CHEMISTRY TOPICS Nrf2 활성화를통한세포내항산화반응을일으키는화합물 허우영박사 한국과학기술연구원, whur@kist.re.kr 서론 세포는끊임없이내부와외부모두에서다양한산화스트레스 (oxidative stress) 와친전자성화합물 (electrophilic chemical) 에노출된다. 특히 ROS(reactive oxygen species) 나 RNS(reactive nitrogen species) 는세포내신호전달에중요한물질이지만, ROS 에오래노출되면지질, 단백질, 핵산등세포내중요한물질들이비가역적으로산화되고, 이러한산화된물질은염증반응을일으켜종국적으로각종암, 퇴행성뇌질환, 염증관련질환, 노화를일으킨다. 세포는이러한산화스트레스에대비하는메커니즘을가지고있는데이들중에서도 Nrf2 전사인자에의한항산화반응이가장중요한보호작용을한다. Nrf2(Nuclear factor E2-related factor 2) 는 Cap n Collar family basic region-leuzine zipper 전사인자로서세포를보호하는여러유전자들의증폭자 (enhancer) 영역에존재하는 ARE(Antioxidant Response Element, 5 - GTGACnnnGC-3 ) 시퀀스와결합하여유전자들의전사를유도한다. 이들유전자들의종류로는항산화물을만들어내는효소 ( 예힘옥시게나제 -1(heme oxygenase-1)), ROS 를제거하는효소 ( 예카탈라아제 (catalase), 과산화물제거효소 (superoxide dismutase)), 해로운외부물질의해독에 관여하는효소 /phase II 효소 ( 예글루타치온 S-전이효소 (glutathione S-transferase), NQO1 효소 (NAD(P)H: quinone oxidoreductase 1)), 글루타치온의형성에관여하는효소 ( 예 γ- 글루탐산염시스타인연결효소 (glutamatecysteine ligase)) 등이있다. 이러한다양한보호작용을하는유전자들의협력적인기능으로세포내산화스트레스에서세포를보호한다. Nrf2 는단백질수준에서 Keap1(Kelch-like ECH associated protein 1) 에의해부정적으로조절되는데, Keap1 은 Cul3 의유비퀴틴 E3 접합효소 (ubiquitin E3 ligase) 복합체의어댑터 (adaptor) 역할을하는단백질이다. Keap1 은시스테인이풍부한단백질로서 (626 아미노산중 27개가시스테인 ), 이러한특성으로인해훌륭한산화환원 (redox) 센서의역할이가능하다. 정상적인상태에서는 Nrf2 는 Keap1 에의한유비퀴틴화 (ubiquitination) 과곧이은프로테아좀 (proteasome) 에의한분해로소량으로존재하지만, 산화스트레스상황에서는 Keap1 의시스테인들의산화로인한 Keap1 구조의변화로 Nrf2 가 Keap1 에서떨어져나와그세포내양이증가하게된다 [ 그림 1a]. 이를 경첩및빗장 (Hinge and latch) 모델로서설명하는데, 하나의 Nrf2 에두개의 Keap1 이다른결합세기로결합하고, Keap1 시스테인의반응으로인해강한상호작용 (hinge) 은유지되는채, 약한쪽의상호작용 (latch) 만이떨 14 화학세계 2013. 12
Nrf2 활성화를통한세포내항산화반응을일으키는화합물 (a) (b) (c) 그림 1. (a) Keap1-Nrf2-ARE pathway, (b) Hinge and latch model, (c) Primary structure of human Keap1 어지면서 Nrf2 에유비퀴틴화가일어나지않아 Nrf2 가세포질에누적된다 [ 그림 1b]. Nrf2 의양이늘어나면세포핵으로이동하여다양한유전자의전사를일으킨다. Keap1 은크게세가지도메인으로나뉘는데 N-말단 (N-terminal) 의 BTB (Broad complex, Tramtrack, and Bric-a-brac) 도메인과 C-말단 (C-terminal) 의 Kelch 도메인, 그리고그사이의 IVR(Intervening region) 이있고, BTB 도메인으로 Keap1 의이합체화반응 (dimerization) 과 Cul3 와의결합이일어나며 Kelch 도메인으로 Nrf2 와의결합이일어난다 [ 그림 1c]. 본론 천연물, 식품, 대사산물, 유기합성화합물등에서 Nrf2- ARE 경로를통한보호유전자들의전사를일으키는다양한구조의화합물들이발견되었다. 지금까지알려진화합물들은모두 Keap1 의시스테인과반응할수있는친전자성화합물이거나세포내대사과정을통해친전자성화합물로 변하는화합물이다. Nrf2-ARE 경로를활성화시키는화합물의부류는플라보노이드 (flavonoid), 페놀항산화물 (phenolic antioxidant), 마이클수용체 (Michael acceptor), 아이소싸이오사이아네이트 (isothiocyanate), 1,2- dithio-3-thione, dimercaptan, 중금속 (heavy metal), 과산화물 (peroxide), 폴리엔 (polyene) 등이다. 대부분의 Nrf2-ARE 활성제들은 Keap1 의여러시스테인들중 BTB 도메인의 C151 과 IVR 의 C273, C288 이세가지시스테인과의반응으로 Keap1 의기능을억제시킨다. IVR 의 C273 과 C288 은 Zn 2+ 와배위결합을하여 Keap1 과 Nrf2 와의결합을유지시키는데중요한역할을하는것으로알려져있다. 이두시스테인의비가역적인변화가 Zn 2+ 을제외시켜 Keap1 의구조변화를일으키는것으로믿어지고있다. 또한중요한 ARE 활성제인 tbhq 와설포라판 (Sulforaphane) 은그활성에서 C151 과의반응이중요하다고알려져있고, 이로인한 Keap1 의구조변화가 Cul3 와의결합을약화시켜 Nrf2 의유비퀴틴화가저해된다고알려져있다. 따라서최근에는 Nrf2 활성제와 C151 의상호작용이 C273 과 C288 2013. 12 화학세계 15
그림 2. Nrf2 activator 의구조 (a) phenolic antioxidant 의 metabolism, (b) phenolic antioxidant, (c) isothiocyanate, (d) Michael acceptor, (e) sulfur-containing compound 이활성제와보다더반응이잘일어나도록구조적인변화를유도하여 Keap1 의기능이저해되는것으로제안되었지만, 이를증명하기위해서는더많은연구가요구된다. 흥미 롭게도 CdCl 2, 비소물질등의중금속들은 C151 과무관하게 Keap1 을저해하는데, 이는 Keap1 을저해할수있는메커니즘이다양함을뜻한다. 더욱이 Keap1 에의한유비퀴틴 16 화학세계 2013. 12
Nrf2 활성화를통한세포내항산화반응을일으키는화합물 화외에도 PKC, PI3K, ERK, PERK 등의키나아제 (kinase) 에의한인산화역시 Nrf2 의활성을조절한다. 화합물을이용하여 Nrf2-ARE 경로 (pathway) 를미리활성화시켜산화스트레스에대항하는다양한보호유전자들을발현시키면후에맞닥뜨리는스트레스에대해미리대응을할수있다. 이러한약리학적인방법으로세포내스트레스와연관있는각종질병의발생을방지하고자하는개념을화학적방어 (chemoprotection) 라부른다. Nrf2-ARE 경로의약리학적인활성화가대표적인화학적방어의예인데실제다양한동물모델에대해연구가진행되어왔다. 예를들어, 다양한 ARE 활성제들이 ROS 나발암물질을제거하여암발생의생성이나발전을방지할수있음이증명되었다. 또한퇴행성뇌질환의뇌에서는알파시누클레인 (αsynuclein), β-아밀로이드 (amyloid) 같은단백질다발들이신경염증반응을일으키고이로인해생성되는 ROS 와사이토카인 (cytokine) 들이질병의발전을더욱촉진하는데, 상당수 Nrf2 활성제들이퇴행성뇌질환의발전을방지할수있다는것이보고되었다. 더욱이많은활성제들이 Nrf2 에의해발현되는보호효소들 (heme oxygenase 1, Peroxiredoxin I) 에의해항염증의활성도보인다. 따라서 Nrf2 활성제들은다양한질병에대한치료제로쓰일수있는가능성을지니고있다. 이에 Nrf2 활성제들을분류하고각부류의대표적인화합물을소개하고자한다. 발암물질에의한암의생성을막는화학적방어효과는페놀항산화물화합물에의해처음으로관찰되었고, 이후그인핸서요소 (enhancer element) 를산화방지제반응성분 (antioxidant response element, ARE) 라칭하게되었다. 페놀항산화물들은라디칼이온을제거하는고유의항산화특성이있는데, 그러나화학적방어효과는사이토크롬 (cytochrome) P450 효소에의해생성되는퀴논 (quinone) 대사물에의한 Nrf2 활성화과정에서기인한것이다 [ 그림 2a]. 커큐민 (Curcumin) 은강황에존재하는노란폴리페놀 (polyphenol) 화합물로서, 그 α,β- 불포화카르보닐그룹이 Nrf2 활성화에필수적임이보고되었다 [ 그림 2b]. 커큐민을복용한쥐에서발암물질인 benzo[a]pyrene (B[a]P) 에의한 DNA 의변형이억제되었고, B[a]P 에의해발현되는 phase I 효소들 (CYP1A1, CYPA2) 역시저해됨이보고 되었다. 따라서커큐민의항암작용은 phase II 효소들의증가와더불어 phase I 효소들의감소를유도하여나타남을알수있다. 또한알츠하이머동물모델에서도커큐민은염증을유발하는사이토카인 (cytokine) 의생성을막고, 불용성 Aβ 단백질의양을감소시킨다. 커큐민은현재신장암, 다발성골수종 (multiple myeloma), 알츠하이머병에임상실험중이다. 레스베라트롤 (Resveratrol) 은포도에존재하는폴리페놀화합물로서노화와연관된질병의발병을지연시키는탁월한활성으로인해최근상당한주목을받는화합물이다 [ 그림 2b]. 이화합물은 SIRT1 경로의활성화를통해식이제한 (caloric restriction) 과동일한효능을보여노화방지효과를보인다고믿어지고있다. 그러나최근연구에서 Nrf2-ARE 경로가이러한효능에매우중요하다는결과가보고되었다. 예를들어, 레스베라트롤이고지방식 (highfat diet) 에의한대동맥에서의산화스트레스를억제함이보였고, Nrf2 knock out 쥐를이용한실험에서는이러한혈관의보호작용이나타나지않았다. 또한 Type-2 당뇨쥐모델에서상당량의과산화수소와나이트로타이로신 (nitrotyrosine) 을지니는단백질이관찰되었으나, 레스베라트롤이구강투여된쥐에서는이러한양이줄어들었다. 아이소싸이오사이아네이트화합물들은주로브로콜리나배추등의십자화과의식물에존재하며, 여러증거에서이러한화합물이함유된채소들을섭취하였을때폐암, 유방암, 대장암등의질병의발병이줄어든다는사실을알수있다. 설포라판이이들부류의화합물들중가장많이연구된화합물로서, Keap1 과는 C151, C273, C288 등의주요시스테인외에많은시스테인과반응하여 Nrf2 를활성화시킨다 [ 그림 2c]. 설포라판은흥미롭게도세포내시스테인과의반응하여생긴대사산물이히스톤디아세틸라제 (histone deacetylase) 를강하게저해하여항암작용에시너지효과를보인다. 또한이화합물은파킨스병의동물모델에도적용되었다. 도파민 (Dopamine, DA) 의세포내산화작용으로생성된도파민 -퀴논 (DA-quinone) 과그로인한산화스트레스가파킨슨병에서선택적인도파민작동성뉴런 (dopaminergic neuron) 의사멸에주된원인이된다. 설포라판은 Nrf2 를활성화시키고이로인해증가한 NQO1 이도 2013. 12 화학세계 17
파민- 퀴논을줄여도파민작동성뉴런을보호한다. 그런데설포라판은도파민 -퀴논의형성과는연관이없는 1-메틸 - 4-페닐피리디늄 (1-methyl-4-phenylpyridinium, MPP+) 에대한보호효과는보이지않아서보호효과의선택성이존재한다. 15-Deoxy-Δ 12,14 -prostaglandin J 2 (15d-PGJ 2 )[ 그림 2d] 는 COX-2 에의해형성되는사이클로펜테논프로스타글란딘 (cyclopentenone prostaglandin) 의대사산물이다. 사이클로펜테논링 (Cyclopentenone ring) 의 α,β-불포화카르보닐그룹이 Nrf2 활성화능력에중요할뿐아니라, IKKβ 의활성화루프 (activation loop) 에존재하는시스테인과공유결합을하여키나아제의기능을저해시켜 NFkB 경로를저해한다. 리포산 (Lipoic acid) 은분자내이황화물 (intramolecular disulfide) 을가지고있고미토콘드리아에서생산되는 α- 케토글루타르산탈수소효소 (α-ketoglutarate dehydrogenase) 의보조인자 (cofactor) 역할을한다 [ 그림 2e]. Keap1 시스테인들과의상호작용을통해 Nrf2 가활성화되기도하지만, 흥미롭게도이화합물은 Nrf2 의활성화와연관된다양한키나아제 (ERK1/2, p38 MAPK, PI3K) 의활성을증가시켜 Nrf2 를활성화시키는능력을가지고있다. 이는여러 phosphatase 의기능을비가역적으로저해시켜키나아제의활성을증가시키는것으로추측되고있다. 올티프라즈 (Oltipraz) 는유기합성화합물로서 1,2- 다이싸이올 -3- 티온 (1,2-dithiol-3-thione) 부류중가장많이연구된화합물이다 [ 그림 2e]. 올티프라즈는방광, 대장, 간, 폐, 위, 신장등의다양한기관에서여러발암물질 ( 아플라톡신 B1, B[a]P, 디에틸니트로사민 (diethylnitrosamine)) 에 의해생성되는암을억제한다는결과가다수보고되었다. 그러나이화합물은 CYP1A 등의 phase I 효소들의발현또한촉진시켜암에대한보호효능에대항하는활성도지니고있다. 비록이화합물은동물모델에서는항암효과가증명되었지만, 과량의아플라톡신 B1에노출된상습흡연자를대상으로실시한실제임상실험에서는주목할만한결과는나오지않았다. 결론 Nrf2-ARE 경로는다양한항산화유전자들과독소제거유전자들의전사를일으켜산화스트레스로부터세포를보호한다. 화합물을이용한 Nrf2 매개의세포방어를구현하는방법은화학적방어전략의주요한분야이며, 다양한 in vivo 질병모델에서그효과가증명되었다. 따라서강력하고독성이없는 Nrf2 활성제는유용한도구화합물로서뿐아니라새로운치료제로서이용될수있다. 지금까지알려진 Nrf2 활성제들은모두 Keap1 시스테인을비가역적으로변형시키는친전자성화합물들이다. 그러나이러한화합물들은시스테인을함유한여러다른효소들과의상호작용이일어날가능성이많으며이로인한여러부작용이나타날가능성이있다. 대부분의암에대한화학적방어는과량의발암물질을투여하여급성으로종양을형성하는동물모델을이용하여연구가수행되었다. 그러나이러한모델은실제소량의발암물질에상습적으로노출되어암에걸리는실제의경우를재현하지못한다. 따라서화학적방어분야에서는보다더실제에가까운모델을개발하는연구가선행되어야할것이다. 허우영 Hur, Wooyoung 포항공과대학교화학과, 학사 (2001.2) 포항공과대학교생명과학과, 학사연구원 (2001.8) Genomics Institute of the Novartis Research Foundation, San Diego, USA, 연구원 (2003.6) The Scripps Research Institute, La Jolla, USA, 화학과, 박사 (2009.1) Dana Farber Cancer Institute, USA, 박사후연구원 (2013.8) 한국과학기술연구원, 선임연구원 (2013.9- 현재 ) 연구분야 : 화학생물학 (Chemical Biology), 신약개발 (Drug Discovery) 18 화학세계 2013. 12