대한안과학회지 2014 년제 55 권제 10 호 J Korean Ophthalmol Soc 2014;55(10):1499-1503 pissn: 0378-6471 eissn: 2092-9374 http://dx.doi.org/10.3341/jkos.2014.55.10.1499 Original Article 분주베바시주맙의무균성과안정성 Stability and Sterility of Bevacizumab after Withdrawal into a Syringe and Refrigeration or Freezing 노광명 1 김수영 2 남기엽 1 이승욱 1 김영호 3 이상준 1 Gwang Myung Noh, MD 1, Soo Young Kim, MD 2, Ki Yup Nam, MD, PhD 1, Seung Uk Lee, MD, PhD 1, Young Ho Kim, PhD 3, Sang Joon Lee, MD, PhD 1 고신대학교의과대학안과학교실 1, 밝은눈안과 2, 고신대학교의과대학분자생물학교실 3 Department of Ophthalmology, Kosin University College of Medicine 1, Busan, Korea BGN Eye Care Center 2, Busan, Korea Department of Molecular Biology, Kosin University College of Medicine 3, Busan, Korea Purpose: The aim of this study was to evaluate the stability and sterility of bevacizumab (Avastin, Genentech, Inc., San Francisco, CA, USA) after withdrawal into multiple doses from single-use vials. Methods: Bevacizumab was repeatedly and aseptically drawn from new vials into 1 cc plastic syringes and refrigerated in the dark at 4 for 0, 3, 6, 12, 28, 38, 46, 52, or 63 weeks or at -10 for 0, 3, 6, 12, 38, 46, or 52 weeks. The stability of bevacizumab was assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and compared with that of controls (0 weeks). The contents of the fractionated bevacizumab syringes were analyzed for microbial growth. Results: When we assessed the relative stability of the bevacizumab stored at 4, there was no concentration change for up to 12 weeks. However, concentration decreased by less than 2% between 28 weeks and 46 weeks. Samples stored at -10 were stable up to 52 weeks. All of the fractionated syringes maintained >90% stability compared with controls for up to one year in both the refrigerated group and the frozen group. The microbial study showed no significant positive results for up to 12 weeks. After intravitreal bevacizumab injection, the statuses of all patients improved, with no signs of intraocular infection. We observed no cases of intraocular infection or complications among the patients. Conclusions: Fractionating and storing smaller amounts from single-use vials is a safe method for intravitreal bevacizumab injection. J Korean Ophthalmol Soc 2014;55(10):1499-1503 Key Words: Avastin, Bevacizumab, Intravitreal injection, Stability, Sterility 베바시주맙 (Avastin, Genentech, Inc., San Francisco, CA, USA) 은 IgG1 에대한재조합인간화단일클론항체 (recombinant Received: 2014. 1. 17. Revised: 2014. 5. 6. Accepted: 2014. 8. 29. Address reprint requests to Sang Joon Lee, MD, PhD Department of Ophthalmology, Kosin University Gospel Hospital, #262 Gamcheon-ro, Seo-gu, Busan 602-702, Korea Tel: 82-51-990-6140, Fax: 82-51-990-3026 E-mail: hhiatus@gmail.com humanized monoclonal antibody) 로서생물학적으로활성화된형태의모든혈관내피성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 와결합하여억제작용을나타낸다. 베바시주맙은미국식약청에서전이성대장암의치료제로서승인을받았기때문에안과적으로는식약청승인없이처방 (off-label) 되며혈관내피성장인자와연관된맥락막신생혈관, 망막정맥폐쇄, 증식성당뇨망막병증, 홍체혈관신생등의질환에사용되고있다. 1-5 시중에유통되는형태는 100 mg/4 ml, 400 mg/16 ml c2014 The Korean Ophthalmological Society This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0/) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. 1499
- 대한안과학회지 2014 년제 55 권제 10 호 - 두종류로보존제없이일회용용기 (single-use vial) 에담겨있다. 유리체주입술을위해사용되는일반적인용량은 1.25 mg/0.05 ml으로대장암치료에사용되는것에비해그양이훨씬적어단회유리체주사에베바시주맙한병을사용하게되면비용효율이좋지않게된다. 이러한이유로일부안과의사들은조제약국에서작은용량으로분주한베바시주맙을사용하여비용을줄이거나한병의약을개봉하여다수의환자들이한꺼번에베바시주맙주입술을받을수있도록스케줄을조정하기도한다. 본원에서는이와유사한방식으로당뇨망막병증, 망막정맥폐쇄혹은연령관련황반변성과같이베바시주맙주입술이필요한환자들에게 4 에서보관된분주베바시주맙을사용하여왔다. 제조사의안내서에따르면각각의약제는일회용으로만들어졌으며보존제가없기때문에정맥주사를위해희석하면 2-30 에서 48시간동안물리화학적으로안정하지만미생물학적측면을고려하여희석후즉시사용할것을권하고있다. 6 최근연구에따르면냉장보관된베바시주맙은효능 (efficacy) 의소실없이 4 에서 3주간보관될수있으며 6개월까지무균성 (sterility) 이유지된다고하였다. 7 그러나 6개월이상의기간동안베바시주맙의안정성과무균성이유지되는지에대한보고는아직까지없다. 그러므로저자들은분주된베바시주맙의안정성과무균성이 4 와 -10 에서 1년까지얼마나유지되는지알아보고자하였다. 대상과방법 분주방법 (Fractionating method) 베바시주맙분주는경험많은약사와간호사들에의해무균실험대 (clean bench) 에서이루어졌다. 이전에개봉되지않은새로운약병에서 26-gauge 바늘을이용하여무균상태의 1 ml 플라스틱주사기에약을나누어담았다. 베바시주맙을뽑기전용기의고무마개부분을이소프로필알콜 (isopropyl alcohol) 로소독하였다. 각각의분주된베바시주맙주사기를무균안전마개로닫은후 4 에서 0, 3, 6, 12, 28, 38, 46, 52, 63주, -10 에서 0, 3, 6, 12, 38, 46, 52주동안보관하였으며제조사의안내지침에따라차광하였다 (Fig. 1). 무균성분석 (Sterility assay) 한병의베바시주맙을여러개의작은용량으로분주할때마다주사기하나를무작위로선택하였고표준평판법 (standard plating technique) 으로세균배양검사를시행하였다. 또한분주되어 4 에서 2, 4, 9, 12주동안보관된베바시주맙으로유리체내주입술을시행한후주사기내에남아있는약제에대해서도세균배양검사를시행하였다. 세 균배양에는맥콘키 (MacConkey), 혈액한천 (Blood agar), 사브로드 (Sabouraud) 배지가사용되었다. 안정성분석 (Stability assay) 냉장또는냉동보관된분주베바시주맙의안정성은효소면역측정법을사용하여평가하였다. Human IgG1 subclass profile ELISA kit (Zymed Laboratories, South San Francisco, CA, USA) 를사용하였으며이는겨자무과산화효소감지시스템 (horseradish peroxidase detection system) 을사용한샌드위치형태 (sandwich type) 의효소면역측정법이다. 코팅된미세적정판 (microtiter plate) 이다양한인간 IgG 하위그룹 (human IgG subclass) 에특이적인단일클론시약 (monoclonal reagent) 을찾아내고차례로단일클론시약이인간 IgG 하위그룹을찾아내게된다. 발견된인간 IgG는겨자무과산화효소항-인간 IgG (horseradish-peroxidase anti-human IgG) 시약에의해표식 (labeling) 이되게되고인간하위그룹항체 (human subclass antibody) 의양에비례하여감지신호가발생하게된다. 안정성에대한평가실험은다음과같은순서에따라시행되었다. 최종적인결과는 1:2500 희석이었다. (1) 저자들은각각의코팅된마이크로웰 (microwell) 에세척완충액 (wash buffer) 200 μl를나누어담고손가락으로가볍게튕겨완충액을개수대로흘려보낸뒤종이수건으로가볍게치며물기를제거하였다. (2) 희석된베바시주맙샘플을 50 μl씩나누어표준 (read-to-use standard) 과대조군 (readyto-use control) 으로각각의웰에바로사용할수있도록하였다. 그리고 50 μl의단일클론항-인간 IgG (monoclonal anti-human IgG) 를빈곳을제외한각각의웰에첨가하였다. 비어있는웰에는희석된베바시주맙 50 μl를나누어담고샘플희석액 50 μl를각각의웰에첨가하였다. (3) 마이크로웰평판은 30분동안실온에서배양되었다. (4) 마이크로웰의내용물을손가락으로가볍게튕겨개수대로흘려보낸후과정 (1) 을 3번반복하였다. (5) 각각의웰에희석된공액용액 (conjugate solution) 을나누어담았다. (6) 마이크로웰평판은 30분동안실온에서배양되었다. (7) 내용물을손가락으로가볍게튕겨개수대로흘려보낸후과정 (1) 을 3번반복하였다. (8) 테트라메틸벤지딘 (tetramethylbenzidine, TMB) 기질 100 μl를각각의웰에나누어담았다. (9) 마이크로웰평판은 10분동안실온에서배양되었다. (10) 정지시약 (stopping reagent) 50 μl를각각의웰에재빨리나누어담고수초간웰을흔들어주었다. 청색에서황색까지드라마틱한색의변화가예상되었다. (11) 450 nm, 550 nm 기준파장 (Emax microplate reader, Molecular Devices, Inc., Downingtown, PA, USA) 에서흡광도를즉시판독하였다. 1500
- 노광명외 : 분주베바시주맙의무균성과안정성 - 광학밀도 (optical density) 는 1시간동안안정적으로남아있을것으로예상되었다. (12) 각각샘플과대조군의 IgG 하위그룹농도는각각의상대적인광학밀도를사용하여표준곡선으로부터산출하였다. 모든샘플에대해개개평가를반복시행하였으며각각의평가도최소 2번이상반복하였다. 결과 총 44개의베바시주맙샘플이무균성평가에사용되었다. 베바시주맙을분주한직후 35개의샘플이세균배양을위해보내졌으며이들중어떤샘플에서도세균이발견되지않았다. 유리체내주입술후주사기에남은 9개베바시주맙샘플에대해서도세균배양검사를시행하였다. 이샘플들은분주된후 4 에서 2, 4, 9, 12주동안보관된것이었는데이중 2개의샘플에서배양 5일째 coagulase- negative Staphylococcus가배양되었다. 저자들은환자들이받았던모든안과검사기록과의무기록을꼼꼼히검토하였으 며이환자들이주입술을받은후안내염증의징후나합병증이전혀없었다는것을발견하였다. 또한베바시주맙주입술후모든환자들의상태가호전되었다. Table 1은 4 에서 0, 3, 6, 12, 28, 38, 46, 52, 63주또는 -10 에서 0, 3, 6, 12, 38, 46, 52주간보관된베바시주맙샘플 (1:2500 희석 ) 의 IgG 농도 (optical density, OD) 를보여준다. 효소면역측정법을통한안정성분석의결과를보았을때 4 에보관한샘플의경우 12주까지는베바시주맙농도변화를보이지않았고 28주에서 46주까지는 2% 미만의농도감소를보였다. 4 에서 0-52주간보관된분주베바시주맙의상대적인안정성은기저치와비교하였을때 90% 이상으로나타났다. 한편 -10 에보관한샘플의경우 52주까지농도변화를보이지않았다. 고찰 유리체내베바시주맙주입술은혈관내피성장인자를매 A B Figure 1. (A) The fractionated bevacizumab syringes were sealed with sterile safety caps. (B) For protection from light, the stored bevacizumab syringes were placed in brown plastic bags. Table 1. Mean bevacizumab concentration (optical density, OD), decreasing rate bevacizumab concentration for each sample Length of storage (weeks) Mean bevacizumab concentration (OD, mg/ml) Decreasing rate of bevacizumab concentration (OD) (%) Stored at 4 Stored at -10 Stored at 4 Stored at -10 0 23.5 23.5 0.0 0.0 3 26.4 24.6 0.0 0.0 6 25.3 28.1 0.0 0.0 12 28.9 25.6 0.0 0.0 28 23.1 1.7 38 23.2 24.3 1.3 0.0 46 23.1 24.9 1.7 0.0 52 22.7 23.7 3.4 0.0 63 22.1 5.6 The decreasing rate of bevacizumab concentration as compared with that at 0 weeks. No sample. 1501
- 대한안과학회지 2014 년제 55 권제 10 호 - 개로하는맥락막신생혈관, 망막정맥폐쇄, 증식성당뇨망막병증, 홍채신생혈관등의질환에효과적인치료방법이다. 상업적으로이용가능한베바시주맙용기에는보존제가들어있지않으며제조사에서는약제가단회사용목적으로만들어졌기때문에개봉후 8시간내에사용하여야한다고권고하고있다. 6 그러나베바시주맙은고가의약이며유리체내주입술에사용되는가장흔한용량은단지 1.25 mg/0.05 ml에불과하다. 이런이유로본원에서는보통베바시주맙을분주하여 4 에서차광보관하고후에안과적검사에따라베바시주맙주입술이필요한환자에게사용하였다. 저자들은약제의안정성이나무균성에영향을주지않고베바시주맙샘플이주사기에보관될수있는기간이얼마나되는지알기위해노력하였다. Bakri et al 8 은주사기로옮겨진베바시주맙이 4 혹은 -10 에서 6개월까지는최소한으로분해된다고보고하였다. 심온동결 (deep freezing) 후해동한베바시주맙은한번도얼리지않은베바시주맙에비해맥락막내피세포에대한항투과효과가감소하였으나이러한활동성의소실은다른연구에서는유의하지않은것으로보여졌다. 9 본원의연구에서베바시주맙의구조적안정성은 63주까지유지되었다. 그러므로 4 혹은 -10 에서저장된분주베바시주맙은 1년이상구조적쇠퇴없이보관될수있다. Ornek et al 10 은베바시주맙한병에서여러개로분주하여보관한베바시주맙에서 2주후세균의오염이발생하지않았다고보고하였으며 Chen et al 7 은 4 에서보관한베바시주맙샘플에서 6개월내에세균배양이관찰되지않았다고보고하였다. 본연구에서는 44개의샘플중 2개에서배양 5일째 coagulase negative Staphylococcus가관찰되었다. 하지만두약을주입받은환자들에서안내감염의징후나합병증이나타나지않았으므로이러한세균배양은남은베바시주맙을배지로옮기는과정에서발생한오염일가능성이높다. 결론적으로유리체내주입술을위해주사기에분주된베바시주맙은 4 혹은 -10 에서 1년까지구조적안정성이유지되며무균성은 4 에서 12주동안유지된다. 분주베바시주맙시스템은몇가지이점이있다. 첫째로외래에기반한주입술을가능하게한다. 둘째로는주입술이 요구될때환자의상태가바뀌기전즉각적으로주입술을시행할수있다는장점이있다. 세번째는치료의지연이없어시력과눈의구조적인회복에좀더좋은결과를보일수있다. 마지막으로베바시주맙한병을개봉하기위해환자들의스케줄을조절할필요가없기때문에환자가주입술을위해다시병원을방문하지않아도된다는장점이있다. 유리체내주입술을위해베바시주맙을분주하여보관하는것은안전한방법일뿐만아니라결과적으로환자의편의성이증대되는이점이있어유용한방법이라할수있다. REFERENCES 1) Hurwitz H, Fehrenbacher L, Novotny W, et al. Bevacizumab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin for metastatic colorectal cancer. N Engl J Med 2004;350:2335-42. 2) Haritoglou C, Kook D, Neubauer A, et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) therapy for persistent diffuse diabetic macular edema. Retina 2006;26:999-1005. 3) Jorge R, Costa RA, Calucci D, et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) for persistent new vessels in diabetic retinopathy (IBEPE study). Retina 2006;26:1006-13. 4) Iturralde D, Spaide RF, Meyerle CB, et al. Intravitreal bevacizumab (Avastin) treatment of macular edema in central retinal vein occlusion: a short-term study. Retina 2006;26:279-84. 5) Yoganathan P, Deramo VA, Lai JC, et al. Visual improvement following intravitreal bevacizumab (Avastin) in exudative age-related macular degeneration. Retina 2006;26:994-8. 6) Roche Pharma (Schweiz), G.I.U., Avastin (bevacizumab), information for patients. 2013. 7) Chen YH, Wu PC, Shiea J, et al. Evaluation of the sterility, stability, and efficacy of bevacizumab stored in multiple-dose vials for 6 months. J Ocul Pharmacol Ther 2009;25:65-9. 8) Bakri SJ, Snyder MR, Pulido JS, et al. Six-month stability of bevacizumab (Avastin) binding to vascular endothelial growth factor after withdrawal into a syringe and refrigeration or freezing. Retina 2006;26:519-22. 9) Peters S, Julien S, Heiduschka P, et al. Antipermeability and antiproliferative effects of standard and frozen bevacizumab on choroidal endothelial cells. Br J Ophthalmol 2007;91:827-31. 10) Ornek K, Karahan ZC, Ergin A, et al. Bevacizumab sterility in multiple doses from a single-use vial. Ann Pharmacother 2008;42: 1425-8. 1502
- 노광명외 : 분주베바시주맙의무균성과안정성 - = 국문초록 = 분주베바시주맙의무균성과안정성 목적 : 한병에서여러개의주사기에분주한베바시주맙 (Avastin, Genentech, Inc., San Francisco, CA, USA) 을냉장및냉동보관하였을때의구조적안정성 (stability) 과무균성 (sterility) 에대해알아보고자하였다. 대상과방법 : 한병의베바시주맙을무균적방법으로여러개의 1 cc 플라스틱주사기에분주하여차광주머니에넣은후 4 에서 0, 3, 6, 12, 28, 38, 46, 52, 63 주, -10 에서 0, 3, 6, 12, 38, 46, 52 주동안보관하였다. 베바시주맙의안정성은효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 을사용하여기저치 (0 주 ) 와비교평가하였다. 무균성은최대 12 주까지보관한분주된실린지에든베바시주맙검체로세균배양검사를실시하여무균성을알아보았다. 결과 : 효소면역측정법을통한안정성분석의결과를보았을때 4 에보관한샘플의경우 12 주까지는베바시주맙농도변화를보이지않았고 28 주에서 46 주까지는 2% 미만의농도감소를보였다. -10 에보관한샘플의경우 52 주까지농도변화를보이지않았다. 분주된베바시주맙은 4 및 -10 보관상태에서 1 년동안 90% 이상의구조적인안정성을보였다. 세균배양검사상분주된주사액의무균성은 12 주동안유지되었다. 분주된베바시주맙주입술후환자들의상태는호전되었으며, 환자들에게서안내염증징후나합병증을관찰할수없었다. 결론 : 유리체내베바시주맙주입술을위해적절한방법으로분주하여보관하는것은최소 4 개월까지안전하였고, 1 년까지구조적인안정성을나타내었다. < 대한안과학회지 2014;55(10):1499-1503> 1503