韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2015;3(2):73-80. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 작약( 芍藥 ) 유전자감별을위한 psba-trnh 부위염기서열분석및 Marker Nucleotide * 김욱진, 지윤의, 문병철 발굴 한국한의학연구원 K-herb연구단 Identification of Marker Nucleotides for the Molecular Authentication of Paeoniae Radix Based on the Analysis of psba-trnh Sequences Kim Wookjin, Ji Yunui, Moon Byeongcheol * K-herb Research Center, Korea Institute of Oriental Medicine, Daejeon, 305-811, Republic of Korea Abstract Purpose : The original plant species of Paeoniae Radix is differentially described in the national pharmacopoeia of Korea, China and Japan. To develop the reliable method for the authentication of four Paeonia species, P. lactiflora, P. japonica, Paeonia veitchii and P. suffruticosa, we analyzed psba-trnh DNA barcode region and identified species-specific marker nucleotides. Materials and Methods : Plant materials were collected from different geographic regions in Korea and China, and psba-trnh DNA barcode region were amplified using psba3-f and trnhf-05 primer set. The DNA sequences were analyzed and aligned using the Bio-Edit program. The multiple alignment of each samples were also analyzed with the Bio-Edit program in order to calculate the genetic distance among the samples using unweight pair group method with arithmetic averages (UPGMA) anlysis. Results : PCR amplification rate of 12 samples used in this study were 100% for psba-trnh region. In comparison of psba-trnh sequences among four Paeonia species, we identified 1, 2, 2, and 16 species specific nucleotides enough to distinguish each species, respectively. These species-specific sequences could provide useful genetic marker nucleotides to discriminate the precise species among the analyzed four Paeonia species. Conclusion : We analyzed psba-trnh region to confirm the availability of molecular authentication for Paeoninae Radix on species levels using four Paeonia species. As a result, we amplified PCR products of psba-trnh region from all of the 12 samples and obtained total 21 marker nucleotides enough to distinguish each four Paeonia species. These marker nucleotides are useful genetic tool for the standardization of Paeonae Radix. Keywords: Marker Nucleotide, Molecular Authentication, Paeonia species, Paeoniae Radix, psba-trnh * Correspondence: 문병철 (Moon Byeongcheol. Tel: +82-42-868-9530 Fax: +82-42-863-9434 E-mail: bcmoon@kiom.re.kr) Received 2015-09-14, accepted 2015-09-22. 73
김욱진외. 작약유전자감별을위한 psba-trn H 부위염기서열분석및 Marker Nucleotide 발굴 서론 작약( 芍藥 ) 은한의학에서전통적으로무월경, 옹종및팔다리마비증상을치료하기위해주로사용 하였으며, 모란피( 牡丹皮 ) 는골증열, 출혈, 발반및월경장애등의치료에사용되어왔다 1). 또한최근 연구결과에따르면작약( 芍藥 ) 은진통, 부인병, 고혈압및염증에효과가있으며, 모란피( 牡丹皮 ) 는 혈액순환, 어혈및치주질환등에효과가있는것으로보고되었다 2-3). 한국, 중국및일본의약전에수재된기원종으로모란피( 牡丹皮 ) 는모란( Paeonia suffruticosa Andrews = Paeonia suffruticosa Andrews) 한종만을인정하고있으나, 작약( 芍藥 ) 의경우한국, 중국및일본의국가별약전수재기원식물종범위에는차이가있다 1). 대한민국약전에서는작약( 芍藥 ) 을 작약(Paeonia lactiflora Pall. ) 또는기타동속근연식물의뿌리 로규정하고있지만, 일본약국방에서 는 작약(P. lactiflora ) 의뿌리 로단 1종만인정하고있다 1). 중화인민공화국약전에서는 작약(P. lactiflora) 또는천적작[Paeonia veitchii Lynch. = Paeonia anomala subsp. veitchii (Lynch) D.Y.Hong & K.Y.Pan] 의뿌리를말린것 을적작( 赤芍 ) 으로, 작약( P. lactiflora ) 의뿌리꼭지와끝부분및잔뿌리 를제거하고끓는물에삶은다음겉껍질을제거하고햇볕에말린것 은백작( 白芍 ) 으로 2종류의약재 로나누어수재하고있다 1). 이처럼각국가별작약( 芍藥 ) 의약전수재기원식물종범위의차이외에도 중국에서약명으로사용하는백작( 白芍 ) 은식물명백작약[ Paeonia japonica (Makino) Miyabe & Takeda] 과혼돈하여사용될수있는문제점을안고있다. 따라서국가별로수재하는기원종의차이, 식물명과약명의유사성에서오는혼 오용을방지하기위해서작약( 芍藥 ) 과모란피( 牡丹皮 ) 를구분하 고정확하게감별하기위해서는작약 (P. lactiflora) 과백작약(P. japonica), 그리고중국의천적작(P. veitchii) 및모란(P. suffruticosa ) 과같은 4종의작약속식물을종단위에서객관적으로구별할수 있는감별법개발이필요한실정이다. 최근들어국제생물바코드컨소시엄(CBOL, Consortium for Barcode of Life) 을중심으로지구상에 존재하는생물종을대상으로 DNA 바코드부위탐색을통하여종을동정하고계통분류학적으로유연 관계를분석하는연구가활발히진행중이며, 이들연구결과의정보를 DB화하여연구자들이모니터링 할수있도록하는 DNA barcode library 구축이진행되고있다 4-5). 식물에서많이이용되는 DNA 바코드부위로핵내염색체에존재하는 rdna-its 유전자부위와엽록체게놈에존재하는 matk, rbcl, psba-trn H 유전자부위등이이용되고있다. matk와 rbcl은단백질 coding 부위로특정염기가 지나치게반복되거나특정부위의염기가삽입/ 결실(indels) 되는등의유전변이가존재할확률이적어 염기서열분석에수월하다는이점이있으나종간유전변이탐색에덜효과적인것으로알려져있다 6). 반면 rdna-its 나 psba-trnh 등의 DNA 바코드부위는 non-coding 부위로단백질을암호화하고 있지않아서빠르게진화하여염기삽입/ 결실(indels) 과치환(substitutions) 이빈번하게존재하는것 으로보고되어종단위감별을위한 marker nucleotide 발굴에유리하다고보고된연구사례도있지만, psba-trn H 부위의경우에는식물종에따라염기삽입/ 결실(indels) 이지나치게차이가많이존재하 여종단위감별마커로활용하기에부적합하다는보고도있어서 DNA 바코드부위로이용하기에적합 한지여부를확인할필요가있다 6-7). 따라서본연구에서는작약( 芍藥 ) 과모란피( 牡丹皮 ) 의구별과작약기원식물을종단위에서감별하 기위해작약, 백작약, 천적작및모란을국내 외다양한자생지에서수집하여 psba-trn H 유전자부위 의염기서열정보분석을통해 DNA 바코드부위로적합성을확인하고종단위감별을위한 DNA marker nucleotide 발굴을하고자하였다. 74
韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2015;3(2):73-80. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 재료및방법 1. 실험재료 유전자분석에사용한작약, 백작약, 천적작및모란각 3개체씩총 12개체의시료는 2007년부터 2014 년까지국내 외서로다른자생지에서수집하여액체질소에급랭시켜 75 초저온냉동고에 보관하여이용하였다 (Table 1). 수집한시료는본초학, 생약학, 식물분류학등의전문가로구성된분 류 동정자문회의의동정을거쳐그종을최종확증하였으며, 각시료의기원식물은압착석엽표본을 제작하여한국한의학연구원한약표준표본관 (KIOM) 에표본번호를부여하여증거표본으로보관하였 다. Table 1. List and information of materials used in this study Eco-dye(Solgent, Korea) 로염색하여 UV light 상에서 DNA band 를확인하였으며, DS-11 spec- Taxon abbreviation No. Herbal Name & origin 1) Location Scientific Name KP 11 ChP 2010 JP XVI 1 Paeoniae Jeongseon-eup, Jeongseon-gun, Gangwon-do, Korea Pl_JS 2 Paeonia lactiflora Paeoniae Radix Alba / Paeoniae Pall. Radix Paeniae Radix Radix Gabuk-myeon, Geochang-gun, Gyeongsangnam-do, Korea Pl_GC 3 Rubra Gaya-myeon, Hapcheon-gun, Gyeongsangnam-do, Korea Pl_HC 4 Paeonia japonica Anseong-myeon, Muju-gun, Jeollabuk-do, Korea Pj_DYS Paeoniae 5 (Makino) Miyabe - - Girin-myeon, Inje-gun, Gangwon-do, Korea Pj_BTS Radix 6 & Takeda Saekdal-dong, Seogwipo-si, Jeju-do, Korea Pj_SD 7 Siguniang Mt., Xiaojin, Ngawa, Sichuan, China Pa_SC1 Paeonia Paeoniae Paeniae Radix 8 - Siguniang Mt., Xiaojin, Ngawa, Sichuan, China Pa_SC2 veitchii Lynch. Radix Rubra 9 Siguniang Mt., Xiaojin, Ngawa, Sichuan, China Pa_SC3 10 Moutan Pungsan-eup, Andong-si, Gyeongsangbuk-do, Korea Ps_AD1 Paeonia suffruticosa Andrews Cortex Cortex Moutan Moutan 11 Radicis Pungsan-eup, Andong-si, Gyeongsangbuk-do, Korea Ps_AD2 12 Cortex Pungsan-eup, Andong-si, Gyeongsangbuk-do, Korea Ps_AD3 : The Korean Pharmacopoeia 11th edition : Pharmacopoeia of the People s Republic of China 2010 edition : The Japanese Pharmacopoeia 16th edition : There is no appropriate official name in corresponding national pharmacopoeia 2. DNA 추출및정량 초저온냉동고에서보관한생체시료의약 100mg 을 Lysing matrix A TM tube(mp biomedicals, USA) 에담아 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, USA) 의 extraction buffer 400uL를넣어 Precellys TM Grinder(Bertin technologies, France) 를이용하여 6,000rpm 에서 30초동안마쇄하였으며이후실험 조건은 DNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN, USA) 제작자가제공한 protocol 에따라추출 정제하였다. 정제된 DNA의순도와질을확인하기위하여 1.5% agarose gel을이용하여전기영동한후 trophotometer(denovix, USA) 를이용하여 260nm와 280nm 에서흡광도를측정하여정량하였다. 3. psba-trnh 부위 PCR 증폭 약 15ng의 genomic DNA는각 20pmole 의 psba3_f 8) 및 trnhf_05 primer 9) 와 SolgTM 2 Taq PCR Smart-Mix I(Solgent, Korea) 를혼합하여 32 3 ProFlex TM PCR SYSTEM(Applied Biosystems, USA) 를이용하여증폭하였으며, primer sequence 정보와 PCR 반응은 Table 2 과같다. 75
김욱진외. 작약유전자감별을위한 psba-trn H 부위염기서열분석및 Marker Nucleotide 발굴 Table 2. Primer information and PCR reaction condition for amplification of psba-trnh region Primer name Primer sequences (5 3 ) PCR condition psba3_f GTT ATG CAT GAA CGT AAT GCT C Step 1: 95, 2 min trnhf_03 CGC GCA TGG TGG ATT CAC AAT CC Step 2: 95, 40 s - 53, 30 s - 72 40 s [35 cycles] Step 3: 72 5 min 4. 염기서열분석 psba-trn H 유전자부위의증폭산물은 DNA 염기서열분석을위해 1.5% agarose gel 상에서 100bp DNA ladder(solgent, Korea) marker와함께전기영동하고 Eco-dye 로염색하여관찰하였으며예상 된밴드크기로증폭된유전자 PCR 증폭산물은회수하여 Gel Extraction Kit(QIAGEN, USA) 를이용 하여정제한뒤 pgem-t easy Vector Systems(Promega, USA) 에삽입하였다. 삽입된증폭산물은 Hit blue competent cell(rbc science, USA) 에형질전환한뒤 ampicillin과 X-gal/IPTG 가첨가된 LB agar 배지에도말하여약 18 시간배양하였다. 각시료별로선별된 white colony는 솔젠트에 T7 primer 를이용하여염기서열분석을의뢰하여염기서열정보를확보하였으며, 각시료별로분석된 3개 colony 의염기서열을비교하여최종확정하였다. 5. Marker nuclotide 탐색및종간유연관계분석 최종확정된 12개체의 psba-trn H 유전자염기서열은 BioEdit program(version 7.0.9) 의 ClustalW 방법으로 multiple alignment 를수행하여종내개체및종별염기서열을정렬하였다. 정렬된 psba-trn H 부위의염기서열은종내개체별비교와종별비교를통해종특이성을갖는염기의삽입 (insertions), 결실(deletions) 및치환(substitutions) 을위치별로분석하여정리하였다. 전체분석대 상시료의유연관계분석은 12개체의확보된 psba-trnh 부위의전체염기서열을이용하여각각 BioEdit program의 UPGMA 방법으로 Neighbor Phylogenetic tree 를작성하고군집의형성유 무와 군집간의유연관계를비교 분석하였다. 결과및고찰 기원식물의감별법으로는형태학적감별과이화학적감별등이있으나, 형태학적감별을이용하기 위해서는주관적인감별기준의객관화를통한체계적인분류법과전문적경험을필요로하며이화학 적감별은지표물질이밝혀져있어야하는등의한계점이있어최근들어서는 rdna-its, matk 및 rbcl 등여러 DNA 바코드부위의염기서열에서종단위감별이가능한 marker nucleotide 발굴을통한 연구가활발하게진행되고있다. psba-trn H 부위는엽록체에존재하는 psba와 trnh유전자의 intergenic space 구간으로유전적변이가많이발견되어식물종에따라다르지만유용한종감별정보로 활용할수있는연구사례가여럿보고되고있다 6-7). 본연구에서는작약, 백작약, 천적작및모란의 psba-trn H 부위를 DNA 바코드로활용하기에앞서대표적인유전자은행인 CBOL과 NCBI DB 조사를 통해염기서열등록여부를확인하였고, 그결과백작약은등록된유전자정보가전무하며작약, 천적작 및모란은등록된염기서열정보가 246~342 bp 정도임을확인하여추후유용한정보로활용이가능할 것으로판단되어본실험을진행하였다 5,10). 한국, 중국그리고일본에서작약( 芍藥 ) 으로규정하는국가별약전수재기원종의차이와식물명 백 작약 과약명 백작( 白芍 ) 의유사성에서오는혼 오용을방지하기위하여 Paeonia 속에속하는작약, 76
韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2015;3(2):73-80. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 백작약, 천적작및모란 4종을대상으로각 3개씩 12개시료의잎으로부터추출한게놈유전자를주형 으로 psba-trn H 부위를 PCR 증폭하였다. 분석에이용한총 12개시료에서예상된약 450bp 크기의 증폭산물을확보하였는데, 이는 NCBI와 CBOL 유전자은행에등록된염기서열보다정보량이많아서 data 활용에유용하다고판단되어증폭된 psba-trnh 유전자부위전체를 pgem-t easy vector에 삽입후염기서열해독을통해각시료별로 3 개씩염기서열을확보할수있었다. 확보된각시료의 염기서열을비교한결과, 종간유전자크기의차이가있었으며종내에서도여러지역의수집지에 따라 1~2bp 씩차이가있음을확인하였다(Table 3, Fig. 1). 종내개체간염기서열비교를통하여개체간염기서열변이를확인한결과작약 5 곳, 백작약 6곳 그리고모란 1 곳에존재하고있었는데(Table 3, Fig. 1), 작약과백작약의개체들에서특히종내변이 가많이관찰되었으며, 이는 143 번, 145-146 번그리고 148번의염기가 A/T, AG/CT 그리고 A/T의 2 가지형태로각각혼재하고있었기때문이다. 그외에도작약의개체간변이는 185번부터존재하고 있는 poly T의존재로 Pl_JS 의 196번위치에 1 개의티민(T) 삽입이있었으며, 백작약의개체간변이 는 Pj_BTS 의 300 번위치에티민(T) 이다른개체의시토신(C) 과차이를보였기때문이다. 또한, 모란 의개체간변이는 Ps_AD2 의 210번위치에존재하는 1 개의티민(T) 삽입으로차이를보이고있었다. Table 3. Statistics of psba-trnh region amplified from four Paeonia species used in this study Scientific name PCR product length (bp) Intra-species variable nucleotide Marker nucleotide position P. lactiflora 439-440 5 1 P. japonica 436-437 6 2 P. veitchii 442 0 2 P. suffruticosa 449-450 1 16 종간염기서열비교분석을통하여삽입/ 결실(indels) 위치를확인한결과모란의 89-99번위치와 135번위치에서각 11개와 1 개의염기가삽입되어있음을확인하였고, 모란의 199번위치와 285-286번위치에서는각 1개와 2 개의염기가결실되어있음을확인하였다. 또한, 백작약의염기 결실이확인된곳은 194번과 195번위치로각 1 개의염기결실을확인하였으며, 천적작의염기삽입이 확인된곳은 197-198 번위치로두개의염기삽입을확인하였다. psba-trn H 부위는동속간염기서 열을비교한여러연구에서도삽입/ 결실부위가많음을보여주는사례가있었는데, 본연구에서도유사 한결과를얻음으로서이는 psba-trn H DNA 바코드부위의특징으로보여진다 6-7). 또한, 종간염기 서열비교분석을통하여종특이적인염기치환부위를분석한결과, 작약은 230번 1개위치에서아데 닌(A) 이다른 3 종의구아닌(G) 과차이를보이는것을확인하였고, 천적작은 152번 1개위치에서각각 아데닌(A) 이다른 3 종의구아닌(G) 과차이를보였으며, 모란은 79 번구아닌(G) 과 81 번의아데닌(A) 등 13개위치에서염기가치환되어다른 3 종과구별이가능하였다(Fig. 1, Table 4). 이상의결과를종합하면표 4 에서정리된바와같이작약, 백작약, 천적작및모란 4종간 psba-trnh 부위의염기삽입/ 결실과치환분석을토대로발굴된 marker nucleotide 는작약 1 곳, 백작약 2 곳, 천적 작 2곳그리고모란 16 곳이확인되었다. 이는 psba-trn H 부위의염기서열분석만으로도 4종에대한 종단위감별이가능하여작약류 4종에대한 DNA 바코드부위로사용하기에적합함을보여준다. 또한증폭된 psba-trn H 부위전체의염기서열정보를바탕으로작약, 백작약, 천적작및모란 4종의 유연관계를분석한결과(Fig. 2), 모란과천적작은종단위의유집을형성하는것을확인할수있었으 나, 작약과백작약은종단위유집을형성하지않았다. 이는 psba-trn H 염기서열분석에이용된종간 77
김욱진외. 작약유전자감별을위한 psba-trn H 부위염기서열분석및 Marker Nucleotide 발굴 또는종내염기서열분석결과, 종특이적으로나타나는염기의삽기/ 결실및치환의 marker nucleo- tide가 14 개로많이확인된모란과달리작약, 백작약은각 1개씩밖에존재하지않음에도불구하고 2종의분석개체에서모두 143~148 번위치의염기서열이 5 -ATAGAA-3 또는 5 -TTCTAT-3 의 2 가지형태로나뉘는결과가영향을끼친것으로생각된다(Fig. 1 and 2, Table 4). 결과적으로본연구에서는작약, 백작약, 천적작및모란 4종을이용하여 psba-trn H 부위의염기서 열분석을통해작약속에포함되지만작약( 芍藥 ) 기원종에포함되지않는모란과식물명 백작약 과 약명 백작( 白芍 ) 의유사성으로인해혼 오용되는문제점및국가별로다르게수재되어있는작약 기원종을종단위에서구별이가능함을알수있었으며, 이러한결과는작약( 芍藥 ) 과모란피( 牡丹皮 ) 감별과작약( 芍藥 ) 기원종을정확하게감별할수있는분자마커로활용이가능할것으로기대된다. Fig. 1. Screening of marker nucleotides from comparative analysis of entire psba-trnh sequences. Dots( ) indicate the identical sequences with P. lactiflora and dashes(-) represents gaps introduced to maximize alignment. Boxes indicate available sequence regions as a specific marker nucleotide. Table 4. Summary of marker nucleotides from comparative analysis of the psba-trnh sequences among four Paeonia species. Aligned Nucleotide Position 79 81 89-99 134 135 136-137 152 156 192 194 195 197-198 199 202 205 229 230 285-286 Scientific Name P. lactiflora T T ----------- C - CC G G T T T -- A A C A A AG G A P. japonica ----------- - - - -- G P. veitchii ----------- - A TT G P. suffruticosa G A GTCTTAATTTA A A TT T A C -- T T T G G -- T G Underlined bold characters and dashes(-) represent species-specific substitutions and indels, respectively. Dots( ) indicate the identical nucleotide sequences with P. lactiflora and dashes(-) represent nucleotide deletions at the aligned nucleotide positions. 370 400 78
韓藥情報硏究會誌 (Korean Herb. Med. Inf.) 2015;3(2):73-80. pissn 2288-5161 / eissn 2288-5293 Figure 2. Dendrogram of four Paeonia species based on psba-trnh sequences. 결론 국내 외지역별수집을통해확보된작약, 백작약, 천적작및모란 4종 12개체를이용하여 psba-trn H 부위를증폭하여이들 4종에대한종감별용 DNA 바코드부위로활용가능한지확인하였 다. 확보된 psba-trn H 부위의염기삽입/ 결실및치환분석을통해종특이적으로나타나는 marker nucleotide 를작약 1 곳, 백작약 2 곳, 천적작 2곳및모란 16 곳에서발굴하였다. 이러한결과는작약의 정확한기원확립을통한재배기반구축에필요한종자기원선별및유사한약재유통방지를위한객관 적인감별에필요한분자마커로활용가능할것으로판단된다. 감사의글 본연구는한국한의학연구원 K-herb 과제의일환으로진행중인 한약자원기원검증체계구축및 육묘증식기술개발(K15421) 과제및 한의본초활용기반구축사업 (K13020) 의지원에의해수행되 었습니다. 79
김욱진외. 작약유전자감별을위한 psba-trn H 부위염기서열분석및 Marker Nucleotide 발굴 참고문헌 1. Korea Institute of Oriental Medicine. Defining Dictionary for Medicinal Herbs[Korean, 'Hanyak Giwon Sajeon'](2015). Published on the Internet; http://boncho.kiom.re.kr/codex/ (accessed 20 15-09-21). 2. 김동걸, 이상인. 적( 赤 ), 백작약의( 白芍藥 ) 효능에관한연구(Paeoniflorin 을중심으로). 대한본초학회지. 1986;1:1-7. 3. Lin SJ, Chen CS, Lin SS, Chou MY, Shih HC, Lee IP, Kao CT, Ho CC, Chen FL, Ho YC, Hsieh KH, Huang CR and Yang CC. In vitro anti-microbial and in vivo cytokine modulating effects of different prepared Chinese herbal medicines. Food and Chemical Toxicology. 2006;44:2078-85. 4. Barcode of Life. Identifying Species with DNA barcoding Retrieved August. 21, 2015, from http://www.barcodeoflife.org. 5. Boldsystem. The Barcode of Life Database Retrieved August. 21, 2015, from http://www.bolds ystems.org. 6. Chase MW, Cowan RS, Hollingsworth PM, van den Berg C, Madriňān S, Petersen G, Seberg O, Jørgsensen T, Cameron KM, Carine M, Pedersen N, Hedderson TAJ, Conrad F, Salazar GA, Richardson JE, Hollingsworth ML, Barraclough TG, Kelly L and Wilkinson M. A proposal for a standardised protocol to barcode all land plants. Taxon. 2007;56:295-9. 7. Maroua G, Nadia Z, Imen F, Neila TF and Sonia M. Molecular characterization of Lathyrus species using chloroplast DNA trnh-psba. Biochemical Systematics and Ecology. 2014;57:439-44. 8. Sang T, Crawford DJ, Stuessy TF. Chloroplast DNA phylogeny, reticulate evolution and biogeo graphy of Paeonia (Paeoniaceae). American Journal of Botany. 1997;84:1120-36. 9. Tate JA and Simpson BB. Paraphyly of Tarasa (Malvaceae) and diverse origins of the polyploid species. Systematic Botany. 2003;28:723-37. 10. National Center for Biotechnology Information. NCBI Genomes Databases Retrieved August. 25, 2015, from://www.ncbi.nlm.nih.gov. 80