한국환경분석학회지제 13 권 ( 제 3 호 ) 143~148, 2010 J. of the Korean Society for Environmental Analysis LC-MS/MS 에의한하천수중스트렙토마이신분석 이종혁 김병주 명승운 경기대학교자연과학대학화학과 The Analysis of Residual Streptomycin in Surface Water by Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry Jong-Hyuk Lee, Byung-Ju Kim, and Seung-Woon Myung Department of Chemistry, Kyonggi University, Suwon 443-760, Korea Received September 9, 2010/Accepted December 6, 2010 The method for the determination of streptomycin in environmental aqueous water samples by LC/ESI-MS/ MS was developed. After ion pairing reagent was added into surface water sample, aqueous samples were extracted and concentrated through a Hydrophilic-Lipophilic Balanced (HLB) cartridge. In reverse phase liquid chromatographic (RPLC) system, chromatographic separation was achieved on a Eclipse Plus C18 column (2.1 100 mm, 5 µm), using gradient elution with 20 mm HFBA in water and acetonitrile as mobile phase. After HPLC separation, quantification and qualification were performed by electrospray ionization(esi) and tandem mass spectrometry. As a result, calibration curve showed good linearities (above r 2 =0.99) in the concentration range of 0.25~1.0 µg/l. From the spiked blank surface water, the limit of detection (LOD) and the limit of quantitation (LOQ) were 0.07 µg/l and 0.23 µg/l, respectively and recovery was the range of 48.7 ~76%. The established method can be used to determine µg/l levels of streptomycin from the environmental aqueous sample, and also can be applied to the other environmental samples. Key words: streptomycin, aqueous sample, LC/ESI-MS/MS 1. 서론스트렙토마이신 (streptomycin) 은아미노글리코사이드계항생제로인체의료용및동물용의약품으로그람-음성 (Gram-negative) 생물체감염의치료에널리이용되고있다. 1) 인체치료용으로는결핵및세균성감염에쓰이고있고, 동물용의약품으로는꿀벌의질병치료에사용되는것으로알려져있다. 2-4) 또한감귤, 복숭아같은과실류와유실수, 고추배추등의채소등의채소류의세균성병해를방지하기위하여살충제로이용되는등세균성질병치료에이용하고있다. 이와같이치료목적으로사용되고있는스트렙토마이신은인체부작용은경미한편이지만현기증, 이명, 난청등의부작용이경고되어있고내성균이생길우려가있기때문에다 른화학적요법과병행하여치료하고있다. 최근항생제인스트렙토마이신을비롯한의약품의광범위한사용으로인한배설및폐기되는의약물질 (Pharmaceutical and Personal Care Products, PPCPs) 과동물성의약품이환경에유입되면서이에대한관심과관리가요구되고있으며, 특히수질환경중에잔류하는항생제는인체에알러지반응이나의약품에대한내성균형성으로인체에악영향을미칠수있기때문에이를모니터링하기위해서환경중잔류하는의약물질의분석방법의확립이필요한실정이다. 스트렙토마이신은자외선 (UV) 검출기를이용하여확인하는방법이있으나흡수발색단이강하지않기때문에미량분석에서는대부분 HPLC에서컬럼을통과후 (post-column) 유도체화후형광검출기 (FLD) 로검출하 To whom correspondence should be addressed. Tel: 82-31-249-9647, Fax: 82-31-249-9647, E-mail: swmyung@kgu.ac.kr
144 이종혁 김병주 명승운 는방법이일반적이며, ELSD 같은검출기를사용한예도있다. 2,5-8) 하지만이방법은절차가복잡하여반복적인실험에적용하기는다소어렵기때문에최근에는액체크로마토그래프 / 텐뎀질량분석법 (LC-MS/MS) 이 HPLC/UV 나 HPLC/FLD 방법보다많이이용되고있다. 1,3-4,9) 한편, 지금까지하천수에서스트렙토마이신을 LC- MS/MS를사용하여분석하는방법을발표한논문은없다. 따라서본논문에서는염기성이며매우친수성이강해서수용액시료로부터추출이까다롭고, 또한역상크로마토그래피 (RPLC) 시스템에서분석이어려운스트렙토마이신을본연구실에서확립하여발표한논문 10 에기초하여하천수에대한시료전처리방법이간편하고감도가좋고신뢰성있는정성및정량확인이가능한방법을확립하였으며, 방법에대한유효성확인시험도실시하였다. 2. 실험방법 2.1. 기구고체상추출 (SPE) 을위한진공감압장치로는 Supelco 사 (Bellefonte, PA, USA) 의 SPE vacuum manifold 제품을이용하였고, 고체상카트리지인 Oasis HLB (hydrophilic lipophilic balance, 60 mg, 3 cc) 카트리지는 Waters사 (Milford, MA, USA) 로부터구입하여사용하였다. Caliper Lifescience사 (Seattle, WA, USA) 의 TurboVap LV evaporator가시료농축기로사용되었다. 실험에사용한시험관등모든유리기구는세척액과 3차증류수로세척후건조하여사용하였다. 2.2. 시약스트렙토마이신 (Streptomycin) 은 Riedel-deHaen 사 (Seelze, Germany) 의고순도시약을사용하였다. 메탄올, 아세토나이트릴, 아세톤등의용매는 J. T. Baker사 (NJ, USA) 의 HPLC 등급용매를사용하였고, HFBA (Perfluorbutyric acid) 와 1-heptanesulfonic acid는 Sigma-Aldrich사 (St Louis, MO, USA) 를제품을사용하였다. 증류수는 Milli-Q system을통과한 3차증류수를이용하였다. 스트렙토마이신표준물질을메탄올과증류수를이용하여 100 µg/ml의표준용액으로만든후 -20 o C 냉동고에보관하였으며, 필요시보관용표준용액을메탄올로혼합 희석하여사용하였다. 2.3. 분석기기분석장비인 LC/MS/MS는시료자동주입기 (Agilent 1200 Series G1313A Autosampler) 가장착된 Agilent Technologies사 (Palo Alto, CA, USA) 의 Agilent 1200 Series HPLC와결합된 Agilent 6410 Triple-Quadrupole 텐뎀질량분석기를사용하였다. 사용된 HPLC 칼럼은 Waters사의 Eclipse Plus C18(2.1 100 mm (length), 3.5 µm particle size) 이었으며, 이동상의유량은 0.3 ml/min, 시료주입량은 10 µl이었다. HPLC 의이동상으로써 20 mm HFBA와아세토나이트릴을 Table 1의기울기용리조건으로사용하였다. 3중사중극자형 (triple quadruple) 질량분석기를사용하였으며이온화방식은전기분무방식 (electrospray ionization, ESI) 의양이온 (+) 모드를사용하였고 MRM(multiple reaction monitoring) 방식으로검출하였으며, nebulizing gas (N 2 ) 의온도는 350 o C, 유량은 10 L/min, collision voltage는 35V 이었다 (Table 1). 2.4. 시료전처리먼저, 하천수시료에 1 M 1-heptanesulfonic acid를첨가한후 ( 이는극성이큰 streptomycin이 streptomycin-sulfonate 이온쌍을생성함으로써스트렙토마이신의극성을감소시켜고체상 (HLB 카트리지 ) 에서의머무름을증가시켜줌으로써추출효율을높이기위한이온쌍시약이다 ) 이시료용액을미리메탄올 5 ml와물 5 ml로활성화시킨 HLB(hydrophilic lipophilic balance) 카트리지 (60 mg, 3 cc) 에적재시켜흡착시키고 5 ml Table 1. LC/ESI-MS/MS parameters for the analysis of streptomycin Parameters Conditions Column Mobile phase Gradient Column flow rate Injection volume Column temperature Ionization mode Capillary voltage Gas temperature Gas flow Nebulizer Eclipse Plus C 18 column, 2.1 mm i.d., 100 mm length, 3.5 µm particle size A: 20 mm HFBA B: Acetonitrile Time(min) 0 2 8 8.1 10 Solvent B(%) 15 25 80 15 15 0.3 ml/min 10 µl 25 o C Positive ion electrospray 4.00 kv 350 o C 10 L/min (N 2 ) 35 psi
LC-MS/MS 에의한하천수중스트렙토마이신분석 145 증류수로세척한후메탄올 5 ml로용출하였다. 용출액은 45 o C에서질소증발기를사용하여농축하고잔류물은 30% 메탄올 1 ml로녹인후실린지멤브레인필터로여과하여시험용액을만든후 10 µl를 LC- MS/MS에주입하였다 (Fig. 1). 2.5. 검정곡선작성스트렙토마이신이검출되지않은하천수바탕시료 (blank sample) 에스트렙토마이신의농도가 0.05, 0.12, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0 µg/l이되도록소량첨가 (spike) 한후 2.4의시료전처리법과동일한방법으로처리한후 LC-MS/MS에주입하여크로마토그램을얻은후검정곡선을작성하였다. 2.6. 방법의유효성확인분석과정에서검출한계를추정한후바탕하천수에 스트렙토마이신을소량첨가시킨시료 (n=7) 를준비하여측정한결과로부터표준편차 (s) 를구하고, 선형검정곡선을작성하여기울기 (m) 값을구한후, 검출한계 (LOD) 는 3s/m, 정량한계 (LOQ) 는 10s/m으로정하였다 11-12). LC/MS/MS를이용한스트렙토마이신분석법의정밀성, 정확성, 회수율을평가하기위하여, 시료중스트렙토마이신의농도가 0.5, 2.5, 5.0 µg/l이되도록 spike 한하천수시료를각농도에대해서 3회반복실험하였다. 3. 결과및고찰 3.1. 스트렙토마이신의 LC/MS/MS 분석스트렙토마이신의구조는 Fig. 2와같으며분자량이 581.57이며극성이큰 -OH와 -NH 2 기능기가많이존재하므로물질자체가극성이매우크며친수성인물질이므로수용액으로부터의추출과크로마토그래피분석이쉽지않은물질로알려져있으며논문도많지않다. Table 1에나타낸바와같은역상크로마토그래피 (RPLC) 조건에서극성이큰친수성물질을효과적으로분석하기위해서 20 mm HFBA 수용액 (A) 과아세토나이트릴 (B) 을사용하여기울기용리방법을사용함으로써피이크의꼬리끌림이없고바탕선이안정된정성및정량에적합한크로마토그램을얻을수있었다. LOD (Fig. 3(a)) 및 LOQ(Fig. 3(b)) 농도로바탕하천수에스트렙토마이신표준용액을소량첨가 (spike) 한시료와시험방법의선택성확인을위해서바탕하천수 (Fig. 3 (c)) 에대하여확립된분석방법에따라전처리한후확립된크로마토그래피조건에서 HPLC를통과시킨후 ESI-MS/MS의 MRM 방식으로분석한결과스트렙토마이신의머무름시간은약 5.8분이었으며, 바탕시료에 Fig. 1. Schematic diagram of sample preparation for the analysis streptomycin in the water sample by LC- MS/MS. Fig. 2. Chemical structure of streptomycin (MW : 581.57).
146 이종혁 김병주 명승운 Fig. 3. LC-MS/MS chromatograms for streptomycin at concentration of (a) LOD (0.07 µg/l), (b) LOQ (0.23 µg/l) and (c) blank sample in spiked surface water. 서는스트렙토마이신이검출된위치에서는피이크가검출되지않았다. 스트렙토마이신표준용액을 HPLC 칼럼을통과시키 지않고직접질량분석기에주입하여 ESI의양이온 (+) 모드와음이온 (-) 모드를비교한결과양이온모드에서훨씬더좋은감도를보였다.
LC-MS/MS 에의한하천수중스트렙토마이신분석 147 Fig. 4. Eletrospray positive ion Q1 mass spectrum (upper) and product ion mass spectrum (lower) used in MRM for streptomycin. 분석의선택성과검출감도향상을위해 MS/MS 분석시 MRM(multiple reaction monitoring) 모드를이용하였고, collision energy 강도를조절하여생성이온 (product ion) 의감응도가크도록조정하였다. 텐뎀질량분석을위해먼저 full scan 모드에서스트렙토마이신의스펙트럼을얻었다 (Fig. 4의상단스펙트럼 ). 양이온모드에서 [M+H] + 인 m/z 582가기준이온 (base ion) 으로검출되어이를선구이온 (precursor ion) 으로선택하였으며, product ion scan을통하여 m/z 246, 263 이온이특성이온으로나타나이들을정성이온으로선정하였다 (Fig. 4의하단스펙트럼 ). 3.2. 정량분석을위한유효성검증실제시료측정을위해서스트렙토마이신이검출되지않은하천수시료에 0.05, 0.12, 0.5, 1.0, 2.0, 4.0, 5.0 µg/l의농도로스트렙토마이신을 spike한후확립된시료전처리방법에따라전처리하여 LC/MS/MS로분석한피크면적으로부터검정곡선을작성한결과, 상관계수 (coefficient of correlation, r 2 ) 는 0.9925로정량분석에양호한직선성 ( 직선식 : y = 58,686x - 2,677) 을나타내었다. 정밀도및정확도는좋지않지만흔적량일지라도검출하여정량을하기위하여검출한계 (LOD) 이하의농도에대해서도검정곡선에포함시켰다. 검출한계 (LOD) 는 0.07 µg/l이었으며, 정량한계 (LOQ)
148 이종혁 김병주 명승운 는 0.23 µg/l이었는데, 이는 2.6항에서제시한방법으로 LOD와 LOQ의이론적인값을계산한후실제농도를바탕하천수에 spike한후크로마토그램을확인한후얻은값이다 (Fig. 4). 절대회수율 (absolute recovery) 조사를위해서바탕시료에 0.5, 2.0, 5.0 µg/l 농도가되도록분석물질은소량첨가하여분석한결과각농도에서 76.0, 48.7, 56.0% 의회수율을나타내었다. 위와동일한농도에서정밀도 (RSD%, n=3) 는 2.2, 4.2, 2.3 % 를나타내었고, 정확도 (bias)(bias = [( 계산값 - 측정값 )/ 계산값 100]) 는 5.8, 13.8, 0.6% 를나타내어비교적만족할만한정밀도와정확도를보여주었다 12). 3.3. 실제시료분석 4대강 ( 한강, 금강, 낙동강, 영산강 ) 유역의하천수를 40지점을대상으로본논문에제시된전처리방법을이용하여분석을실시하였으나정량한계 (LOQ) 이상으로나타난하천수는없었다. 외국의경우에도하천수중 streptomycin의검출결과는보고된바없었다. 하지만, 우리나라의경우항생제인 streptomycin의사용량이다른나라에비해서많다는사실에근거하여 streptomycin의검출방법을확립하였으며하천수에서의모니터링도실시하였다. 4. 결론하천수중에잔류하는스트렙토마이신을 LC/MS/MS 로분석하기위해 HLB 카트리지를사용한고체상추출법은크로마토그래피분리에방해되는매트릭스를효과적으로제거함으로써스트렙토마이신을선택적으로추출이가능하였다. 적절한이온쌍시약 (1-heptanesulfonic acid) 을사용함으로써친수성이강한스트렙토마이신을하천수시료로부터효과적으로추출 ( 추출율 : 48.7~76%) 할수있었으며, 역상크로마토그래피 (RPLC) 시스템에서도이온쌍시약인 20 mm HFBA를사용함으로써감도좋게 ( 검출한계 : 0.07 µg/l, 정량한계 : 0.23 µg/l) 분석할수있는방법을확립하였다. 본연구를통해확립된분석조건을이용하여먹는물 ( 정수 ) 에적용시킬수있고지속적인모니터링을실시하여수질관리에이용될수있을것이다. 감사의글 본연구는국립환경과학원의 2009년도잔류의약물질분석방법연구및실태조사 (II) 사업과 2009년도정부 ( 교육과학기술부 ) 의재원으로한국장학재단의지원을받아수행된연구이며 (No. S2-2009-000-00686-1), 경기대학교특성화사업단의 LC/ESI-MS/MS를사용하였음. 참고문헌 1. R. H. M. M Granja, A.M. Montes Niño, R. A. M. Zucchetti, R. E. Montes Niño, R. patel and A. G. Salerno, Anal. Chim. Acta. 2009, 637, 64-67. 2. J. M. Serrano and M. Silva, J. Chromatogr. A, 2006, 1117, 176-183. 3. A. Kaufmann, P. Butcher and P. Kölbener, Rapid Commun. Mass Spectrom., 2003, 22, 2575-2577. 4. M. van Bruijnsvoort, S. J. M. Ottink, K. M. Jonker and E. de Boer, J. Chromatogr. A, 2004, 1058, 137-142. 5. P. Viñas, N. Balsalobrea and M. H-Córdoba, Talanta, 2007, 72, 808-812. 6. C. W. Pyun, A. M. Abd El-Aty, M. M. M. Hashim, J. H. Shim, S. K. Lee, K. D. Choi, K. H. Park, H. C. Shin and C. H. Lee, Biomed. Chromatogr, 2008, 22, 254-259. 7. P. Edder, A. Cominoli and C. Corvi, J. Chromatogr. A, 1999, 830, 345-351. 8. A. K. Sarri, N. C. Megoulas and M. A, Koupparis, J. Chromatogr. A, 2006, 1122, 275-278. 9. S. Bogialli, R. Curini, A. Di Corcia, A. Laganà, M. Mele and M. Nazzari, J. Chromatogr. A, 2005, 1067, 93-100. 10. Y. E. Shim and S. W. Myung, Anal. Sci. Tech., 2008, 21, 535-431. 11. D. C. Harris, Quantitative Chemical Analysis, 2007, 7th Ed, Ch 5. 12. US FDA/Center for Veterinary Medicine, 1999, Guidance for Industry: Validation of Analytical Procedures: methodology.