대한입상영리사회지 : 제 11 권제 1 호 1979 血淸빌리루빈測定에對한 Malloy-Evelyn 援과 J endrassik -Grof 法의實驗的比較 仁齊 I 醫大附屬서울白病院臨皮病理科 指導高一香敎授 鄭樂昇 =Abstract= Comparative stuby of Ma

대한입상영리사회지 : 제 11 권제 1 호 1979 血淸빌리루빈測定에對한 Malloy-Evelyn 援과 J endrassik -Grof 法의實驗的比較 仁齊 I 醫大附屬서울白病院臨皮病理科 指導高一香敎授 鄭樂昇 =Abstract= Comparative stuby of Malloy-Evelyn and Jendrassik-Grof methods on serum bilirubin measurement. Diredor: Il Hyang Ko, M.D. Nak Seung Chung, M.T., B.S. Dept. 01 Clinical Pathology. Inje Medical College, Paik Hospital, Seoul. Malloy-Evelyn method is simple a~d widely used, but turbidity and faintness of the color intensity may interfere correct measurement of the normal and direct bilirubin values. The disadvantages also include greater interference by hemolysis and foam formation which may prolong reading time and cause error of the value. A comparative experiment between Malloy-Evelyn and Jendrassik-Grof methods: using caffeine as an accelerator and utilizing better color reaction in strong alkali in the latter. The following conclusions are made. 1. There is a significant difference of total bilirubin value between two methods; J-G method showed superior reproducibility. 2. J -G method re realed no turbidity and foam formation. It also requires shorter testing time and easier manioulation compare to that of M-E method. 3. Both methods were greatly influenced by hemolysis, showing lower values but better result was encountered by adding ascorbic acid to J-G method. 4. Measuring direct bilirubin in J-G method, the color intensity continuously increases by significant degree for several minutes if reducing agent is not added as in M-E metod. 5. Reconsideration of the 1 minute value of direct bilirubin measurement is stresesd. 績論 Bergh 는이反應을血淸에서의빌리루반을定量하는 데처음으로利用하였다. 원래의 Ehrlich 法에서는벌 리루반파 Diazo 試藥의同時溶解툴寫하여알콜을행 1883 年 Ehrlich 는民中에排뻐되는빌리루반에 Dia- 加使用하였는데, 1916 年 Van den Bergh 가사람의 zotized Sulfanilic acid 툴作用시컸을때先緊色의 Azo 廳싹을調훌하면서우연히알콜을댄加하지않고도 複合體를形成함을報告하였고, 1913 年 Van den Dia :l o 시약과직첩反應을일으킹을發見하였다. 이것 - 3

운以後 direct 或은 prompt reacting bilirubin과 :total biliru bin을區分하는始初가되었으며, 1937 年 에 Malloy ç., velyn 읍蛋白의沈銀을피하는데 50% 의알콜을使用함이적합하다고報告하였다 1), 2) 1945 年 Ducci 와 Watson 은 Diazo 시약을넣고 1 分만 에反應펀빌리루빈을 Direct 로, Methanal 을加하고 서 30 分에反應띈빌리루반을 total 빌리루반으르하였 다.3) 1953 年 Cole 과 Lathe 는 icteric serum 우료부터抽 出한빌리루반을 chromatography 로分離한결과 indirect 빌리루빈은 slow moving fraction 을나타내 었고, direct 빌리루반은 fast moving fraction 을보 임을발견하였다.4) 이후 1956 年이래 direct 빌리루빈 은소위 conjugated 빌리루반 (bilirubin glucuronide) 이고, indirect 빌리루빈은 unconjugated 빌리루빈 ι(protein bound bilirubin) 임을알게되었다 2) 빌리루빈의測定은肉眼比色法 (Meulengracht 法 ), Biliverdin 法, 그리고 direct reading 方法등이있다. 後者는흔히 bilirubinometer 로개발되어利用되는것 으로서, 빌리루빈이 455nm 에서最高吸光度를나타내 며, 이때함께영향을미치는 Hb 또는 Oxy Hb 의吸 光度를다시 555nm 에서修표하도록하는原理이나, 新生兒등의血淸총빌리루반을測定하는데이용될뿐 이며, 簡易필速한方法이기는하나정밀하지뭇하다. 벌리루빈의定量法으로서는 Van den Bergh 法또 는 Azo빌리루빈法을應用한많은變품들이主宗을 ò] 루어왔다고할수있으며, 특히 1937 年度의 Malloy Evelyn 法과 1938 年度의 J endrassik-grof 法이여기에 포함펀다.2) Azo 빌리루빈의發色은그自體카하나의 indicator 의역할을하여서, 중간정도의 acid 에서는 purple.color 를나타내고, 5 옳醒또는彈알칼리에서는 blue color 를나타내는데, 彈알칼리에서의發色이좀더캉 하묘르非빌리루빈物質에依한測定상의영향을줄일 수있다고한다.2), 5) 中間醒의方法으료서는 Malloy-Evelyn 法이있으며, 後者의方法으로서彈醒을使用하는것으로는 Stoner Weisberg 法, Brüchner 法들이었고, 彈알칼리플使 用하는것으로는 J endrassik -Grof 法, Michaelsson 法 등이있다. Malloy-Evelyn 方法은널리보편화되어있고, 檢호 i* 과試藥의取됐이 III 교적간단하므로本검사설레저 - 도이方法을使用해왔던바, @ 測定도중돼때로發生하는混獨 ; 甚하면 Blank : 가 unknown 의吸光度보다더높아지는경우도發生 한마. @ 弱한發色 ; 표템域의발리루빈 f 直또는直接빌리 루빈 f 直의不確實. @ 新生兒등에서불치피하게얻어지는溶血에依한 영항 : ; 결과를낮게한다. @ cuvet 등에발생하는氣泡 ; 吸光度를구할때의시 간을지연시키고, reading 오차륜발생시키며, 특히 flow cell 을使用할수없다. @ 直接빌리루빈예對한吸光度즐구할때매검체마 다!- 1 分이상씩소요되는時間상의문제빛 reading 기 술상의운제. @ Methanol 같加하고完全發色까지의時間이걸려 (30 分 ) @ 바교석多量의檢體가必要란문제. 이상과같은둔체들에逢옳하게되었다. 물론이외에 도共存꿇白의농도헤따라吸收曲線의形이변하고, Methanol 의純度에영향되는등缺點들이指鋼되어왔 고, 多數의變뿔들이考 案되었마 Methanol 뎌신에 안식향산나트륨, 카페인, Acetoan~i 따, Urea 등을反 應 f 足進顆 l 로使用하고, Diazo 反應發色後에彈醒이나 彈알칼리로만들어吸收를長波測으로移動시켜서吸 光度틀增大시켜測定하는方法플은前述한바와같다. 最近 Disease Control Center 의發表어 1 依하면 cord blood 에빌리루반을加했을때 Malloy-Evelyn 法에依 해서는 50%, Jendrassik-Grof 法에依해서는 90% 의 빌리루반이測定되어진믹고하였다 6) 1970 年 Clinical chemi5try service cf the NatioT'.al Institutes of Health 의발표에依하면 Malloy-Evelyn 法의변법안 Ducci-vVatson 法과 J endrassik -Grof 법의 변볍인 Weber-Schalm 法의比較에서後者가우수한 成積을얻었다 - 고한다.7) Barrett 는역시 J endrassik Grof 법의변법인 Michaelsson 法을쓴結果同 - 檢體 에서 2% 의변이계수플나타냈다고하였으며, 8) 또믹 른보고에서는 ì.v eber-schalm 法 (Jendrassik -Grof 法 의변법 ) 은 5% 以內의변이계수깥브였다고하였다 9) 또빌리푸빈은醒性溶滅에서그 Solubility 가불얀 정 4) 하므로彈알칼리에서의발색만응을고려하게되었 으며, 마칭市飯 Kit* 카 Jendrassik-Grof 法을이용한 方法이기에본싣험에서는 K 社의 kit 을利用하여 Jendrassik -Grof 法 ( 이후 JG 法으후略稱함 ) 과종래의 Malloy-Evely 法 ( 이후 ME 法오르略稱함 ) 과의測定結 果를比較하고上述한問題點들에판하여調호하여보 았다. *W AKO, NIPPON, KRC etc. - 4

實驗方法및 ** 料 1. 1979 年 6 월 2, 3, 4 일사이에本檢훌室에依賴된 血淸檢體中比較的빌리루빈 { 直가높아보이는것을 닙 1 릇한 30 개를무작위선택하였다. II. 빌리루빈 f 直는時間이經過하면떨어진닥는特珠 性과 ME 法은操作에時間이걸란마는方法상의問題 흘고려하여다 - 음과같은連續測定方法윷써서두方 法各各에對한再現性및두方法間의結果흘구하 였마. @ 檢體를 - 列로정돈하고, @ 檢훌器具및試藥을양펀에準備完 T 한後 @ME 法 ( 1 次 ) 을조작하고 30 分발색시간을커다 리는통얀 키고 하고 하고 @ JG 法 ~(l 次 ) 을조작하고 10 分간 timer 를作動시 @ 다시 @ 과同一한方法으로 ME 法 (II 次 ) 을조착 @ 다시 @ 와同 - 한方法으로 JG 法 (II 次 ) 을조작 ø @@@@ 을 I1 直序대로吸光度플구하였다. III. 標準曲線은 20mg% 용빌리루반標準血淸 (Hale 'C o 社 ) 을使用하였고, 樓血에依한영향은抗擬固齊 ] 處 理를하지않은 O 形血球흘증류수에溶血시켜서, 적당 량의 Hb 含量이되도록한後, 各各標準血淸을隱加 하여 lomgdl?=- 드의빌려루빈함량이되도록만들었 다. 發色의安定度는總빌리루반에對한것을比較하였 고, 直接빌리르반에관한것은 JG 法에디 } 해서考察하 였다. 吸光度曲線쉰우方法共히標準血淸과愚者의것 어 1 對하여調호하였고, 最低吸光度가 y 래의 roj 눈금 이상약펴도록調節한후쿠하였다. 이覆遇에증류수 등의對照吸光度즉 roj control 用 Blank 는使用하지 아니하였다. N. ME 法은마음과같이하였다. Principle: 省略 Reagents: Û) Methanol, absolute (Merk 社 ) cî> 1. 5 % HCI: Diazo blank. @ 0.1% Sulfanilic acid: DiazoA. @ 0.5% Sodium nitrite: Diazo B. Procedure: Û) serum 1. Oml+dist. water 9.0ml (Ì) Diazo reag.: Diazo A 10ml + Diazo B 0.3ml ( 使用직천제조 ) @ DB DU TB TU diluted serum 2.0 2.0 2.0 2.0 dist water 2.5 2.5 Diazo blank 0.5 0.5 methanol 2.5 2.5 Diazo reag 0.5 0.5 正確히 l 分 30 分 Colemann J un III. 19mm cuvet. 파장 540nm. B 를 blank 로 U 의吸光度를구함. * DB; direct blank. DU; direct unknown. TB; total blank. TU;total unknown. V. JG 法은다음과같이하였다. Principle; Total bilirubin-~ Bili. -i- Caffeine 시약 +Diazo 시약 +alkali 시약 (accelerator )(Diazotization; \1 acid- alkali; \ Direct bilirubin-~ \purple J\purple bluej Bili. 카 - Diazo 시약 + 환원제 +alkali 시약. Reagents; Û) Diazo 시약. cî> HCI 시약. @ Caffeine catalyst. *50gm of caffeine 75gm of sod benzoate 125gm of sod acetate(3h 20)q.s II D. W @ alkali 시약. 19m of EDTA 판 100gm of NaOH 350gm of sod. pot. tartrateq.s II DW. *@4. Owv% ascorbic acid. *@ 3.48gmq.s to 10ml DW., Hydroxylamine hydrochloride. 註 ;* 표는別途로著者가만들어서實驗어 l 使用 한것이고, CD~@@ 는 K 社의 Kit 제품엄. Procedure; CD Diazo 시약 1Vo l. +HCI 시약 1Vol. ( 使用直前製造 ) ~ B Serum. 0.2 caf. catalyst. 1.0 Dist water 0.4 HCI 시약. Diazo 시약 T 0.2 1. 0 D 0.2 0.9 0.4 0.4 즉시꼭 10 分꼭 1 分 - 5 -

τasrorbic acid 0.1 alkali 시약 2. 0 2.0 2.0 Colemann J un m. flow cell 파장 600nm. dist. water 롤 Zero 吸光度에맞추고 T. D.B. 의吸光度를 구한後 T-B. D-B 의吸光度를各各標準曲線에 서쿠하였다. *T=total 빌리루반, D=direct 빌리루반. B= 밸리루반 blank. 結果및考察 1. 무작위選定한愚者의血淸 30 個로서 ME 法및 JG 法으로밸리루반測定을運續施行하여, 총빌리루반 f 直에對한結果를 [ 表 1) 과같이얻었다. 이때第一次拖行後第二次施行까지의時間은약 17 分이經過하였으며, 보통室內에서이정도의時間差 表 1. Comparison of M.E. method and J.G. method (mgdl) Malloy-Ev 러 yn 법 次 I n 次 I Mean u u 때T l Tl 없k - - --냐- 次1 0.18 0.18 0.18 0.18 0.26 0.22 2-2.5 0.22-0.26 0.29 0.27 3 0 0.15 0.08 0.15 0.15 0.15 4 1. 15 1.92 1.53 0.86 0.80 0.83 5 0.45 0.77 0.61 0.41 0.41 0.41 6 11.50 12.20 11.85 8.65 8.75.8.70 7 0.35 0.50 0.42 0.35 0.35 0.35 8 1. 57 1. 60 1. 58 1. 37 1. 41 1. 39 9 0.25 0.38 0.32 0.49 0.44 0.46 10 0.65 0.13 0.39 0.65 0.73 0.69 11 4.33 5.21 4.77 5.14 5.04 5.09 12 3.89 3.89 3.89 3.15 3.18 3.16 13 0.53 0.39 0.46 0.52 0.52 0.52 14-2.0-1.50 0.91 0.95 0.93 15 1.15 0.18 0.67 1. 67 1. 70 1. 6B 16 7.10 7.90 7.50 6.40 6.42 6.41 17 1. 13 2.01 1.57 1. 14 1. 24 1.19 18 12.06 11.80 11.93 9.80 9.90 9.85 19 4.07 3.60 3.83 3.50 3.50 3.50 20 1.30 1.04 1. 17 0.95 0.98 0.97 21 20.0 21. 6 20.8 21. 0 22.6 21.8 22 2.45 2.23 2.34 1.98 2.01 1.99 23 14.20 14.70 14.45 13.70 14.30 14.00 24 6.80 6.60 6.70 6.42 6.60 6.51 25 17.30 15.40 16.40 16.46 16.84 16.65 26 10.3 8.8 9.6 10.50 10.10 10.30 27 1. 23 1. 50 1. 36 1. 84 1. 80 1. 82 28 11.20 10.05 10.57 9.67 9.85 9.76 29 0.44 0.30 0.37 0.15 0.18 0.17 30 0.70 0.84 0.77 0.68 0.64 0.66 η=28 I E 1:136.28 효 I 4.87 - I - 때M 뼈次FU 돼ζ= ζru H - -잊Am wm -4 - n -% 때6 l gi127 72 11 g 앓늬% - 4 H% -6 짧ζ-4-않

에依한빌리루반 { 直의減小는없었던것 후보았다. C 表 1J 을一見하여, ME 법에서第 1 次雄行時에混潤 이發生하여 U 의吸光度보다오히려 B 의吸光度가더 높아져서결과를측정할수없게된것이검체 2 와검체 1 양 1 두개가나왔고, 2 次에서는檢體 14 에서역시同 - 한現像이있었다. ME 뽑에서이런混潤이發生하였다는사살만을認定 하고검체 2 와검체 14 를除外한나머치 28 개의검체 에대해서만各各統計處理를하였다. ME 法에서는 η=28, ε 1 =136.28, E II =135. 87. (1) 호 =4.87, (II) 호 =4.85 로서 1, II 次의 zp: 均差는 ().02 였으며, JG 뽑에서는 η=28, E 1 =127.72 EII= 130.76, (1) 호 =4.56, (II) 호 =4.67 平均差는 ME 法 보다높아서 0.11 이었다. 두方速에서의再現性에판하여서는, ME 法에서검 체 1 과캠체 12 의두개가各各 I 次와 H 次의結果가 同一하게나온데比하여, JG 法에서는검체 3, 검체 5, 검체 7, 검체 13, 캠체 19. 이렇게 5 개가 I 次와 II: 次 의結果가同一하였다. 各方法에서의 I 次結果를 y 래 에, II 次結果를 Z 래에표시하여본바, c 圖 1] 파같 이 JG 法의再現性이매우우수함을나타내였다. 두方法간의상관관계는各方法共히 1, II: 次의 zp: 均 f 直플求하여서그 zp: 均 { 直에對하여調훌하여보았 다. ME 法에서는 ζmean=136.11, (mean) 호 =4.86, JG 法네서는 Emean=129.23, (mean) 호 =4.62. 두方 tf'._ 1 { 11 R- a=-.. ι.r!i=_ 세!'JO --...J. -l _L_.'. 圖 1> 재현성 <1 1 교..-,1E '~ - J(;"; JG4 γ 1. 딱 圖 2) M-E 法과 J-G 法의상관 法간의平均 { 直의差異는 0.24 로나타났으며, t= 2.0637, p<0.05 로서두方法間의結果는유의한차이 가있었다. c 圖 2J ME 法 (x) 에對한 JG 法 (y) 의회기직 선은 y=o. 9717 x-o. 1507. 상판계수 r=0.9895 로나타 냈다. 吸光度의 Reading 時間은 ME 法에서 LII 次合計 60 檢體를읽는데氣泡鍵生등으로 100 分정도를消費하 였고, JG 法에서는合計 30 分정도消費하였다. 원래 Van den Bergh 法은알콜深加時에直接빌리 루반의 - 部가血淸蛋白어 l 吸훌하커때문에回收率이 나쁘다. 그래서 ME 法에서희석혈청을쓰게되고, 50% methanol 용액에서간접빌리루반의 Diazo 反應을시 키도록하였다. 그러나本結果와같이 JG 法에比하여 감도가나쁘며正常 f 直부근의측정특히 2.0mgfdl 이 하가不표確하였고 E 圖 l 참조그, 混獨을일으키는등의 결첨들이본측정에서나타았다. II. 총빌리루반측정치에대한發色의安定度를比 較해본結果 [ 表 2) 와같았다. 그리고직캡적안결과 의변화를 圖 3J 에서 mgdl 로환산하여표시하였다. ME 法에서는대체로 30 分에서 100 分사이가가장높 은吸光度를보였으나, 4 시간까지도變動福은매우적 으것으로나타났다. JG 法에서는時間이경과할수록鐘慢하게減少하는 경향을보였으며, 그것은 U 의吸光度가減少하면서 - 7

Bd r l' t, π I. 표즌혈정 II. 환자의힐정, - m. 용혈된환자의혈칭폐 \1",g, dl) 1S t-.--ι~ --.- -'_ - -'- - 14 f- ---.-,----_ -+_._ J G( D 13~ _~- - ------------- r ---- --. --- 경값 ) -_""~- _.,..--- _.-~ -- ---. 12 1- I... _..-- I 1,"--. EM(II) I,.,. ----- ------ 10~ ].---- -. - --------._-----------~~(ï;) 건김니셰1.0 f- 5~ 넣 -~ I..~-~~--. '.-------....--- -- - - - -... - - - - -... - - - - -- EM( 많 )... - ι '.-----.~.~.------.------.------.------. ----.-- I JG(] 따 I l ] 1 -j L 1 (,~ 까 궁꾀 o 40 50 lj 80 100 120 140 160 180 200 220 2 객 表 2J 발색의안정도 ( 흡광도의변화 ) 分 圖 3) 발색의안정도 ( 결과의변동 ) 시까 ( 상 ) ME 법 (OD) JG 법 (OD) H m 5 0.58 0.61 0.020 - - 10 0.68 0.65 0.021 0.009-0.95 0.013-0.74 0.028-0.058 15 0.69 0.66 0.023 0.009-0.95 0.013-0.74 0.028-0.058 20 O. 70 0.67 0.021 0.008-0.95 0.013-0.74 0.028-0.058 30 0.73 0.68 0.023 0.010-0.94 0.014-0.735 0.030-0.058 40 0.73 0.685 0.026 0.010-0.93 0.013-0.73 0.031-0.060 60 0.73 0.69 0.025 0.012-0.93 0.012-0.72 O. 020- O. 050 80 0.73 0.69 0.026 0.013-0.93 0.013-0.72 0.020-0.045 100 O. 73 0.69 0.040 0.015-0.92 0.012-0.72 0.018-0.030 120 0.72 0.68 0.026 0.018-0.91 0.013-0.71 0.018-0.040 140 O. 725 0.68 0.022 0.020-0.90 0.018-0.715 0.020-0.045 160 0.725 0.68 0.022 0.020-0.90 0.018-0.715 0.020-0.045 180 O. 725 0.68 0.020 0.025-0.90 0.018-0.715 0.015-0.040 200 0.725 0.68 0.020 0.020-0.90 0.019-0.71 0.010-0.035 240 0.720 0.67 0.020 0.025-0.90 0.028-0.71 0.025-0.035 혐.1 = 표준혈청 II= 환자혈청 IlI= 용혈된환자혈청 H m 同時에 B 의吸光度는上昇하는作用으로서나타값다. 단, 溶血펀愚者의血淸에서는다소不安定한變化를 보이는것같다. 두方法共히室溫에서發色의安定度는비교적양호하다고하겠다. ME 볍에서의回收率을나쁘게하눈다른原因의하나 는, 作用 medium 에서의 ph 의安定性 l 弱한테도있 다고한다. 血淸을加했을때약한 p:a~ 변동이올수 있고, 이것은곧發色의彈度에變化를일으키는要因 J 이될수있다는것이다. 이론상彈한알칼리매질에서 의 JG 法의發色이좀더얀정할것도같 냐본살험 에서는 ME 法이좀더나은것으로도보이며, 이것은즉 8 --

μ mm 씨l1. 40 e r 깨 hn n lv p 어r 1. 20 - I ::l ι 2jt~ ~ιν ~~~~.~ME 엽網 ;et lid ".01110 1-1.& 1.30-1.20-90- ι낀ι80 - 긴70 ~\ ~ ~ _, F 60 i-- j s -- 0... 30- ) } :>am 어. T Sample e:. r 圖 4) 빌리루반표준곡선 ME 法에서作用 medium 에서의 ph 의안정성은곧發 色의彈度에만영향을마칠뿐 발색의안정성에는무 판하던가, 다른원인에기인하는가에대해서는不分明 하였다. m. 두方法各各에對한 Calibration curve 는 圖 4J 와같았다. 짧色은 M 'E 法에서더욱弱하나 19mm cuvet 을使用 하여서吸光度폴크게하였고, 의 flow cell 율사용하였다. JG 법에서는便宜상 1cm 두方法共히 20mgdl 이 상의빌리루빈 { 直는隔釋해서뼈 u 定하도록되어있다. JG 法에서血淸을 O.2ml 썩使用한것은直接또눈 IE 常 f 直附近의빌리루반에對한測定精度를높이고자하 는意圖였고, 이때媒質에서의 ph 의영향은매우적 은것으로보았다. ME 法에서의 標準曲線은빌리루반 의 choloroform 橋被을使用하도록되어었으나이方 法에서는共存蛋白의농도가 홉광도에영향을마치게 되므로 5) JG 法에서의標準血淸을그대로 ME 法에서도 使用하였다. N. 任意의농도에대한, 檢體및標準血淸의吸光 度曲線은 ME 法에서 圖 5J 와같았다. 대체로 "81 슷한類型을나타내였으나標準血淸의 test 및檢體의 test와, 標準血淸의 blank 및檢體의 blank 는더가까운類型을보였다. test 의曲線은 525nm 근 처에서最高를이루나, Blarik 는그렇지않고약 500 nm 근처에서부터완만한碩힘를이루며약 600nm 까지내려오고있다. procedure 대로 540,..., 550nm 에서 吸光度를求함이가장좋은것우로나타났다. JG 法에서의吸光度曲線은 圖 6J 과같었다. - 見하여다소複雜한느낌을주며, 標準血淸과檢 體의 test 및標準血淸의 blank 와檢體의 各비슷한형태를보이고있다. blank 는各 特히 test 와 blank 의 吸光度曲線이약 530nm 에서 650nm 사이에는反對유형 10 0 390 410 430 450 470 490 딩 o 530 550 570 590 ('! C coj 650 670 690 710 730 750 77C L다장 ) 圖 5) Evelyn-Malloy 법의홉광도곡선 ; ); 삽 K 圖 6) J endrassik -Grof 볍의흡광도곡선 의곡션을그리고있다. ~n test 는약 570-610nm 에 서最高틀이루고, blank 는 590-620nm 사이에서最 低를나타내고있다. 本 procedure 와같이 590-610 nm 에서吸光度플쿠함이가장좋은것으로나타낮다. 吸光度測定에서, 千涉物質은最小의영향을, 빌려루 반에依한發色은 最大의영향올받는 JG 法이 ME 法 에比하여좀더合理的이라고판단되었다. V. 두方法共히溶血度가짙을수록빌리루빈은더 낮은 f 直를보였 나 JG 法이다소덜한것으로나타났 다. ME 法에서, 實驗檢體흘만드는過程에서만들어진 蛋白含量變化 ( 標準血淸의절반 ) 에依하여예상되는 結果 { 直의變動은고려되지않았다. 9 -

3 2.6 10 0.332-0.795 6.9 0.258-0.950 10.5 까 = 뻐 表 3J 용혈에의한영향 검체의함량 l ME 볍 Hb(gmdl) Bili(mgdl) 11 0 JG 법 OD Bili l OD Bili l 1. 3 10 0.292-0.705 6.1 0.192-0.735 8.2 2 1.7 10 0.350-0.705 5.3 0.246-0.730 7.25 3 2.6 10 0.495-0.820 4.8 0.332-0.795 6.9 表 4J Ascorbic acid 를첨가했을때의용혈에의한영향 (JG 법 ) 검체의함량 Hb(gm%) bili(mg%) 11 11 ascorbic acid 없이 1I ascorbic acid 첨가 OD bili. 11 OD bili. l 1.3 10 0.192-0.735 8.2 0.152-0.840 10.5 2 1. 7 10 0.246-0.730 7.25 0.220-0.935 10.9 뻐 빠 1%1페표 i. 1 ε- --_...--_...--- ---. - -- ---------... Direct 빌리루빈측정에 Hydroxylamine hydroch 익2 0.180 0.185 30 0.185 0.180 3 0.180 0.185 40 0.180 0.180 4 O. 180 0.185 60 0.182 0.180 6 O. 180 90 0.185 0.175 *AA:ascorbic acid HAC: Hydroxylamine hydrochloride l 0.205 2 0.220 3 0.230 4 0.240 5 0.245 J ohn D. Bauer등 5) 6 0.250 의저서에도溶血血淸에 7 0.252 는 O.lml의 ascorbic loride (34.8%) 와 ascorbic acid (4%) 를使用하였을 8 0.252 acid를카하도록하였 9 0.2525 으며, 本 結果로보아 ascorbic acid 등의캉.1 껴 --'- L l 4..L....L -- J... \... --- ) 1 ~ 3 1 :; tì H ~J },,) ι. "_,;"C 1 團 7) 직접빌리루빈의흡광도변화 (JG 법 ) 表 5 그직접빌리루반의홉表 3. 에서의 JG 法파 광도변화 (JG 법 ) 同一한조작을하고 0.1 分 OD ml 의 ascorbic acid (4 %) 를加했을배, 약간 높기는하였으나 表 4 그 와같은좋은결과를얻 었다. 10 0.253 JG 法에서溶血에依한 11 0.253 12 0.253 17 0.253 70 0.253 판단되었다. 영향을줄이는데는 력한환원제를행加했을 때에야가능한것으료 - 1 0- m 의. 펀쨌뻔르빌= 표E 발 접색,) 表[ 分20 0.180 0.183 - = MM 뉴 찌에 꾀HK 음20 램(---- 핸패分α-( 제0 첨m) 직g 0.180 120 0.180 0.168 10 0.180 0.185 180 0.179 0.165 15 0.188 0.183 240 0.187 o. 160 를가하지않고 direct 빌리루빈 { 直를측정할때, 吸光 度의經時變化를 [ 表 5J 와 圖 7J 에나타내었다. 약 6 分까지는빡른吸光度의增加가있었고, 以後 10 分까 치는완만하기는하나吸光度의增加카계속되었다. 그리고 70 5} 까지판찰하였으나변동이없었다. 해의훌훌色의安定度를各各쿠하여 C 表 6J 파같은吸 光度를얻었다. 前者는 4 시간까지吸光度의완만한減 少를보였으나後者는 - 定함을보였다. 직캡빌리루반을통상 conjugated bilirubin 이라고. 한다. conjugated bilirubin 은주로 bilirubin diglucuronide 로되어있으며, 其他 bilirubin monoglucuronide, pigment Azo A, Pigment Azo B, 및 Sulfate, phosphate, taurine 等의 bilirubin conjugated 物質이있는것으로알려졌다 11)

Bilirubin diglucuronide 는 Diazo 시약과 l 分以內에 反應을하지만其他는反應이늦거나不完全하다. 直接밸리루반이란 Diazo 시약과직접반응 ( 얄콜동의 첨가없이 ) 을일으키는것을意味하게되며주로 I 分 { 直 의것 ( 야境遇에는 bilirubin diglucuronide) 이測定 되어오고있으냐, 5 分植, 10 分 f 直, 15 分 f 直, 20 分植들 을測定하는方法도있다.6), 12) 위에서보이듯 JG 法에서도 l 分 { 直의直接빌리루반을 구할경우에는반드시환원제가펄요한것으로나타났 고, 환원제로쓰이는 ascorbic acid 는每日新造使用하 고, Hydroxylamine hydrochloride 는每週新造하도 록되어았는테, Lynch s med. lab. tech. 10 ) 에서는後 者를켠장하고있다. ( 表 6) 에서는後者의경우적어 도 20 分以內에吸光度를쿠해야할것을暗示한다. 直接빌리루반의뼈.u 定은, ME 法에서의技術上의難點 은새삼論議할것도없거니와, JG 法에서도위와같은 發色의彈度는時間어 l 짜라增加하며, 特히 l 分前後 하여서는매우甚한變動이있음을보았다. 짜라서 1 分 f 直直接빌리루반測定은이같은技術上그리고方法 上의誤差要因을크게얀고었는것이다. 다시말하면, 加한試藥의混合속도와 l 分간의反應量은큰相關關 係를갖고있음이分明하며, 또정확히 1 分간의시간 을치키는문제도적지가않다. 다수의檢體를取銀하 게되면약 30 초정도의지연을가져오기도쉽고, 또 多數의檢體에 } 試藥을넣고나서흔들어混合을시킨 약던지하면反應은훨씬덜일어날수도있다. 뿐만 약니라 cf 웹 7J 에서보이듯이렇게發色의심한增加 도중씌, 정확히 1 分을區分지어서그것으로파연 bilirubin diglucuronide 만이測定되거냐또는 bilirubin diglucuronide 全量이測定되어진다고할수가었겠 는가하는문제다. 또反應은, 反應媒質의조건에짜 라서도변동될여지가있다고본다. 上述한점으로서直接빌리루반의測定은만드시 l 分 f 直툴지켜야할이유가적으며새로운安定時間내지 는총직접빌리루반 f 直를쿠함이측정자나염상에서만족 스럽고신뢰할수었는결파를얻을것이라고생각한 다. 이마各種自動分析機나 kit 에 10 分 f 直차응용되고 있음은이러한사실을반영하는것으로도보여진다. 마만이경우에는새로운正常 f 直를設定함이必要할 것이마. VII. JG 法에對한缺點은 @ 시약의제조가다소불 편하다는점에었다. 그러나실제 3l 정도플한벤에제 조하면, caffeine 시약의경우 3 천건을할수었게펀 다. 필요하면그이상을만들어도될것이다. (2) Diazo 시약및환원제의짧은保存期間이문제가훤다. Diazo 시약은적어도 ME 법과다툴것이없으며, 長期保存할 수있게 kit 에만틀어져냐오므로짧究해볼여지카 있다. 환원제는溶血血淸에만쓰고, 直接빌리루벤의 測定은 1 分植以外의것으로채선하여야할것이다.@ 藥品이彈하다는點이고, @ 조작이다소복잡하다는 點이나, 自動 pipet 을使用한결과오히려능률적이 다. 위의모든敵點은많은檢體를取됐하는檢훌室에서 는그長點과는 Þl l 걸수없다고하겠다. 本짧究에서 JG 法에對하여 kit 를使用하고또 kit 의方法을다짜르지않은것은討論의여지가있을 것으로도보이나 CD 우리가사용하는방볍을그애로 Þll 교하고, (2) [" 실험재료 난에서참고한바와같이제 조하여서本方法과比較하였던바매우類似한結果를얻었었다. 本陽究는두方法간의擺括的인差異와問題點에 關하여比較檢討해보고자한것이였으프로크게相 備되는바는없으리라고본다. 結論 1. ME 法파 JG 法에依한총밸리루반치의결과에는 유의한差異가있었으며 JG 法의再現性이우수하였다. II. JG 法은混獨, 氣泡의發生 l 없고, ME 法에比 하여時間 1 만축되고, 조작기줄이安全하다. ill. 두方法共히發色의安定度는良好한것으로나 다낮으나, ME 法이좀더좋았다. N. ME 法의吸光度曲線은 Blank 와 test 카바슷한 曲線을보였고, 540-550nm 가가장걱당한測定波長 우로나타났으나, JG 法에서는 590-610nm 사이가가 작적합한測定波長域으로나타냈으며, blank 는最小 吸光度, test 는最大吸光度를냐타내었다. V. 두方法共히辯血에依한영향은커서低 f 直를 보였으나, JG 뿔에서 ascorbic aciod 플加했을때좋은 댔績을보였다. \1. JG 法에서도直接밸리루빈 f 直의뼈 u 定어 1 환원제를 첨카하지않으면發色은의의있는數 f 直만큼數分간증 가하였다. 때. 직접빌리루빈의측정에 1 分 f 直틀쿠하는것은再 考할것을주장한다. References 1) Harold, A. Harper: Revew of phy. chem. 8th. Lange California. 274 (1961). -11-

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