과제구분 기본 수행시기 중장기code RIMS code 연구분야 수행기간 연구과제 및 세부과제명 (code) 버섯 버섯 부가가치 향상 기술개발 LS0116 14 버섯 버섯의 항당뇨성 물질 탐색 LS0116 14 15 색인용어 버섯, 생리활성, 항당뇨 물질 전반기 연구실 책임자 농업기술원 정윤경 버섯연구소 농업기술원 정윤경 버섯연구소 ABSTRACT In this study, we investigated characteristics of α-glucosidase inhibitor from P. cornucopiae. Material extract from P. cornucopiae fruiting body showed the highest α-glucosidase inhibitory activity among several edible mushrooms. The α-glucosidase inhibitor was maximally extracted when P. cornucopiae fruiting body was treated with distilled water at A С for B hrs. The α-glucosidase inhibitor was purified by Sephadex G-100, G-50 gel permeation chromatography, ultrafiltration, C18 solid phase extraction and reverse-phase HPLC, and obtained the purified α-glucosidase inhibitor with inhibitory activity of 10.88 mg/ml of IC50. The purified α-glucosidase inhibitor was tripeptides with sequence of treonin- isolucin alanin - phenylalanine isolucin - aspalatic acid and its molecular weight was 1,823.92 Dalton. The α-glucosidase inhibitor from P. cornucopiae was showed clear anti-diabetic action dosage-dependantly in streptozotocin-treated diabetic induced rat. Key words : Anti-diabetic, Pleurotus cornucopiae, α-glucosidase 1. 연구목표 느타리버섯은 우리나라의 주요 식용버섯으로 면역조절효과, 항암활성, 항바이러스, 항염, 항생제, 콜레스테롤저감활성 등이 알려져 있다(Wang et al., 2000; Regina et al., 2008). 만성질환중의 하나인 당뇨병은 2000년 이후에는 성인 발병률이 10명중 1명으로 10%수준 으로 증가하고 있으며, 전세계적으로는 3번째로 위험한 질병으로 분류되고 있으나, 우리 나라 에서는 사망원인 5위의 성인병에 해당되고 있다(Baek, 2007). 특히, 당뇨병은 뇌하 520 2015년도 시험연구보고서
α α α α α 2. 재료및방법 가. 시험버섯및추출방법 나. α-glucosidase 억제활성측정 α α α μ μ μ μ Ⅳ. 버섯연구 521
다. α-glucosidase 저해제분리및정제 μ α 522 2015 년도시험연구보고서
라. 분자량 및 아미노산 서열 동정 펩타이드 동정은 gel digestion 으로 처리하여 Q-TOF2 mass spectrometer (AB Sciex Instruments, CA 94404 USA)와 결합된 Nano-ESI로 분석하였다. 분석조건은 상 온에서 규산으로 코팅한 nanoelectrospray needles (EconoTipTM, New Objective, USA)에 1 kv전력으로 조절하였고, 안정적인 flow rate (10-30 nl/min)를 유지하기 위 해 0 5 psi으로 조절한 nitrogen back-pressure와 연결시켰으며 cone 전압은 40 V으로 조절하였다. 4중극 분석기(quadrupole analyzer)는 헥사폴 충돌세포(hexapole collision cell)에서 분열에 적합한 전구체 이온(precursor ions)을 택하기 위해 수행되었다. 충돌가 스(collision gas)는 Ar을 압력 6 7x10-5mbar으로 조절하였으며, 충돌에너지(collision energy)는 25 40V였다. 생산된 이온은 반사장치(reflector)와 micro-channel plate detector, a time-to digital converter를 적합한 조건으로 맞춘 orthogonal TOFanalyze 로 분석하였다. 마. 효능검증 수컷 실험용 쥐는(Sprague-Dawley male rats) 체중 180 200 g이고 5 7주 생육한 것을 Orientbio Co.(Korea)에서 구입하였으며, 12시간 낮, 12시간 밤시간을 유지하고 온 도와 습도는 실험 1주전에 조절하였다. 모든 실험용 쥐는 5마리씩 무작위로 선발하여 처리하였으며 α-glucosidase 억제제와 당뇨를 streptozotocin 투여 방법은 Stavric et al.(1975)와 Hall et al.(1990) 방법에 준하여 처리하였다. 실험용 쥐의 혈청내 혈당수준을 높이기 위해 최후 약제처리 1시간전에 streptozotocin 를 280 mg/kg 복강내 주입하였다. 노랑느타리버섯추출물은 300 mg/kg, 100 mg/kg, 50 mg/kg 3수준 농도로 급여하였고, soluble starch 는 3 g/kg 농도로 처리별 혼합하여 경구 투여하였다. 혈액은 심장에서 채취 하였으며, 상온에서 1시간 정도 응고한 후 3,000rpm으로 10분간 원심분리하여 혈 청을 분리 20 C에 저장하여 실험에 사용하였다. creatinine, alkaline phosphatase, triglycerides 등은 Sigma-Aldrich(St. Louis, Mo, USA), α-glucosidase assay kit는 Abnova Corporation제품을 사용하였다. 3. 결과 및 고찰 <시험1> 느타리버섯의 항당뇨성 물질 분리 및 동정 느타리버섯을 포함한 4종의 식용버섯 추출물의 α-glucosidase 억제활성을 분석한 결과(표 1), 노랑 느타리버섯에서 48.5%로 가장 높았고, 분홍 느타리버섯은 (Pleurotus salmone ostramineus) 39.1%의 효과를 나타냈다. 일반 느타리버섯과 큰 느타리버섯은 활성도가 없었다. Ⅳ. 버섯연구 523
표 1. 주요 식용버섯 추출물의 α-glucosidase 억제 활성 추출물 α-glucosidase 저해활성도(%) Pleurotus ostreatus(느타리버섯) n.d* Pleurotus eryngii(큰느타리버섯) n.d Pleurotus salmoneostramineus(분홍느타리버섯) 39.1±0.1 Pleurotus cornucopiae(노랑느타리버섯) 48.5±0.4 * n.d ; not detected. 느타리버섯의 α-glucosidase 억제물질의 적합 추출조건을 분석한 결과, 표 2에서 보는 바와 같이, E시간에서 가장 저해 활성이 높게 나타났다. 표 2. 노랑느타리버섯 추출시간에 따른 α-glucosidase 저해활성 추출시간(hr) A B C D E F α-glucosidase 27.8±0.1 39.8±0.8 55.7±0.6 64.9±0.1 77.9±0.8 48.5±0.4 저해활성도(%) 그림 2. 노랑느타리버섯 자실체의 추출물에서 α-glucosidase 저해제 분리 524 2015년도 시험연구보고서
α α α α α α α Ⅳ. 버섯연구 525
α α α α 526 2015 년도시험연구보고서
P-1 P-2 α α α α α α α Ⅳ. 버섯연구 527
< 시험 2> 노랑느타리버섯의항당뇨성물질효능검증 α α 4. 결과요약 528 2015 년도시험연구보고서
α α α α α α 5. 인용문헌 Baek SH. 2007, Prevention of type 2 diabetes. Medical post graguates. 3:128-131. Derosa G, Maffioli P. 2012. α-glucosidase inhibitors and their use in clinical practice. Arch Med. Sci. 8(5):899-906. Hall IH, Scoville JP, Reynolds DJ, Simlot R, Duncan P. 1990. Substituted cyclicimides as potential anti-gout agents. Life Sci. 46:1923-1927. James, R. 2003. Report of the expert committee on the diagnosis and classification of diabets mellitus. Diabets Care 26 Supple. 1:S5-20. Jung MJ, Heo SI, Wang MH. 2008. Rat lens aldose reductase inhibitory of taraxacum mogolicum and two cirsium speecies. J, Appl Biol. Chem. 51:302-306. Kang MG, Zanabaatar B, Lee JS, Seo GS, Lee JS. 2011. Antihypertensive activity and anti-gout activity of mushroom Sarcodon aspratus. Kor. J. Mycol. 39:53-56. Kim BH, Son SM. 2006. mechanism of developing diabetic vascular complication by oxidative stress. J. Korean Endor Soc. 21(6):448-459. Regina MMG, Elisabeth W, Jamile RR, Jorge LN, Sandra AF. 2008. Alternative medium for production of P. ostreatus biomass and potential antitumor polysaccharides. Bioresource Technol. 99:76 82. Ⅳ. 버섯연구 529
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7. 연구원편성표 Ⅳ. 버섯연구 531