따라최종적으로확립된박층크로마토그래피 (TLC) 와액 체크로마토그래피 (HPLC) 분석법을적용하여분석하였다. - 37 -
제 3 장총괄연구개발과제의최종결과및고찰 제 1 절국내외식품중천연색소 ( 첨가물 ) 분석법자료및특성 - 38 -
Table 7. General information and analytical trend of domestic and developed countries on Kaoliang color 4. 고량색소 (Kaoliang Colorant) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 제외국첨가물분석법 표준물질 시판표준품이가능하나 procyanidin 은순도가낮아정제후사용 TLC Silica gel, 정성법 (Prussian blue 법및 Vanillin 법 ) HPLC 색가 (500nm) 나라 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 5) RP-18, 280nm, 정량법및정성법 색가 (E, 10%, 1cm) = 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 흡광도 1000 검체의채취량 (g) 분석법 국내외분석논문 물리화학적특성 국내 1. 기능성, 물리적특성연구는있으나분리, 분석연구는탐색되지않음. 국외 외관 용해도 안전성 특성 1. Xu X., et al., 2007: Resin 을이용하여정제후 HPLC/MS 에의한분석 2. Fabre, S., et al., 2008: 음이온교환수지를이용항여정제후 HPLC 로정량 3. Gambuti, A., et al., 2009: FPLC 를이용하여정제후분석 4. Hurst, W.J., et al., 2009: UPLC 를이용하여 n2-n10 까지 polymer 를분석 5. Wu, L., et al., 2011: NP-FLD 를이용하여 P1-P10 을분석 암갈색의분말또는액체이다. 수용액은중 알칼리성에서적갈색 갈색을띤다. 물, 함수에탄올, 프로필렌글리콜및알칼리용액에용해되나, 유지에는용해되지않는다. 산성에서불용화하는경우가있으며, ph 4.0 부근에서색소응집이생긴다. 내광성, 내열성이우수하며단백질에대한염착성이좋다. 일반적으로액체제품은안정화를위해에탄올등을함유한다. 매우뛰어난염착성을이용해축육, 식물단백, 수산가공품등을착색하는것으로, 내부침투가없고또색이번지지않는다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 2) 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ 3) - 39 -
Table 8. General information and analytical trend of domestic and developed countries on lac color 13. 락색소 : Lac color 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 제외국첨가물분석법 표준물질 TLC HPLC 색가 (490nm) 나라 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 5) 시판표준품구입가능 RP-C18 TLC, 정성및정량 (Densitometry) 없음 색가 (E, 10%, 1cm) = 정량법없음 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 흡광도 1000 검체의채취량 (g) 분석법 국내 - 국내외분석논문 국외 외관 1. Wako Chemical Co, 2001: HPLC에의한 3개 Laccaic acid 분리 2. Karapanaglotis et al. 2008: HPLC에의하여유기산과 Lac color 혼합물분리 3. Karapanggiotis et al. 2006; 천연색소의혼합물을분리적등색의분말또는암적색의액체이다 용해도물에아주약간녹으며, 에탄올, 프로필렌글리콜에가용이다. 물리화학적특성 안전성 특성 수용액은산성에서등색 등적색, 중성에서적색, 알칼리성에서적자색을띤다. 묽은에탄올용액은적색을띠며열, 빛, 산화, 환원에안정하다. 또금속이온, 특히철이온과반응해흑변하고, 단백질과반응해암자색이된다. 색깔안정화제의용해에는열탕을사용한다. 색가가높은분말은물에녹기어렵기에, 알코올또는프로필렌글리콜을첨가한액체제제가있으며, 중성의단백질함유식품에대해명반과유기산을가해색조의안정화를꾀한분말제제도있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 40 -
Table 9. General information and analytical trend of domestic and developed countries on tagetes extract 22. 마리골드색소 (Tagetes Extract) 구조식 Lutein 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 TLC HPLC Lutein 시판표준품구입가능 없음 없음 식품첨가물공전정량법 색가 (444nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 1000 검체의채취량 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 5) 정량법없음첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨첨가물로수재, 444nm에서흡광분광광도계법으로분석 국내 - 국내외분석논문 국외 1. De las Rias, J. 1989: HPLC 에의한 Lutein 분리 2. Gau, W., et al., 1983: Tagetes extract 에서 HPLC 로 lutein 분리. 3. Gregory, G.K., et al, 1986: Tagetes extract 에서 HPLC 로 lutein 분리. 물리화학적특성 외관유지용액은황색을나타낸다. 용해도물, 프로필렌글리콜에는용해되지않고알코올, 유지에는용해된다. 안전성 특성 내열성, 내광성은비교적양호하나 150 이상의고온에서는불안정하다. ph 에의한색깔변화는거의없다. 유화제가유지에함유된식품에사용할경우유지에이행되는경우도있다. 냉암소에서밀봉하여보관. 이품목은유용성이기때문에유화제, 안정제를부용제로혼합한물분산형의유화액제제가있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 2) 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ 3) - 41 -
Table 10. General information and analytical trend of domestic and developed countries on berries color 25. 베리류색소 (Berries Color) 정의 주색소는안토시아닌 (anthocyanin). 베리류색소에는구스베리색소 (Gooseberry color), 듀베리색소 (European dewberry color), 라즈베리색소 (Raspberry color), 레드라즈베리색소 (American red raspberry color), 레드커런트색소 (Red currant color), 로우건베리색소 (Loganberry color), 멀베리색소 (Mulberry color), 블랙베리색소 (Blackberry color), 블랙커런트색소 (Black currant color), 허클베리색소 (Black huckleberry color), 블루베리색소 (Blueberry color), 새먼베리색소 (Salmonberry color), 스트로베리색소 (Strawberry color), 엘더베리색소 (Elder berry color), 우귀수카구라색소 (Uguisukagura color), 훠틀베리색소 (Whortleberry color), 카우베리색소 (Cowberry color), 크랜베리색소 (Cranberry color), 팀블베리색소 (Thimbleberry color) 가있다. 다만, 색가조정, 품질보존등을위하여희석제, 안정제및용제등을첨가할수있다. 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 TLC HPLC 주성분색소없음없음없음 식품첨가물공전정량법 색가 (520nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 1000 검체의채취량 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 정량법없음첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨 국내외분석논문 물리화학적특성 JECFA 5) 국외 외관 용해도 첨가물로수재않됨 1. Vitaglione P., et al., 2007: ESI-MS에의한 cyanidin-glucosides 분석 2. Jakokbek L., et al., 2009: DAD을이용하여 5% acetic acid in acetonitrile로 anthocyanins을분석 3. Ogawa K., et al., 2008: ESI-MS을이용하여 10% acetic acid in water와 acetonitrile을이용하여 anthocyanin분석 4. Kal W., et al., 2008: TFA(pH 1.35) 와 acetonitrile의이동상으로 DAD 검출기를사용하여 flavonoids를분석 5. Bores G., et al., 2010: DAD, ESI-MS를이용하여 1% acetic acid in water와 acetonitrile 이동상으로 flavonoid를분석황 적갈색의분말또는약체로약간특유의냄새가있다. 수용액은선명한황색을나타낸다. 물과알코올에용해되지만아세톤, 헥산등유기용매에용해되지않는다. 안전성산에안정하나알칼리에약하고특히광선과환원제에약하다. 특성 이품목은암적색의액체, 덩어리, 분말또는페이스트상의물질로서약간특유의냄새가있다 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 42 -
Table 11. General information and analytical trend of domestic and developed countries on beet red 30. 비트레드 (Beet Red) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 제외국첨가물분석법 국내외분석논문 물리화학적특성 베타닌 (Betanin) 표준물질 TLC HPLC 색가 (535nm) 나라 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 5) 국외 시판표준품구입불가 없음없음 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 1000 검체의채취량 분석법 첨가물로수재, 정성법및정량법없음. 색가측정 첨가물로수재않됨 첨가물로수재, ph 5 인용액에서 535nm 에서최대흡광 첨가물로수재, 530nm 에서분광광도법, TLC 법에의한정성 1. Herbach, K.M., et al., 2004: Red Beet 에서추출하여 HPLC 로 betanin 을분석 2. Czapski J., et al., 1990: Red beet juice 추출물에서 HPLC 에의한 betacyanin 과 batanin 분리 3. Kuiala t., et al., 2002: Beet root 에서 betalain 과 phenolic compound 를 HPLC 로동시분리. 4. Stintzing F.C., et al., 2004: 식물, 식품등에서 anthocyanin 과 betanin 을 HPLC 에의한분리. 5. Pszczola E.E., et al., 2003: Betanin 을 HPLC 을이용한분석 외관베타인계의베타닌을주성분으로하는적 자색색소이다. 용해도물에용해되며에탄올, 유지에는잘용해되지않는다. 안전성 특성 수용액은 ph에따른색조변화는그다지없지만, 열및빛에대해불안정하며특히산성에서매우불안정하여수분이많은식품과고온가열공정이있는식품에는적합하지않다. 그러나아스코르빈산등의산화방지제의첨가로어느정도개선가능한경우도있다. 중금속이온에의해퇴색이촉진된다. 제품은주로분말품인데, 냉암소보관을조건으로한액체제품및친유성 ( 親油性 ) 을첨가해유성식품에사용할수있도록한제품, 분말을기름에분산한타입의제품등이있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 43 -
Table 12. General information and analytical trend of domestic and developed countries on spirulina color 37. 스피룰리나청색소 (Spirulina Color) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 제외국첨가물분석법 국외분석논문 물리화학적특성 표준물질 TLC HPLC 색가 (618nm) 나라 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 5) 국외 Phycocyanin 시판표준품구입불가 없음 없음 색가 (E, 10%, 1cm) = 정량법없음 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 흡광도 1000 검체의채취량 분석법 1. Thengodkar, R.R.M., et al., 2010: cyanobacterium Spirulina platensis 에서추출한 phycocyanin 을 HPLC 로분리 2. Otsuki A., et al., 1994: cyanobacteria 에서추출한 phycocyanin 을형광검출기를이용하여 HPLC 로분석. 3. Swanson, R.V. 1992: NaPO 4 buffer 와 acetonitrile 을이용하여 phycocyanin 을분리 외관청색분말로약간특유한냄새가있다. 수용액은선명한청색을띤다. 용해도 안전성 특성 피코시아닌은냉수, 온수에쉽게용해하여투명한수용액을만들어주나, 알코올, 아세톤, 에테르등의유기용매에는용해되지않는다. 그리고단백질의변성에의해침전경우가있으므로에탄올과프로필렌글리콜을사용할때는 20% 이하의수용액에용해해야한다. 1 피코시아닌의내열성은약한편이다. 내열성을향상시키기위해서는설탕과혼합하여사용하면피코시아닌에결합되어있는단백질이상용되어단백질의변성을막아주므로내열성이향상된다. 2 피코시아닌은 ph 6 7에서안정하다. 그러나대다수의식품이가지고있는 ph가 3 4이기때문에침전되는경향이있다. 이를조정하기위해서는단백질의분해물과같이사용하면비교적안정된색소로이용할수있다. 단백질분해물로는중합도 800 1000의것이이상적이고, 증점제인아라비아검이양호하다. 3 피코시아닌의내광성은 ph에의해영향을받는다. 내광성은알칼리성일때가산성보다안정한편이다. 천연색소의단점인내광성은포장부분에서직사광선을피하도록할수밖에없다. 피코시아닌의물성은일반색소체와달리발색단에의한것이아니라결합되어있는단백질의성질에의존되어단백질이가지고있는성질과같다. 따라서품질안정화를위해구연산염과인산염을배합한분말제제와글리세린으로용해한액체제제가있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 44 -
Table 13. General information and analytical trend of domestic and developed countries on turmeric oleoresin 39. 심황색소 (Turmeric oleoresin) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 제외국첨가물분석법 국내외분석논문 표준물질 TLC HPLC 색가 (440nm) 나라 일본 2) 미국 3) 심황색소분말을 HPLC등으로 RP-HPLC 를이용하여적갈색물질분리 정제후사용 Silica gel 또는 RP-C18, 정성법 RP-HPLC 법으로정성법및정량법, 425nm 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 1000 검체의채취량 분석법 색가또는 TLC(isoamylalcohol:ethanol;water;ammonia=4:4:2:1) 정성법및정량법없음유럽연합 4) - JECFA 5) 국내 국외 TLC(3-methyl-1-butanol/ethanol/water/ammonia=4:4:2:1) 1. Kim, H.Y., et al., 2002: 식품중의 curcumin 를 TLC 로정성 1. Jadhav, B.-K., et al., 2006: Curcumin, Demethoxycurcumin, Bisdemethoxycurcumin 을 RP-HPLC 로분석 2. Zhang, J., et al., 2009: Curcuminoid 를 RP-HPLC 로분석 3. Schiborr, C., et al., 2010: HPLC 와형광검출기를사용하여 Curcumin 분석 4. Tsai, Y.-M., et al., 2011: 생물의 2 차대사물질 curumin 을 HPLC 로분석 외관황 암적갈색의분말, 덩어리, 페이스트또는액체. 특유의냄새가있다. 물리화학적특성 용해도 안전성 물에거의녹지않는다. 에탄올, 프로필렌글리콜에약간녹기어렵다. 유지에잘녹지않는다. 천연에들어있는쿠르쿠민의유도체에는물과열수에가용인것이있다. 쿠르쿠민은알칼리성용액에서는암적갈색을띠며산성에서는담황색을띤다. 철이온에의해변색하기쉬우나내환원성이좋다. 열에대해상당히안정하고카레요리등에서볼수있듯이색조변화가거의없다. 빛으로갈색화하기쉬워암소에보관하는것이중요하다. 특성단백질에대한염착성은좋고무착색부분으로색소가흘러들지않는다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 2) 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ 3) - 45 -
Table 14. General information and analytical trend of domestic and developed countries on annatto extract 43. 안나토색소 (Annatto extract) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 Norbixin과 bixin의시판표준품구입불가능, 분리정제필요. TLC RP-C18, 정성법 HPLC RP-C18, 495nm, 정성법및정량법 식품첨가물공전정량법 색가 (470nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 200 검체의채취량 (g) 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 일본식품중식품첨가물분석법에 HPLC 법등재 미국 3) 색가 (454nm, 1cm) = 유럽연합 4) 첨가물로수재않됨 흡광도시료농도 (g/l) JECFA 5) Column chromatography and Carr-Price reaction 적합, silica gel TLC 크로마토그래피법 국내 1. Kim, H.Y., et al., 2002: 식품중의안나토색소를 TLC 로정성 국내외분석논문 물리화학적특성 국외 외관 용해도 안전성 특성 1. Bareth A., et al., 2002: HPLC 에의한 Norbixin 과 bixin 분리 2. Noppe, H., et al., 2008; HPLC-PDA 에의한 Annatto 분리 3. Michael, S., 2009: Norbixin 과이성질체를 HPLC 로분리 4. Bouvier, F. 2003: HPLC 에의한 Bixin 분리, 표준물질정제 5. Alves R.W., et al.,: HPLC 에의한 Bixin 분리 카로티노이드계빅신및노르빅신을주성분으로하며소량의 crocetin 을함유하는황등색의색소로적갈색의액체, 페이스트또는분말로약간냄새가있다. 유지, 프로필렌글리콜, 클로로포름, 아세톤에녹으며에탄올에약간녹고, 물에는녹지않지만, 알칼리수용액에는잘녹는다. 산화, 환원에강하고일광, 열에는약하다. 염착력은매우강하나값이매우비싸기때문에일반화되지못하고있다. 이색소는빅신을유지또는모노글리세리드로추출한유성형, 물또는프로필렌글리콜로미립자로분산시키든지가수분해해얻어지는노르빅신을주성분으로한수분산형이있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 46 -
Table 15. General information and analytical trend of domestic and developed countries on red cabbage color 정의 식품중식품첨가물분석법 1) 50. 적양배추색소 (Red Cabbage Color) 이품목은양배추 (Brassica oleracea Linné) 의잎을약산성수용액으로추출 하여얻어진물질로 anthocyanin 계통의색소이며시아니딘아실글리코시드 (cyanidin acylglycoside) 를주성분으로하는복합물질로이루어져있다. 다만, 색가조정, 품질보존등을위하여희석제, 안정제및용제등을첨가 할수있다. 표준물질 TLC HPLC 주성분또는주요성분이정해지지않았음 없음 없음 식품첨가물공전정량법 색가 (536nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 200 검체의채취량 (g) 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨 국외분석논문 JECFA 5) 국외 첨가물로수재않됨 1. Arapitsas P., et al., 2008: LC-MS 와 DAD 를이용하여 red cabbage 에서추출한 anthocyanin 을분리 2. Charron CS., et al., 2007; Red cabbage 에서추출한 anthocyanin 을 HPLC 로분석 3. Hagiwara, A., et al., 2002: 고구마색소와양배추색소을추출하여 HPLC 로분리. 4. McMougall GJ., et al. 2007: 적양배추에서추출한색소를 HPLC 로분리 5. Panagiotis A., et al.,: 적양배추에서추출한 anthocyanin 을 DAD 검출기를사용한 HPLC 에서분리 외관적자 암자색의액체또는분말로약간냄새가있다. 용해도물, 함수에탄올, 프로필렌글리콜에용해되고유지에용해되지않는다. 물리화학적특성 안전성 내열성, 내광성은비교적뛰어나며품질안정화를위해구연산, 에탄올등을배합한제제가있다. 수용액은 ph 에따라변색하며산성에서보라빛의적색, 중성에서자 자청색, 알카리성에서암녹색이된다. 단백질에의해암자색으로변색하며금속이온에의해서도변색한다. 염착성은그다지강하지않지만, 내염성은비교적양호하다. 특성다른안토시아닌계색소와비교하면푸른빛이강하며노란빛이적다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 47 -
Table 16. General information and analytical trend of domestic and developed countries on gardenia red 56. 치자적색소 (Gardenia Red) 이품목은치자나무 (Gardenia augusta Merrill 또는 Gardenia jasminoides Ellis) 의과실추출액에함유된 Iridoid 배당체의에스테르가수분해물과단백 정의 질분해물의혼합물에 β-glucosidase 를첨가하여얻어지는색소이다. 다만, 색가조정, 품질보존등을위하여희석제, 안정제및용제등을첨가할수 있다. 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 TLC HPLC 주성분이정해지지않았음 없음 없음 식품첨가물공전정량법 색가 (535nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 1,000 검체의채취량 (g) 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨 JECFA 5) 첨가물로수재않됨 국외분석논문 국외 1. Oshima, T., et al., 1988: Gardenia jasminoidse 에서추출한추출물을를 HPLC 를이용하여 geniposide, gardenoside, geniposidic acid, genipin-1-gentiobioside 등을분리함. 2. Tsai, T.R., et al., 2002: Gardenia jasminoide 에서추출한색소를 HPLC 로분석 3. Moritome, N., et al., 1999: 치자로부터추출한청색소를 HPLC 에의한분리 외관암적자색의분말또는액체이다. 용해도물에가용이며에탄올, 플로필렌글리콜, 유지에불용이다. 물리화학적특성 안전성 특성 ph 에따른색조변화는적다. 내열성, 내광성이양호하다. 단백질에대한염착성은양호하다. L- 아스코르빈산의병용으로내열성, 내광성이향상된다. ph 3.5 이하에서침전하는것이있다. 일반적으로액체제제는안정화부제 ( 副劑 ) 로서에탄올등을함유한다. 수용액은적자색이며파장 530 540 nm부근에서최대흡수부를가진다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 48 -
Table 17. General information and analytical trend of domestic and developed countries on gardenia blue 57. 치자청색소 (Gardenia Blue) 이품목은치자나무 (Gardenia augusta Merrill 또는 Gardenia jasminoides 정의 Ellis) 의과실추출액에함유된 Iridoid 배당체와단백질분해물의혼합물에 β -Glucosidase 를첨가하여얻어지는색소이다. 다만, 색가조정, 품질보존등 을위하여희석제, 안정제및용제등을첨가할수있다. 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 TLC HPLC 주성분이정해지지않았음 없음 없음 식품첨가물공전정량법 색가 (595nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 1,000 검체의채취량 (g) 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨 JECFA 5) 첨가물로수재않됨 국외분석논문 국외 1. Touyama, R., et al., 1994: Genipin 이생성하는청색색소를 HPLC 로분리 2. Chen, L., et al., 2001;Gardenia jasminoides 에서추출한 β -glucosidase-dependent green 색소를 HPLC 로분리 3. Touyama, R., et al., 1994: Genipin 이생성하는청색색소를 HPLC 로분리 4. Park, J.E., et al., 2002: Gardenia jasminoides 에서추출한수용성청색색소를 HPLC 로분리 외관암청남색의액체로페이스트상혹은분말이다. 용해도 물에용해되며에탄올, 유지에용해되지않는다. 그러나 ph 4 이하에서침전하는것, ph 1.5 까지견디는것이있다. 물리화학적특성 안전성 특성 내광, 내열성이좋고안정성도모든천연색소중뛰어난편이며염착성도좋다. 그러나색조가약간어둡기때문에색소의정제는물론제 1 급아미노기화합물의선택등에주의하여야한다. 일반적으로액체제제는안정화를위해에탄올등을부제로서함유한다. 수용액은청색을띠며파장 590 595 nm부근에서극대흡수부를갖는다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 49 -
Table 18. General information and analytical trend of domestic and developed countries on gardenia yellow 58. 치자황색소 (Gardenia yellow) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 TLC HPLC 색소성분 Crocetin, 비색소성분 Geniposide 시판표준품구입불가 없음 RP-C18, 435nm( 색소 ), 240nm( 비색소 ), 정성법및정량법 식품첨가물공전정량법 색가 (440nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 1000 검체의채취량 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 정량법없음첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨 JECFA 5) 첨가물로수재않됨 국내외분석논문 국내 국외 외관 1. Kim, H.-Y., et al., 1999: 식품중치자색소함유량조사 2. Park Y.S., et al., 2001: crocetin, crocetin 을 HPLC 로분리 3. Kim, Y.S., et al., 2008: TLC 에의한 crocein 검색 1. Hori, H., et al., 1988: Crocetin dimer 과 crocin dimer 을 HPLC 로동시분리. 2. Cormier, F., et al., 1995: HPLC 에의한 Crocetin 분리 3. Rong, Z., et al., 2009: HPLC 로 Crocetin 과 crocin 을동시분리. 4. Chryssanthi, D., et al., 2011: SPE 에의한전처리 HPLC 에의한분리. 5. Anastasaki, E., et al., 2010: HPLC 와 Raman 을이용한분석 황 적갈색의분말또는약체로약간특유의냄새가있다. 수용액은선명한황색을나타낸다. 물리화학적특성 용해도물, 함수에탄올에약간녹기쉽고유지류에는거의녹지않는다. 안전성 알칼리성에서는빛, 열모두안정하나, 산성에서는빛, 열모두불안정하다. L- 아스코르빈산등의산화방지제를병용하면산성에서의안정성이개선된다. 단백질에대한염착성은비교적양호하다. 공기산화에따라색가가저하되기에 L-아스코르빈산과인산염등을배합한제제가있다. 에탄올, 액당, 프로필렌글리콜을사용한액체제제도있다. 특성효소 (β-글로코시다제) 에의해녹변하는 iridoid 배당체를제거한정제품도있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 2) 일본식품공정서 8판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 50 -
Table 19. General information and analytical trend of domestic and developed countries on cacao color 64. 카카오색소 (Cacao Color) 정의 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 제외국첨가물분석법 이품목은카카오 (Theobroma cacao Linné) 의종자 ( 카카오콩 ) 을발효 ( 醱 酵 ), 배소 ( 焙燒 ) 시킨다음물로추출하여얻어진색소로서안토시아닌 (anthocyanin) 의중합물을주성분으로하는것이다. 다만, 색가조정, 품질보 존등을위하여희석제, 안정제및용제등을첨가할수있다. 표준물질 TLC HPLC 색가 (520nm) 나라 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 주성분이정해지지않았음 없음 없음 색가 (E, 10%, 1cm) = 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 흡광도 1,000 검체의채취량 (g) 분석법 국외분석논문 JECFA 5) 국외 첨가물로수재않됨 1.Keim, M.A., et al., 2006: Cacao 의 procyanidins 을 HPLC 를이용하여분리와정제 2. Natsume, M., et al., 2002; Cacao liquor, cocoa, chocolate 의 polyphenol 을순상과역상 HPLC 를이용하여분리 3. Cooper, K.A., 2007: Cocoa 의주요 polyphenol 을역상 UHPLC 로분리정제. 4. Stafford, H.A., et al.. 1980: HPLC 에의한 Cocoa 의 polyphenol 분리 5. Hammerstone, J.F.., et al.,: HPLC-MS 에의한 cocoa 와 chocolate 에서 polyphenol 분리 외관암적갈색의액체, 페이스트상혹은분말이다. 용해도물, 함수에탄올에용해되고유지에용해되지않는다. 물리화학적특성 안전성 특성 내열, 내광성우수하고, ph 에의한색깔변화는거의없으나산성에서약간노란빛이증가하고 ph 3 이하에서불용이된다. 알카리성에서붉은기가증가한다. 내산성은좋으나내환원성은떨어진다. 단백질이나전분에대한염착성이좋고과자에사용하더라도변색 퇴색하지않는견고한색소이다. 특히금속이온과의결합이강하여진한검은적갈색 ( 초콜릿색 ) 으로부터회색을띤적갈색이될때까지레이크 (Lake) 를형성하여불용화성색소가된다. 금속이온과의반응성은 Fe++>Cu++>Al+++>Mg++>Zn++>Pb++ >Sn++ 이다. 가시부흡수곡선은단파장측에서장파장측으로완만하게저하한다. 일반적으로액체제품은안정화부제로서에탄올등을함유한다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 51 -
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Table 20. General information and analytical trend of domestic and developed countries on cochineal extract 67. 코치닐추출색소 (Cochineal extract) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 제외국첨가물분석법 표준물질 TLC HPLC 색가 (495nm) 나라 시판 Carminic acid 표준품구입가능 RP-C18, 정성법 RP-C18, 495nm, 정성법및정량법 함량 (%)= 15 흡광도 100 검체채취량 (mg) 0.262 분석법 일본 2) 이품목의색가 (E10%, 1cm) 는 80 이상으로서표시량의 95 ~ 115% 를함유한다 (490-497nm) 미국 3) 유럽연합 4) - 첨가물로수재않됨 JECFA 5) 함량 (%)= 100 흡광도 100 검체채취량 (mg) 1.39 국내외분석논문 국외 1. Valianou L., et al., 2009: Carminic acid 추출법및 HPLC 분석법 2. Karapanagiotis I., et al., 2008: Carminic acid을 HPLC에의한분석 3. Serrano A., et al., 2011: Carminic acid을 HPLC-PDA 에의한분석 4. Lech K., 2011: 추출법및 HPLC 에의한 carminic acid 분석법확립 물리화학적특성 외관적 암갈색의분말또는액체로, 약간특유의냄새가있다. 용해도물에녹기쉽고, 에탄올에약간녹는다. 유지류에거의녹지않는다. 안전성 열, 빛에안정하고특히산성영역에서강하다. 색소는 ph에따라등색 ( 산성 ), 등색-적색 ( 중성 ), 적자색-자색 ( 알칼리성 ) 을나타낸다. 단백질에염착되어적자색으로변하는데색조안정제로서명반, L-주석산나트륨등의병용이필요하며, 이들을사용한분말제제가일반적으로널리사용되고있다. 미량의철이온에의해자흑색으로변색하거나또중성부근에서 Ca 2+, Al 3+, 그외금속이온에의해불용성염을생성하기쉬운데, 중합인산염등의금속봉쇄제의병용으로방지할수있다. 천연색소중에서가장훌륭한색소에속하며연지벌레 (coccid) 의몸체로부터 특성뜨거운물로추출한것인데 anthraquinone 의일반적인이름이 carmine이다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 3) 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 53 -
Table 21. General information and analytical trend of domestic and developed countries on tamarind color 73. 타마린드색소 (Tamarind Color) 이품목은콩과타마린드 (Tamarindus indica L.) 의종자를배소 ( 焙燒 ) 시킨 정의 다음물로추출하여얻어지는색소로서주색소는플라보노이드이다. 다만, 색가조정, 품질보존등을위하여희석제, 안정제및용제등을첨가할수 식품중식품첨가물분석법 1) 있다. 표준물질 TLC HPLC 주성분이정해지지않았음 없음 없음 식품첨가물공전정량법 색가 (500nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 10 검체의채취량 (g) 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨 JECFA 5) 첨가물로수재않됨 국내외분석논문 물리화학적특성 국외외관용해도안전성특성 1. Tsuda, T., et al., 1994: Tamarind (Tamarindus indica L.) 의종자로부터항산화물질분리 2. Sudjaroen, Y., et al., 2005; Tamarind (Tamarindus indica L.) 의종자로부터 phenolic 항산화물질분리 3. Marangoni, A, et al., 1988: Tamarindus indica 의종자에대한성분조성분석 4. Bhattacharva, S., 1994: Tamarind (Tamarindus indica) kernel 로생산한상품의특성조사 적갈색 암갈색의액체, 덩어리, 분말또는페이스트상으로약간특이한냄새가있다. 물, 에탄올, 프로필렌글리콜에용해되며유지에용해되지않는다. 열과빛에대한안정성이매우높고, 약산성 알카리성에서안정하며, 단백질에대한염착성이양호하다. ph 4 이하에서용해성이나빠지고침전을일으키는경우가있다. 분말제품은에탄올에는거의용해되지않지만, 액체제품은저농도의에탄올에는용해된다. 일반적으로액체제제는안정화를위해에탄올등을함유한다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 54 -
Table 22. General information and analytical trend of domestic and developed countries on oleoresin paprika 80. 파프리카추출색소 (Oleoresin Paprika) 정의 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 capsanthins 시판표준품구입불가능, 분리정제필요. TLC 없음 HPLC 없음 식품첨가물공전정량법 색가 (460nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 164 F 검체의채취량 (g) F: 기기보정역가 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨 국내외분석논문 JECFA 5) 국외 외관 첨가물로수재, 분석법은따로정하지않음 1. Hayashi, T., et al., 2001: HPLC 에의한 capsanthins 를분리 2. Kim, S.., et al., 2009; Capsicum spp. 에서추출한 capsnthin 을 HPLC-PDA 으로분리 3. Deli, J., et al., 2001: Red paprika(capsicum spp.) 에서추출한 capsnthin 을 HPLC 으로분리 4. Collera-Zuniga, O., et al., 2005: Capsicum spp. 에서추출한 capsnthin 을다른 carotenoid 성분과동시분리분리 암적색의덩어리, 페이스트또는점조한액체로약간특유의냄새가있다. 유지용액은등색을띤다. 물리화학적특성 용해도물에용해되지않으며, 알콜에약간녹고유지에용해된다. 안전성 특성 내열성은양호하나내광성은약간떨어진다. ph 에따른변화는없다. 산화되기쉽다. 산화방지제첨가로안정성이향상된다. tar 계색소인식용적색 40 호대용으로사용된다. 그러나착색정도는적색 40 호의 1/5 밖에되지않는다. 유용성이기때문에물에분산하는제제로서가공식품등의착색에사용한다. 색소는산화되기쉬우나추출토코페롤등의산화방지제를병용하면안정성은향상된다. 고추, 파프리카특유의냄새를정제처리하여제거한제품도있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 55 -
Table 23. General information and analytical trend of domestic and developed countries on grape skin extract 85. 포도과피추출색소 (Grape Skin Extract) 정의 이품목은포도과포도 (Vitis labrusca Linné 또는 Vitis vinifera Linné) 의과피를물로추출하여얻어진색소로서안토시아닌 (anthocyanin) 을주성분으로하는것이다. 다만, 색가조정, 품질보존등을위하여희석제, 안정제및용제등을첨가할수있다. 이품목은안토시아닌색소의에노시아닌을주성분으로하는적색색소이다. 와인제조공정중압착잔류물로부터얻어지는경우가많고, 와인제조를위해첨가되는이산화유황이색소중에소량잔류하는경우가있다. ph에의한변색이크고, 단백질에의해서도자색으로변색되지만, 내열, 내광성은비교적양호하다. 산성에서는적색 ~ 암적색을나타내기때문에음료, 빙과, 쨈, 과일소스등에사용된다. 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 TLC HPLC 주성분이정해지지않았음 없음 없음 식품첨가물공전정량법 색가 (525nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 1,000 검체의채취량 (g) 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 첨가물로수재됨, 색가로측정 첨가물로수재됨, 545nm 에서색가로측정 첨가물로수재않됨 JECFA 5) 첨가물로수재됨, 정량법은색가로측정. 국내외분석논문 국외 1. Revilla, I., et al., 1999: Grape skin extracts 와 Red wines 에서추출한 anthocyanin 유도체를 HPLC 에의해분리. 2. Priego Capote, F., et al., 2007: Grape skin extracts 에서추출한 anthocyanin 를 CE 와 HPLC 으로분리. 3. Kennedy J.A., et al., 2001: HPLC 으로 Grape skin extracts 에서추출한 proanthocyanin 를분리. 4. Fournand D., et al., 2006: 포도과피에서추출한 tannins 과 anthocyanins 을 HPLC 로분석 5. Sun B., et al., 2006: 포도과피에서추출된색소의분리. 외관적 암자색의분말또는액체이다. 용해도물, 함수에탄올, 프로필렌글리콜에용해되며유지에용해되지않는다. 물리화학적특성 안전성 ph 에따른변화가크며, 단백질에의해서도자색으로변색하는데내열성, 내광성은비교적양호하다. 수용액은산성에서적색을띠며 ph 에따라변색한다. 중성에서는암적색 적자색, 알카리성에서는적자색 암녹색이되며불안정하다. 단백질에의해서도자색으로변한다. 특성 이품목은적 ~ 암자색의액체, 덩어리, 분말또는페이스트상의물질로서약간특이한냄새가있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 56 -
Table 24. General information and analytical trend of domestic and developed countries on monascus pigments 94. 홍국적색소 (Monascus pigments) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 TLC HPLC 시판흥국적색소에서 monascin 과 ankaflavin 을분리 정제후사용 없음 RP-C18, 390nm, 정성법및정량법 식품첨가물공전정량법 색가 (500nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 10 검체의채취량 (g) 제외국첨가물분석법 나라 분석법 일본 2) 이품목의색가 (E10% 1 cm ) 는 50 이상으로서, 그표시량의 90~110% 를함유한다 (480-520nm). 미국 3) 첨가물로수재않됨 유럽연합 4) 첨가물로수재않됨 국내외분석논문 물리화학적특성 JECFA 5) 국내국외외관용해도안전성 첨가물로수재않됨 1. Park, Y.H. 1996: RP-HPLC에의한 monascin 분리 2. Park, Y.H., et al., 1997: monascin을 RP-HPLC 분리 3. Lee T.S., et al., 2001: monascin과 ankaflavin을분리 정제후 RP-HPLC로분리 1. Chen, M., et al., 1992: HPLC에의한 Monascin 분리 2. Eisenbrand, G., 1997: LC에의한정제후 ankaflavin 분석 3. Tsai, R., et al., 2009: monascin과 ankaflavin을 mold rice에서분리한후표준물질로사용, HPLC로정량 4. Zheng, Y., et al., 2009: 표준물질분리후 HPLC의형광검출기, MS 검출기를이용하여분석 5. Wongjewboot, I., 2011: Monascin 정제후 HPLC에의한분리. 외 10건 빛깔은황금색 검은갈색까지여러가지있는데갈색의착색료로가장적합한색소이다. 물과묽은알코올에용해되고벤젠, chloroform, acetone, 석유 ether 에용해되지않으며특정한 ph 에따라불용화되기도한다. 카라멜은식품에사용할때카라멜교질의등전점 ph 보다높은 ph 의식품에사용하면착색효과가최대가되므로등전점보다낮은 ph 에서는효과가없다. 그것은등전점보다낮은 ph 에서카라멜은양전하로하전되어모두침전되기때문에착색효과를나타낼수없다. 따라서탄산음료나맥주에사용할때는반드시 ph 를고려하여야한다. 특성규격품은비중이 1.125 이상, ph 3.0 7.5, 점도는 100 3,000cps 이다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 57 -
Table 25. General information and analytical trend of domestic and developed countries on carthamus yellow 95. 홍화황색소 (Carthamus Yellow) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 제외국첨가물분석법 국내외분석논문 표준물질 TLC HPLC 색가 (403nm) 나라 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 5) 국외 Safflor yellow 시판표준품정제후사용 없음 RP-C18, 403nm, 정성법및정량법 색가 (E, 10%, 1cm) = 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 흡광도 1,000 검체의채취량 (g) 분석법 TLC(n-butanol, acetic acid and water=4:1:2) 1. Shi, X., et al., 2008: LC/MS/MS 에 Safflor yellow A 의한분리 2. Zhang, Z., et al., 2009: HPLC 에 Safflor yellow A 의한분리 3. Yang, Z., et al., 2009: RP-HPLC Safflor yellow A 의한분리 4. Tian, Y., et al., 2010: Safflor yellow A 을 HPLC 으로분리 5. Wang, L., et al., 2006: Safflor yellow 을 HPLC 으로분리 외관황 갈색의분말또는액체이다. 물리화학적특성 용해도 안전성 물에용해되며, 에탄올, 프로필렌글리콜에약간용해되며유지에는용해되지않는다. 내열, 내광성이뛰어나다. 단백질에대한염착성은없지만전분질에대한염착성이뛰어나다. 수용액은황색이며 ph 에따른색조변화는적지만, 알칼리성에서약간붉은기를나타낸다. L- 아스코르빈산등을병용함으로서내열성, 내광성이향상된다. 다른황색소보다도안정성이우수하며치자청색소와배합하여녹색색소로서사용한다. 특성 후라보노이드계의 Cathamus yellow 를주성분으로하는황색색소이다. 식품용황색 4 호계의색조를나타내며, 파장 400 nm부근에서극대흡수를가진다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 58 -
Table 26. General information and analytical trend of domestic and developed countries on sepia color 113. 오징어먹물색소 (Sepia Color) 이품목은갑오징어과몽고오징어 (Sepia officinalis Linnaeus) 등의먹물주 머니의내용물을물로씻은다음약산성함수에탄올및함수에탄올로세정 구조식 하고건조하여얻어진색소로서주색소는유멜라닌 (eumelanin) 이다. 다만, 색가조정, 품질보존등을위하여희석제, 안정제및용제등을첨가할수 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 있다. 표준물질 Eumelanin의시판표준품구입불가 TLC 없음 HPLC 없음 색가 없음 나라 분석법 제외국첨가물분석법 국내외분석논문 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 5) 국외 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 1. Bolivar-Marinez, L.E., et al., 1999: Eumelanins 의 monomer 를분광으로연구 2. Novellino, L., et al., 2000: 머리카락에서분리한 eumelanin 을분리하고특성에대한연구 3. Zeise, L., 1995: Eumelanin 의특성및확인 : HPLC 로분리 4. Napolitano, A., et al., 1996: Eumelanin 에대한분해실험 외관흑갈 흑색의분말로특유의냄새가있다. 용해도물, 알콜, 유지등대부분의용매에녹지않는다. 물리화학적특성 안전성 특성 내광성, 내열성, 내염성이매우우수하다. 산성 알카리성에서매우안정하다. 불용성이기때문에색소용출은없지만, 염착성이없어외면염색에는적합하지않다. 특성 : 인돌멜라닌인유멜라닌이단백질과결합한멜라노프로테인을주성분으로하는흑색색소로, 대형오징어의먹물주머니내용물을세정, 건조, 분쇄하여얻는다. 이품목은흑갈 흑색의분말또는분산상의액체로서특이한냄새가있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 59 -
Table 27. General information and analytical trend of domestic and developed countries on rutin 126. 루틴 (Rutin) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 표준물질 TLC HPLC 시판루틴표준품구입가능 없음 RP-C18, 355nm, 정성법및정량법 식품첨가물공전정량법 색가 (375nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 200 검체의채취량 (g) 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨 국내외분석논문 JECFA 5) 국외 첨가물로수재않됨 1. Zu, Y., et al., 2006: RP-HPLC으로 rutin분석 2. Samee, W., et al., 2007: polyphenol을 RP-HPLC로분석 3. Petroianu, G., et al., 2009: rutin을 RP-HPLC로분석 4. Jain A., et al., 2009: quercetin, rutin을 HPTLC로분석 5. Gokarn,V., et al., 2010: rutin을 RP-HPLC로분석 외관황색의침상결정성분말이다. 용해도물, 유지에거의용해되지않고, 에탄올에는약간녹기어렵다. 물리화학적특성 안전성 내열성이뛰어나며, 알칼리액에용해되어등색이되는데불안정하다. 금속이온과킬레이트화하고특유의색이된다. 특성 루틴은야채, 과일을비롯해식물계에널리분포하고있는쿠에르세틴 (quercetin) 배당체이다. 식품색소에대한내광성을증강시키고향미의열화를방지한다. 1) 4) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 2) 일본식품공정서 8판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 60 -
Table 28. General information and analytical trend of domestic and developed countries on purple sweet potato color 142. 자주색고구마색소 (Purple Sweet Potato Color) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 이품목은고구마 (Ipomoes batatas Poiret 및그변종 ) 의괴근 ( 塊根 ) 을물 로추출하여얻어진색소로서시아니딘아실글루코시드 (cyanidin acylglucoside) 및페오니딘아실글루코시드 (peonidin acylglucoside) 를주성 분으로하는것이다. 다만, 색가조정, 품질보존등을위하여희석제, 안정제 및용제등을첨가할수있다. 표준물질 TLC HPLC 색가 (530nm) 나라 시아니딘아실글루코시드는복합물질로시판표준품구입불가능 없음 없음 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 10 검체의채취량 (g) 분석법 제외국첨가물분석법 국내외분석논문 물리화학적특성 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 5) 국외외관용해도안전성 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 1. Cevallow-Casals, B.., et al., 2003: Sweet potato 와 purple corn 에서항산화물질추출및분리 2. Jing, P., et al., 2008; anthocyanins 을 HPLC 로분리 3. Kano, M., 2005: Purple sweet potato 의항산화물질분리 4. Hagiwara, A., et al., 2002: Purple sweet potato color 의 anthocyanins 에대한항산화성분석 적 적자색의액체또는분말이다 물, 함수에탄올, 프로필렌글리콜에용해되며유지에는용해되지않는다. 내열성, 내광성은비교적양호하나염착성은좋지않고, 단백질에의해변색된다. 수용액은적 적자색을띄며 ph 에따라변색하는데, 산성역에서는적 적자색을나타내고중성및알카리성에서는적자색 암녹색이되며불안정하다. 특성 안토시아닌계색소, 시아니딘아실글루코시드및페오니딘아실글루코시드를주성분으로하는적자색의색소이다. 원료가되는자주색고구마는안토시아닌색소를함유하는고구마로주로남큐슈에서재배되고있다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 61 -
Table 29. General information and analytical trend of domestic and developed countries on perilla color 144. 치즈기색소 (Perilla Color) 구조식 식품중식품첨가물분석법 1) 식품첨가물공전정량법 제외국첨가물분석법 국내외분석논문 물리화학적특성 표준물질 TLC HPLC 색가 (520nm) 나라 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) JECFA 5) 국외 외관 Shisonin shisonin 시판표준품구입불가능 없음 없음 색가 (E, 10%, 1cm) = 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 첨가물로수재않됨 흡광도 10 검체의채취량 (g) 분석법 1. Peng, Y.Y., et al., 2005: Perilla frutescens 에서추출한항산화물 질을 CE 로분석 2. Povilaityt, V., et al., 2000; Perilla frutescens 에서추출한항산화 물질을분석 3. Watanabe, S.. 1996: Perilla frutescens 에서추출한항산화물질에 대한구조분석 4. Meng, L., 2006. Perilla frutescens 으로 anthocyanin 과 flovonoid 항산화물질제품제조적 적자색의액체, 덩어리, 분말또는페이스트상으로약간특유의냄새가있다. 용해도물, 함수에탄올에용해되고유지에는용해되지않는다. 안전성 내열성은떨어지나내광성은양호하고 ph 영향을받아변색한다. 수용액은적자색으로산성에서는매우안정하나, 중성 알카리성으로하면적 녹색은수초내에갈색이되며, 갈색이된것은산성으로해도적색으로돌아오지않는다. 일반적으로액체제품은안정화를위해유기산, 에탄올등을함유하며, L- 아스코르빈산을첨가한경우는퇴색을촉진하는경우가있다. 특성 안토니사인계의 Shisonin, Malonyshisonin 을주성분으로하는적색색소이다. 원료인차즈기잎은주로일본, 중국등에서생산된다. 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 62 -
Table 30. General information and analytical trend of domestic and developed countries on red radish color 173. 적무색소 (Red Radish Color) 정의 식품중식품첨가물분석법 1) 이품목은십자화과무 (Raphanus sativus LINNE) 의적자색의뿌리를물, 약산성수용액또는함수에탄올로추출하여얻어지는색소로서, 주색소는 안토시아닌계의펠라고니딘아실글루코시드 (pelargonidin acylglucoside) 이 다. 다만, 색가조정, 품질보존등을위하여희석제및안정제등을첨가할 수있다. 표준물질 TLC HPLC pelargonidin acylglucoside 는복수물질로시판표준품구입불가 없음 없음 식품첨가물공전정량법 색가 (470nm) 색가 (E, 10%, 1cm) = 흡광도 1,000 검체의채취량 (g) 나라 분석법 제외국첨가물분석법 일본 2) 미국 3) 유럽연합 4) 첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨첨가물로수재않됨 JECFA 5) 첨가물로수재않됨 국내외분석논문 국외 1. Otsuki, T., et al., 2002: Raphanus sativus 에서추출한 anthocyanin 의 HPLC 에의한분석 2. Liu, Y.,., et al., 2008; Raphanus sativus 에서추출한 anthocyanin 을 Prep. HPLC 에분리 3. Tatsuzawa, F., et al., 2010: Raphanus sativus 에서추출한 Cyanidin 3-sophoroside-5-glucosides 를 HPLC 에의한분석 4. Giusti, M., et al., 1998: Raphanus sativus 에서추출한 anthocyanin 을 NMR 에의한구조분석 5. Ishikura, N., et al., 1962: 적무의 anthocyanin 함량연구 물리화학적특성 외관적 암적색의분말또는액체로특유의냄새가있다. 용해도물, 함수에탄올에잘녹고유지류에거의녹지않는다. 안전성 특성 ph 에따라색조가변화하며 ph 5 이하에서적 적등색을나타내고내열성, 내광성은비교적양호하나중성 알카리성에서담색화되고색깔도적자색에서황갈색이되며불안정해진다. 단백질에의해암자색으로변색한다. 금속이온 ( 특히철이온 ) 과반응해변색한다. 이품목은암적색의분말로서약간특유의냄새가있다 1) 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011 년 ), 2) 일본식품공정서 8 판, 3) http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html 4) FCC 7 판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, 5) http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 63 -
제2절식품중천연색소 ( 첨가물 ) 계통별전처리법확립 3.2.1 천연색소별용해도, 안정성등검토다음 Table 31은 flavonoid계천연색소의주성분과주성분에대한구입가능여부, 유럽, 미국, 일본, JECFA에해당천연색소가수재유무를표시하였다. Table 31. Analytical method and standard of developed countries of carotenoid color 시판색소색깔주성분 ( 시판여부 ) 분석법 1) 제외국규격 2) 여부 파프리카색소황적 적 Capsantin( ) HPLC 유럽, JECFA 안나토색소황 황적 Bixin, Norbixin( ) T L C, HPLC 토마토색소황적 Lycopene( ) HPLC 일본 치자황색소황 Crocetin ( ), Geniposide (x) HPLC 일본 사프란색소 황 Crocin( ), Geniposide Safranal, T L C, HPLC JECFA JECFA 마리골드색소황 Lutein( ) HPLC 미국, JECFA 알팔파추출색소황 Lutein( ) HPLC 유럽, 미국 파피아색소적갈 갈 Astaxanthin ( ) HPLC - 가재색소황적 적 Astaxanthin ( ) HPLC - 크릴색소황적 적 Astaxanthin ( ) HPLC - 1) 자료검색에서관련색소의분석문헌유무 2) 검색자료 : 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ Table 32. Physical and chemical properties of carotenoid color 색깔시판여부 ph에의색소물알코올유지빛열금속염착성한변색파프리카색소 안나토색소 알칼리성에서물에용해 토마토색소 x - - - 치자황색소 x 사프란색소 x 마리골드색소 x - - 알팔파추출색소 x - - 파피아색소 - - 가재색소 - - - - 크릴색소 - - - - : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨. - 64 -
Table 33. Analytical method and standard of developed countries of flavonoid color 색소 색깔 주성분 ( 시판여부 ) 시판여부 분석법 1) 제외국규격 2) 베리류색소 적 적자 Anthocyanin - - 포도과즙색소 적 적자 Anthocyanin - - 포도과피색소 적 적자 Malvidin-3-glucoseide ( ) - 일본, 미국 적양배추색소 적자 Anthocyanin - - 자주색옥수수색소 적 Anthocyanin x - - 피칸너트색소 갈 Flavonoids x - 미국 카카오색소 갈색 Polyphenolic - - 감색소 적 Flavonoids x - - 고량색소 갈 Procyanidin ( ), Luteolinidin( ) TLC, HPLC - 타마린드색소 적 적자 Flavonoids x - - 무궁화색소 적 적자 Anthocyanin x - - 시아너트색소 갈 Flavonoids x - 미국 자주색고구마색소 자 Anthocyanin - 일본 자주색참마색소 적 적자 Anthocyanin x - - 차즈기색소 적 적자 Shisonin (x), Malonyshisonin (x) x - - 적무색소 적 Anthocyanin (x) x - - 홍화적색소 적 Carthamin (x) x HPLC 일본, JECFA 홍화황색소 황 Safflomins TLC, HPLC 일본, JECFA 루틴 황 Rutin ( ) HPLC - 양파색소 갈색 Quercetin ( ) x HPLC - 백단향색소 적자 Santalin ( ) x - - 1) 자료검색에서관련색소의분석문헌유무 2) 검색자료 : 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ - 65 -
Table 34. Physical and chemical properties of flavonoid color 색소 색깔시판여부 ph에의물알코올유지빛열금속염착성한변색 베리류색소 적 ~ 암록 포도과즙색소 암적 ~ 암록 포도과피색소 적 ~ 암록 적양배추색소 자 ~ 암록 자주색옥수수색소 암자 ~ 암록 피칸너트색소 - 갈색 카카오색소 갈색 ~ 적색 감색소 - - - - - - 고량색소 - 적갈 ~ 갈 타마린드색소 - 무궁화색소 - 시아너트색소 - - 자주색고구마색소 - 자주색참마색소 - - 적 ~ 암적 차즈기색소 - - 적무색소 - 홍화적색소 - - - 홍화황색소 황 ~ 적색 루틴 - - - - 양파색소 - - - 백단향색소 - - - : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨 - 66 -
Table 35. Analytical method and standard of developed countries of anthraquinone color 색소색깔주성분 ( 시판여부 ) 시판여부분석법 1) 제외국규격 2) 코치닐황적 적자 Carminicacid( ) TLC 일본, 유럽, JECFA 락황적 적자 Laccaic acids (x) TLC 일본 1) 자료검색에서관련색소의분석문헌유무 2) 검색자료 : 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ Table 36. Physical and chemical properties of anthraquinone color 색소 색깔시판여부 ph 에의한변색물알코올유지빛열금속염착성 코치닐 등 ~ 적자 락 등 ~ 적자 : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨 Table 37. Analytical method and standard of developed countries of betacyanin color 비트레드 색소색깔주성분 ( 시판여부 ) 시판여부분석법 1) 제외국규격 2) 적 적자 Betacyanin (x) (Betanin, Betanidin) HPLC 1) 자료검색에서관련색소의분석문헌유무 2) 검색자료 : 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ 일본, 유럽, JECFA Table 38. Physical and chemical properties of betacyanin color 색깔시판여부 ph에의한색소물알코올유지빛열금속염착성변색비트레드 황 적색 : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨 - 67 -
Table 39. Analytical method and standard of developed countries of monascin color 색소색깔주성분 ( 시판여부 ) 시판여부분석법 1) 제외국규격 2) 홍국적적 Monascin( ) HPLC 일본 홍국황황 Xanthomonasin x - - 1) 자료검색에서관련색소의분석문헌유무 2) 검색자료 : 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ Table 40. Physical and chemical properties of monascin color 색소 색깔시판여부 ph에의한물알코올유지빛열금속염착성변색 홍국적 적 ~ 등 홍국황 - - - : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨 Table 41. Analytical method and standard of developed countries of iridoid color 색소색깔주성분 ( 시판여부 ) 시판여부분석법 1) 제외국규격 2) 치자적적 Iridoid - 일본 치자청청 Iridoid - 일본 1) 자료검색에서관련색소의분석문헌유무 2) 검색자료 : 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ Table 42. Physical and chemical properties of iridoid color 색소 색깔시판여부 ph 에의한변색물알코올유지빛열금속염착성 치자적 치자청 - : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨 - 68 -
Table 43. Analytical method and standard of developed countries of curcuminoid color 색소색깔주성분 ( 시판여부 ) 시판여부분석법 1) 제외국규격 2) Curcumin( ), 심황 황 Demethoxycurcumin( ), TLC 일본 Bisdemethoxycurcumin( ) 1) 자료검색에서관련색소의분석문헌유무 2) 검색자료 : 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ Table 44. Physical and chemical properties of curcuminoid color 색소 색깔시판여부 ph 에의한변색물알코올유지빛열금속염착성 심황 황 ~ 적갈 : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨 Table 45. Analytical method and standard of developed countries of melanin color 색소색깔주성분 ( 시판여부 ) 시판여부분석법 1) 제외국규격 2) 오징어먹물흑 흑갈 Eumelanin( ) x - 1) 자료검색에서관련색소의분석문헌유무 2) 검색자료 : 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ Table 46. Physical and chemical properties of melanin color 색소 색깔시판여부 ph 에의한변색물알코올유지빛열금속염착성 오징어먹물 - x - : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨 - 69 -
Table 47. Analytical method and standard of developed countries of miscellaneous color 색소색깔주성분 ( 시판여부 ) 시판여부분석법 1) 제외국규격 2) 스피룰리나청 Phycocyanin( ) HPLC 일본 김색소황적 적 Phycoerythrin( ) x HPLC - 카라멜갈색복합체 x 1) 자료검색에서관련색소의분석문헌유무 2) 검색자료 : 식품공전해설서 ( 식품의약품안전청, 2011년 ), 일본식품공정서 8판, http://ec.europa.eu/food/fs/sfp/flav_index_en.html FCC 7판 (Food Chemical Codex) 3rd supplement, http://www.who.int/ipcs/food/jecfa/en/ 일본, 미국, JECFA Table 48. Physical and chemical properties of miscellaneous color 색소 색깔시판여부 ph 에의한변색물알코올유지빛열금속염착성 스필루나 갈색무변 김색소 - - - 카라멜 갈색무변 : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨 - 70 -
3.2.2 국내유통되는천연색소검색 Table 49 는 2009-2011 년품목제조보고서를참고하여천연색소를사용한식품품목명과품목수 조사하였다. Table 49. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 파프리카추출색소치자황색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 소스류 788 소스류 913 소스류 940 빵류 221 빵류 211 빵류 306 복합조미식품 339 복합조미식품 300 복합조미식품 327 혼합제제 142 캔디류 181 혼합제제 147 기타가공품 237 기타가공품 179 즉석섭취식품 251 캔디류 127 절임류 116 떡류 99 양념젓갈 104 양념젓갈 128 빵류 226 절임류 108 떡류 107 캔디류 80 즉석섭취식품 104 즉석섭취식품 117 기타가공품 198 국수 81 혼합제제 82 절임류 73 빵류 92 빵류 99 양념젓갈 98 기타가공품 81 기타가공품 76 과자 66 즉석조리식품 57 즉석조리식품 84 즉석조리식품 71 떡류 65 국수 66 기타가공품 64 곡류가공품 38 유탕면류 61 곡류가공품 59 과자 40 기타코코아가공품 42 국수 55 과자 36 절임류 48 절임류 48 소스류 37 치자황색소 35 치자황색소 -2 45 어묵 35 어묵 40 과자 41 당류가공품 34 소스류 34 당류가공품 39 신선편의식품 33 과자 37 어묵 40 복합조미식품 28 과자 31 소스류 37 향미유 29 곡류가공품 34 떡류 38 치자황색소 27 당류가공품 24 곡류가공품 30 국수 28 혼합제제 32 식육가공품 34 곡류가공품 18 과. 채음료 22 즉석섭취식품 30 만두류 27 향미유 26 신선편의식품 34 농산물조림 15 준초콜릿 19 어묵 18 수산물가공품 23 식육가공품 24 혼합제제 24 초콜릿가공품 14 초콜릿가공품 15 준초콜릿 18 드레싱 21 국수 20 파프리카추출색소 23 기타잼류 12 농산물조림 14 수산물가공품 16 식육가공품 20 떡류 20 유탕면류 19 과. 채음료 11 드레싱 14 기타코코아가공품 15 카레 18 파프리카추출색소 19 준초콜릿 19 즉석섭취식품 11 복합조미식품 14 복합조미식품 15 파프리카추출색소 18 만두류 18 드레싱 18 즉석조리식품 11 양념젓갈 14 양념젓갈 14 떡류 16 향신료조제식품 18 만두류 17 냉면 10 곡류가공품 12 초콜릿가공품 14 향신료조제식품 14 드레싱 12 수산물가공품 16 양념젓갈 10 견과류가공품 11 빙과류 13 어육소시지 13 기타코코아가공품 11 캔디류 16 조미건어포 10 빙과류 11 농산물조림 11 유탕면류 13 수산물가공품 11 향신료조제식품 16 만두류 9 음료베이스 10 음료베이스 11 절임류 11 캔디류 11 향미유 14 빙과류 9 혼합음료 10 튀김식품 10 초콜릿가공품 11 수산물조림 10 국수 13 준초콜릿 9 튀김식품 9 과. 채음료 9 캔디류 10 신선편의식품 10 당류가공품 13 서류가공품 8 어묵 7 혼합음료 9 혼합제제 10 준초콜릿 10 기타코코아가공품 11 음료베이스 8 유탕면류 7 냉면 8 과. 채가공품 9 카레 10 카레 10 견과류가공품 6 모조치즈 6 서류가공품 8 당류가공품 9 어육소시지 9 마요네즈 9 식육가공품 6 초콜릿 6 견과류가공품 6 준초콜릿 7 화이트초콜릿 7 수산물조림 9 추잉껌 6 수산물가공품 5 드레싱 6 냉면 6 마요네즈 6 어육소시지 9 드레싱 5 화이트초콜릿 5 기타잼류 5 튀김식품 6 기타김치 5 젓갈 9 어묵 5 냉면 4 즉석조리식품 5 기타김치 5 냉면 5 조미김 7 초콜릿 5 만두류 4 화이트초콜릿 5 기타어육가공품 4 농산물조림 5 초콜릿가공품 7 모조치즈 4 서류가공품 4 기타면류 4 추잉껌 4 당류가공품 5 화이트초콜릿 7 화이트초콜릿 4 조미건어포 4 체중조절용조제식품 4 축산물조림 4 초콜릿가공품 5 농산물조림 6 수산물가공품 3 즉석섭취식품 4 추잉껌 4 기타 37 기타 50 기타 53 기타 25 기타 43 기타 39 총품목수 2236 총품목수 2406 총품목수 2755 총품목수 1225 총품목수 1279 총품목수 1338 Table 50. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing - 71 -
reports(2009-2011) 코치닐색소 치자청색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 빵류 179 빵류 179 빵류 317 혼합제제 152 캔디류 158 빵류 173 혼합제제 101 캔디류 129 혼합제제 76 빵류 141 빵류 133 혼합제제 169 캔디류 88 떡류 66 캔디류 59 캔디류 116 혼합제제 86 캔디류 64 떡류 32 혼합제제 48 떡류 54 떡류 40 떡류 54 떡류 39 당류가공품 29 기타가공품 45 과자 39 치자청색소 33 기타가공품 25 당류가공품 35 준초콜릿 29 초콜릿가공품 44 준초콜릿 35 츄잉껌 26 치자청색소 24 치자청색소 29 기타가공품 28 기타코코아가공품 35 혼합음료 26 당류가공품 20 기타코코아가공품 23 츄잉껌 27 코치닐색소 23 준초콜릿 35 초콜릿가공품 25 과자 17 당류가공품 21 기타가공품 21 복합조미식품 17 즉석섭취식품 30 기타가공품 24 초콜릿가공품 13 과자 16 과자 20 과자 14 당류가공품 21 코치닐색소 24 기타가공품 12 초콜릿가공품 14 어묵 15 양념젓갈 14 과자 19 기타코코아가공품 23 절임류 12 절임류 13 초콜릿가공품 15 초콜릿가공품 12 코치닐색소 12 당류가공품 22 빙과류 9 준초콜릿 11 기타코코아가공품 14 혼합음료 12 어묵 11 즉석섭취식품 19 혼합음료 9 츄잉껌 10 수산물가공품 13 즉석섭취식품 11 복합조미식품 10 양념젓갈 9 음료베이스 7 음료베이스 9 절임류 11 초콜릿 11 추잉껌 10 어묵 9 기타잼류 4 화이트초콜릿 8 음료베이스 10 추잉껌 11 양념젓갈 9 어육소시지 9 드레싱 4 초콜릿 6 곡류가공품 9 스위트초콜릿 8 초콜릿 9 화이트초콜릿 9 곡류가공품 3 과. 채음료 5 혼합음료 7 어묵 7 식육가공품 6 빙과류 8 소스류 3 드레싱 5 빙과류 6 소스류 6 화이트초콜릿 6 초콜릿 8 준초콜릿 3 빙과류 5 준초콜릿 6 화이트초콜릿 5 소스류 5 소스류 7 초콜릿 3 소스류 4 화이트초콜릿 6 빙과류 4 어육소시지 5 복합조미식품 6 화이트초콜릿 3 향신료조제품 4 기타잼류 5 기타코코아가공품 3 음료베이스 5 스위트초콜릿 6 과. 채음료 2 혼합음료 4 자가규격품목 5 농산물조림 3 혼합음료 5 음료베이스 6 기타캔디류 2 냉면 3 고형차 4 절임류 3 스위트초콜릿 3 농산물조림 5 복합조미식품 2 기타잼류 2 냉면 4 가공두부 2 식용유지가공품 3 추잉껌 5 수산물가공품 2 식용유지가공품 2 과. 채가공품 3 곡류가공품 2 과. 채음료 2 과. 채음료 3 식육가공품 2 견과류가공품 1 드레싱 3 기타절임 2 기타잼류 2 체중조절용조제식품 3 조미건어포류 2 고형차 1 즉석섭취식품 3 식물성크림 2 드레싱 2 국수 2 탄산음료 2 곡류가공품 1 천연착향료 3 어육소시지 2 밀크초콜릿 2 기타식물효소함유제 2 과채주스 1 국수 1 과. 채음료 2 축산물조림 2 빙과류 2 밀크초콜릿 2 국수 1 농산물조림 1 기타엿 2 침출차 2 절임류 2 식육가공품 2 기타건포류 1 만두류 1 농산물조림 2 고형차 1 즉석조리식품 2 로얄젤리제품 1 기타코코아가공품 1 묵류 1 밀크초콜릿 2 과. 채가공품 1 고형차 1 수산물가공품 1 냉면 1 밀크초콜릿 1 소스류 2 과. 채음료 1 과. 채가공품 1 신선편의식품 1 농산물조림 1 수산물가공품 1 액상차 2 기타어육가공 1 국수 1 인산. 홍삼음료 1 들기름 1 스위트초콜릿 1 초콜릿 2 두부 1 기타어육가공 1 잼 1 땅콩건과류 1 어묵 1 가공두부 1 기타 4 기타 7 기타 4 기타 9 기타 9 기타 12 총품목수 673 총품목수 775 총품목수 853 총품목수 658 총품목수 657 총품목수 746-72 -
Table 51. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 심황색소 홍화황색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 빵류 397 빵류 322 빵류 339 캔디류 71 캔디류 85 빵류 113 절임류 24 기타가공품 30 절임류 31 혼합제제 44 빵류 84 캔디류 59 기타가공품 18 절임류 17 곡류가공품 28 빵류 42 떡류 26 혼합제제 58 즉석섭취식품 15 즉석섭취식품 14 기타가공품 19 추잉껌 16 혼합제제 26 혼합음료 18 곡류가공품 14 혼합제제 13 소스류 9 황화황색소 13 혼합음료 20 추잉껌 14 마가린 13 캔디류 11 복합조미식품 8 절임류 12 초콜릿가공품 19 당류가공품 12 혼합제제 8 곡류가공품 7 심황색소 8 초콜릿가공품 9 당류가공품 13 떡류 11 소스류 7 식육가공품 7 혼합제제 8 당류가공품 8 절임류 12 황화황색소 11 심황색소 7 과자 5 캔디류 7 혼합음료 8 황화황색소 12 기타가공품 8 캔디류 5 소스류 4 즉석섭취식품 5 떡류 6 기타코코아가공품 9 기타코코아가공품 7 과자 3 식물성크림 4 마가린 4 기타잼류 4 추잉껌 7 수산물가공품 7 기타잼류 3 마가린 3 식물성크림 4 빙과류 3 탄산음료 7 절임류 7 당류가공품 3 심황색소 3 드레싱 3 과. 채음료 2 기타가공품 6 음료베이스 6 복합조미식품 3 초콜릿가공품 3 즉석조리식품 3 과자 2 음료베이스 4 준초콜릿 6 빙과류 3 드레싱 2 과채가공품 2 기타가공품 2 초콜릿 4 초콜릿가공품 4 서류가공품 3 떡류 2 당류가공품 2 소스류 2 화이트초콜릿 4 과. 채음료 3 쇼트닝 2 복합조미식품 2 유산균음료 2 준초콜릿 2 기타잼류 3 과자 3 유산균음료 2 과채음료 1 과자 1 탄산음료 2 드레싱 3 빙과류 3 과채가공품 1 국수 1 국수 1 화이트초콜릿 2 빙과류 2 화이트초콜릿 3 국수 1 당류가공품 1 기타김치 1 곡류가공품 1 소스류 2 기타엿 2 드레싱 1 두유 1 서류가공품 1 과. 채가공품 1 식육가공품 2 액상차 2 떡류 1 서류가공품 1 쇼트닝 1 과. 채쥬스 1 준초콜릿 2 어묵 2 옥수수기름 1 추잉껌 1 음료베이스 1 기타코코아가공품 1 향신료조제품 2 유산균음료 2 천연착향료 1 콩기름 1 튀김식품 1 드레싱 1 과. 채음료 1 가공두부 1 초콜릿가공품 1 향신료조제식품 1 땅콩견과류 1 과자 1 기타과당 1 침출차 1 복합조미식품 1 만두류 1 기타잼류 1 해바라기유 1 사탕류 1 밀크초콜릿 1 농산물조림 1 혼합식용유 1 수산물가공품 1 복합조미식품 1 드레싱 1 총품목수 540 총품목수 456 총품목수 490 유산균음료 1 수산물가공품 1 복합조미식품 1 음료베이스 1 스위트초콜릿 1 소스류 1 식물성크림 1 인삼, 홍삼음료 1 어묵 1 젤리 1 탄산음료 1 총품목수 261 총품목수 363 총품목수 371-73 -
Table 52. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 안나토색소 적양배추색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 빵류 57 빵류 77 빵류 293 빵류 73 캔디류 78 혼합제제 55 기타가공품 8 과자 7 과자 9 혼합제제 65 떡류 50 캔디류 49 안나토색소 5 소스류 7 기타가공품 7 캔디류 55 혼합제제 39 빵류 44 소스류 4 기타가공품 4 혼합제제 5 당류가공품 19 과. 채음료 22 과자 28 과자 3 식물성크림 4 식물성크림 4 적양배추색소 13 혼합음료 22 떡류 22 당류가공품 3 안나토색소 3 안나토색소 4 과. 채음료 11 당류가공품 11 혼합음료 17 복합조미식품 3 어육소시지 3 식육가공품 3 혼합음료 9 적양배추색소 9 음료베이스 14 식물성크림 2 즉석섭취식품 3 어묵 3 절임류 6 음료베이스 6 과. 채음료 13 혼합제제 2 혼합제제 2 어육소시지 3 과자 4 초콜릿가공품 6 적양배추색소 11 과채음료 1 고형차 1 복합조미식품 2 소스류 3 과자 5 즉석조리식품 10 기타잼류 1 곡류가공품 1 소스류 2 음료베이스 3 기타코코아가공품 4 당류가공품 9 기타코코아가공품 1 기타잼류 1 즉석섭취식품 2 추잉껌 3 추잉껌 4 절임류 7 드레싱 1 식육가공품 1 가공두부 1 기타가공품 2 탄산음료 4 기타잼류 6 땅콩견과류 1 즉석조리식품 1 당류가공품 1 드레싱 2 기타가공품 3 농산물조림 5 즉석섭취식품 1 초콜릿가공품 1 액상차 1 떡류 2 소스류 2 추잉껌 5 캔디류 1 유산균음료 1 가공두부 1 액상차 2 소스류 4 자가규격품목 1 기타잼류 1 절임류 2 기타가공품 3 정제 1 빙과류 1 기타두유 1 기타코코아가공품 3 튀김식품 1 수산물가공품 1 기타잼류 1 액상차 3 혼합음료 1 식물성크림 1 드레싱 1 탄산음료 3 총품목수 94 총품목수 116 총품목수 345 유산균음료 1 수산물가공품 1 빙과류 2 준초콜릿 1 식물성크림 1 체중조절 2 추출음료 1 준초콜릿 1 과. 채가공품 1 탄산음료 1 과. 채주스 1 드레싱 1 생식함유식품 1 인삼. 홍삼음료 1 잼 1 준초콜릿 1 초콜릿가공품 1 카카오색소 1 화이트초콜릿 1 총품목수 279 총품목수 275 총품목수 325-74 -
Table 53. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 카카오색소락색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 빵류 19 빵류 49 빵류 109 캔디류 31 캔디류 94 혼합제제 64 혼합제제 10 혼합제제 12 초콜릿가공품 83 혼합제제 21 혼합제제 45 캔디류 46 당류가공품 8 떡류 5 준초콜릿 25 과채음료 16 과채음료 28 빵류 26 카카오색소 7 과자 4 초콜릿 24 양념젓갈 15 락색소 23 락색소 -5 23 초콜릿가공품 6 초콜릿가공품 4 혼합제제 24 혼합음료 14 떡류 19 혼합음료 20 과자 5 냉면 3 과자 22 당류가공품 12 혼합음료 10 과채음료 19 떡류 4 카카오색소 3 당류가공품 8 떡류 10 빵류 9 당류가공품 12 기타가공품 2 기타가공품 2 카카오색소 8 조미건어포류 9 즉석섭취식품 9 양념젓갈 12 기타건포류 1 당류가공품 2 기타가공품 4 빵류 7 탄산음료 9 준초콜릿 12 냉면 1 고춧가루 1 떡류 3 소스류 6 양념젓갈 8 즉석섭취식품 11 빙과류 1 빙과류 1 기타코코아가공품 2 즉석섭취식품 6 화이트초콜릿 6 떡류 6 어묵 1 액상차 1 밀크초콜릿 2 기타가공품 5 복합조미식품 5 과자 5 인삼. 홍삼음료 1 캔디류 1 체중조절용조제식품 2 락색소 5 과자 4 기타가공품 5 조미건어포 1 캔디류 2 복합조미식품 4 조미건어포류 4 빙과류 5 초콜릿 1 과. 채가공품 1 유산균음료 4 과. 채가공품 3 음료베이스 4 캔디류 1 기타엿 1 빙과류 3 당류가공품 3 초콜릿가공품 4 복합조미식품 1 탄산음료 3 빙과류 3 탄산음료 4 소스류 1 과자 2 어묵 3 어묵 3 조제커피 1 기타잼류 2 기타가공품 2 조미건어포류 3 코코아분말 1 기타절임 2 기타잼류 2 복합조미식품 2 화이트초콜렛 1 드레싱 2 소스류 2 소스류 2 총품목수 69 총품목수 88 총품목수 325 식품가공품 2 유산균음료 2 유산균음료 2 어묵 2 음료베이스 2 체중조절용조제식품 2 음료베이스 2 준초콜릿 2 초콜릿 2 잼 2 초콜릿가공품 2 가공두부 1 기타건포류 1 고형차 1 과채가공품 1 농축. 과채즙 1 농산물조림 1 드레싱 1 밀크초콜릿 1 만두류 1 식물성크림 1 수산물가공품 1 수산물가공품 1 액상차 1 초콜릿가공품 1 절임류 1 자가규격품목 1 젓갈 1 즉석조리식품 1 추잉껌 1 치자청색소 1 튀김식품 1 화이트초콜릿 1 총품목수 192 총품목수 304 총품목수 306-75 -
Table 54. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 홍국적색소 적무색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 혼합제제 34 빵류 47 어묵 31 빵류 7 빵류 42 빵류 66 빵류 27 어묵 24 즉석섭취식품 30 적무색소 4 혼합제제 3 혼합제제 3 떡류 21 떡류 22 혼합제제 25 혼합제제 4 빙과류 2 소스류 2 양념젓갈 17 혼합제제 21 양념젓갈 21 과자 3 캔디류 2 기타김치 1 곡류가공품 12 양념젓갈 17 홍국적색소 19 기타잼류 2 과자 1 드레싱 1 어묵 11 즉석섭취식품 16 빵류 16 드레싱 2 적무색소 1 적무색소 1 과자 10 기타가공품 11 떡류 12 당류가공품 1 즉석섭취식품 1 껌 1 소스류 9 홍국적색소 10 절임류 9 소스류 1 절임류 9 과자 8 소스류 8 캔디류 1 조미건어포류 9 소스류 5 곡류가공품 6 총품목수 25 총품목수 52 총품목수 75 초콜릿가공품 9 캔디류 5 초콜릿가공품 5 홍국적색소 9 곡류가공품 4 캔디류 5 즉석섭취식품 6 복합조미식품 4 기타잼류 4 기타잼류 5 절임류 4 기타가공품 3 캔디류 5 조미건어포류 3 당류가공품 3 추잉껌 4 추잉껌 3 복합조미식품 3 기타가공품 3 당류가공품 2 젓갈 3 수산물가공품 3 빙과류 2 조미건어포류 3 복합조미식품 2 식육가공품 2 가공두부 2 빙과류 2 기타잼류 1 과자 2 국수 1 만두류 1 기타엿 2 기타건포류 1 수산물가공품 1 빙과류 2 기타절임 1 식물성크림 1 식육가공품 2 당류가공품 1 잼 1 잼 2 만두류 1 초콜릿가공품 1 과채음료 1 식물성크림 1 농산물조림 1 잼 1 수산물가공품 1 젓갈 1 음료베이스 1 추잉껌 1 총품목수 215 총품목수 216 총품목수 223-76 -
Table 55. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 비트레드 고량색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 혼합제제 14 빵류 39 빵류 35 혼합제제 16 빵류 7 빵류 37 기타가공품 5 떡류 9 혼합제제 7 조미건어포류 9 혼합제제 6 혼합제제 11 비트레드 5 혼합제제 7 당류가공품 6 고량색소 5 떡류 4 고량색소 -9 2 빙과류 4 비트레드 6 비트레드 -7 4 추잉껌 5 조미건어포류 4 수산물가공품 2 빵류 3 빙과류 5 체중조절용조제식품 4 떡류 4 고량색소 3 식육가공품 2 떡류 2 기타가공품 4 기타가공품 3 빵류 3 기타가공품 3 조미건어포류 2 소스류 2 캔디류 4 캔디류 3 수산물가공품 1 추잉껌 3 과자 1 곡류가공품 1 기타잼류 3 떡류 2 식육가공품 1 국수 1 기타가공품 1 과. 채가공품 1 과자 2 빙과류 2 식육가공품 1 냉면 1 기타잼류 1 밀크초콜릿 2 초콜릿가공품 2 어묵 1 당류가공품 1 당류가공품 1 과. 채가공품 1 곡류효소함유제 1 캔디류 1 소스류 1 음료베이스 1 초콜릿가공 품 절임류 1 특수의료용도식 품 1 락색소 1 어묵 1 1 수산가공품 1 즉석조리식품 1 캔디류 1 유산균음료 1 튀김식품 1 준초콜릿 1 기타 1 총품목수 42 총품목수 84 총품목수 73 총품목수 44 총품목수 34 총품목수 65 Table 56. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 베리류색소 오징어먹물색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 빵류 14 빵류 20 빵류 20 빵류 7 캔디류 15 어묵 13 기타잼류 11 캔디류 7 기타잼류 10 떡류 3 빵류 4 빵류 9 당류가공품 3 혼합음료 4 캔디류 7 캔디류 3 오징어먹물색소 3 혼합제제 9 베리류색소 2 기타잼류 3 음료베이스 4 혼합제제 3 과자 2 오징어먹물색소 4 음료베이스 2 과. 채음료 2 과. 채가공품 3 국수 1 혼합제제 2 과자 3 혼합음료 2 기타가공품 2 잼 3 기타가공품 1 냉면 1 떡류 3 과. 채음료 1 당류가공품 2 과자 2 드레싱 1 전분가공품 3 블랙키런트색소 1 과. 채가공품 1 베리류색소 2 곡류가공품 2 체중조절용조제식품 1 베리류색소 1 혼합음료 2 냉면 2 캔디류 1 잼 1 혼합제제 2 국수 1 혼합제제 1 과. 채음료 1 기타가공품 1 총품목수 39 총품목수 43 총품목수 56 기타엿 1 파스타류 1 총품목수 18 총품목수 28 총품목수 52-77 -
Table 57. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 스피풀리나청색소 포도과피추출새고 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 빵류 7 빵류 28 빵류 36 혼합제제 7 캔디류 8 기타가공품 8 당류가공품 6 추잉껌 4 빙과류 3 캔디류 5 포도과피추출색소 4 혼합음료 5 스리룰리나청색소 6 혼합제제 2 스리룰리나청색소 3 과. 채음료 4 혼합음료 4 과. 채음료 4 추잉껌 6 기타가공품 1 혼합제제 3 포도과피추출색소 4 떡류 2 기타발효음료 2 혼합제제 5 빙과류 1 캔디류 2 혼합음료 2 기타발효음료 1 천연착향료 2 캔디류 3 스리룰리나청색 소 1 복합조미식품 1 과. 채주스 1 두유 1 체중조절용제제식품 과자 2 천연착향료 1 두유 1 소스류 1 포도과피추출색 2 소복합조미식품 1 초콜릿가공품 1 떡류 1 특수의료용도식품 1 혼합제제 2 빙과류 1 소스류 1 혼합제제 1 과자 1 총품목수 37 총품목수 37 총품목수 50 액상차 1 기타잼류 1 잼 1 달류가공품 1 추잉껌 1 소스류 1 2 즉석조리식품 1 천연식품첨가물 1 캔디류 1 특수의료용도식품 1 총품목수 29 총품목수 23 총품목수 35 Table 58. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 루틴 자주색고구마색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 과채음료 14 과채음료 7 탄산음료 13 캔디류 10 혼합제제 6 캔디류 7 탄산음료 14 혼합음료 7 혼합음료 13 혼합제제 6 캔디류 5 자주색고구마색소 5 혼합음료 7 탄산음료 5 과채음료 5 기타잼류 4 과. 채음료 4 떡류 4 만두류 3 기타가공품 1 액상커피 2 자주색고구마색소 3 자주색고구마색소 4 혼합음료 4 빵류 3 빵류 1 인삼홍삼음료 1 과. 채음료 2 기타가공품 2 기타잼류 3 기타가공품 1 혼합제제 1 과자 2 기타잼류 2 빙과류 3 기타잼류 1 혼합음료 2 음료베이스 2 체중조절용조 제식품 당류가공품 1 기타가공품 1 추잉껌 2 혼합제제 2 조미김 1 소스류 1 혼합음료 1 과. 채음료 1 총품목수 45 총품목수 21 총품목수 35 음료베이스 1 총품목수 28 냉면 1 추잉껌 1 자가규격품목 1 화이트초콜릿 1 추잉껌 1 총품목수 34 총품목수 34 2-78 -
Table 59. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 차즈기색소 치자적색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 품목수량품목수량기타발효음료 7 떡류 5 떡류 7 치자적색소 5 없음 - 없음 - 액상차 7 혼합제제 5 캔디류 4 혼합제제 5 침출차 7 캔디류 3 빵류 3 캔디류 4 고형차 2 기타가공품 2 초콜릿가공품 2 과자 3 기타식품효소 1 치자적색소 2 혼합제제 2 냉면 2 함유제 총품목수 24 가공두부 1 과자 1 드레싱 1 과자 1 묵류 1 어묵 1 기타잼류 1 전분가공품 1 절임류 1 1 초콜릿 1 즉석섭취식품 1 체중조절용 조제식품 초콜릿가공품 1 추잉껌 1 총품목수 23 추잉껌 1 치자적색소 1 총품목수 23 총품목수 24 Table 60. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 마리골드색소 타마린드색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 - - - - 기타발효음료 7 당류가공품 6 빵류 3 빵류 1 액상차 7 과자 1 초콜릿가공품 1 초콜릿가공품 1 침출차 7 총품목수 7 타마린드색소 1 혼합제제 1 고형차 2 총품목수 5 총품목수 3 기타식품효소 1 함유제 총품목수 24 Table 61. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 도마토색소 포도과즙색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 1 - - 곡류가공품 1 어묵 1 - - 혼합음료 1 기타가공 품 어묵 1 혼합제제 1 총품목수 1 총품목수 1 총품목수 2 총품목수 2-79 -
Table 62. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 감색소 자주색옥수수색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 곡류가공품 1 어묵 1 - - 혼합제제 1 - - - - 어묵 1 혼합제제 1 총품목수 1 총품목수 2 총품목수 2 Table 63. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 홍국황색소 알팔파추출색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 - - - - - - - - - - - - Table 64. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 홍국황색소 알팔파추출색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 - - - - - - - - - - - - Table 65. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 무궁화색소백단향색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 - - - - - - - - - - - - Table 66. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 사프란색소 시아너트색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 - - - - - - - - - - - - Table 67. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) - 80 -
양파색소 자주색참마색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 - - - - - - - - - - - - Table 68. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 피칸너트색소 파피아색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 - - - - - - - - - - - - Table 69. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 가재색소김색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 - - - - - - - - - - - - Table 70. Food items and numbers used natural color by food items manufacturing reports(2009-2011) 크릴색소 홍화적색소 2009 2010 2011 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수품목명품목수 - - - - - - - - - - - - - 81 -
3.2.3 천연색소표준품구입천연색소구입은품목제조보고서자료를통하여 2011년생산또는유통중인천연색소 24 품목을선정하였다. 24 품목은파프리카추출색소, 치자황색소, 코치닐추출색소, 치자청색소, 심황색소, 홍화황색소, 안나토색소, 적양배추색소, 카카오색소, 락색소, 홍국적색소, 적무색소, 비트레드, 고량색소, 베리류색소, 오징어먹물색소, 스피룰리나청색소, 포도과피추출색소, 루틴, Table 71. Solvent solubilities commercially available natural color additives 1) 색소이름 Water Methanol Ethanol Acetonitrile Acetone Hexane 파프리카색소분말 치자황색소 코치닐색소 홍국적색소 락색소 치자청색소 적양배추색소 홍화황색소 고량색소 안나토색소 심황색소 자주색고구마색소 베리류 포도과피추출 비트레드 스피룰리나청색소 카카오색소 적무색소 오징어먹물 자주색옥수수색소 마리골드 치차적색소 홍화적색소 1) 10mL 용매에 10mg 의색소를첨가하여침전유무, 색의농도, 색깔의투명도등을비교하여고려하여판다. : 매우좋음, : 보통, : 조금나쁨, x: 나쁨 - 82 -
자주색고구마색소, 차즈기, 치차적색소, 마리골드색소, 타마린드색소이었다. 그러나차즈기와포도과피색소는 2012년에는생산이되지않거나유통이되지않아구입할수없었으나자주색옥수수색소와홍화적색소는유통업체에재고품이있어서구입할수있었다. 43품목중총 24 품목을구입하여천연색소전처리및분석법확립에사용하였다. 24품목을계통별로나누면 flavonoid 계색소는 8품목으로베리류색소, 적양배추색소, 카카오색소, 타마린드색소, 포도과피색소, 자주색옥수수색소, 루틴색소, 자주색고구마색소, 적무색소이며, carotenoid계색소에는마리골드색소, 안나토색소, 파프리카색소였다. anthraquinone색소는락색소, 코치닐색소, 홍화황색소가속하며기타색소에는비트레드, 심황색소, 치자황색소, 고량색소로분류하였다. 천연색소의제조회사에따라천연색소에부형제를첨가하여천연색소첨가물로상품화하는경우도있고천연색소추출물원액을천연색소첨가물로판매되는경우도있다. 구입한천연색소의용해도는자료에서조사한것과다를수있어천연색소에대한용해도를추가적으로조사하여보았다 (Table 71). 가. 천연색소의계통별분류 시판되고있는색소를구입하여천연색소의화학구조, 용해도, TLC 및 HPLC 에서의 분리, 등을고려하여다음 4 가지형태로분류하였다 (Table 72-75). Table 72. Flavonoid color food additives used for establishment of analytical method 색소색소시판 ( 여부 ) 품목제조보고서 1) ( 품목수 ) 2009 2010 2011 베리류색소 11 10 11 자주색고구마색소 12 9 12 포도과피추출색소 12 9 16 적양배추색소 24 23 33 자주색옥수수색소 1 0 0 적무색소 9 7 7 카카오색소 16 13 22 루틴 9 5 6 1) 식품의약품안전청 - 83 -
Table 73. Carotenoid color food additives used for establishment of analytical method 색소색소시판 ( 여부 ) 품목제조보고서 1) ( 품목수 ) 2009 2010 2011 파프리카색소 57 64 63 안나토색소 16 15 20 마리골드색소 5 3 8 1) 식품의약품안전청 Table 74. Anthraquinone color food additives used for establishment of analytical method 색소색소시판 ( 여부 ) 품목제조보고서 1) ( 품목수 ) 2009 2010 2011 코치닐색소 40 43 40 락색소 42 37 48 홍화황색소 30 32 33 1) 식품의약품안전청 Table 75. Miscellaneous color food additives used for establishment of analytical method 색소색소시판 ( 여부 ) 품목제조보고서 1) ( 품목수 ) 2009 2010 2011 치자황색소 53 58 56 고량색소 8 12 15 심황색소 28 24 25 비트레드 14 13 15 1) 식품의약품안전청 - 84 -
3.2.4 전처리법확립천연색소전처리는 flavonoid계, carotenoid계, anthraquinone계, 기타색소로나누어서확립하였다. 가. Flavonoid계천연색소전처리 (1) Flavonoid계색소의전처리색소함량이표기사항에표기되어있지않아시료의사용량이결정하는것은간단하지않다. 그러나일반적으로 10-20g의시료를사용하면 TLC나 HPLC에서검출하는데충분하다. 색소를빵, 떡등과같은고형식품은동결건조하여분말화하면색소를추출하기가용의하다. 유음료등지방을함유하고있는식품은 hexane을가하여잘혼합한다음원심분리하여지방을제거하고여과한다음농축하여 SPE 시료로사용하면회수율을높일수있다. 음료를여과하여곧바로 SPE에적용해도충진물에색소가흡착이되나일부색소는용출되는경우가있어시간이소요될지라도농축하는것이좋다. 음료가당, 염등고형물을많이함유하는경우는농축할경우석출되기도하는데이때는침전이되지않을정도로희석하여시료로사용하는것이바람직하다. 농축은자외선이완전히차단된곳에서행하며감압농축조건은은 35 에서 20 mbar 이하에서행하여빠른속도로농축해야색소의파괴를최소화할수있다. 일반적으로 Solid phase extraction(spe) 를사용하는절차를 Fig. 3에수록하였다. SPE tube의충진물질은 C18과 phenyl을비교하였을때회수율에서크게차이나지않아 C18을사용하였다. 또한층진의양은 30, 60, 100, 200, 500, 1000mg등을비교하였을때 1000mg의충진물의 tube가가장높은회수율을보였다 (Data not shown). flavonoid계색소전처리의분석조건은 C18-1g SPE tube를사용하여세부적인사항을결정하였다. C18의충진물을사용할경우는보통 methanol을이용하여 C18을충진물을세척하고증류수로 C18을활성화하는것이일반적인절차이다 (Fig. 3). 본실험에서도 methanol 5mL로 3회충진물을세척하고 10mL 증류수로 C18 층진물을활성화하였다. 층진물이증류수에충분히젖어있는상태에서시료를도입하여야한다. Flavonoid게천연색소시료는대부분물과 methanol에잘용해된다. 시료에서천연색소를추출하고용액을농축하는데농축후다시추출물을용해할때에는최소한의양으로시료를녹이는것이회수율을높일수있으며증류수에잘녹을때에 methanol보다물로녹이는것이회수율을높일수있다. 시료흡착이끝나이후 0.1% formic acid 수용액으로세척을하는데이때무기염, 단당류, 유기산, 아미노산등수용물질이용출된다. 그러나이때색소물질도다량용출된다. 색소가용출되는정도를보면서세척수용액을조절할수있는데약 15mL 정도면충분하며낮은속 - 85 -
도 (2mL/min) 으로세척하는것이회수율을높인다. 색소의용출은 methanol과증류수의혼합용액 (7:3) 으로하는데 30mL이면충분하나색소가충진물에남아있는것이유관으로관찰되면더많은양을사용할수있다. (2) Flavonoid계색소의전처리와관련된국내외연구보고된논문에서 flavonoid계추출조건들을살펴보았다. Flavonoid계색소인코코아색소는색소성분으로 procyanidin을함유하고있다. Procyanindin은추출은코코아식품 1g을 15mL test tube에넣고 10mL hexane으로지방을추출하여제거하였다. 지방을제거한시료에 acetone/water/acetic acid(70:29.5:0.5) 를가하여 procyanidin 을추출하였다 (Gu, 2006). Zu 등 (2005) 루틴을시료전처리과정을보면, 건조잎의가루를 30 ml의 85% 에탄올을가해 ultrasonic 추출장치 (80 khz, 45 C) 에넣고 30분동안추출하는과정을두번정도반복하여추출하였다. 또는시료에메탄올을 20 ml 가하고 80 C 조건에서 1시간동안추출한다 (Maeng et al., 1990). Fig. 3. Solid phase extraction step (From Supeco Co. Bulletin 910) Table 76. Sample pretreatment conditions for flavonoid color additives SPE tube Sorbent : C18 Mass : 1g Particle zize : 60μm Pore size : 50A SPE Procedure Washing tube : Methanol 5mL(3회 ), Water 10mL Conditioning : 0.1% formic acid 5mL - 86 -
Sample adsorption Washing packing Elution compound Concentration : 약 3mL 농축시료 : 0.1% formic acid 15mL (2mL/min) : 30mL (Methanol: 0.1% formic acid 7:3), 2mL/min : 0.5mL (Dilute with methanol) 나. Carotenoid계천연색소전처리 (1) Carotenoid계색소의시료전처리파프리카색소, 안나토색소, 마리골드색소는유지에잘녹는지용성물질이나 hexane 보다는약간극성이 acetone, ethyl acetate, ethanol, methanol에도녹는다. 파프리카는 acetone, ethanol에잘녹으며 methanol에일부녹으며물에는거의녹지않는다. 색소제조회사에따라혼합제제형태의제품은 hexane을제외한대부분의용매에서녹게제조되었다. 안나토색소는 acetone과 ethanol에잘녹으며, methanol과물에도일부녹아노란색을나타낼수있을정도록녹는다. 또한 hexane에도잘녹아서대부분의식품의색소로사용하기용이하게제조되었다. 마리골드는액상으로 hexane 에서약간녹으나침전이생성되고 ethanol, methanol, 증류수등에아주잘녹으며 acetone에는 hexane보다잘녹지만극성용매보다는적게녹아서식품에사용하기용기하게조제되었다. 지용성물질의전처리에는 SPE tube의충진물질을 silica gel, CN, NH 2 등을사용할수있으나, silica gel이천연색소의회수율이높게나타나 silica gel을 SPE의충진물질로선택하였으며충진물질의 mass는 1000mg을사용하였다 (Data not shown). 충진물을 ethyl acetate로세척하고 hexane으로 ethyl acetate를제거한후 hexane으로충진물을 conditioning한다. 시료를흡착하고중성지질물질을 hexane으로제거한다 (Table 77). Hexane의양을 15mL이상할경우색소가용출될수도있어색소가용출되지않을정도로 SPE tube를세척하는것이바람직하다. 색소가용출되지않는다면더많은양의 hexane으로세척할수있다. 색소의용출은 ethyl acetate나혼합용매로사용할수있으나혼합용매를우선적으로사용해보고색소가충진물에서잘용출이되지않을경우 ethyl acetate를사용할수있다. 용출된색소는감압농축기를사용하여농축하며다시 ethyl acetate나 acetone으로희석한후 0.22μm membrane filter로여과후 TLC나 HPLC로사용한다. - 87 -
Table 77. Sample pretreatment conditions for carotenoid color additives Sorbent Mass :1g Particle zize :Silica gel :60μm Pore size :50A Washing tube Conditioning Sample adsorption Washing packing Elution compound Concentration SPE tube SPE Procedure :Ethyl acetate(3 회 ), hexane 10mL :Hexane 5mL : 약 3mL 농축시료 :Hexane 5mL :1) 혼합용액 (1% 암모니아수 : methanol =1:9) 15mL (2mL/min) 2) Ethyl acetate 15mL :0.5mL (dilute with ethyl acetate or acetone) (2) Carotenoid계계색소의전처리와관련된국내외연구안타토색소에대한국내외많은연구가이루어안타토색소에대한국내에연구를알아보았다 (Table 78). Lancaster et al.(1995) 는수용성식품과지용성식품등다양한시료의전처리방법을개발하였다. 캔디에서 annatto 색소추출법을간단히살펴보면일정양의시료를 230mL 유리원심분리관에담고증류수 50mL로시료를완전히녹인다음표준물질을일정량 spike하였다. 그리고이용액에 0.5% acetic acid (in chloroform) 50mL가하고격렬하게혼합한다음 chloroform에의해형성된압력을마개를열어제거한다음원심분리하였다. chloroform을모은다음여과하고수용액층을다시추출하여 HPLC시료로사용하였다. 마가린이나버터시료는위와같은방법으로하였으나 celite를가하고추출용매는 ethanol-물-29% ammonium hydroxide 를이용하였다. 또한방해물질을최대한제거하기위한방법으로개발되어있다. 식품중식품첨가물분석법에방해물질을제거하는 SPE cartridge를사용하여전처리방법을간편화하였다. 안나토색소에대한전처리법은식품중식품첨가물분석법과일본식품중식품첨가물분석법에수록되어있는데이들에전처리법을다음과같은방법으로하였다. 식품중식품첨가물분석법 : 시고형상검체경우초산에틸, 10% 염산용액, 증류수를각각가하여원심분리한후초산에틸층을색소추출액으로한다. 액상검체의경우 50 g을취하여색소추출액으로한다. 상기고형상검체색소추출액인초산에틸층은감압농축 (40 C) 한후에틸초산, n-헥산을가한후실리카겔카트리지에가한다음 1% - 88 -
암모니아 메틸알코올로용출시킨다. 이액을감압건고시킨후메틸알코올을가하여 1 ml로한액을시험용액으로한다. 액상검체의경우상기조건과실리카겔카트리지를이용하여상기조건과동일하게시험용액을조제한다. 일본식품중식품첨가물분석법 : 시료를원심관에넣고, n-헥산 40 ml를첨가한후, 원심분리하고상층부의 n-헥산층을버리고동일한조작을반복한다. 잔류물을가온해냉각한후, 0.1 mol/l 수산화나트륨용액 : 에탄올 (1:1) 를첨가해균질화한후, 원심분리하여분취한다. 잔류물은 0.1 mol/l 수산화나트륨용액 : 에탄올혼액 (1:1) 을이용해마찬가지로 2회조작후, 0.1 mol/l 수산화나트륨용액 : 에탄올혼액 (1:1) 을합쳐물로 100 ml로정용한것을시료액으로한다. Table 78. Summary of sampler pretreatment condition for annatto color Analytes Applications Typical extraction condition Reference Bixin Red peppers, oleoresin, paprika 0.2-20g sample weight. Acetone extraction followed by partition with ether/ NaCl soln then alkaline saponification. Minguez et al. 1995 Bixin and norbixin cis/trans isomers Norbixin and bixin cis/trans isomers + other isomers Candies, cheese, butter and margarine cheese, margarine, fish, edible ices, snacks, bakery wares, desserts Sample size 20g. Extraction / partition using ethanolic aqueous ammonia, pet ether, hexane and CHCl 3. Five different extraction regimes depending upon sample type. Either variant of extraction / partition using ethanolic aqueous ammonia, hexane with Celite; partitioned CHCl 3/HOAc; or Biphasic partition CH 3CN/hexane. Mínguez-Mo squera et al., 1995 Lancaster and Lawrence, 1995 Bixin and norbixin cis/trans isomers Cheese, butter and cream Antioxidant added. Sample size 5g. Extraction with acetone/hcl(cheese) or ethanolic aqueous ammonia, pet ether (butter and cream),centrifugation, filtration, SPE Scotter et al., 2002-89 -
다. Anthraquinone계천연색소전처리 (1) Anthraquinone계색소의시료전처리락색소, 코치닐색소, 홍화황색소는물에잘녹으며극성용매에도잘녹는다. acetone 이나 hexane의용매에는잘녹지않으며 acetonitrile에일부녹는다. 락, 코치닐색소는붉은색색소로 anthraquinone계색소이지만홍화황색소는 flavonoid색소이다. 그러나 TLC, HPLC 분석에있어 anthraquinone계와같이잘분석이되어 anthraquinone계에포함시켜서분석한다. 고형식품은 10% 염산을가하는데이는식품의성분에흡착된색소를유리하는것을도우며식품조직을파괴하여색소가추출되는것을돕는다. 식품으로부터추출한색소는모아서 ph가 3-4로조정하여 polyamide gel에흡착할수있도록한다. Polyaminde gel은색소물질을잘흡착하는특성을갖고있어색소물질분석에종종사용된다. 충분한양의 polyamide gel를사용하여추출된색소가 polyamide에흡착하도록하며 gel을계속해서흔들어주어색소가 gel에흡수가용이하도록한다. 색소가완전히흡착하여추출용액의색깔이완전히무색이되지는않지만충분히방치하여색소의흡착하도록한다. 색소가흡착된 polyamide gel을 100mL 물로 2회세척한다음충진물이없은 SPE tube에물을이용하여옮겨증류수로세척한다. 색소가더이상나오지않을때까지세척하고증류수를 tube에통과시키고 (1.2% acetic acid 함유한 methanol 20mL로충진물을세척한다. 다음에 50% methanol 10mL로세척을한다. 세척이끝난 tube에 2% 암모니아용액과 ethanol 용매를같은비율로혼합한혼합용매 80mL로착색된색소를용출시킨다. 이때용출속도는 10mL/min의속도로조정한다. 용출된색소용액은감압농축기로농축하고 methanol로약 0.5mL이되게희석한다. Table 79. Sample pretreatment conditions for anthraquinone color additives Sorbent characteristic and Mass Sorbent : Polyamide gel Mass : 2g Particle zize : 0-150μm Pore size : 100A Procedure Sample adsorption : 추출색소용액 + polyamide gel(3hr) Packing in tube : Using distilled water : 1) Distilled Water 20mL ( x 3) Washing tube 2) 20mL(1.2% acetic acid in methanol), 50% methanol 10mL Elution compound : 80mL(2% ammonia solution: ethanol=1:1) Concentration : 0.5mL (dilute with methanol) - 90 -
(2) Anthraquinone계색소의전처리와관련된국내외연구락색소, 코치닐색소, 홍화황색소의전처리방법에대한보고된논문들을살펴보았다. 락색소제조에따른추출은분말화된 stick lac 슬러지 1kg을분말붕산 (100-200kg) 과완전히혼합한후약간의물 (200-230mL) 을가하고숙성을위해하루밤방치한다. 여기에충분한물을가하여붕산이 1% 가되게하여 1시간방치한다. 1mL 빙초산을가하여잘혼합하고침전물과부유물이형성하도록정치한다. 약 2시간후맑은액을 50% 황산을이용하여산성으로조정한다. 침전된 lac 색소는천으로여과하고천일건조하거나 stainless 용기에서가열증기로건조하여 lac 색소를만들면이물질은색소성분이약 70-75% 정도함유된다. Szostek et al., (2003) 의연구에서락색소를제조하는방법으로다음과같은방법을제시하였다. 잘게부순 stick lac을물로완벽하게세척하고세척한용액을정치시킨다음, 상층액을모은다. 이용액에가성소다를가하여 ph 8로조절하고서서히저으면서 calcium chloride을가한다. 이때침전된색소를여과하고세척하면물순물이없는색소를얻는다. 또는락색소시료에서추출한연구으로 Kozu(1979) 는락색소추출법에대한연구를하여 laccaic acid의성공적으로품질을향상시켰다. 즉 stick lac를실온에서 methanol에침지하고 methanol 추출물을감압농축한후그잔사을 ph 4.0-4.5로조정한후물로추출하였다. 이수용액을다시감압농축하고 65 이하에서 85% ethanol용액에녹였다. 이 ethanol 용액을여과하고감압농축하여잔사를얻었으며이것을 ph 4.0-4.5로조정한후물로추출하였다. 다음은일반적으로많이사용하 는방법 (Hofenk de Graaff, 2004; Halpine, 1996; Novotna, 1999) 수정하여작성 한것으로회수율과재현성실험을통하여최적방법이설정되어야한다. 식품중식 품첨가물분석법에수재되어있는방법으로시료고체시료추출은다음과같다. 시 료 20g에 0.1% methanolic oxalic acid를 200mL가하고원심분리기로원심분리하고 (850xg, 5min), 상층액을회전증발기를이용하여건고한다. 건고한잔사에 50% n-butanol 수용액 50mL을가하여녹이고잘혼합한다음 n-butanol층을분리하여회전증발기로건고한다. 건조한잔사에증류수 20mL을가하여녹이고 SPE(solid phase extraction) tube을이용하여정제한다. 또한식품중식품첨가물분석법에서 SPE 에의한정제법은다음과같다. SPE tube(500mg, 3mL 용량 tube) 는먼저 methanol 로 washing 을하고물로활성화한다. 여기에앞에서제조한용액을가하고 methanol 로 10mL 로 lac 색소를용출시킨다. 이용출된용액을건조하고물과 methanol 혼합용액 (1:1) 1mL 을가하여용해하여 0.2μm membrane filtr 로여과하여 - 91 -
정성및정량시료로사용한다. 코치닐로부터 carminic acid를추출하는방법은분쇄한코치닐의무게에 100-500배에해당하는알칼리용액을가하고 100 로가열하여 20분간을유지한다음냉각하고여과하여추출액으로한다. 그러나이러한방법에는많은문제점이야기된다. 먼저냉각시점도가높아지면서 gel을형성한다. 이는아마시료중의단백질성물질과가교결합이일어나든지시료에함유한다른중합체와가교결합이형성되는것으로예상된다. Carminic acid의분석을위한전처리는추출과정제과정을거치는방법이일반적이다. 전처리에대한연구논문을살펴보면다음과같다. Karapanagiotis et al. (2009) 는시료에산성으로조정된 methanol을이용하여수회반복해서추출한연구가있으며 Gallegos et al, 1999는시료에 methanol: 물 (65:35) 혼합액을가하고균질화한후 80 에서 30분간추출하였다. 시료를냉각한후 15분간원심분리한후상등액을추출하여최적추출조건을구하였다고하였다. 체계적으로추출조건을연구한보고는많지않으나시료에 methanolic hydrochloric acid를실온보다약간높은온도에서처리하면수율이높인다는보고가있으면 (Valianou et al., 2009) 이러한결과는몇몇연구에서사용되었다. Carthamus yellow는열, 내광성이뛰어나며단백질에대한염착성은없지만전분질에대한염착성이뛰어나다. 수용액은황색이며 ph에따른색조변화는적지만, 알칼리성에서약간붉은색조를나타낸다. 홍화적색색소와달리높은수용성과열안정성으로추출하기가용이하다. Tian et al.(2010) 는색소와물을 1:6 비유로혼합하여일정시간정치시킨후 100 로두번반복가열하여색소를추출하였다. 또한이용액을 HCl로 ph를 4.0으로조절하고원심분리하여수용성단백질등을침전시켜제거하였다. 이와같은조건으로추출한다면수율은상당히높아질것으로보아지며지용성식품에서추출할경우에도용이하게색소물질을추출할것으로판단된다. - 92 -
라. 기타천연색소전처리 (1) 기타색소의시료전처리기타천연색소에서는치자황색소, 고량색소, 심황색소, 비트레드등 4 품목이천연색소가포함되어있다. 치자황색소는구조상으로는 carotenoid계통고량색소는 flavonoid 계통, 심황색소는 curcuminoid계통, 비트레드는 betacyanin계통의색소로구성하였다. 4가지색소모두물에잘용해되며 methanol에도잘용해된다. 여러계통으로구성되어있지만 flavonoid와유사한전처리조건으로실행할수있다. 추출조건은 anthraguinone과유사하다. 고형색품색소추출시 10% 염산을가하며 hexane으로지방을제거한다. SPE 조건은 flavonoid와같이 C18의충진물질을사용하며무게, 공극크기, 입자크기등같은조건을사용하였다. Washing, conditioning, 흡착, 용출도유사한조건으로확립되었다. Table 80. Sample pretreatment conditions for miscellaneous color additives SPE tube Sorbent : C18 Mass : 1g Particle zize : 60μm Pore size : 50A SPE Procedure Washing tube : Methanol 5mL(3회 ), Distilled water 10mL Conditioning : 0.1% formic acid 5mL Sample adsorption : 약 3mL 농축시료 Washing packing : 0.1% formic acid 15mL (2mL/min) Elution compound : 30mL Methanol (2mL/min) Concentration : 0.5mL (Dilute with methanol) (2) 기타색소의전처리와관련된국내외연구식품에함유한 crocetin을분석하기위한전처리법은 식품중식품첨가물분석법 에의거하여전처리를한다. 이방법은 Kim et al.(1999) 의방법에따른것으로이전처리법을간단히정리하면다음과같다. 이전처리법은수용성검체와비수용성검체에따라물또는 methanol를처리한다음원심분리하여 n-butanol로색소분석용시료를 - 93 -
추출한다. 색소분석용시료는시료에함유한 crotin을 crocetin으로바꾸기위해 0.1N 수산화나트륨을가하여가수분해한후 1N 염산으로중화한후이분해액을 dichloromethane을이용하여추출하고 0.45μm membrane filter를이용하여여과하여 HPLC의시료로사용한다. 고량색소는내광성, 내열성이우수하며단백질에대한염착성이좋다. 물, 함수에탄올, 프로필렌글리콜및알칼리용액에용해되나, 유지에는용해되지않는다. 이러한점을감안하여전처리방법이최적화되어야할것이다. 식품중식품첨가물분석법에는과자류, 우유류, 햄및초콜릿류등식품의종류에따라전처리법을제시했다. 과자류는 1g에 80% methanol 10mL가하여 30분간진탕추출한후이추출액을원심분리하여상등액을취해실온에서감압농압축한다음물로채워 10mL로정용한다. 미리메탄올 5mL와물 5mL을통과시켜활성화시킨 SPE C18카드리지에정용한시료액 1mL을흡착시키고 70% methanol으통과시켜받은용출액을이정량으로정용한후 membrane filter로여과하고시험용액으로하였다. 다른연구논문에서도대부분 alcohol과물의조합으로추출하였고 (Dallas et al., 1995; Hammerstone et al., 1999; Peng et al., 2001), SPE를이용하여시료를전처리한연구도많이확인되었다 (Counet et al., 2003; Hurst et al., 2009; Hammerstone et al., 1999). 우유를 1g에물을가하여일정부피로정용한후 SPE에투입하여간편하게할수있으나유지의함량이높은시료는탈지를하여실행하였다. Curcumin, demethoxycurcumin, bisdemethoxycurcumin 분석에대한연구논문에서전처리시추출용매를살펴보면 methanol(tayyem et al., 2006; Jadhav et al., 2007; Schiborr et al., 2010), ethanol (Tonnesen, et al., 1985; Wang et al., 2006), ethyl acetate(schiborr et al., 2010), acetonitrile (Tsai, et al., 2011) 의다양한용매가사용되었는데 methanol과 etanol이가장많이이용되었다. 열수추출한경우는없었으며 sonicator를사용하거나, 하루밤정치하거나, 두가지용매를혼합하거나사료에따라다양한방법이사용되었다. Methanol과 ethanol을사용한경우대부분물과혼합용액으로사용된것과두용매를서로혼합한경우가가장많이나타났다. - 94 -
Table 81. Summary of sampler pretreatment condition for turmetric color analytes* Applications Typical extraction Reference Total curcuminoids CUR, DMC, BDMC CUR, DMC, BDMC CUR, DMC, BDMC CUR, DMC, BDMC (synthetic) Yoghurt, mustard Tablets, teas and candies Curcuma longa gerrmplasm Powders, tablets, dressings, teas and beverages Fish 0.3-2g sample weight. Acetonitrile extraction, filtration and dilution. >0.1g sample weight. Methanol extraction with ultrasonication, or predilution in water then reverse-phase SPE preconcentration and cleanup. 100g sample weight. Soxhlet extraction with hexane to remove oils then benzene. Clean up by silica column chromatography 0.025-1g sample weight. Methanol extraction with ultrasonication, entrifugation and filtration. Internal standard (xylenol). 2g sample weight. Ground with elite, ascorbyl palmitate and HCl. Hexane wash then acetonitrile extraction, centrifugation, filtration, concentration. *Curcumin, CUR; demethoxycurcumin, DMC; bisdemethoxycurcumin, BDMC Navaz-Diaz and Ramon- Peinado, 1992 Inoue et al., 2003 Paramasivam et al., 2009 Zhang et al., 2009 Scotter, 2009-95 -
제3절식품중천연색소 ( 첨가물 ) 계통별분석법확립천연색소계통별분석법확립에대한연구결과및고찰은천연색소계통별로 TLC, HPLC, 기기및분석방법검증의순서로기술하였다. 즉 flavonoid계천연색소의계통별분석법에서는천연색소의 TLC 분석법을먼저서술하고이어서 HPLC에대한분석법확립에대하여기술하였다. 더불어기기검증및분석법검증을 HPLC의분석법다음에기술하였다. 이와같은순서로 carotenoid계, anthraquinone계, 기타천연색소의순서기술하였다. 3.3.1 Flavonoid계천연색소의계통별분석법가. Flavonoid계천연색소의기기검증및분석법검증 (1) 루틴 1 표준물질분석과표준검량선의직선성아래 Fig. 4는 flavonoid HPLC 조건으로루틴표준물질의분석한 chromatogram 을나타낸것이다. 루틴의표준물질농도, 0, 2, 5, 10, 25, 50 μg/ml에서표준검량선을작성한결과상관계수 (correlation coefficient, R 2 ) 는 0.9994이었다 (Fig. 5. 와 Table 82). mau 120 100 80 60 40 20 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 min Fig. 4. HPLC chromatogram of rutin. - 96 -
Fig. 5. Calibration curve of lutin. 2 검출한계및정량한계 확립된 flavonoid 계 HPLC 분석방법으로 0 50μg/mL 의농도에서산출된 chromatogram 에서 검출한계 (LOD) 는 0.53 μg/ml, 정량한계 (LOQ) 는 1.62 μg/ml 이었다 (Table 82). Table 82. Limit of detection(lod) and limit of quantification(loq) of rutin, n=3 Standard Curve data 농도 (μg/ml) 0 2 5 10 25 50 면적 ( 10 5 ) 0.0±0.0 0.41±0.02 1.61±0.21 2.92±0.13 7.02±0.20 13.85±2.98 Reproducibility 반복 1st 2nd 3rd 4th 5th 6th Mean STDEV 기울기 28173.0 27780.2 27377.3 27652.2 27477.7 27721.6 27697.0 278.0 절편 6269.4-5072.6 6479.9 5222.5 6080.7 5491.9 5798.5 4508.3 1 Linearity ( 직선성 ) = 0.9994 2 Limit of detection (LOD, 검출한계 ) = (4508.3 3.3) / 27697.2 = 0.53 μg/ml 3 Limit of quantification (LOQ, 정량한계 ) = (4508.3 10) / 27697.2 = 1.62 μg/ml - 97 -
3 정확도및정밀도정확성및정밀성을알아보기위해식품유형별로사탕, 식빵, 사이다에루틴을 10, 50, 100µg/mL의농도로 spike하여첨가시료를만들고추출후정확성 ( 회수율 ) 을측정하였고, 3회반복추출하여상대표준편차 (RSD, %) 를산출하여정밀성을 나타내었다 (Table 83). 회수율은사탕은 82.1 86.3%, 식빵은 83.7 86.9%, 사 이다는 88.5 86.9% 으로나타났으며식품유형에따른차이가나타났다. 상대표준편차 (%) 는 1.24 5.04% 의범위를나타내었다. 식품중식품첨가물분석법에서는 100% ethanol로추출하고 80 에서 3시간동안환류추출하였는데과자및분말류는 90 99%, 고추장및소스류는 101 102%, 음료는 88% 수준의회수율을나타내었다고하였다. 건조잎의가루를 30 ml의 85% 에탄올을가해 ultrasonic 추출장치 (80 khz, 45 C) 에넣고 30분동안추출하는과정을두번정도반복하여추출한연구에서회수율은 98.0% 99.5% 였다. Table 83. Recovery(%) and relative standard deviation(rsd, %) of lutin in candy, bread, and cyder, n=3 식품 회수율 (%) 상대표준편차 (%) lutin 농도 (µg/ml) 10 50 100 사탕 (Candy) 식빵 (Bread) 사이다 (Cyder) Recovery 82.1±3.7 86.3±3.1 85.9±2.8 RSD 4.51 3.60 3.26 Recovery 83.7±2.2 84.1±3.5 86.9±3.3 RSD 2.63 4.16 3.80 Recovery 89.2±4.5 88.5±1.1 87.6±2.6 RSD 5.04 1.24 2.96-98 -
나. Flavonoid계천연색소의 TLC 분석법 (1) Flavonoid계천연색소의 TLC 분석법확립 TLC plate의박막물질은 cellulose와 C18을사용하여비교하여보았다. 각 plate에대해다양한용매조성으로하여적양배추색소를시료로예비실험을한후몇가지용매조건을설정하였다. 먼저 flavonoid계색소를 Cellulose TLC의전개용매로 n-butanol: water: acetic acid(3:2:1), ethanol: methanol: water: acetic acid(3:2:1:0.5), acetone: ethyl acetate: formic acid in water(1:1:2) 등의조성으로전개하였을때 butanol, water, acetic acid 혼합용매 (3:2:1) 가가장좋은분리를나타내었다. 그러나 C18에비하여색소가번지는현상이나타나분리된 spot를구분하기어려웠다. C18 에의한 TLC 전개용매는 acetonitrile: 5% acetic acid in water(1:1), methanol: 10% formic acid in water(2:1), ethanol: 2% trifluoroacetic acid in water(1:1), acetonitrile:10% formic acid in water(1:1) 등의용매를사용하여비교하여보았다. 4 가지전개용매조성에서 acetonitrile:10% formic acid in water(1:1) 이가장좋았으나같은용매구성에 4: 6의조성도천연색소의분리가유사하게나타났으나적양배추색소의다양한 spot를관찰하는데 1:1 조성이 spot의분리가뚜렷하여 TLC에의한 flavonoid계의천연색소의최종분석조건은 C18의 TLC plate를이용하고전개용매는 acetonitrile:10% formic acid(1:1) 로결정하였다. 색소의 TLC 분리는시료를 TLC 에서적용하는상당히중요한데양이카카오색소는자외선의조사에의해 spot을뚜렷이확인할수있으며가시적인관찰에서는진한띠의형태로관찰되었다 (Fig. 6). flavonoid계색소에대한 TLC 나타내었다. 적양배추색소는 RF 값이 0.54-0.75 범위로 spot가관찰되었고, 자주색고구마색소의 RF는 0.4-7.0, 베리류의 RF는 0.5-0.8, 포도과피추출색의 RF는 0.38-0.7, 카카오색소의 RF는 0.43-0.7, 적무색소의 RF 0.4-0.6, 자주색옥수수색소의 RF는 0.3-0.78, 루틴의 RF는 0.4-0.8이었다. 대부분색소의 RF값이 0.4-0.8의범위에있었다. 자주색옥수수색소는넓은범위의 RF갑을갖고있었으며적양배추색소는다른색소에비해범위가좁게나타났다. (2) Flavonoid계천연색소의 TLC 분석법과관련된국내외연구 Flavonoid계배당체의화합물인루틴에대한 TLC 분석한연구를많지않은편이다. Jain et al.(2009) 는 Tephrosia purpurea (TP) 잎을시료로 ethanol을추출용매로하여 Soxhlet extractor로 72시간추출하고농축하여 TLC시료로사용하였다. TLC plate는 RP-18 F254 (5x7.5cm, E. Merck, Germany) 를사용하였다. Rutin과 quercetin을표준물질로사용하였고 Camag HPTLC system(tlc samper, TLC scanner, UV cabinet) 를이용하여정량하였다. - 99 -
a b c d e f g h i j k Fig. 6. Thin layer chromatograms of standard solution of flavonoid color. a: 적양배추색소, b: 자주색고구마색소, c: wildberries( 베리류색소 ), d: elderberry( 베리류색소 ), e: shade strawberry( 베리류색소 ), d: blue berry( 베리류색소 ), g: 포도과피추출색소, h: 카카오색소 (253.7nm), i: 적무색소, j: 자주색옥수수색소, k: 루틴 - TLC plate TLC Silica Gel 60 RP-18F254S (Aluminum sheets, Merck, USA) - 전개용매 Acetonitrile: 10% formic acid in water = 1: 1-100 -
다. Flavonoid계천연색소의 HPLC 분석법 (1) Flavonoid계천연색소의 HPLC 분석법확립 Flavonoid계천연색소의 HPLC 분석법은 flavonoid계천연색소인베리류색소, 자주색고구마색소, 포도과피추출색소, 적양배추색소, 자주색옥수수색소, 적무색소, 카카오색소, 루틴에대한개별적색소에대한최적조건을먼저확립하였다. 그리고이들에대한공통적인조건을찾아서최종적으로 flavonoid계색소의동일조건에의한분석법을확립하였다. 대부분의 flavonoid계색소들은순수한 methanol이나 acetonitrile로색소의구성성분들이분리가되지않았다 (Fig. 7). 이들의 broad하게분리되는 peak 를없애기위해서는이동상이낮은 ph를유지해야한다. 이를위해 formic acid, trichlororacetic acid, acetic acid를사용할수있다. 본연구에서는 10% formic acid 를사용하였다. Flovonoid계색소의분리에서는 methanol과증류수를사용하였는데각각의이동상이 10% formic acid를함유하도록제조하여사용하였을경우대부분의 peak가뚜렷이분리되었다. 적양배추색소는 45-80분까지많은색소물질들이용출되며대부분의 peak들이 500-530nm에서최대흡광도를갖는다. mau 75 50 25 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 min Fig. 7. Red cabbage chromatogram: Used 100% methanol and water as mobile phase. - 101 -
(2) Flavonoid계천연색소에대한확립된 HPLC 분석법 - Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm - Column 온도 : 35, - 이동상 : Gradient program 이동상 A: 10% formic acid in Methanol 이동상 B: 10% formic acid in H 2 O - 유속 : 0.34ml/min - 주입량 : 1-10μL - 검출기 : PDA(200nm-700nm) Table 84. HPLC Gradient program for flavonoid color Time(min) Methanol Water 0.01 10 90 88 30 70 90 100 0 115 100 0 116 10 90 132 10 90 135 Stop - 102 -
1 적양배추색소다음의 Fig. 8은적양배추색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 9는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a 20 mau 15 10 5 b 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 min c Fig. 8. Chromatograms of red cabbage color. a: 520nm, b: 295nm c: 395nm - 103 -
a 20 mau 15 10 5 b 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 min 2.0 1.5 Absobance 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 9. Chromatogram and spectrum of red cabbage color. a: 520nm, b: red cabbage spectrum, c: spectrum of 44.51min, d: spectrum of 58.64 min, e: spectrum of 62.48 min, f: spectrum of 64.63 min - 104 -
2 자주색고구마색소다음의 Fig. 10은자주색고구마색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 11는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a mau 30 20 10 0 b 0 10 20 30 40 50 60 70 80 min c Fig. 10. Chromatograms of red cabbage color. a: 520 nm, b: 295nm c: 395nm - 105 -
a mau 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 min b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 10. Chromatograms and spectrum of purple sweet potato color. a: 520nm, b: purple sweet potato color spectrum, c: spectrum of 59.91 min, d: spectrum of 60.71 min e: spectrum of 64.82 min, f: spectrum of 68.47 min - 106 -
3 Wildberry 다음의 Fig. 11은 wildberry의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 12는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 11.Chromatograms of wildberries color. a: 520nm, b: 290nm c: 350nm - 107 -
a b 1.0 0.8 Absobance 0.6 0.4 0.2 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 12. Chromatograms and spectrum of wildberry color. a: 520nm, b: wildberries color spectrum, c: spectrum of 13.48 min, d: spectrum of 25.69 min e: spectrum of 37.35 min, f: spectrum of min - 108 -
4 Elderberry 다음의 Fig. 13 은 elderberry 의최대흡수파장에서의 chromatogram 과주요파장에 서의 chromatogram 이다. Fig. 14 는색소의 spectrum 과주요 peak 의 spectrum 을나 a 타내었다. b c Fig. 13. Chromatograms of elderberry color. a: 520nm, b: 280nm c: 360nm - 109 -
a b 2.0 1.5 Absobance 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 14. Chromatograms and spectrum of elderberry color a: 520nm, b: elderberry color spectrum, c: spectrum of 7.03 min, d: spectrum of 10.62 min e: spectrum of 13.46 min, f: spectrum of 16.70 min - 110 -
5 Shadestrawberry 다음의 Fig. 15은 shadestraw berry의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 16는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 15. Chromatograms of Shadestrawberry. a: 520nm, b: 290nm c: 350nm - 111 -
a b 0.8 0.6 Absobance 0.4 0.2 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 16. Chromatograms and spectrum of shade strawberry color. a: 520nm, b: shade strawberry color spectrum, c: spectrum of 7.86 min, d: spectrum of 10.25 min e: spectrum of 16.01 min, f: spectrum of 18.67 min - 112 -
6 Blue berry 다음의 Fig. 17은 blue berry의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 18는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 17. Chromatograms of blueberry color. a: 520nm, b: 300nm c: 400nm - 113 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 18. Chromatograms and spectrum of buleberry color. a: 520nm, b: blueberry spectrum, c: spectrum of 7.86 min, d: spectrum of 10.25 min e: spectrum of 16.01 min, f: spectrum of 18.67 min - 114 -
7 Mul berry 다음의 Fig. 19은 mul berry의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 20는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 19. Chromatograms of mul berry color. a: 520nm, b: 300nm c: 370nm - 115 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 20. Chromatograms and spectrum of bulberry color. a: 520nm, b: bulberry spectrum, c: spectrum of 8.71 min, d: spectrum of 16.29 min e: spectrum of 21.34 min, f: spectrum of 41.28 min - 116 -
8 Choco berry 다음의 Fig. 21은 choco berry의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 22는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 21. Chromatograms of choco berry color. a: 520nm, b: 300nm c: 370nm - 117 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 22. Chromatograms and spectrum of choco berry color. a: 520nm, b: chocoberry spectrum, c: spectrum of 8.00 min, d: spectrum of 12.85 min e: spectrum of 19.80 min, f: spectrum of 35.18 min - 118 -
9 Black berry 다음의 Fig. 23은 black berry의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 24는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 23. Chromatograms of black berry color. a: 520nm, b: 290nm c: 350nm - 119 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 24. Chromatograms and spectrum of black berry color. a: 520nm, b: black berry spectrum, c: spectrum of 16.43 min, d: spectrum of 34.33 min e: spectrum of 37.72 min, f: spectrum of 49.97 min - 120 -
10 Cranberry 다음의 Fig. 25은 cranberry의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 26는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 25. Chromatograms of cranberry color) a: 520nm, b: 315nm c: 420nm - 121 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 26. Chromatograms and spectrum of cranberry color. a: 520nm, b: BerriesColor spectrum, c: spectrum of 8.28 min, d: spectrum of 18.67 min e: spectrum of 37.63 min, f: spectrum of 49.70 min - 122 -
11 Acaiberry 다음의 Fig. 27은 acaiberry의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 28는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 26. Chromatograms of acaiberry color. a: 520nm, b: 285nm c: 320nm - 123 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 27. Chromatograms and spectrum of acaiberry color. a: 520nm, b: acaiberry color spectrum, c: spectrum of 11.79 min, d: spectrum of 16.99 min e: spectrum of 25.98 min, f: spectrum of 30.19 min - 124 -
12 Raspberry 다음의 Fig. 28은 raspberry의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 29는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 28. Chromatograms of raspberry color. a: 520nm, b: 300nm c: 350nm - 125 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 29. Chromatograms and spectrum of raspberry color a: 520nm, b: raspberry color spectrum, c: spectrum of 8.56 min, d: spectrum of 11.79 min e: spectrum of 16.71 min, f: spectrum of 38.75 min - 126 -
13 포도과피추출색소다음의 Fig. 30은포도과피추출색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 31는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 30. Chromatograms of grapeskin extract. a: 520nm, b: 230nm c: 450nm - 127 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 31. Chromatograms and spectrum of grapeskin extract. a: 520nm, b: grapeskin extract color spectrum, c: spectrum of 9.20 min, d: spectrum of 20.80 min e: spectrum of 28.27 min, f: spectrum of 34.40 min - 128 -
14 카카오색소다음의 Fig. 32은카카오색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 33는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 32. Chromatograms of cacao color. a: 520nm, b: 330nm c: 450nm - 129 -
a b 2.0 1.5 Absobance 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 33. Chromatograms and spectrum of cacao color. a: 520nm, b: cacao color spectrum, c: spectrum of 4.26 min, d: spectrum of 5.31 min e: spectrum of 6.10 min, f: spectrum of 9.54 min - 130 -
15 적무색소다음의 Fig. 34은적무색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 35는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 34. Chromatograms of red radish color. a: 520nm, b: 270nm c: 370nm - 131 -
a b 2.0 1.5 Absobance 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 35. Chromatograms and spectrum of red radish color. a: 520nm, b: red radish color spectrum c: spectrum of 57.20 min, d: spectrum of 64.53 min e: spectrum of 70.40 min, f: spectrum of 72.53 min - 132 -
16 자주색옥수수색소다음의 Fig. 36은자주색옥수수색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 37는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 36. Chromatgrams of maize morado color. a: 520nm, b: 260nm c: 370nm - 133 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 37. Chromatograms and spectrum of maize morado color. a: 520nm, b: maize morado color spectrum c: spectrum of 14.27 min, d: spectrum of 21.07 min e: spectrum of 27.87 min, f: spectrum of 38.80 min - 134 -
17 루틴다음의 Fig. 38은루틴의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 39는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 38. Chromatograms of rutin. a: 520nm, b: 240nm c: 290nm - 135 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 39. Chromatograms and spectrum of rutin. a: 520nm, b: rutin spectrum c: spectrum of 4.80 min, d: spectrum of 7.04 min e: spectrum of 40.15 min, f: spectrum of 42.53 min - 136 -
(3) Flavonoid색소의 HPLC 분석과관련된국내외연구 Flavonoid계색소에인루틴에대한 HPLC에대한분석을살펴보면, Maeda et al. (1984) 는 5종의식품시료를 methanol을이용하여추출한다음 rutin과 quercetin을 RP-HPLC로분리하였다. Column은 Lichrosob RP-18 (5μm, 4.6mm x 250mm, Merck, Germany) 을사용하였다. 이동상은 acetonitrile: acetic acid: water (30: 0.3: 70, v/v) 사용하였다. 이때이동상의유속은 1.0mL/min이었고가시광선의검출파장은 345nm를사용하였다. 또한 Zu et al.(2006) 는 sea buckthorn의시료에 85% ethanol을가하여 ultrasonicator로 30분간처리한다음 3회반복하여추출하고이시료를 RP-HPLC-MS(Agilent, Waldbronn, Germany) 를사용하여분석하였다. Column 은 HIQ SIL C18V (5μm, 4.6mm id x 250mm length, Alltech, USA) 과 guard column, HIQ SIL C18V guard column (12.5 mm 4.6 mm, 5 μm) 를사용하였으며이동상은 methanol acetonitrile water (40:15:45, v/v/v) 을 isocratic으로사용하였다. 이때이동상의유속은 1.0mL/min으로하고 UV 검출기는 368nm을사용하였으며시료주입량은 10μL였다. 카카오색소에대한 HPLC 분석을살펴보면 Column은 ultra Aqueous RP-18 (3μm, 2.1mm x 100mm, Restek, USA) 을사용하였다. 이동상은 A욤매, acetonitrile: methanol (50:50, v/v), B용매, 0.1% formic acid in water를이용하여 gradient을하여분석하였다. 이때이동상의유속은 0.4mL/min이었고가시광선의검출파장은 210nm를사용하였다 (Kowalski, 2009). 코코아색소의 procyanidin은 Agilent 1100 HPLC system을사용하여분석하였다 (Gu, 2002). Column은 Phenomenex Luna Phenyl Hexyl (5μm, 4.6mm id x 250mm length, Phenomenex Luna, USA) 과 guard column, Phenyl Hexyl guard column (12.5 mm 4.6 mm, 5 μm) 를사용하였으며이동상은 A은 water/acetonitrile/aceitc acid(89:9:2, v/v/v), B은 acetonitrile/water(80:20, v/v) 을이용하여 gradient로용출하였다.. 이때이동상의유속은 1.0mL/min으로하고 UV 검출기는 368nm을사용하였으며시료주입량은 10μL였다. - 137 -
3.3.2 Carotenoid계천연색소의계통별분석법가. Carotenoid계천연색소의기기검증및분석법검증 (1) Bixin 1 표준물질분석과표준검량선의직선성아래 Fig. 40는확립된 carotenoid 계 HPLC 조건으로 Bixin 표준물질의분석한 chromatogram을나타낸것이다. Bixin의표준물질농도, 0, 2, 5, 10, 25, 50 μ g/ml에서표준검량선을작성한결과, 상관계수 (correlation coefficient, R 2 ) 는 0.9993이었다 (Fig. 41과 Table 85). mau 2000 1500 1000 500 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 min Fig. 40. HPLC chromatogram of bixin standard. Fig. 41. Calibration curve of Bixin. - 138 -
2 검출한계및정량한계확립된 carotenoid계 HPLC 분석방법으로 0 50μg/mL의농도에서산출된 chromatogram에서검출한계 (LOD) 는 0.11 μg/ml, 정량한계 (LOQ) 는 0.34 μg/ml 이었다 (Table 85). Table 85. Limit of detection(lod) and limit of quantification(loq) of bixin, n=3 Standard Curve data 농도 (μg/ml) 0 2 5 10 25 50 면적 ( 10 7 ) 0.0±0.0 0.22±0.22 0.66±0.32 1.08±0.28 2.65±0.33 5.28±1.86 Reproducibility 반복 1st 2nd 3rd 4th 5th 6th Mean STDEV 기울기 1,171,869.4 1,080,465.4 1,236,137.3 994,800.1 1,257,904.5 1,154,773.6 1,048,946.0 98,471.7 절편 497,663.5 442,741.9 504,898.2 421,964.3 483,217.1 429,264.2 443,860.0 36,325.4 1 Linearity ( 직선성 ) = 0.9993 2 Limit of detection (LOD, 검출한계 ) = (36,325.4 3.3) / 1,048,946.0 = 0.11 μg/ml 3 Limit of quantification (LOQ, 정량한계 ) = (36,325.4 10) / 1,048,946.0 = 0.34 μg/ml 3 정확도및정밀도정확성및정밀성을알아보기위해식품유형별로사탕, 식빵, 사이다에 bixin을 10, 50, 100µg/mL의농도로 spike하여첨가시료를만들고추출후정확성 ( 회수율 ) 을측정하였고, 3회반복추출하여상대표준편차 (RSD, %) 를산출하여정밀성을 나타내었다 (Table 86). 회수율은사탕은 75.9 79.2%, 식빵은 72.9 77.1%, 사 이다는 78.4 83.6% 으로나타났으며식품유형에따른차이가나타났다. 상대표준 편차 (%) 는 1.95 5.35% 의범위를나타내었다. - 139 -
Table 86. Recovery(%) and relative standard deviation(rsd, %) of bixin in candy, bread, and cyder, n=3 식품 회수율 (%) 상대표준편차 (%) Bixin 농도 (µg/ml) 10 50 100 사탕 (Candy) 식빵 (Bread) 사이다 (Cyder) Recovery 75.9±2.9 78.7±1.6 79.2±2.1 RSD 3.82 2.03 2.65 Recovery 72.9±3.7 76.5±2.4 77.1±1.5 RSD 5.01 3.13 1.95 Recovery 78.4±4.2 80.5±2.8 83.6±2.6 RSD 5.35 3.47 3.11 나. Carotenoid계천연색소의 TLC 분석법 (1) Carotenoid계천연색소의 TLC분석법확립 TLC plate는 HPTLC Silica gel 60 (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck), TLC Silica gel 60 (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck), TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) cellulose TLC (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) 을사용하여분리가양호한 plate를선택하였다. HPTLC Silica와 TLC Silica의분리차이는크지않았다. HPTLC의경우약간 TLC보다선명도가높았으나 carotenoid계색소에서는일반적으로알려진것보다분리능이높지않았다. 적양배추색소를시료로예비실험을한후몇가지용매조건을설정하였다. Carotenoid계색소중에서파프리카추출색소를이용하여예비실험을하였다. 연구논문을참고로하여 TLC silica gel plate의전개용매로 n-butanol: methanol: water(3:2:1), ethyl acetate: methanol: water: (3:1:1), ethyl acetate: methanol: acetone: water: (3:1:1:1) 등의조성으로전개하였을때 ethyl acetate: methanol: water: (3:1:1) 가가장좋은분리를나타내었다. 또한 ethyl acetate: methanol: acetone: water: (3:1:1:1) 의용매조성은파프리카추출색소의분리에는뛰어난조건이나마니골드나안나토색소의분리에는 ethyl acetate: methanol: water: (3:1:1) 의조성보다는낮은분리능을나타내었다. TLC의전개용매로 ethyl acetate함량은전개시간에많은영향을주는데함량이높을수로전개시간이길게나타났으면높은비율에서는전개시간이 4시간이상이되어특히색소를분리하는실험에서는사용하지않는것이좋을것으로판단되었다. 노란색의천연색소는전개과정중색깔의퇴색이쉽게일어나초기에는뚜렷한색을보이다가도시간이지나면희미하게변하는문제가발생한다. - 140 -
연구논문을참고로하여 TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S의전개용매로 acetonitrile : methanol: 0.5% formic acid in water(3:2:1), butanol: ethanol: 10% Na 2 SO 4 (2:1:2), 2-butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 (1:1:1), butanol: n-propanol: ethyl acetate: water (2:4:1:3) 등의용매조성을사용하였다. 이중에서 butanol: ethanol: 10% Na 2 SO 4 (2:1:2), 2-butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 (1:1:1) 이유사하게나타났으나전개시간이 RF값이약간높은 butanol: ethanol: 10% Na 2 SO 4 (2:1:2) 이 RP-18에서는최적의조건으로판단된다. Cellulose TLC의경우 butanol: acetic acid: water (4:1:2) 의조성으로분리는일어나지만작은 spot의경우는 RF값을결정하기어려울정도로뭉쳐서나타났다. Carotenoid 계색소의 TLC 분리는 Silica gel TLC가가장적합한것으로판단이되며용매조성은 ethyl acetate: methanol: water: (3:1:1) 로최종결정하여사용하였다. Fig. 42는 silica gel TLC로파프리카추출색소, 안나토색소, 마리골드색소를분석한 chromatogram이다. 파프리카추출색소의주성분으로판단되는 spot는 0.98의 RF값을갖는다. 아래작은 spot는노란색을띠며 RF값을 0.12와 0.2 갖는다. 파프리카추출색소의진한용액은붉은색이지만희석된용액은노란색을띤다. 안나토색소는황등색또는노란색을띤다. TLC chromatogram 상에서는엷은노란색을띠는주 spot의 RF 값은 0.98이었으며아래에엷은노란색의 spot는 0.31의 RF값을갖는다. 마리골드색소는주색소로판단되는 spot가두개가있는데첫번째 spot는 0.98 두번째 spot는 0.96 RF값을갖는다. 다른희미한 4개의 spot가확인되었다. 노란색은전개되는동안에도색의농도가퇴색되어전개즉시 spot를확인해야한다. - 141 -
a b c Fig. 42. Thin layer chromatogram of standard solution of carotenoid color. a: 파프리카추출색소 (Oleoresin paprika) b: 안나토색소 (Annatto extract) c: 마리골드색소 (Tagetes extract) - TLC plate TLC Silica gel 60 (Aluminum sheets, Merck) - 전개용매 ethyl acetate: methanol: water: (3:1:1) - 142 -
(2) Carotenoid계천연색소의 TLC 분석과관련된국내외연구 Carotenoid계색소중에연구가많이된안타토색소의 TLC분석을 Table 87에서나타내었다. 대부분의안나토색소분리에서 silica gel을사용하였으며 Acetone, Acetonitrile, Benzene, Cyclohexane, Chloroform, N,N-Dimethylformamide, Ethyl acetate, Ethanol, Diethyl ether, Hexane, Acetic acid, isopropyl alcohol, Petroleum ether, tertiary butylmethyl ether 등의다양한용매가사용되었다. Lirimanna (1981) 은버터, 치이즈, 마가린, 식용유등에함유한 bixin과 norbixin을 Silica gel TLC plate를이용하여정성하였다. 전개용매는 chloroform: ethyl acetate(4:1) 을사용하였다. Table 87. Summary of TLC analytical conditions for annatto color Analytes Adsorbent Mobile phase * Reference(s) Bixin, norbixin, C17 Annatto fat soluble and other dyes Paper Annatto Silica gel G Annatto pigments and other Bixin and norbixin c o m m e r c i a l formulations Ether extracts foods of CHX:CHCl 3:DMF:HOAc (85:10:3:2) Silica gel G Amyl acetate Silica gel G (2-dimensional) Silica gel Silica gel GF Annatto seeds Silica gel GF Annatto formulations Silica gel GF 1% HOAc in amyl acetate (1) CHCl 3:EtOAc (4:1) (2) Et 2O P E : E t 2 O : H O A c (85:15:2.5) (1) CHCl 3: HOAc (9:1) (2) Et 2O: IPA (9:1) (1) HEX:ACE(10:9) (2) DCM:Et 2O (9:1) (3) PE: BZ (1:1) (4) PE CHCl 3:HOAc:ACN:ACE (8:1:0.5:0.5) McKeown, 1961, 1963 Ramamurthy Bhalerao, 1964 Francis, 1995 Tirimanna, 1980 Preston and Rickard,1980 and Corradi and Micheli, 1981 Mínguez-Mosquera, Hornero-Méndez and Garrido-Fernández (1995) Galindo-Cuspinera and Rankin, 2005 ACE = Acetone; ACN = Acetonitrile; BZ = Benzene; CHX = Cyclohexane, CHCl 3 = Chloroform; DMF = N,N-Dimethylformamide; EtOAc = Ethyl acetate; EtOH = Ethanol; Et 2O = Diethyl ether; HEX = Hexane; HOAc = Acetic acid; IPA = isopropyl alcohol; PE = Petroleum ether; t-bme = tertiary butylmethyl ether - 143 -
다. Carotenoid계천연색소의 HPLC 분석법 (1) Carotenoid계천연색소의 HPLC 분석법확립 Carotenoid계천연색소의 HPLC 분석법은 carotenoid계천연색소인에대한개별적색소에대한최적조건을먼저확립하였다. 그리고이들에대한공통적인조건을찾아서최종적으로 carotenoid계색소의동일조건에의한분석법을확립하였다. 파프리카추출색소는색소의 matrix가단순하지않으며많은성분들을함유하고있어분리조건을결정하는데많은어려움이있었다. Carotenoid는일반적으로 acetonitrile 이나 methanol에잘녹지않는다. 따라서이들의용매를이동상으로사용하면분석시간이길어질뿐만아니라분리도용이하지않다. Carotenoid계색소의이동상으로 acetone과 H 2 O을선택하여조건을설정하였다. Fig. 43 파프리카추출색소에대한최적화된 HPLC chromatogram이다. 그러나이와같은조건으로는안나토색소나마리콜드색소의성분들을분리할수없었다. 따라서파프리카추출색소와다른조건을설정해야했다. 20 mau 15 10 5 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 min Fig. 43. Chromatogram of oleoresin paprika color optimized separation condition) 안나토색소의분리를위하여 32분에 acetone의조성을 64% 로설정하였으며마리골드의색소를분리하기위하여 85% 의조성으로설정하였다. 안나토색소는 bixin과 norbixn의주성분을함유하고있는데 carotenoid의성분을모두분리하기위해서는두성분의분리가 base line의분리형태로나타나지않았다. - 144 -
(2) Carotenoid계천연색소에대한확립된 HPLC 분석법 - Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm - Column 온도 : 35, - 이동상 : Gradient program 이동상 A: Acetone 이동상 B: 0.1% formic acid in H 2 O - 유속 : 0.34ml/min - 주입량 : 1-10μL - 검출기 : PDA(200nm-700nm) Table 88. HPLC Gradient Program for carotenoid color Time(min) Acetone Water 0.01 35 65 1 55 45 32 64 36 34 85 15 88 96 4 90 100 0 115 100 0 116 35 65 132 35 65 140 Stop - 145 -
1 파프리카추출색소다음의 Fig. 44은파프리카추출색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 45는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 44. Chromatograms of oleoresin paprika. a: 520nm, b: 330nm c: 420nm - 146 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 45. Chromatograms and spectrum of oleoresin paprika color. a: 520nm, b: Oleoresin Paprika, spectrum c: spectrum of 69.68 min, d: spectrum of 86.13 min e: spectrum of 89.32 min, f: spectrum of 92.68 min - 147 -
2 안나토색소다음의 Fig. 46은안나토색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 47는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 46. Chromatograms of annatto extract color a: 520nm, b: 330nm c: 290nm - 148 -
a b 2.0 1.5 Absobance 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 47. Chromatograms and spectrum of annatto extract. a: 520nm, b: annatto extract spectrum c: spectrum of 5.73 min, d: spectrum of 11.73 min e: spectrum of 39.04 min, f: spectrum of 42.00 min - 149 -
3 마리골드색소다음의 Fig. 48은마리골드색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 49는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 48. Chromatograms of tagetes extract. a: 520nm, b: 300nm c: 290nm - 150 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 49. Chromatograms and spectrum of tagetes extract. a: 520nm, b: tagetes extract spectrum c: spectrum of 13.22 min, d: spectrum of 18.86 min e: spectrum of 48.96 min, f: spectrum of 49.81 min - 151 -
(3) Carotenoid계천연색소의 HPLC 분석법과관련된국내외연구 Scotter et al. (1994) 는 norbixin과 bixin를씨로부터추출한색소추출물에서분리하였다. Column은 HiRPB RP C18 (5μm, 4.6mm x 250mm, Hichrom Ltd, Reading, UK) 을사용하였다. 이동상은 acetonitrile:acetic acid(65:35) 를사용하였다. 이때이동상의유속은 1mL/min이었고가시광선의검출파장은 495nm를사용하였다. Lancaster et al.(1995) 은치이즈, 버터, 마가린, 캔디등의식품으로부터석유에테르, hexane, chloroform 등의비극성용매를이용하여 annatto 색소성분을추출하고수용성 methanol을이용하여방해물질을제거한후 HPLC로 norbixin과 bixin을분석하였다. Column은 Supelco LC-18 (5μm, 4.6mm id x 250mm length, Supelco Co., USA) 와 Spectroflow 783 UV detector를사용하였으며이동상은 methanol:2% acetic acid(in water) 를사용하였으며이때이동상의유속은 1.0mL/min으로하고 UV 검출기는 500nm을사용하였다. Bareth et al. (2002) 는치이즈와유제품에서 annatto 색소를신속히추출하는법을개발하고이추출액에함유한 norbixin과 bixin등분리하기위하여 Shimadzu RP-HPLC system을사용하였다. Column은 Hypersil ODS2 (5μm, 4.0mm id x 250mm length, Cs-Chromatographie Service GmbH, Langerwehe, Germany) 를사용하였으며이동상은 acetonitrile: 수용액의 5% acetic acid (75:25) 를사용하였으며이때이동상의유속은 1.0mL/min으로하고 UV 검출기는 460nm을사용하였다. Noppe et al.(2008) 는육류에함유한 norbixin과 bixin을 RP-HPLC- DAD(Hewlett Packard, Palo Alto, CA, USA) 를사용하여분석하였다. Column은 Symmetry C18 (5μm, 2.1mm id x 150mm length, Waters, Milford, MA, USA) 를사용하였으며이동상은 acetonitrile (A용액), 수용액의 0.1% formic acid (B 용액 ) 를사용하였다. 이동상을기울기용리를사용하였으며분석시간은 30분이었다. 이때이동상의유속은 0.3mL/min으로하고검출기는 300-580nm에서모니터링하고검출은 458nm에서하고, oven 온도는 35 로유지하였다. - 152 -
3.3.3 Anthraquinone 계천연색소의계통별분석법가. Anthraquinone 계천연색소의기기검증및분석법검증 (1) Carminic acid 1 표준물질분석과표준검량선의직선성아래 Fig. 50는확립된 anthraquinone HPLC 조건으로 carminic acid 표준물질의분석한 chromatogram을나타낸것이다. Carminic acid의표준물질농도, 0, 2, 5, 10, 30, 60 μg/ml에서표준검량선을작성한결과, 상관계수 (correlation coefficient, R 2 ) 는 0.9992이었다 (Fig. 51과 Table 89). mau 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 min Fig. 50. HPLC chromatogram of carminic acid. Fig. 51. Calibration curve of carminic acid. - 153 -
2 검출한계및정량한계확립된 anthraquinon계 HPLC 분석방법으로 0 50μg/mL의농도에서산출된 chromatogram에서검출한계 (LOD) 는 1.49 μg/ml, 정량한계 (LOQ) 는 4.52 μg/ml 이었다 (Table 89). Table 89. Limit of detection(lod) and limit of quantification(loq) of carminic acid n=3 Standard Curve data 농도 (μg/ml) 0 2 5 10 30 60 면적 ( 10 6 ) 0.0±0.0 0.21±0.12 0.65±0.18 1.02±0.35 3.25±0.12 6.86±2.47 Reproducibility 반복 1st 2nd 3rd 4th 5th 6th Mean STDEV 기울기 116,672.5 118,015.6 96,962.6 99,043.3 125,238.3 114,970.4 104,434.1 11,277.4 절편 -45,251.1 36,624.9 45,908.9-38,771.6 52,009.3-38,628.2 40,358.9 47,272.5 1 Linearity ( 직선성 ) = 0.9992 2 Limit of detection (LOD, 검출한계 ) = (47,272.5 3.3) / 104,434.1 = 1.49 μg/ml 3 Limit of quantification (LOQ, 정량한계 ) = (47,272.5 10) / 104,434.1 = 4.52 μg/ml 3 정확도및정밀도정확성및정밀성을알아보기위해식품유형별로사탕, 식빵, 사이다에 carminic acid을 10, 50, 100µg/mL의농도로 spike하여첨가시료를만들고추출후정확성 ( 회수율 ) 을측정하였고, 3회반복추출하여상대표준편차 (RSD, %) 를산 출하여정밀성을나타내었다 (Table 90). 회수율은사탕은 68.9 74.6%, 식빵은 62.1 65.9%, 사이다는 70.6 72.5% 으로나타났으며식품유형에따른차이가나 타났다. 상대표준편차 (%) 는 1.74 4.41% 의범위를나타내었다. - 154 -
Table 90. Recovery(%) and relative standard deviation(rsd, %) of carminic acid in candy, bread, and cyder, n=3 식품 회수율 (%) 상대표준편차 (%) Carminic acid 농도 (µg/ml) 10 50 100 사탕 (Candy) 식빵 (Bread) 사이다 (Cyder) Recovery 68.9±1.7 70.4±2.1 74.6±1.3 RSD 2.46 2.98 1.74 Recovery 63.7±2.6 62.1±1.7 65.9±1.4 RSD 4.08 2.73 2.12 Recovery 70.6±2.4 73.9±1.5 72.5±3.2 RSD 3.40 2.03 4.41 나. Anthraquinone 계천연색소의 TLC 분석법 (1) Anthraquinone 계천연색소의 TLC 분석법확립 Anthraquinone계색소를 TLC 분리하기위하여 cellulose TLC (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA) 와 TLC Silica Gel 60 RP-18F254S (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA) 을사용하였다. Cellulose TLC에대한전개용매 n-butanol : water: acetic acid (4: 2: 0.1), n-butanol : water: acetic acid (5: 2: 0.1), ethanol: methanol: water: acetic acid (5: 2: 0.1), acetone: ethyl acetate: formic acid in water (1:2:1) 를사용하였다. n-butanol : water: acetic acid (5: 2: 1) 의용매조성이분리능이높았다. 이용매조성에서 butnanol의조성비율을 6까지높여도성분의 spot 는뚜렷이분리되었다. TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S에대한전개용매로 acetonitrile : 5% acetic acid in water(5: 6), methanol: 5% formic acid in water (5: 3), ethanol: 5% trifluoroacetic acid in water(1: 1), 2-butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 (1:1:1) 을사용하여최적조건을검색하여보았다. 이들전개용매조건중에서 ethanol: 5% formic acid in water (5: 3) 과 2-butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 (1:1:1) 의용매조성이코치닐과락색소에서천연색소에대한분리능이좋았으나홍화황색소는색소가분리가확산에의해분간하기어려웠다. 따라서 Anthraquinone계천연색소분리에서 2-butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 (1:1:1) 의용매조성을사용하도록하였다 (Fig. 52). 코치닐색소와락색소에서는주색소에해당하는 spot(rf = 0.95)) 와주색소밑에작은 spot(rf = 0.94) 이나타났다. 락색소에서는주색소 ((RF = 0.97) 희미한 spot 4개가있었다 (Fig. 52). 홍화황색소는 5개의노란색 spot이 RF값이 0.75-0.96사이에나타났다. - 155 -
a b c Fig. 52. Thin layer chromatogram of standard solution of anthraquinone color. a: 코치닐색소 (Cochineal extract) b: 락색소 (Lac color) c: 홍화황색소 (Carthamus yellow) - TLC plate TLC Silica Gel 60 RP-18F254S (Aluminum sheets, Merck, USA) - 전개용매 2-Butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 = 1: 1: 1-156 -
(2) Anthraquinone 계천연색소의 TLC 분석법과관련된국내외연구 국내외보고된연구자료를살펴보면다음과같다. Hofenk-de et al.(2004) 은코치닐 추출색소을분석하는데있어서 10 여년전에는정성적확인방법으로많이사용했지 만지금은 HPLC 의법으로대치되고있다고하였다. 즉코치닐색소분석에서 carminic acid정량은대부분 HPLC 방법으로실행되고있어최근에 TLC를이용하여 carminc acid를분석한연구보고는거의없는실정이다. 식품중식품첨가물분석법에는 RP-18F245(10x10cm, HPTLC plate) 를사용하여 laccaic acid와 carminic acid를분리하였다. 이때사용된전개용매는 0.5N-80% methanolic oxalic acid(60:40) 을락색소정성과정량에사용하였던같은방법으로제시하고있다. TLC는락색소의실험에서순수한색소로정제하기위한 preparative TLC로사용되었거나정성적으로사용하여 lac색소가시료에함유되었는지를파악하기위하여사용되었다. TLC 크로마토그래피의분석은 RP-C18과 silica gel TLC plate가가장많이사용되는데분리에서가장중요한것은전개용매의조성의조건개발이다. Silica gel TLC의전개용매로사용된조성은 1% oxalic acid in ethyl acetate, chloroform:methanol:water (90:10:1), 1-butanol:acetic acid:water(4:1:5) 이었고식품중식품첨가물분석법에는 RP-C18 TLC에서는 methanol; 0.5N-80% methanolic oxalic acid (6:4) 이었다. Haque, Faraq과 Ali (1998) 는실온에서물로락색소를추출하고칼슘염으로침전시켜얻은추출물을산성화한다음이추출물을 TLC(1-butanol:acetic acid:water=4:1:5) 로순수분리하였다. TLC 분석에서 laccaic acid A1, B, C를분리하였다 (Rf 0.75, laccaic acid A1; Rf 0.85, laccaic acid B+C). 홍화황색소에대한연구는황화적색소에비해적게검색이되었으며 TLC에대한연구보고가거의없었다. JECFA에서는 Safflor yellow A와 safflor yellow B를각 각 safflomin A 와 safflomin B 로명명하고있으며이색소에대한 JECFA 의순도 test는 TLC에의한방법이규정되어있다. 이방법에는 cellulose를 20분간 60-80 에서활성화시키고 methanol로시료를용해하여 10% 시료용액을제조하고 20μL을 TLC plate에 spotting 한다. 시료가건조되면 n-butanol, acetic acid, water(4:1:2) 혼합용매로전개 tank에포화시켜준비한전개조에 TLC plate를장착시킨다. 전개용매상단이 10cm 이동했을때 plate를꺼내어건조시키고 carthamus yellow 색소 2개가나타나는지관찰한다. Carthamus yellow 색소의 Rf값은 0.2-0.5 범위에있다. TLC에의한 safflomin A와 safflomin B의정성분석은 JECFA 방법이잘확립되어있지만추후더검색하여 TLC 방법에최적방법이확립되어야할것이다. - 157 -
다. Anthraquinone 계천연색소의 HPLC 분석법 (1) Anthraquinone계천연색소의 HPLC 분석법확립 Anthraquinone계천연색소의 HPLC 분석법은천연색소인코치닐색소, 락색소, 홍화황색소를분리하였다. 락색소의주성분은 laccaic acid A, laccaic acid B, laccaic acid C, laccaic acid이며락색소는이들의혼합물로구성이되어있으며 laccaic acid A가가장많이함유되어있고다음으로 laccaic acid C가가장많이함유되어있다고보고되었다. 코치닐색소의주성분은 carminic acid로낮은산성에서불용성이라는제한성을갖고있다 (Sugimoto et al., 2002). Anthraquinone 계색소는순수한 methanol이나 acetonitrile 로이동상을사용하면 flavonoid색소같이 peak가 broad하게분리되어 10% formic acid를함유한 acetonitrile 을사용할때대부분의 peak들에대한분해능이높아졌다. 따라서 A 이동상은 10% formic acid를함유하는 acetonitrile 을사용하였으며 B 이동상은 10% formic acid를함유하는 H 2 O를사용하였다. Acetonitrile 은초기 2% 로시작하여 88분에는 20% 로 linear type으로 gradient를사용했다 (Table 91). Fig. 53는락색소의전형적인 chromatogram으로분리된 peak들을 laccaic acid로추정된다. 40 mau 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 min Fig. 53. Chromatogram of lac color. 520nm. - 158 -
(2) Anthraqunone계색소의확립된 HPLC 분석법 - Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm - Column 온도 : 35, - 이동상 : Gradient program 이동상 A: 10% formic acid in acetonitrile 이동상 B: 10% formic acid in H 2 O - 유속 : 0.34ml/min - 주입량 : 1-10μL - 검출기 : PDA(200nm-700nm) Table 91. Gradient program for anthraquinone color Time Acetonitrile Water 0.01 2 98 88 20 80 90 100 0 115 100 0 116 2 98 132 2 98 135 Stop - 159 -
1 코치닐색소다음의 Fig. 48은코치닐색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 55는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 54. Chromatograms of cochineal extract. a: 520nm, b: 250nm c: 410nm - 160 -
a b 1.5 Absobance 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 55. Chromatograms and spectrum of cochineal extract. a: 520nm, b: cochineal extract, spectrum, c: spectrum of 44.44 min, d: spectrum of 46.69 min e: spectrum of 67.08 min, f: spectrum of 79.31 min - 161 -
2 락색소다음의 Fig. 56은락색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 57는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 56. Chromatograms of lac color. a: 520nm, b: 260nm c: 290nm - 162 -
a b Absobance 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 57. Chromatograms and spectrum of lac color. a: 520nm, b: lac color spectrum c: spectrum of 36.58 min, d: spectrum of 63.70 min e: spectrum of 70.73 min, f: spectrum of 75.80 min - 163 -
3 홍화황색소다음의 Fig. 58은홍화황색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 59는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 58. Chromatograms of carthamus yellow. a: 520nm, b: 290nm c: 400nm - 164 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 59. Chromatograms and spectrum of carthamus yellow. a: 520nm, b: carthamus yellow spectrum c: spectrum of 31.86 min, d: spectrum of 44.16 min e: spectrum of 60.19 min, f: spectrum of 71.16 min - 165 -
(3) Anthraquinone계천연색소의 HPLC 분석법과관련된국내외연구 Valianou et al., (2009) 는식품중에함유한 carminic acid 등다른색소를분리하기위하여 RP-HPLC/DAD를사용하여분석하였다. Column은 Alltima HP C18 (5μm, 3.0mm id x 250mm length, Alltech Deerfield, IL) 를사용하였으며이동상은수용액에 0.1% trifluoroacetic acid (A용액), acetonitrile에 0.1% rifluoroacetic acid (B용액 ) 으로하여기울기용리를이용하였다. 기울기용리는 A용액을 95% 로 1분간유지하다가 70% 로 15분동안감소하고 40% 로 5분동안감소하였다. 이때이동상의유속은 0.5mL/min으로하고검출기는 190-700nm에서모니터링하였으며 oven 온도는 3 5 로유지하였다. Serrano et al.(2011) 는다양한천연색소원료에 carminic acid 등색소성분을분리하기위하여 RP-HPLC-DAD(Thermofinnigan, USA) 를사용하여분석하였다. Column은 Zorbax Eclipse plus C18 (5μm, 2.1mm id x 150mm length, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) 를사용하였으며이동상은 100% methanol (A용액), 수용액에 0.3% perchloric acid (B용액) 으로하여기울기용리를이용하였다. 기울기용리는 A용액을7% 로 2분간유지하다가 15% 로 6분동안증가하고 75% 로 17분동안증가하고, 80% 로 2분동안증가시키고마지막으로 95% 로 2분간유지하였다. 이때이동상의유속은 0.5mL/min으로하고검출기는 200-600nm에서모니터링하였으며 oven 온도는 35 로유지하였다. Table 92. Summary of TLC analytical conditions for chochineal color Sample HPLC conditions Reference Yoghurt Yoghurt, cheese, cookie, filling, alcoholic beverage Fruit jelly, liqueur, juice, yoghurt, ice cream. RP-HPLC: acetonitrile:1.19m formic acid with diode array detection at 280 and 500nm RP-HPLC: acetonitrile:1.19m formic acid with diode array detection at 480nm and fluorimetric detection at Ex=470nm and m=600nm RP-HPLC : methanol:phosphate buffer ph 6. UV detection at 280nm Jalón et al., 1989. Carvalho and Collins, 1997. Merino, Edberg and Tidriks, 1997 Table 92에코치닐색소에대한 HPLC 조건의요약을나타내었다. Karapanaglotis et al.(2008) 은곤충 (cochineal, kermes) 에서색소물질을추출하고 HPLC(Agilent Technologies, Hewlett-Packard, Germany) 와 DAD(diode array detector) 를연결하여분석하였다. Column은 Nova-Pak C18 (4μm, 3.9mm id x 150mm length, Merck) 를사용하였으며수용액에 0.1% trifluoroacetic acid (A용액), acetonitrile에 0.1% - 166 -
trifluoroacetic acid (B용액) 으로하여기울기용리를이용하였다. 이때이동상의유속은 0.8mL/min으로하고검출기는 495nm을사용분석하였다. 락색소에대한연구는 2000이전에는활발히진행되었으나 2001년이후에는연구보고가검색되지않고있다. 현재는락색소표준물질이 Wako에서구입이가능하나 2008 년이전에는락색소의표준물질의확보가어려워락색소에대한연구가미진한것으로판단된다. Oka et al. (1998) 는고속 counter-current chromatography과두용매 system으로분리하고 HPLC/MS로확인하였다. lac 색소 25mg으로부터 97.2% laccaic acid C 2.6mg과 98.1% laccaic acid A 9.5mg, 98.2% laccaic acid B 3.6mg, 95% anthraquinonedicarboxylic acid 0.5mg을얻었다. Carbalho et al.(1997) 은 HPLC/MS(ESI LC/MS/MS) 을이용하여 jelly 에함유하는 laccaic acid 를분석하였 다. Braockmann. et al. (1989) diazomethane으로 lac색소를 methylation하여식품중의 lac색소를검출하였다. 이실험에서 lac색소는 methanolic oxalic acid로추출하였으며 Amberlite XAD-2 column에주입하여 methanolic oxalic acid로용출하였다. Lac색소를함유하는분획을 diazomethane과반응시켜적자색지표를만들었다. 반응혼합물에이색은 TLC나 RP-HPLC에서검출된다. 적등색지표는전개용매 (chloroform:methanol:water=90:10:1) 을사용하는 silica gel TLC에서다른분리물질과완전히구분되어진다. Novotna et al., (1999) 는 ethanol-water-oxalic acid 혼합용액으로식품중의 lac색소를추출하였고 polyamide를고정화한 column을사용하여정제하였다. 그리고정제된색소는 TLC와 HPLC를이용하여분석하였다. - Hofenk (2004) 는시판용 lac색소나식품에서추출한시료를 HPLC를이용하여 laccaic acid A와 B를분리하였다. 이때사용된 column은 Nucleosil 5 C18이었고이동상은 acetonitrile-5% H 3 PO 4 을사용하였다. 시판용 lac색소는 1.66-1.69% 의 laccaic acid를함유하였고 0.40-0.42% 의 laccaic acid B를함유하고있는반면크래커식품에는 3.7μg/g의 laccaic acid를함유하였다. Surowiec et al.,(2004) 는 lac색소추출법에대한연구를하여 laccaic acid의성공적으로품질을향상시켰다. 즉 stick lac를실온에서 methanol에침지하고 methanol 추출물을감압농축한후그잔사을 ph 4.0-4.5로조정한후물로추출하였다. 이수용액을다시감압농축하고 65 이하에서 85% ethanol용액에녹였다. 이 ethanol 용액을여과하고감압농축하여잔사를얻었으며이것을 ph 4.0-4.5로조정한후물로추출하였다. Zhang et al. (2009) 는다양한홍화황색색소식품을재배한후이들에서홍화황색색소를물로추출하고 RP-HPLC로분리하였다. 이동상은 10% acetonitrile (in water) - 167 -
를사용하였다. 이동상은 isocratic으로하였으며 403nm 파장에서색소물질을검출하였다. Tian et al.(2010) 은홍화황색색소재료에서 Carthamus yellow을물로추출하고 RP-HPLC system으로색소를정량하였다. 이동상은 acetonitrile ( 용액 A) 와 0.02 M KH2PO4(pH 3.5로조정, 용액 B) 를사용하였다. 검출파장은 403nm을사용하였고시료주입량은 50μL 였다. Shi et al. (2008) 는사람혈청에 0.5mL에 0.1M HCl 을가하고 tert-butyl ether로색소를추출한다음 LC/MS/MS system으로분석하였다. 이동상은 methanol-water(95:5) 의조성으로이때이동상의유속은 1.0mL/min으로하였다. 대부분의이동상은 methanol, acetonitile을 acetic acid나 trifluoroacietic acid를 modifier로사용하는이동상조성이었다. - 168 -
3.3.4 기타천연색소의계통별분석법가. 기타천연색소의기기검증및분석법검증 (1) Curcumin 1 표준물질분석과표준검량선의직선성시판되는 Curcumin 표준물질은 curcumin외에도 bisdemethoxycurcumin과 demethoxycurcumin을상당량함유하고표준물질로사용하기에는순도가너무낳다. 시판표준물질 0.5g을사용하여 Preparative HPLC로정제하여 curcumin 표준물질 200mg을정제하였다. Fig. 60는확립된기타색소 HPLC 조건으로 preparative HPLC로정제된 curcumin 표준물질을분석한 chromatogram을나타 낸것이다. Curcumin 의표준물질농도, 0, 2, 5, 10, 20, 40 μg/ml 에서표준검 량선을작성한결과, 상관계수 (correlation coefficient, R 2 ) 는 0.9994 이었다 (Fig. 61 과 Table 93). mau 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 min Fig. 60. HPLC chromatogram of curcumin standard solution - 169 -
Fig. 61. Calibration curve of curcumin. 2 검출한계및정량한계확립된기타색소 HPLC 분석방법으로 0 40μg/mL의농도에서산출된 chromatogram에서검출한계 (LOD) 는 0.12 μg/ml, 정량한계 (LOQ) 는 0.39μg/mL 이었다 (Table 93). Table 93. Limit of detection(lod) and limit of quantification(loq) of curcumin, n=3 Standard Curve data 농도 (μg/ml) 0 1 5 10 20 40 면적 ( 10 4 ) 0.0±0.0 0.11±0.12 0.39±0.23 0.88±0.11 1.65±0.42 3.26±0.96 Reproducibility 반복 1st 2nd 3rd 4th 5th 6th Mean STDEV 기울기 910.5 921.0 756.7 772.9 977.4 897.2 815.3 88.0 절편 227.1 183.8 230.4 184.5 261.1 189.9 202.6 31.7 1 Linearity ( 직선성 ) = 0.9994 2 Limit of detection (LOD, 검출한계 ) = (31.7 3.3) / 815.3 = 0.12 μg/ml 3 Limit of quantification (LOQ, 정량한계 ) = (31.7 10) / 815.8 = 0.39 μg/ml - 170 -
3 정확도및정밀도정확성및정밀성을알아보기위해식품유형별로사탕, 식빵, 사이다에루틴을 10, 50, 100µg/mL의농도로 spike하여첨가시료를만들고추출후정확성 ( 회수율 ) 을측정하였고, 3회반복추출하여상대표준편차 (RSD, %) 를산출하여정밀성을나타내었다 (Table 94). 회수율은사탕은 90.5 98.2%, 식빵은 97.5 101.3%, 사이다는 90.6 93.1% 으로나타났으며식품유형에따른차이가나타났다. 상대표준편차 (%) 는 1.73 4.19% 의범위를나타내었다. Table 94. Recovery(%) and relative standard deviation(rsd, %) of curcumin in candy, bread, and cyder, n=3 식품 회수율 (%) 상대표준편차 (%) Curcumin 농도 (µg/ml) 10 50 100 사탕 (Candy) 식빵 (Bread) 사이다 (Cyder) Recovery 90.5±3.8 91.4±2.7 98.2±3.1 RSD 4.19 2.95 3.16 Recovery 98.1±1.7 97.5±4.7 101.3±2.1 RSD 1.73 4.82 2.07 Recovery 90.6±2.4 92.3±2.8 93.1±3.6 RSD 2.65 3.03 3.86-171 -
나. 기타천연색소의 TLC 분석법 (1) 기타천연색소의 TLC 분석법확립기타천연색소의 TLC 분석법을개발하고자 Cellulose TLC (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA), TLC Silica gel 60 (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck) 와 TLC Silica Gel 60 RP-18F254S (Aluminum sheets 20 x 20cm, Merck, USA) 의 TLC plate를이용하였다. Cellulose TLC 의전개용매조성 n-butanol : water: acetic acid (4: 2: 2) 와 acetone: ethyl acetate: 5% formic acid in water (1: 2: 1) 을비교하여보았다. n-butanol : water: acetic acid (4: 2: 2) 의조성에서고량색소와비트레드색소가분리가뚜렷했으나 acetone: ethyl acetate: 5% formic acid in water (1: 2: 1) 의조성과비교할때치자황색소의 spot 수가적었다. TLC Silica gel 60의 plate를이용하여전개용매 ethyl acetate: methanol: water(5:5:1) 와 butanol : methanol: water(4: 3: 1) 을비교하여보았다. ethyl acetate: methanol: water(5:5:1) 의조성에서심황색소의 RF값은 1에가까웠으나비트레드는거의전개되지않았다. Cellulose TLC에서비트레드의 RF값은 0.3이상으로 silica gel plate보다분리가훨씬뛰어났다. TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S의 plate에 acetonitrile : acetic acid in water (5: 6) 와 2-Butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 (1:1:1) 의전개용매조성으로치자황색소, 고량색소, 심황색소, 비트레드를분석하였을때두용매조성간에비슷한 chromatogram 을얻었으나비트레드의 spot 분리가훨씬뛰어났다. 기타색소에서는 2-Butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 (1:1:1) 를전개용매로사용하여기타천연색소를분리하였다. 이조성은 anthraquinone 계색소에서사용하던 TLC 용매조성과같은조성으로 TLC에서는 anthraquinone 계천연색소와기타천연색소를동시분석할수있다. Fig. 62는치장황색소, 고량색소, 심황색소, 비트레드을전개용매 2-Butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 (1:1:1) 로분리한 chromatogram 이다. 치자황색소는다른색소와달리여러개의황색 spot로구성되어있으며 RF값의범위는 3.0-0.95 로색소가넓은범위에산재한다. 고량색소는갈색의천연색소인데가시적으로색소분리 spot를관찰할수없으나 375nm의자외선을조사할때두개의선명한 spot를관찰할수있으며 RF값은 0.25, 0.38이다. 심황색소는 bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin, curcumin의주성분으로구성되어있으나 TLC chromatogram 에서는 RF 값이 0.25인서명한밝은노란색의 spot 하나만관찰할수있어세개의주성분이분리되지않은것으로판단된다. 비트레드는붉은천연색소로두개의 spot로분리되었으며 RF값은 0.89 와 0.94이었다.. - 172 -
a b c d Fig. 62. Thin layer chromatogram of standard solution of miscellaneous natural color. a: 치자황색소 (Gardenia yellow) b: 고량색소 (Koaliang color), 375nm c: 심황색소 (Turmeric oleoresin) d: 비트레드 (Beet red) - TLC plate TLC Silica Gel 60 RP-18F254S (Aluminum sheets, Merck, USA) - 전개용매 2-Butanone: methanol: 5% Na 2 SO 4 = 1: 1: 1-173 -
(2) 기타천연색소의 TLC 분석법과관련된국내외연구치자색소의분석을 TLC를이용하여정량이나정성을한연구보고는많지않다. Kim et al.(2008) 에서 2차대사물질에대한연구에서배설물의 crocetin과 crocin을 Silica gel 60F TLC(Merck, Germany) 로분석하였다. 전개용매는 CHCl3:MeOH(6:1) 로사용하였다. 또한 Xu-lan et al.(2011) 은 Crocetin을정성분석하기위하여 TLC를사용하였다. TLC(silica gel 60F-254) 에전개용매 CHCl3:MeOH:water(60:10:1) 을사용하여정성분석을하였다. 고량색소분리에는 TLC에의한연구가많이발표되지않았다. 아마시료의 matrix 가다른시료에비해복잡하기때문일것으로판단된다. 색소의이성질체도많이있으며다량체로형성된색소물질도많이검출된다. Glavnik et al. (2010) 은 silica gel TLC plate를이용하여 procyanidin의이성질체에대한연구하였다. 이때전개용매는 20% sodium chloride-ethyl acetate(2:3). 색소는전개되어도선명한자체색을띠기때문에발색을위한다른시약의처리가필요없으나색소의감도가낮을때에는식품중식품첨가물분석법에서고량색소를확인하는시험같이미리 TLC plate에시약을처리할있다. Prussian blue법은 silica gel TLC plate에 0.02M 염화제이철에침지시킨후 30 에서품건하고고량색소표준용액및시료용액에같은양의발색제 0.016M 페리시아화칼륨을첨가한반응시킨후미리만든건조한 TLC plate에흡착시킨후건조한다. 이때표준용액과같이청색의반점이형성되면고량색소가함유하는것으로판정한다. 또한 Vanillin법에서는박층판을바닐린시약에침지시킨후 3 0 건조기에서건소한후따로고량색소표준용액과시료용액에동량의염산 1mL 을첨가하여 30 에서 20분간반응시킨후, 앞서만든 TLC plate에시료를흡착시켰을때분홍색이나타나면양성으로판정한다. Tennesen et al. (1985) 는 curcumin의 feruloylmethane를 silica gel HP254 TLC plate(merck) 를이용하여정성적으로분석했고또는동일 TLC plate와 KC18 (Whatman) 을이용하여 curcumnoid와 curcumin를정량하였다 (Tennesen et al., 1985). 이때 chloroform/ethanol/water(25:0.96:0.04) 와 chloroform/anhydride acetic acid(10:1) 을사용하였다. 그이후같은연구팀에서 (Tennesen et al. 1991) 에서 NH2F2548b Merck (10 x 10 cm, layer thickness, 0.2 μm) HPTLC의 TLC plate와 ethanol/water(96:4) 의전개용매를사용하여 curcumnoid와 curcumin를분석하였다. 이때 Shimadzu TLC scanner(dual-wavelength Flying spot, CS-9000) 를사용하여정량하였다. Pan et al. (1999) silica gel plates (Silica Gel 60 F254, 20 3 20 cm; - 174 -
thickness, 2 μm; catalog 5717; E. Merck) 와 4% ethanol (in chloroform) 을사용하여 curcumin을분석하였다. 식품중식품첨가물분석법에는 silica gel G와 RP-18 aluminium TLC plate를사용하였다. 전개용매로서 silica TLC는 chlorofrom과 methanol(47:3) 의비율로사용하고역상 TLC의경우 70% methanol(in water) 과초산 (98:2) 을사용하였다. 분리 spot는자연광에서육안으로관찰이가능하다. Silica gel TLC는색소의분리가 RP-18보다양호하여정성적으로심황색소를분석할때 silica TLC가추천된다. - 175 -
다. 기타천연색소의 HPLC 분석법 (1) 기타천연색소의 HPLC 분석법확립기타천연색소는 carotenoid 계천연색소인치자황색소, flavonoid 계천연색소인고량색소, curcuminoid 계인심황색소, betacyanin 계인비트레드로구조로이루어져있다. 치자황색소는 acetonitrile 이나 methanol의이동상으로분리가잘이루어지나 acetone을주조성으로하는이동상에서는 gradient 조성을찾기힘들었다. 치자황색소는기타천연색소의최적조건인 50% acetonitrile 의조성에서 base line 형의분리가이루어졌다.. 고량색소는성분은 apigenin, procyanidin, luteolinidin 등이있다. 이들의성분들은다른 flavonoid계성분들보다지용성이강하여 flavonoid계천연색소와같은조건의이동상에서용출이되지않고더늦은시간대에용출되기때문에기타색소에포함시켰다. 심황색소의주성분은 bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin, curcumin인데 Fig 63는심황색소최적은분리조건에서분리한 chromatogram이다. 그러나기타천연색소에서확립된조건에서는 90분대에 3개성분이근접해서용출되고있다 (Fig.68). 비트레드는기타천연색소에서분석시간의중간에걸쳐서용출되는성분으로구성되어있어분리하는데어려움은없었다. 250 mau 200 150 100 50 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 min Fig. 63. Chromatogram of cochineal extract color. - 176 -
(2) 기타천연색소색소의확립된 HPLC 분석법 - Column (Phenomenex, Torrance, CA. USA) Luna C18(2): 3.0mm I.d. 150mm, 입경 3μm - Column 온도 : 35, - 이동상 : Gradient program 이동상 A: 0.1% formic acid in acetonitrile 이동상 B: 0.1% formic acid in H 2 O - 유속 : 0.34ml/min - 주입량 : 1-10μL - 검출기 : PDA(200nm-700nm) Table 95. HPLC Gradient Program for miscellaneous natural color Time(min) Acetonitrile Water 0.01 2 98 88 50 50 90 100 0 115 100 0 116 10 90 132 10 90 135 Stop - 177 -
1 치자황색소다음의 Fig. 64은치자황색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 65는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 64. Chromatograms of gardenia yellow. a: 520nm, b: 330nm c: 390nm - 178 -
a b 2.5 2.0 Absobance 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 65. Chromatograms and spectrum of gardenia yellow. a: 520nm, b: gardenia yellow, spectrum c: spectrum of 54.00 min, d: spectrum of 58.22 min e: spectrum of 69.47 min, f: spectrum of 71.76 min - 179 -
2 고량색소다음의 Fig. 66은고량색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 67는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 66. Chromatograms of kaoliang color. a: 520nm, b: 270nm c: 380nm - 180 -
a b Absobance 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 67. Chromatograms and spectrum of kaoliang color. a: 520nm, b: kaoliang color, spectrum, c: spectrum of 35.86 min, d: spectrum of 51.61 min e: spectrum of 62.44 min, f: spectrum of 69.75 min - 181 -
3 심황색소다음의 Fig. 68은심황색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 69는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 68. Chromatograms of turmeric oleoresin. a: 520nm, b: 320nm c: 400nm - 182 -
a b 3.0 2.5 Absobance 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 69. Chromatograms and spectrum of turmeric oleoresin) a: 520nm, b: turmeric oleoresin, spectrum, c: spectrum of 43.28 min, d: spectrum of 90.78 min e: spectrum of 92.50 min, f: spectrum of 94.18 min - 183 -
4 비트레드다음의 Fig. 70은마리골드색소의최대흡수파장에서의 chromatogram과주요파장에서의 chromatogram이다. Fig. 71는색소의 spectrum과주요 peak의 spectrum을나타내었다. a b c Fig. 70. Chromatograms of beet red. a: 520nm, b: 240nm c: 290nm - 184 -
a b 0.6 Absobance 0.4 0.2 0.0 200 300 400 500 600 700 c Wavelength(nm) d e f Fig. 71. Chromatograms and spectrum of beet red. a: 520nm, b: beet red spectrum c: spectrum of 29.12 min, d: spectrum of 38.02 min e: spectrum of 40.42 min, f: spectrum of 46.04 min - 185 -
(3) 기타천연색소의 HPLC 분석법과관련된국내외연구 Hori et al.(1988) 은사프란색소의분리에있어 crocin과 crocetin을분리하고자 HPLC를이용하였다. Ethanol 70% 을시료에가하고균질화한다음원심분리하여시료를추출하였다. Column은 Lichrosorb RP-18 (5μm, 0.4 x 25cm, Merck) 과 Lichrosorb SI-60(7μm 0.4 x 25cm, Merck) 을사용하였다. Cormier et al.(1995) 은 saffron을세포배양한후이시료에서 crocetin을추출하여 HPLC로분석하였다. Column은 ODS-2 (10μm, 0.46cm id x 25cm length, Merck) 를사용하였으며이동상은수용액에 1% acetic acid (A용액) 와 methano에 1% acetic acid (B용액) 으로하여기울기용리를이용하였다. 기울기용리는 A용액을 100% 로시작하여 50% 로 10분동안감소하고 50% 에서 0% 까지 30분동안감소하였다. 이때이동상의유속은 1mL/min으로하고검출기는 440nm을사용분석하였다. Glavnik, et al.(2010) 는 crocetin을분석하기위하여 RP-HPLC/DAD를사용하여분석하였다. Column은 Sugerlabor Inertsil ODS 25μm (25μm, 0.46cm id x 25cm length, Sugerlabor) 를사용하였으며이동상은수용액에 10% acetonitrile과 0.05% trifluoroacetic acid (A용액 ), 수용액에 10% acetonitrile과 0.95% trifluoroacetic acid (B용액) 과 100% acetonitrile (C용액) 으로하여기울기용리를이용하였다. 기울기용리는 A용액을 82.5% 로 5분간유지하다가 18.8% 로 15분동안감소하고 18.8% 에서 C용액 100% 까지 15분동안증가하였다. 이때이동상의유속은 0.8mL/min으로하고검출기는 190-700nm에서모니터링하여분석하였다. Dallas et al. (1995) 는 red wine 시료로부터추출한 apigenin, procyandidin을 RP-HPLC로분리하였다. Column은 Superspher 100 (5μm, 4.6mm x 250mm, Merck, Germany) 을사용하였다. 동상은 acetic acid-water(10:90, A 용액 ), 증류수 (B용액) 를사용하였으며기울기용리는다음과같다. 초기 10% A용액으로시작하여 20분에 A용액 50% 로상승하고 30분에는 A용액 70% 로상승하였다. 이때이동상의유속은 1.0mL/min이었고가시광선의검출파장은 280nm를사용하였다. Carando et al. (1999) 은 white wine으로부터 procyandidin을 RP-HPLC-Fl 사용하여분석하였다. Column은 Nucleosil 100 C18 (5μm, 20mm id x 250mm length, Hewlett Packard, USA) 와 Fluorescence detector 사용하였으며이동상은 20mM acetic acid(in water, A 용액 ) 과 methanol (B 용액 ) 를사용하였다. 기울기용리는 0-5min 98% 용액 A; 5-12min from 98 to 93 solvent A; 12-18min from 93 to 89 solvent A; 18-28min from 89 to 85 solvent A 으로하였다. 이때이동상의유속은 0.5mL/min으로하고 - 186 -
형광검출기는 Ex 275nm, Em 322을사용하였으며시료주입량은 10μL였다. Adamson et al. (1999) 는 Cocoa 식품에서시료를분말화하고 hexane으로탈지하여시료를건조하고여기에 acetone으로 procyanidin을추출하였다. 이추출물을건고하고다시 hexane으로지방을추출하여완전히시료가함유하는지질을제거하였다. 시료분석은 RP-HPLC을이용하여 procyanidin 분석하였다. Column은순상, Supelcosil LC-Si 100 Å (5μm, 4.6mm id x 250mm length, Supelco, Co. USA) 을사용하였다. 이동상은 methylene chloride/acetic acid/water(96:2:2) 를사용였다. 이때이동상의유속은 1.0mL/min으로하고 UV 검출기는 280nm을사용하였다. Hammerstone et al.(1999) 는 cocoa식품에서 procyanidin을 Adamson et al.(1999) 와비슷한방법으로추출하고 RP-HPLC-MS(Agilent, Waldbronn, Germany) 를사용하여분석하였다. Column은 Luna silica column (5μm, 2.1mm id x 150mm length, Alltech, USA) 과 guard column, Alltech AlltimaC18 guard column (12.5 mm 4.6 mm, 5 μm) 를사용하였으며이동상은 (A) dichloromethane, (B) methanol, and (C) 50% acetic acid(in water). 기울기용리는다음과같은 program으로행하였다. 초기에는 14% B in A; 14-28.4% B in A, 0-30 min;28.4-50% B in A, 30-60 min; 50-86% B in A, 60-65 min;65-70 min은 isocratic. 이때이동상의유속은 0.2mL/min으로하여분석하였다. Peng et al.(2001) 은포도에서 procyanidin을 70% ethanol로추출하고여과한후 Waters HPLC/PDA system로분리하여색소물질을정량하였다. Column은 Exsil 100 (5μm, 20mm id x 250mm length, Activon, Sydney, Australia) 과 guard column Exsil 100 (Guard C18, Activon, Sydney, Australia) 을사용하였으며이동상은 0.1% phosphoric acid (A용액), 82% acetonitrile (B용액)) 를사용하여기울기용리로물질을용출시켰다. 이때유속은 0.8mL/min으로하고검출기는 200-500nm에서모니터링하고검출은 280nm에서하고, oven 온도는 35 로유지하였다. Tayyem et al. (2006) 는 5종양념류에 methanol을이용하여추출한다음 curcumin을 RP-HPLC로분리하였다. Column은 Waters Symmetry Shield (5μm, 3.9mm x 150mm, Millipore Co., Milford, MA, U.S.A) 을사용하였다. 이동상은 acetonitrile:methanol:water:acetic acid (40:23:36:1) 를 isocratic 으로하여 curcumin 을분리하였다. 이때이동상의유속은 1.0mL/min이었고가시광선의검출파장은 262nm 를사용하였다. Jayaprakasha et al. (2002) 은 curcumin 양념에 95 % ethanol을가하여 24시간동안 curcumin을추출하고감압건조하여 curcumin의분석시료로사용하 - 187 -
였다. 색소분석은 RP-HPLC system을이용하여분석하였다. Column은 C18 column, ODS (hypersil) (5μm, 20mm id x 250mm length) 을사용하였으며이동상은 40% tetrahydrofuran(thf) 와 60% 1% citric acid(in water) 를사용하였다. 이때이동상의유속은 0.7mL/min으로하고 UV 검출기는 420nm을사용하였으며시료주입량은 5μL였다. Jadhav et al. (2007) 는 Turmeric 분말을 hexane의용매를이용하여지방을추출하고분말을건조후 methanol을가하여시료를추출하였다. Curcuminoid를분석하기위하여 Hypersil, Thermo, Vydac column을사용하여최적의 column을선정하였다. Curcuminoid분석은 Vydac column을선정하였다. 같은종유의역상 C18 Column일지라도분리가다르게되는이유는충진물질의표면적과 column의 end capping 비율에따라다른것으로판단된다. Column은 Vydac (5μm, 4.6mm id x 250mm length, (Vydac, Separation Group Inc. Hesperia CA., USA)) 을사용하였다. 이동상은 acetonitrile-0.1% trifluoroacectic acid(in water) 를이동상으로사용하였으며조성은 50:50으로 isocratic으로분석물질을용출하였다. 이때이동상의유속은 0.8mL/min으로하고 UV 검출기는 420nm을사용하였으며시료주입량은 10μL였다. - Schibor et al.(2010) 는생체시료에서 curcuminoid의 2차대사산물과 curcumin을분석하기위하여 ethanol과 methanol 혼합용매 (95:5) 를사용하여 curcumin을추출하였다. 추출한 curcumin은 Jasco RP-HPLC-Fluorescence(Jasco co, Tokyo, Japan) 를사용하여분석하였다. Column은 Jasco Reprosil-Pur Basic (5μm, 4.6mm id x 250mm length) 를사용하였으며이동상은 76% acetonitrile(in water) 을 isocratic으로사용하였다. 이때이동상의유속은 0.5mL/min으로하고 Fluorescence 검출기는 Ex 420nm, Em 470nm을사용하였으며시료주입량은 20μL였다. Tsai et al.(2011) 은실험동물에 curcumin을투여하고혈액과장기에함유하는 curcumin을 50% acetonitrile(in water) 로추출하였다. Curcumin 분석은 Shimadzu HPLC system을이용하여분석하였다. Column은 Eclipse XDB (5μm, 20mm id x 250mm length, Agilent, Palo Alto, CA, USA) 과 Jasco guard column (1 4.6 mm, 5.0 μm) 을사용하였으며이동상은 acetonitrile:10mm orthophosphoric acid(ph 3.5) 을 40:60의조성으로사용하였다. 이때유속은 0.8mL/min으로하고검출은 425nm로하여분석하였다. - 188 -
제 4 절국내유통식품중천연색소첨가물실태조사 3.4.1 천연색소를사용한국내유통식품선정 천연색소를사용한식품중확립된 TLC 와 HPLC 방법으로천연색소실태조사를위하여 2009 년 부터 2011 년품목제조보고서를활용하였다. 2009 년도에생산된식품은 75,270 품목, 2010 년도는 Table 96. Number of Food items used Natural color additives by food items manufacturing reports (2009-2012) 2009 2010 2011 품목명품목수품목명품목수품목명품목수 파프리카추출색소 57 2336 64 2406 63 2755 치자황색소 52 1225 58 1279 56 1338 코치닐추출색소 40 673 43 775 40 853 치자청색소 42 658 37 657 48 746 심황색소 28 540 24 456 25 490 홍화황색소 30 261 32 363 33 371 안나토색소 16 94 15 116 20 345 적양배추색소 24 279 23 275 33 325 카카오색소 16 69 13 88 22 325 락색소 30 192 30 304 36 306 홍국적색소 28 215 25 216 29 223 적무색소 9 25 7 52 7 75 비트레드 14 42 13 84 15 73 고량색소 8 44 12 34 15 65 베리류색소 11 39 10 43 11 56 오징어먹물색소 6 18 7 28 13 52 스피룰리나청색소 9 37 6 37 8 50 포도과피추출색소 12 29 9 23 16 35 루틴 9 45 5 21 6 35 자주색고구마색소 12 34 9 28 12 34 차즈기색소 - - - - 5 24 치차적색소 11 23 11 24 9 23 마리골드색소 5 11 3 5 8 13 타마린드색소 2 7 3 5 3 3 토마토색소 2 2 2 2 - - 포도과즙색소 1 1 1 1 - - 감색소 - 1 1 - - 자주색옥수수색소 1 1 - - - - 총품목수 79,184 79,184 84,469-189 -
79,184품목, 2011년도는 84,469품목으로매년천연색소를사용하여식품을제조하는품목수가증가하는것으로볼수있다 (Table 96). 파프리카추출색소, 치자황색소, 코치닐추출색소, 치자청색소, 심황색소, 홍화황색소, 안나토색소, 적양배추색소, 카카오색소, 락새소, 홍국적색소등 11 천연색소품목은 3년간 200품목이상을유지하였으나그다음으로많은적무색소부터는품목수가낮아져 75품목이하로사용량이적은것으로판단된다. 2011년도에는총 43천연색소중에서타마린드색소를포함하여총천연색소 24품목이사용되었다. 토마토색소, 포도과즙색소, 감색소는 2009년도나 2010년도에사용되었으나 2011 년도에는사용되지않는천연색소였으며차즈기색소는 2009년도와 2010년도에사용되지않았으나 2011년도에사용되기시작했다. 자주색옥수수색소는 2009년도이후에는사용되지않았으며, 홍화적색소, 홍국황색소, 알팔파추출색소, 무궁화색소, 백단향색소, 사프란색소, 시아너트색소, 양파색소, 자주색참마색소, 피칸너트색소, 파피아색소, 가재색소, 김색소, 크릴색소등 14품목은 2009년이후사용된실절이없다. 파프리카추출색소다음으로많이사용되는색소는카라멜색소이나천연동식물로부터추출되지않는색소이다. 본연구에서는품목제조보고서에서 2011년도에생산되는색소를 24품목을모두구입하여색소를계통별로분류하였다. - 190 -
Table 97. Production value of Natural color during 2008-2011 1) unit: Won 순위천연색소 2008 2009 2010 2011 1 치자황색소 2,343,955 2,634,466 2,534,841 4,616,266 2 코치닐새소 1,950,159 1,786,261 2,235,837 3,220,116 3 파프리카추출색소 2,300,683 2,356,061 941,790 3,087,451 4 치자청색소 1,124,861 1,388,992 1,572,100 1,441,434 5 락색소 1,200,691 911,263 1,123,395 1,303,757 6 홍국황색소 722,717 858,578 1,022,150 1,249,687 7 홍국적색소 810,893 789,404 743,890 890,170 8 적양배추색소 549,979 529,026 703,754 751,118 9 베리류색소 446,177 356,506 508,941 715,654 10 스피룰리나청색소 833,285 474,308 555,379 622,413 11 안나토색소 170,218 164,424 257,325 363,136 12 카카오색소 100,210 97,160 202,672 357,655 13 심황색소 90,225 104,635 138,978 294,960 14 포도과피추출색소 49,495 91,307 214,246 293,164 15 자주색고구마색소 151,099 132,414 165,448 155,525 16 고량색소 67,703 123,872 178,012 115,611 17 치자적색소 141,917 70,256 83,537 104,391 18 오징어먹물색소 132,588 34,820 34,630 39,166 19 적무색소 2,572 13,161 33,624 9,732 20 자주색옥수수색소 1,100 1,719 1,868 6,948 21 마리골드색소 23,310 39,474 19,210 2,045 22 카라멜색소 4,535,378 5,698,279 6,431,146 6,363,741 23 포도과즙색소 - - 453,088-24 백단향색소 - 500 - - 총액 17,751,223 18,658,895 20,157,871 26,006,151 1) 식품의약품안전청자료 - 191 -
3.4.2 첨가물실태조사전국 ( 서울, 부산, 인천, 충청도, 전라도, 등 ) 의대형마트및재래시장에서구입한가공식품은천연색소의계통에따라최종적으로확립된박층크로마토그래피 (TLC) 와액체크로마토그래피 (HPLC) 분석법을적용하여분석하였다. 천연색소실태조사를식품구입은 Fig 72와 73을참고로사여구입하였며입한가공식품을보면캔디류 (9건), 빵류 (10건), 잼류 (3), 추잉껌 (4), 음료 (12), 유산균음료 (3), 육가공식품 (5), 수산가공식품 (3), 소스류 (4), 빙과류 (4), 떡류 (5), 초콜릿 (6), 조미료 (3), 발효음료 (4) 등이다. 시료구입후사용하기전까지 -20 냉동실에보관하였다. 총 132건의식품을구하여분석하였는데 TLC와 HPLC의분석자료가유사한것은 TLC와 HPLC chromatogram 은삭제하였다. Fig. 73. Food items of Natural color additives by food manufacturing reports(2009-2011). - 192 -
Fig. 72. Food items of Natural color additives by food manufacturing reports(2009-2011). - 193 -