KJMB fm

Korean J. Microbiol. Biotechnol. (2014), 42(4), 331 338 pissn 1598-642X eissn 2234-7305 Korean Journal of Microbiology and Biotechnology 점액세균 Myxococcus stipitatus KYC4013 에의한생리활성물질 생산 안동주 1, 박수현 1, 이종석 2, 조경연 1 * 1 호서대학교생명공학과 2 경기과학기술진흥원경기바이오센터 Received: March 10, 2014 / Revised: July 15, 2014 / Accepted: September 25, 2014 Production of Bioactive Substances by a Myxobacterium Myxococcus stipitatus KYC4013 Dongju An 1, Soohyun Park 1, Jong Suk Lee 2, and Kyungyun Cho 1 * 1 Department of Biotechnology, Hoseo University, Asan 336-795, Republic of Korea 2 Gyeonggi Bio Center, Gyeonggi Institute of Science & Technology Promotion, Suwon 443-270, Republic of Korea Myxococcus stipitatus KYC4013 extract exhibited the most potent antifungal activity among the extracts of 207 Myxococcus strains isolated in Korea. High-resolution LC-MS analysis revealed that M. stipitatus KYC4013 produces five antifungal substances and three other secondary metabolites that were predicted to be melithiazol and phenalamide derivatives, respectively. The putative melithiazol derivatives were best produced in CYS medium and the putative phenalamide derivatives were best produced in VY3 medium. Keywords: Myxococcus stipitatus, myxobacteria, melithiazol, phenalamide, stipiamide 서 론 점액세균 (myxobacteria) 은 δ-proteobacteria 문 (phylum) 의 Myxococcales 목 (order) 으로분류되는그람음성세균으로토양및썩은나무껍질이나식물, 초식동물들의배설물등에서집단으로서식하며다른유기물등을분해하거나주변의미생물을죽이고분해하여영양분을얻는다 [9, 11, 20]. 7 과 (family) 22 속 (genus) 이알려져있는데 [3, 9], 이중 Corallococcus, Myxococcus, Nannocystis, Sorangium 속에속하는균주들이다른속균주들에비해많은수분리되었다 [4]. 주변의다른미생물들을죽이고분해하여영양분을얻는다는특성에서알수있듯이점액세균은다양한이차대사생리활성물질을생산하여현재까지약 100 종류의기본구조를갖는 500 여개의물질이분리되었다 [7, 17]. Sorangium 속은대표적인생리활성물질생산점액세균종류로점액세균 *Corresponding author Tel: +82-41-540-5627, Fax: +82-41-548-6231 E-mail: kycho@hoseo.edu 2014, The Korean Society for Microbiology and Biotechnology 에서분리된생리활성물질의약 48% 가이속에속하는균주들에서분리되었다 [4]. 그다음으로많은생리활성물질이분리된점액세균종류는 Myxococcus로점액세균에서분리된생리활성물질의약 21% 가 Myxococcus 속균주들에서분리되었다 [4]. Myxococcus 속은 M. virescens, M. fulvus, M. macrosporus, M. stipitatus, M. xanthus의 5개종로구성되어있다 [9]. Myxococcus 속균주들이생산하는생리활성물질로는 althiomycin, cittilin, DKxanthene, melithiazol, myxalamid, myxochelin, myxochromid, myxopyronin, myxothiazol, myxotyroside, myxovalargin, myxovirescin, phenalamide (stipiamide), rhizopodin, saframycin Mx1 등이있다 [10, 18]. Althiomycin, myxochelin, myxopyronin, myxovalargin, myxovirescin, saframycin은항세균물질이다. Althiomycin 과 myxovirescin은세균의세포벽합성을저해하며, myxopyronin은 RNA 중합효소를저해하고, myxovalargin 은단백질합성을억제하며세포막을파괴한다. Melithiazol, myxalamid, myxothiazol, myxotyroside, rhizopodin은항진균물질로 melithiazol, myxalamid, myxothiazol은미토 December 2014 Vol. 42 No. 4

332 An et al. 콘드리아의전자전달계를저해하며, rhizopodin 은액틴의중합을억제한다. Cittilin 은 elastase 저해제이며, phenalamide 는항암및항바이러스물질이고, DKxanthene 은포자형성에관여하는물질로알려져있다. 비록 Myxococcus 속균주들로부터여러생리활성물질이분리되었지만유전체분석결과 Myxococcus 속균주들이현재발견된생리활성물질들보다도더많은생리활성물질을생산할수있는능력이있는것으로나타났다 [5,8,19]. 본연구에서는국내에서분리한 Myxococcus 속균주들을대상으로배양추출물을제조하여항미생물활성물질생산균주들을선별하였으며, 이중강력한항진균물질을생산하는 M. stipitatus KYC4013 을대상으로이균주가생산하는생리활성물질을분석하고생산특성을조사하였다. 실험재료및방법 사용균주점액세균균주는모두본연구팀이국내에서순수분리한균주들을사용하였다 [14]. Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Candida albicans ATCC 18804는생명공학연구원생물자원센터에서구입하였다. 배지및배양조건점액세균균주의일반적인배양을위해서는 VY3 배지 [14] 를사용하였으며, 배양추출물의제조를위해서는 CYG 배지를사용하였다. CYG 배지는 0.5% casitone, 0.1% 효모추출물, 0.3% 포도당, 0.1% MgSO 4 7H 2 O, 0.05% CaCl 2, 50 mm 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid (HEPES) (ph 7.6), 0.1% 미량원소용액, 0.5 μg/ml cyanocobalamine을함유하고있었으며, 미량원소용액은 1리터당 100 mg MnCl 2 4H 2 O, 20 mg CoCl 2, 10 mg CuSO 4, 10 mg Na 2 MoO 4 2H 2 O, 20 mg ZnCl 2, 5 mg LiCl, 5 mg SnCl 2 2H 2 O, 10 mg H 3 BO 3, 20 mg KBr, 20 mg KI, 8 g EDTA Na-Fe 3+ salt (trihydrate) 를함유하고있었다. 물질생산을위한다른배지로는 CY [11], CYE [13], CF [13], CYC, CYS 배지 [14] 를사용하였다. CYC 배지는 CYG 배지에서탄소원으로포도당대신키토산을넣어준배지이고, CYS 배지는포도당대신가용성전분을넣어준배지이다. P. aeruginosa, S. aureus의배양에는 NA [14], C. albicans는 YM [14] 을사용하였다. 모든균주들은 32 o C에서배양하였다. 배양추출물의제조점액세균균주들을 2% Amberlite XAD-16 레진 (Sigma, USA) 을넣은 50 ml 배지에서 7 일동안진탕배양한뒤레진 을회수하였다. 레진을 50% 아세톤으로 2 회, 100% 아세톤으로 2 회추출하고, 회전증발기를사용하여아세톤만을제거한다음, 남은수용액을에틸아세테이트로추출한후건조시키고 80% 메탄올에용해하였다. 항미생물활성측정 C. albicans가각각도말된평판배지위에배양추출물을흡수시킨 6mm 종이디스크를올려놓았다. 2일간배양한후, 생장저지환의지름을측정하여항미생물활성을조사하였다. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) 분석 Zorbax SB-C18 칼럼 (4.6 150 mm, 5 μm) 을장착한 Agilent 1260 VL Infinity Series HPLC 시스템을사용하였다 (Agilent Technologies, USA). 이동상 A는 0.1% 포름산을함유한증류수, 이동상 B는 0.1% 포름산를함유한아세토니트릴을사용하였으며유속은 0.5 ml/min이었다. 일반적인점액세균균주들의배양추출물분석을위해서는 20분간 5-100% B 용매기울기, 20-25분간 100% B 용매, 25-30분간 5% B 용매로용리하였다 ( 용리조건1). M. stipitatus KYC4013 균주가생산하는항진균물질들의분석을위해서는 10분간 5-60% B 용매기울기, 10-40분간 60% B 용매, 40-60분간 60-100% B 용매기울기, 그리고 60-70분에는 100% B 용매로용리하였다 ( 용리조건2). 용리액은 photo diode array (PAD) 검출기를사용하여검출하였다. 추출물의고분해능질량분석질량분석기를이용한배양추출물분석은 Waters BEH C18 칼럼 (2.1 150 mm, 1.7 μm) 을장착한 Accela UHPLC (Thermo Scientific, USA) 와 LTQ-Orbitrap XL 고분해능질량분석기 (Thermo Scientific, USA) 를사용하였다. 이동상 A는 0.1% 포름산을함유한증류수, 이동상 B는 0.1% 포름산을함유한아세토니트릴을사용하였으며 20분간 5-70% B 용매기울기, 20-24분간 70-100% B 용매, 24-27분간 100% B 용매로유속은 0.4 ml/min 조건으로용리하였다. 질량분석스펙트럼은 HESI 이온화소스를사용하여 m/z 100-1,500 분자량범위의스펙트럼을검색하였다. 결과및고찰 M. stipitatus KYC4013 배양추출물의 HPLC 분석본연구팀은앞선논문에서국내에서분리한 Myxococcus 속점액세균의약 52% 가 C. albicans 의성장을억제하는항진균물질을생산함을보고하였다 [14]. 이활성조사에서 M. stipitatus 에속한균주들이다른 Myxococcus 종균주들에비

Bioactive Substances from Myxococcus stipitatus 333 Fig. 1. HPLC chromatograms of isolated M. stipitatus extracts. (A) CYG medium control extract. (B-E) M. stipitatus KYC4013, KYC4174, KYC2004, and KYC2018 extracts, respectively. Extracts were separated by HPLC using separation condition 1 described in the Materials and Methods section. 해강한활성을보이는것으로나타났다. 따라서본연구에서는 M. stipitatus 균주들의배양추출물을대상으로 HPLC 분석을실시하여항진균활성을보이는물질피크를찾고자하였다. 46균주들의배양추출물을용리조건1로분석하였을때가장강한항진균활성을보인 KYC4013 균주의배양추출물은 23-25분부근에서 6개의피크를보였다 (Table 1, Fig. 1B). 하지만활성이없는 KYC2018 균주의크로마토그램에서는이러한피크가보이지않았으며 (Table 1, Fig. 1F), KYC2004 균주의크로마토그램에서는일부피크만검출되었다 (Table 1, Fig. 1D). 그리고 KYC4174 균주와같이항진균활성이약한균주들의배양추출물에서는 6개피크가모두검출되었지만피크들이상대적으로낮게나타났다 (Table 1, Fig. 1C). 용리조건1을사용한 HPLC 분석에서 6개의피크가서로가깝게존재하므로 KYC4013 균주의배양추출물을용리조건2로분석하여보았다. 그결과 6개의피크들이 43.66분 (S1), 44.25분 (S2), 44.58분 (S3), 45.01분 (S4), 45.54분 (S5), 45.7분 (S6), 46.21분 (S7), 46.71분 (S8), 47.65분 (S9) 에각각검출되는 9개피크로분리되었다 (Fig. 2A). 각피크분획을받아 C. albicans에대한성장저해활성을측정하였는데, S1, S2, S7, S8, S9 피크분획들은모두항진균활성을보였지만 S3, S4, S5, S6 피크분획들은활성을보이지않았다 (Table 2). 9 개피크이외의다른피크분획들도항진균활성을보이지않았다. 따라서 KYC4013 균주의배양추출물이 C. albicans 에의성장을저해하는강한항진균활성을보이는이유는 S1, S2, S7, S8, S9 피크물질들때문인것으로사료되었다. 약한항진균활성을보인 KYC4174 균주의배양추출물에서도 S1-S9 의 9 개피크가모두검출되었다. 하지만활성을보이지않은 KYC2004 균주의배양추출물에서는항진균활성을보이는 S1, S2, S7, S8, S9 피크물질들은검출되지않았고항진균활성이없는 S3-S6 의 4 개피크만검출되었다. 피크물질의 UV 스펙트럼분석 S1, S2, S7, S8, S9 피크물질들이모두동일한항진균활성을보이므로 PDA 검출기로얻은각피크의 UV 스펙트럼을비교분석하여유도체일가능성을조사하여보았다. 그결과 S1, S2, S7, S8, S9 피크분획모두가 240 nm 와 310 nm 부근에서최대흡광을보여스펙트럼이서로유사 December 2014 Vol. 42 No. 4

334 An et al. Fig. 2. HPLC chromatogram of the M. stipitatus KYC4013 culture extract and UV spectra of the peaks. (A) HPLC chromatogram of the culture extract between 40 and 50 min. (B) UV spectra of the peaks detected with photo diode array detector. HPLC was conducted with separation condition 2 described in the Materials and Methods section. Table 1. Myxococcus stipitatus strains used in this study and their corresponding antimicrobial activity against Candida albicans, Staphylococcus aureus, and Pseudomonas aeruginosa. Strains Geographical origin Diameter of growth inhibition zone (mm) C. albicans S. aureus P. aeruginosa KYC2004 Jinan, Jeonbuk - - - KYC2018 Namhae, Gyeongnam - - - KYC4013 Jeju, Jeju 20 - - KYC4174 Chungju, Chungbuk 12 - - 하였다 (Fig. 2B). 따라서이들다섯개피크물질들은동일계열항진균물질일가능성이높은것으로나타났다. 한편 S4, S5, S6 피크분획의 UV 스펙트럼도서로유사하여 (Fig. 2B) S1, S2, S7, S8, S9 피크물질들과구별되는또다른계

Bioactive Substances from Myxococcus stipitatus 335 Table 2. Antifungal activity of peak-denoting fractions collected from the HPLC separation of the M. stipitatus KYC4013 extract. Peak number Retention time (min) 열의물질일가능성을보였다. Growth inhibitory activity against C. albicans S1 43.66 + S2 44.25 + S3 44.58 - S4 45.01 - S5 45.54 - S6 45.70 - S7 42.21 + S8 46.71 + S9 47.65 + The M. stipitatus KYC4013 extract was separated by HPLC using separation condition 2 described in the Materials and Methods section. 피크물질의질량분석항진균활성을보인 S1, S2 피크, 그리고활성을나타내지는않았지만상대적으로높은피크를보인 S4 피크를분획으로분리한후, 고해상도질량분석기로분석하였다. S1 피크물질은 m/z ([M+H] + ) 값이 471.1418로 C 24 H 26 O 4 N 2 S 2 의화학식을가진물질일것으로분석되었으며, S2 피크물질은 m/z ([M+H] + ) 값이 423.1415으로, C 20 H 26 O 4 N 2 S 2 의화학식을가진물질일것으로분석되었다 (Fig. 3). S4 피크물질은 m/z ([M+H] + ) 값이 508.3415로 C 32 H 45 O 4 N일것으로분석되었다 (Fig. 3). 얻어진화학식을기초로물질데이터베이스를분석한결과, S1 피크물질은 melithiazol F, S2 피크물질은 melithiazol A 또는 E일것으로나타났으며, S4 피크물질은 phenalamide C일것으로분석되었다. S5와 S6 피크의혼합분획은 m/z ([M+H] + ) 값이 492.3465로 C 32 H 45 O 3 N일것으로분석되어 phenalamide A1, A2 또는 A3이섞여있을것으로추정되었다. Melithiazol은점액세균 Melittangium lichenicola Me l26과 Me l46, Archangium gephyra Ar 7747, M. stipitatus Mx s64 균주에서발견된항진균물질로미토콘드리아전자전달계의복합체 III을저해하는것으로알려져있다 [12, 16]. 13개의유도체가알려져있는데, 국내에서는 Ahn 등이 Myxococcus sp. JW154로부터 melithiazol F를분리하여식물병원균에대한 in vivo 활성을조사하였다 [1]. 질량분석결과외에도 KYC4013 배양추출물의 HPLC 분석에서검출된 S1, S2, S7, S8, S9 피크분획의 UV 스펙트럼이 melithiazol 의 UV 스펙트럼과유사하며항진균활성을갖는것으로보아이들다섯피크물질들은모두 melithiazol의유도체인것으로사료된다. Phenalamide는 M. stipitatus AJ-12587 균주에서처음발견된물질로 stipiamide라는이름으로처음보고되었다 [6]. 이물질은항세균또는항진균활성을보이지않지만 P- glycoprotein으로인한암세포의다제내성을되돌리며 HIV- 1에대한항바이러스활성을보이는것으로알려져있다 [15]. Phenalamide A1, A2, A3, B, C의다섯유도체가알려져있는데, 국내에서는 Ahn 등이 M. stipitatus JW117 균주로부터 phenalamide A1, A2, A3를분리하여다약제내성암세포에대한활성을조사하였다 [2]. 질량분석결과외에도 KYC4013 배양추출물의 HPLC 분석에서검출된 S4, S5, S6 피크분획의 UV 스펙트럼이 phenalamide의 UV 스펙트럼과유사하므로이들피크물질들은모두 phenalamide의유도체인것으로사료된다. 따라서 M. stipitatus KYC4013과 KYC4174 균주는생산량에있어서는차이가있지만 melithiazol과 phenalamide 유도체들을동시에생산할수있는균주로보인다. 반면에 KYC2004 균주는소량의 phenalamide 유도체들만을생산하며, KYC2018 균주는두종류의물질모두생산하지않는것으로보인다. 배지에따른 M. stipitatus KYC4013 의물질생산특성배지에따른물질생산특성을조사하기위하여 M. stipitatus KYC4013 균주를 VY3, CY, CYE, CF, CYS, CYC, CYG 배지에서 7일동안배양한뒤, 추출물을제조하여생리활성물질생산양상을분석하였다. S1, S2, S7, S8, S9 피크물질은 CYS 배지에서가장많이생산된반면 S4, S5, S6 피크물질은 VY3 배지에서높은생산을보였다 (Fig. 4). 따라서 melithiazol은 CYS 배지에서가장잘생산되며, phenalamide는 VY3 배지에서가장잘생산되는것으로나타났다. CYE, CF, CYC 배지에서는모든피크물질들이 CY 배지에비해훨씬적은양생산되었다 (Fig. 4). CYE 배지는 1% 의 casitone과 0.5% 의효모추출물을함유하는등영양분함량이높아일부점액세균들은이배지에서매우잘성장하지만균주에따라서는성장하지않는다. 점액세균균주들은영양분이고갈되지않으므로이배지에서자실체를형성하지는않는다. CY 배지는야생점액세균균주의배양에많이사용되는배지로 0.3% 의 casitone과 0.1% 의효모추출물을함유하여 CYE 배지에비해영양분함량이낮다. 점액세균균주들은대부분이배지에서잘자라며일정기간이지나면균주에따라영양분고갈시유도되는자실체를형성하기도한다. CYG 배지는 0.5% casitone, 0.1% 효모추출물, 0.3% 포도 December 2014 Vol. 42 No. 4

336 An et al. Fig. 3. High-resolution MS analysis of the active fractions from M. sitpitatus KYC4013. 당, 미량원소용액, cyanocobalamine 으로구성되어있으며대부분의 Myxococcus 균주들이잘자라며일정기간이지나면자실체를형성하였다. CYC 배지는 CYG 배지에서탄소원으로포도당대신키토산을넣어준배지이고, CYS 배지는포도당대신가용성전분을넣어준배지이다. Myxococcus 속균주들은가용성전분에서보다는키토산또는포도당이존재할때훨씬빨리자랐다. VY3 는효모세포를먹이로하는 배지로대부분의점액세균균주들이느린속도로자라다가일정기간이지나면영양분이고갈되어자실체형성이유도된다. CF 배지에는극미량의영양분만을함유하고있어점액세균세포들을올려놓을경우영양분부족으로곧바로자실체형성이유도된다. 따라서 M. stipitatus KYC4013 은 CYE 와같이영양분함량이높은배지나 CF 와같이영양분이거의없는배지에서는생리활성물질을잘생성하지못하

Bioactive Substances from Myxococcus stipitatus 337 Fig. 4. Effects of different media on the production of bioactive substances by M. stipitatus KYC4013. 며, CYS, CYG, VY3 와같이초기에영양성장을하다가후기에영양분이고갈되는배지에서물질을잘생성하는것으로보인다. 요 약 국내분리 Myxococcus 속점액세균 207 균주들중가장높은항진균활성을보인 M. stipitatus KYC4013 균주의배양추출물을고분해능 LC-MS로비교분석한결과 melithiazol 유도체로추정되는 5개항진균물질과 phenalamide 유도체로추정되는 3개이차대사산물을생산하고있는것으로나타났다. Melithiazol 유도체추정물질들은 CYS 배지에서가장잘생산되었으며, phenalamide 유도체추정물질들은 VY3 배지에서가장잘생산되었다. Acknowledgments This research was supported by the Academic Research Fund of Hoseo University in 2013 (2013-0318). References 1. Ahn J-W, Kim B-W. 2002. Isolation and in vivo activities of antifungal compounds from Myxococcus sp. JW154 (Myxobacteria). Korean J. Microbiol. Biotechnol. 30: 162-166. 2. Ahn J-W, Choi S-U, Kwon HJ. 2002. Isolation and properties of cytotoxic polyene antibiotics produced by Myxococcus stipitatus JW117. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 30: 157-161. 3. Garcia R, Gerth K, Stadler M, Jr Dogma IJ, Müller R. 2010. Expanded phylogeny of myxobacteria and evidence for cultivation of the unculturables. Mol. Phylogenet. Evol. 57: 878-887. 4. Gerth K, Pradella S, Perlova O, Beyer S, Müller R. 2003. Myxobacteria: proficient producers of novel natural products with carious biological activities-past and future biotechnological aspects with the focus on the genus Sorangium. J. Biotech. 106: 233-253. 5. Huntley S, Kneip S, Treuner-Lange A, Søgaard-Andersen L. 2013. Complete genome sequence of Myxococcus stipitatus strain DSM 14675, a fruiting myxobacterium. Genome Announc. 1: e0010013. 6. Kim YJ, Furihata K, Yamanaka S, Fudo R, Seto H. 1991. Isolation and structural elucidation of stipiamide, a new antibiotic effective to multidrug-resistant cancer cells. J. Antibiot. 44: 553-556. 7. Kim YS, Bae WC, Back SJ. 2003. Bioactive substances from myxobacteria. Korean J. Microbiol. Biotechnol. 31: 1-12. 8. Li Z-F, Li X, Liu H, Liu X, Han K, Wu Z-H, et al. 2011. Genome sequence of the halotolerant marine bacterium Myxococcus fulvus HW-1. J. Bacteriol. 193: 5015-5016. 9. Reichenbach H. 2005. Myxococcales. pp. 1059-1144. In Brenner DJ, Krieg NR, Staley JT, Garrity GM (ed.), Bergey s Manual of systematic Bacteriology, 2nd ed. Bergey s Manual Trust, East Lansing, MI, USA. 10. Reichenbach H, Hofle G. 1999. Myxobacteria as producers of secondary metabolites. pp. 149-179. In Grabley S, Thiericke R (ed.), Drug Discovery from Nature, Springer Verlag, Berlin. 11. Reichenbach H, Dworkin M. 1992. The myxobacteria. pp. 3416-3487. In Balows A, Trüper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer K-H (ed.), The Prokaryotes, 2nd ed., vol. IV, Springer Verlag, New York. 12. Sasse F, Böhlendorf B, Herrmann M, Kunze B, Forche E, Steinmetz H, et al. 1999. Melithiazols, new beta-methoxyacry- December 2014 Vol. 42 No. 4

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