대한수혈학회지 : 제 20 권제 1 호, 2009 ABO 혈액형및 D 혈액형판정용시약의품질관리용동결적혈구표준품확립 송성욱 1 ㆍ최종현 1 ㆍ김신영 1 ㆍ김현옥 1 ㆍ민혜경 2 ㆍ김재옥 2 ㆍ신원 2 = Abstract = 연세대학교의과대학진단검사의학교실 1, 식품의약품안전청생물진단의약품과 2 Development of Cryopreserved Red Blood Cell Panels for Verifying ABO and D Blood Grouping Reagents Sungwook Song 1, Jonghyeon Choi 1, Sinyoung Kim 1, Hyun Ok Kim 1, Hyekyoung Min 2, Jaeok Kim 2, Won Shin 2 Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine 1, Biological In Vitro Diagnostics Division Team, Korea Food and Drug Administration 2, Seoul, Korea Background: ABO blood grouping reagent verification is essential to ascertain safe blood transfusions. However, the research use of donated blood products has been hampered in Korea by the blood transfusion law and management policies. In this study, we developed cryopreserved red blood cell (RBC) panels utilizing the high glycerol method to verify the ABO and D blood grouping reagents. In addition, we evaluated the stability of ABO and D antigenicity. Methods: Fresh blood was frozen by the high glycerol method, aliquoted and cryopreserved in 2 ml cryotubes. Twenty-four vials of bloods with types A (n=5), B (n=5), AB (n=4) and O (n=10) for ABO RBC panels, and eleven vials of blood types D positive (n=5), D negative (n=5) and D weak (n=1) for D RBC panels were established. Potency, avidity and specificity tests were carried out with four different commercial ABO and D blood grouping reagents. Results: The potency of cryopreserved RBCs after thawing showed no statistical difference compared with pre-freezing RBCs. Avidity time measurements were 5 seconds in ABO blood and 20 seconds in D positive blood. Specificity test uniformly showed 100% specificity. When thawed RBCs were stored at 4 o C for 7 days, the potency test measured at intervals of 2 days showed no variation. Conclusion: Cryopreserved RBC panels produced by the high glycerol method showed excellent results in stability test with reagents produced by manufacturers in Korea. Therefore, these panels can be utilized as a reliable method of verifying blood grouping reagents. (Korean J Blood Transfus 2009;20:46-54) Key words: Blood grouping reagent, High glycerol method, Cryopreserved red blood cell 접수일 :2009년 4월 3일, 승인일 :2009년 4월 20일책임저자 : 김현옥 120-752 서울시서대문구신촌동 134 연세대학교의과대학진단검사의학교실 TEL: 02) 2228-2444, FAX: 02) 313-0956, E-mail: hyunok1019@yuhs.ac 본연구는식품의약품안전청학술연구용역사업 (07102국제협735) 의지원에의해이루어졌음. - 46 -
Cryopreserved RBC Panels for ABO and D Blood Grouping Reagents 서론안전한수혈을위하여정확한혈액형검사는필수적이다. 따라서이에사용되는혈액형판정용시약의품질관리는매우중요하다. 대부분의국가에서는그나라에서생산되거나수입하여시판되고있는항-A, 항-B 및항-D 시약에대한허가기준을갖고있다. 유럽연합의혈액형판정용시약기준은 In vitro Diagnostic Medical Device Directive의 Annex II, List A로분류되어 Common Technical Specifications for in vitro diagnostic medical devices (2002/364/EC) 의규정에따라서통합적으로관리된다. 1,2) 미국에서혈액형판정용시약은 CFR Title 21, Subchapter F Biologics, Part 660 Additional standards for diagnostic substances for laboratory test에규정되어있다. 3) 국내에서사용중인혈액형판정용시약은약사법제44조규정에의한생물학적제제기준및시험방법고시 ( 고시번호제2006-57호 ) 에따라제조및시험평가되고있다. 즉 ABO 및 D 항혈청을수입또는제조하는경우위의기준에의해특이성시험, 응집력시험, 응집소역가시험을시행하고식약청에 국가검정의약품자가시험성적서 를제출하여품목허가를획득한후판매할수있다. 그러나국내에서는혈액관리법관련규정에따라매혈이가능하지않고, 헌혈받은혈액은수혈이외의목적으로는출고될수없으며, 의료기관의검사후잔여검체역시해당기관윤리심의위원회의승인을받아야하므로현실적으로생물학적제제기준및시험방법고시에따른혈액형판정용시약의시험평가를위한검사용혈액을구하기쉽지않다. 또한 A 2 나 A 2B와같은희귀혈액형의경우에는더욱구하기어려운실정이다. 글리세롤을이용한적혈구의동결보관은 1950 년 Smith 4) 에의해최초로시도되었으며, 현재글 리세롤을이용하는방법에는 40% 고농도글리세롤법과 20% 저농도글리세롤법의두가지방법이있다. 2003년 Lelkens 등 5) 은고농도글리세롤법이저농도글리세롤법에비해해동후저온저장하는동안용혈이더적었다고보고하였다. 액체질소를이용한적혈구의동결보관은 1960년 Huntsman 등 6) 에의하여시도되었다. 이러한방법으로적혈구를동결보관할경우 10년이상장기보관이가능하다는보고 7,8) 들이있으며, 특히동결적혈구를해동한후 additive solution (AS), citrate phosphate dextrose adenine (CPDA) 등에보관할경우 15일에서 21일까지도보관상태가양호하였다는보고들이있다. 8,9) 그러나이러한방법은수혈에사용하기위한적혈구의동결및해동방법이며, 혈액형판정용시약의품질관리를위한적혈구표준품제조방법에대한연구는거의없었다. 따라서, 본연구에서는고농도글리세롤법을이용하여혈액형판정용시약의품질관리용동결 ABO 및 D 적혈구표준품을제작하였다. 또한표준품의품질평가는국내에서시판중인혈액형판정용시약을사용하여동결전후적혈구의 ABO 및 D 항원성의변화를평가하여적혈구의장기보관에따른적혈구항원성의변화를측정함으로써 ABO 및 D 혈액형판정용동결적혈구표준품으로서의사용가능성여부를판정하였다. 재료및방법 1. 동결적혈구표준품제조세브란스병원혈액원에서본연구에자발적인참여동의를받은헌혈자로부터 CPDA-1 항응고보존제가 56 ml 포함된헌혈백에 400 ml 전혈을채혈하고이를원심분리하여농축적혈구를제조 - 47 -
대한수혈학회지 : 제 20 권제 1 호 하였다. 적혈구의동결은최등 10) 의방법을참고하여다음과같은방법으로시행하였다. 채혈후 7일이내의냉장보관된농축적혈구를 37 o C 수조에 30분간가온한후무균연결장치를이용하여 1,000 ml 백과연결하고혈액을옮겼다. 120 rpm 에회전속도를맞춘수평혼합기에혈액백을올려놓은후수혈셋트를이용하여 Glycerolyte 57 solution (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, USA) 50 ml를 4분간주입한후혼합기를 5분간정지시킨상태로방치하였다. 동일한방법으로 50 ml를추가로주입하고 5분간방치후다시동일한방법으로 Glycerolyte 57 solution 250 ml를 20분동안주입하였다. 22 o C에서 2,200 rpm으로 10분간원심분리한후상층액을 40 ml정도남기고농축적혈구가담겨있던빈 bag으로상층의 glycerol을옮긴후봉합하여백을분리하였다. 내용물을잘혼합한후수액세트와연결하여미리준비한 2 ml cryotube (Axygen Scientific Inc., Union City, CA, USA) 에적혈구농축액과글리세롤의혼합액을 1.5 ml씩분주한후각혈액형별로 150 vial씩제조하여 70 o C 냉동고에보관하였다. 동결 ABO 적혈구표준품판넬은 A형및 B형각각 5개, AB형 4개, 그리고혈액형판정시약의특이성판정을위해 O형 10개를포함하여 24개로구성하였으며, 동결 D 적혈구표준품판넬은 D 양성혈액 5개와 D 음성혈액 5개그리고 D 약양성 1개를포함하여 11개로구성하였다. 2. 동결적혈구표준품의해동및탈글리세롤방법 적혈구의해동은뉴욕혈액센터의적혈구해동방법에대한표준지침서 11) 를참조하여시행하였으며, 방법은다음과같다. 보관되어있던 vial을꺼내 37 o C 수조에서흔들어주면서빠르게해동하였다. 혼합액을 13 100 mm의테스트튜브 ( 녹 십자 ) 에옮기고동량의 9.0% NaCl 용액을천천히흔들어주면서혼합한후실온에서최소 1분간정치하였다. 추가로 2.5% NaCl 용액으로튜브를가득채운후, 잘혼합한뒤 3,400 rpm에서 15초간원심분리를하였다. 용혈된상층액은버리고, 2.5% NaCl 용액으로한번더세척한뒤, 0.9% NaCl 용액으로상층액이깨끗해질때까지세척하였다. 해동한적혈구는 Alserver s solution (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) 에 2% 적혈구부유액을만들어 4 o C에냉장보관하면서항원성의변화를측정하였다. 3. 해동적혈구표준품의품질평가와장기보관후의안정성평가 동결전후의적혈구 ABO 및 D 항원의안정성을평가하기위해모든적혈구에대하여동결전과동결 6개월후의응집력, 특이성및응집소역가를측정하였다. 또한해동후냉장보관에따른적혈구항원의안정성을평가하기위하여 A형, B 형, AB형, D 양성적혈구를대상으로동결전 7일동안 2일간격으로응집소역가를측정하였고, 6 개월후해동하여 7일간냉장보관하면서 2일간격으로응집소역가를측정하였다. D 약양성혈액은동결전, 동결 6개월후의응집력, 특이성검사및항글로불린검사를시행하였다. 검사에사용된혈액형판정용시약은 Novaclone (Dominion Biologicals, Dartmouth, Canada), Bioclone (Ortho- Clinical Diagnostics, Raritan, NJ, USA), Monotype (Medion Diagnostics, Düdingen, Switzerland), Bioscot (Millipore, Livingston, UK) 의 4개회사제품을사용하였다. - 48 -
Cryopreserved RBC Panels for ABO and D Blood Grouping Reagents 결과 1. 동결전및해동후적혈구의 ABO 및 D 항원성변화평가 1) 응집소역가평가 A 형동결적혈구 (n=5) 와 AB 형동결적혈구 (n=4) 를사용하여동결전과동결 6개월후의항-A 응집소역가를평가하였다 (Table 1). 동일방법으로 B형동결적혈구 (n=5) 와 AB형동결적혈구 (n=4) 를사용하여항-B 응집소역가를평가하였으며 (Table 2), D 양성동결적혈구 (n=5) 사용하여항-D 응집소역가를비교평가하였다 (Table 3). 각항- A, 항-B 및항-D의동결전후응집소역가에는통계적인차이가없어동결적혈구의항원성이안 정적으로유지됨을확인하였다. 2) 응집력평가 4개회사의항-A, 항-B 혈액형판정용시약을사용하여응집력을시험하였으며, A형, B형및 AB형적혈구는모두 5초내외의빠른응집을보이며동결전후통계학적차이를보이지않았다. D 양성적혈구는혈액을동결시키기전에응집력검사를시행하지않아동결전후의차이를알수없지만해동시킨적혈구로시행한응집력검사에서모든시약에대해약 20초내외의빠른응집을보여 D 항원의안정성을확인할수있었다 (Table 4). 3) 특이성평가항-A 시약에 B형과 O형의혈구가, 항-B 시약에는 A형과 O형의혈구가, 항-D 시약에는 D 음성 Table 1. Titers of anti-a reagents with 2% saline suspended fresh and post-thawing red cells Pre-freezing (N=9) Post-thawing (N=9) Manufacturers P-value* Median (Range) Median (Range) A 1,024 (512 2,048) 1,024 (1,024 2,048) 1.0 B 1,024 (512 1,024) 1,024 (512 1,024) 0.5 C 512 (512 1,024) 1,024 (512 1,024) 0.75 D 1,024 (1,024 2,048) 1,024 (1,024 2,048) 0.5 *P-value of more than 0.05 was not considered as statistically significant difference by Wilcoxon signed rank test. Table 2. Titers of anti-b reagents with 2% saline suspended fresh and post-thawing red cells Pre-freezing (N=9) Post-thawing (N=9) Manufacturers P-value* Median (Range) Median (Range) A 2,048 (1,024 2,048) 2,048 (1,024 2,048) 1.0 B 512 (512 1,024) 512 (512 1,024) 1.0 C 1,024 (512 1,024) 1,024 (512 1,024) 0.5 D 2,048 (1,024 4,096) 2,048 (1,024 2,048) 0.5 *See Table 1. - 49 -
대한수혈학회지 : 제 20 권제 1 호 Table 3. Titers of anti-d reagents with 2% saline suspended fresh and post-thawing red cells Pre-freezing (N=5) Post-thawing (N=5) Manufacturers P-value* Median (Range) Median (Range) A 256 (128 256) 256 (128) 0.5 B 128 (64 256) 128 (64 256) 0.5 C 128 (128) 128 (128 256) 1.0 D 64 (128) 128 (128) 0.06 *See Table 1. Table 4. Avidity time of thawing RBCs by the slide test Manufacturers Reagent Thawing RBCs A B C D Anti-A A (N=5) 4.6±2.6 3.2±1.8 6.5±3.2 5.6±1.5 AB (N=4) 5.5±1.7 2.8±1.2 7.3±2.1 5.6±1.4 Anti-B B (N=5) 6.9±2.8 3.1±1.1 5.3±1.4 5.5±1.5 AB (N=4) 7.9±2.8 3.2±2.0 6.3±1.6 6.1±1.3 Anti-D D positive (N=5) 8.0 5.8±4.8 9.6±3.5 23.6±2.4 Avidity time (seconds) was expressed as a mean±standard deviation value. 의혈구가반응하지않아모든혈액형판정용시약에대해특이성 100% 의우수한결과를얻었다. D 약양성적혈구는동결전후모든항-D 시약에음성이었으나항글로불린단계에서 3회사의제품은양성을, 한회사만은음성결과를보였다. 2. 해동적혈구의냉장보관후의안정성평가해동후냉장보관에따른항원의안정성을평가하기위하여해동후일주일간냉장보관하면서 2일간격으로응집소역가를측정하였으며, A 항원, B 항원및 D 항원모두에서동결전후에각각 7일간냉장보관하는동안차이를보이지않고거의일정하게유지되었다 (Fig. 1). 고찰 혈액공급을쉽고안전하게하기위해서는적혈구를장기간보존하는것이중요하다. 12) 현재수혈용으로제조되어공급되는적혈구의항응고제는 CPDA-1이며, 이경우유효기간은 35일이다. 그러나첨가액을사용하면 1 6 o C에서 42일까지도보관이가능하다. 13) 그이상의기간을보관하기위해서는혈액을동결해야하며, 이미국내 14-19) 및국외 5-9) 에서액체질소나 hydroxyl ethyl starch (HES), dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol 등을이용하여동결적혈구를제조한뒤, 이를해동하여적혈구회수율, 적혈구생존율등에대한많은평가를시행한바있다. 특히국내연구에서는대 - 50 -
Cryopreserved RBC Panels for ABO and D Blood Grouping Reagents Fig. 1. The antigenicity variations of frozen RBCs between pre-freezing and post-thawing during 7 days. (A) A antigen, (B) B antigen, (C) D antigen. 부분고농도글리세롤법을이용하였고, 14-19) 예외로동결보호제로 HES를사용한연구도있었다. 18) 그러나이연구들은주로동결적혈구를제조하여전쟁시혈액공급위한대책, 수혈을통한감염및후천성면역결핍증예방, 희귀혈액형보존및재고확보, 자가수혈등에사용하려는데목적을두고있었다. 최근에는항체동정용희귀적혈구의동결보존에고농도글리세롤법과액체질소법을 6개월간비교하였을때, 고농도글리세롤법이응집강도의변화가거의없어동결적혈구보존에더우수하였다는보고도있다. 19) 본연구에서 는국내혈액형판정용시약을공급하는데있어서국내혈액관리법상시약회사에서품질관리를위한표준적혈구를확보하는데어려움이있음을알고, 적혈구를안정적으로공급하기위한방법으로동결적혈구를제조하는방법을확립하고자하였다. 고농도글리세롤법을이용하여제조한동결적혈구표준품은현재국내시판중인 4종의혈액형판정용시약을사용하여동결전후의 ABO 및 D 항원성의변화를평가하였다. 적혈구표준품은동결전후의항원성이거의변화없이유지되고 - 51 -
대한수혈학회지 : 제 20 권제 1 호 있었으며, 해동후 7일간시행한항원성변화평가시험에서도응집소역가의감소가관찰되지않았다. 이러한실험결과로혈액형판정용시약의품질관리를위한적혈구표준품제조기술을확보할수있었다. 그러나본연구에서는연구기간의한계로 10년이상의장기간보관에따르는항원성변화를평가하지못했다. 이를위해추가적인실험이필요할수도있겠다. 그러나고농도글리세롤법을이용한동결적혈구제조에관한관련연구들중에, 21년간보관하였을때적혈구상태가수혈에적합할정도로안정적이었다는보고가있으며, 7) 특히 37년간보관하였을때에도적혈구의상태가양호하였다는보고도있다. 20) 그러므로본연구에서확보한기술로제조한혈액형판정용시약의품질관리용적혈구의장기간보관에따르는안정성도문제가없을것이라고판단되었다. 본연구는수혈이목적이아닌, 혈액형판정용시약의품질관리용적혈구를제조하는것이목적이므로적혈구회수율에대한평가는하지않았다. 본연구에서확립한동결적혈구제조법을사용하면장기간 ABO 및 D 항원성이유지되는안정한적혈구표준품을제조할수있을것으로생각되며이렇게만들어진적혈구표준품은혈액형판정용시약의품질관리를위한표준품으로써국내실정에맞게안정적으로사용될수있을것이다. 또한국내혈액형판정용시약의품질관리에대한신뢰성의향상은물론이고, 시약의질향상및국산시약의개발등에이용될수있을것이다. 요약 배경 : 안전한수혈을위하여정확한혈액형검사가필수적이며, 따라서혈액형판정용시약의 품질관리는매우중요하다. 그러나품질관리를위한혈액공급이국내혈액관리법관련규정에의해어려운실정이다. 따라서본연구에서는고농도글리세롤법을이용하여혈액형판정용시약의품질관리용적혈구표준품을제조하고, ABO 및 D 항원의동결전후안정성을평가하고자하였다. 방법 : 신선한농축적혈구 A형 5개, B형 5개, AB형 4개, O형 10개그리고 D 양성 5개, D 음성 5개, D 약양성 1개를고농도글리세롤법을이용하여동결적혈구표준품을제조하였고 2 ml cryotube에각각배분하여보관하였다. 각항원의안정성평가를위해국내시판중인혈액형판정용시약 4종을이용하여응집소역가, 응집력및특이성변화를측정하였다. 결과 : 동결적혈구의응집소역가평가결과동결전후통계적인차이가없었으며, 응집력검사의결과에서도동결전후에항 ABO 혈액은 5초내외, D 양성혈액은 20초내외로항원성이잘유지됨을알수있었다. 또한특이성평가시험에서도모두 100% 의우수한결과를얻었다. 특히해동후 7일간냉장보관하며 2일간격으로측정한응집소역가평가에서역가의감소는관찰되지않았다. 결론 : 고농도글리세롤법을이용하여제조한동결적혈구표준품은국내시판중인모든혈액형판정용시약을사용한안정성평가에서우수한결과를얻었다. 따라서이렇게제조된동결적혈구표준품은혈액형판정용시약의품질관리를위해안정적으로공급될수있을것으로평가되었다. 참고문헌 1. Directive 98/79/EC of The European Parlia- - 52 -
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