대한소아신장학회지제 14 권제 2 호 2010년 원저 DOI 10.3339/jkspn.201.2.166 1) 소아복막투석환자에서혈관내피성장인자유전자다형성이복막의용질이동성에미치는영향 서울대학교의과대학예방의학교실, 성균관대학교의과대학삼성서울병원소아청소년과질병관리본부예방접종관리과, 서울대학교어린이병원소아청소년과인제대학교해운대백병원소아청소년과 * 최현진ㆍ백경훈ㆍ조희연 ㆍ강희경 ㆍ정해일 ㆍ최용 ㆍ하일수 * = Abstract = Influence of VEGF Genetic Polymorphism on Peritoneal Solute Transport in Pediatric Dialysis Patients Hyun Jin Choi, M.D., Kyung Hoon Paik, M.D. * Hee Yeon Cho, M.D., Hee Kyung Kang, M.D. Hae Il Cheong, M.D., Yong Choi, M.D. and Il Soo Ha, M.D. Department of Preventive Medicine, College of Medicine, Seoul National University Department of Pediatrics *, Samsung Medical Center, Sungkyunkwan University School of Medicine Division of Vaccine Preventable Disease Control and National Immunization Program Korean Centers for Disease Control and Prevention Department of Pediatrics, Seoul National University Children s Hospital Department of Pediatrics, Inje University Haeundae Paik Hospital Purpose : Genetic and clinical factors can influence the permeability of the peritoneal membrane. The peritoneal equilibration test (PET) is helpful in measuring peritoneal permeability in peritoneal dialysis (PD). We investigated the influence of genetic polymorphism of vascular endothelial growth factor (VEGF) on the PET parameters. Methods : Pediatric patients who underwent PET within 12 months of initiating PD at Seoul National University Children s Hospital and Samsung Medical Center were selected. The patients with positive history of peritonitis before PET were excluded. The VEGF -2578C/ A, -14978T/C, -1154G/A, -634G/C, and +936C/T single-nucleotide polymorphisms were genotyped. Results : The mean 4-hour dialysate-to-plasma ratio for creatinine (D/P creatinine) and the mean 4-hour dialysate glucose to baseline dialysate glucose ratio (D/D0 glucose) were 0.56± 0.13 and 0.43± 0.11, respectively. The patients with haplotype CTGGC showed higher 4-hour D/P creatinine (0.67± vs 0.50± 0.09, P =0.007) and lower 4-hour D/D0 glucose (0.35± vs 0.47± 0.08, P =0.037) than those without haplotype CTGGC. Conclusion : The VEGF genetic polymorphism may influence the peritoneal solute transport. (J Korean Soc Pediatr Nephrol 2010;14:166-173) * 최현진, 백경훈두저자는본연구에동일하게기여하였음. * 본논문은대한소아신장학회 2006년제 9 회페링연구비지원으로이루어졌음. 접수 : 2010년 9월 20 일, 수정 : 2010년 10월 4 일, 승인 : 2010년 10월 9일책임저자 : 하일수, 서울시종로구연건동 28번지서울대학교어린이병원소아청소년과 Tel : 02)2072-2858 Fax : 02)2072-0274 E-mail : ilsooha@snu.ac.kr
대한소아신장학회지 : 제 14 권제 2 호 2010년 Key Words : Peritoneal equilibration test, Vascular endothelial growth factor, Single nucleotide polymorphism, Peritoneal dialysis 서 소아말기신부전환자의 80% 이상에서복막투 석이사용되고있다. 복막투석환자에서용질에대한 복막의투과성은개인에따라다른특성을보이며이 는복막투석환자의장기적인경과에영향을미친다. 임상에서는개인별로다른용질의투과속도를평가 하기위해복막평형검사가널리사용되고있다. 표준 화된복막평형검사는 1987년 Twardowski 에의해 처음으로도입되었다 [1]. 초기에소아는성인에비 해높은복막투과성을보이고소아에서도연령이어 릴수록복막을통한용질의이동이빠르게일어난다 고알려졌으나복막평형검사중주입하는복막투석 액양을체표면적에비례하여결정하기시작한뒤로 는연령이미치는영향이크지않다는결과들이보고 되었다 [2, 3]. 용질의복막투과율은주로복막의관류모세혈관 의양, 혈류및복막투석액과접촉하는복막의면적 에의해결정된다 [4, 5]. 이러한복막혈관의밀도 및용질이동속도조절에혈관내피성장인자 (vascular endothelial growth factor; VEGF), nitric oxide (NO), interleukin-6 (IL-6) 등이중요한역할을 하고있음이알려지면서 [6-9], 연령, 복막염의병 력, 복막투석의기간, 잔여신기능, 안지오텐신전환효 소억제제의사용등[10-13] 과같이관련성이보 고된바있는다양한임상적요인들외에, 위의단백 질을전사하는 VEGF, endothelial NO synthase (enos), IL-6 유전자다형성과같은유전적요인 이복막의용질이동에미치는영향에대한연구들이 이루어져왔다[13-15]. 이가운데 VEGF 유전자 다형성과복막투과성의상관관계를살핀연구들은 모두성인을대상으로하였으며 VEGF 유전자다형 론 성과초기복막평형검사사이에는상관관계가없는 것으로보고하였다 [13, 15]. 소아복막투석환자에 서 VEGF 유전자다형성에따른복막용질이동성의 차이는밝혀진바가없어기존연구들보다다양한 VEGF 유전자다형성부위를대상으로그상관관계 를살펴보았다. 1. 대상 대상및방법 2001년부터 2007 년까지서울대학교어린이병원 과삼성서울병원에서복막투석을한소아만성신부 전환자들중복막투석시작 1개월이후부터 1년사 이에복막평형검사를시행한환자를대상으로하였 다. 이가운데복막평형검사전에복막염의병력이 있는환자와복막평형검사가아래에기술한표준화 된복막평형검사방법으로시행되지않은환자를제 외하였다. 2. 방법 1) 대상환자의기본특성 대상환자들의성별, 체표면적, 연령, 복막투석기 간, 기저질환등을의무기록을통해후향적으로조사 하였다. 2) 복막평형검사 복막평형검사는다음과같이시행하였다. 복막평 형검사전마지막투석을할때 복막투석액을주입하여검사전까지최소 2.5% 텍스트로스, 4시간이 상저류시켰다. 이를최소한 20분동안배액한다음 2.5% 텍스트로스복막투석액을체표면적 (m 2 ) 당
최현진외 6 인 : 소아복막의용질이동성과 VEGF SNP 1,050-1,150 ml을 10 분에걸쳐주입하였다. 주입 이끝난직후를 0시간으로하여 4시간동안투석액 을저류시키고저류 0, 2, 4시간에복막투석액의포 도당과크레아티닌을측정하고저류 2시간에혈청 포도당과크레아티닌을측정하였다. 측정값들을이 용하여대상환자들의 4 시간투석액 / 혈장크레아티 닌비 (D/P creatinine) 및 4 시간투석액 /0시간투 석액포도당비 (D/ D 0 3) VEGF 유전자다형성분석 glucose) 를구하였다. VEGF -2578C/A, -1498T/C, -1154G/A, -634G/C, +936C/T 유전자다형성부위를대상으 로하였다. 말초혈액백혈구에서 genomic DNA를 뽑아 VEGF 유전자 -2578C/A, -14978T/C, -1154G/A, -634G/C, +936C/T 의다형성염기 서열을포함한염기쌍을증폭시키기위해시발체를 사용하여중합효소반응 (polymerase chain reac- tion, PCR) 을시행하였다 (Table 1). -2578C/A, +936C/T 의중합효소반응에는 DNA polymerase 로 Takara Taq TM (TaKaRa, Otsu, Shiga, Japan) 를사용하였고 -1498T/C, -1154 G/A, -634G/C 의중합효소반응에는 Taq TM Takara La (TaKaRa, Otsu, Shiga, Japan) 를사용하 였다. -2578C/A, +936C/T 의중합효소반응은 ge- nomic DNA 50 ng, 상부시발체와하부시발체각각 10 pm, 10X PCR buffer 2 μl, 25 mm MgCl 2 1 μl, 2.5 mm dntp 1 μl, 1 unit Taq DNA poly - merase 을넣고 20 μl 의반응용액에서시행하였다. -1498T/C, -634G/C 의중합효소반응은 genomic DNA 50 ng, 상부시발체와하부시발체각각 10 pm, 2X GC PCR buffer I 10 μl, 2.5 mm dntp 4 μl, 1 unit Taq DNA polymerase 을넣고 20 μl의반 응용액에서시행하였다. -1154G/A 는 genomic DNA 50 ng, 상부시발체와하부시발체각각 10 pm, 2X GC PCR buffer II 10 μl, 2.5 mm dntp 1 μl, 1 unit Taq DNA polymerase 를넣고 20 μl 의반응용액에서시행하였다. -2578 C/A와 -1498T/C 의반응조건은첫반 응주기에서먼저 94 에서 5분간변성시켰고이후 94 에서 30 초간변성, 57 에서 30초간서냉복 원, 그리고 72 에서 30초간신장하는과정으로 35 주기를시행한후마지막주기에서는 72 에서 5분 간두었다. -1154G/A, -634G/C, +936 C/T의 경우서냉복원을각각 60, 53, 58 에서 30초 간시행하여 35 주기를시행하였다. VEGF -2578C/A, -1498T/C, -1154G/A, -634G/C, +936C/T 의 PCR 산물은각각 Bgl II, BstU I, Mnl I, Nla III, BsmF I 제한효소 (New Table 1. VEGF Polymorphism Primer Sequences Used in This Study Region -2578C/A -1498T/C -1154G/A -634G/C +936C/T Nucleotide sequences of primers 5 -ACCTAGCACCTCCACCAAAC-3 5 -CCCATCCCATTCTTGCATATAG-3 5 -TGTGCGTGTGGGGTTGAGCG-3 5 -TACGTGCGGACAGGGCCTGA-3 5 -CCTGCTCCCTCCTCGCCAAATG-3 5 -GCGGGGACAGGCGAGGCTC-3 5 -GCTTGGGGAGATTGCTCTAC-3 5 -GTCTGTCTGTCCGTCAGCG-3 5 -CAGGGTTTCGGGAACCAG-3 5 -TGGGTGGGTGTGTCTACAGG-3 Abbreviation : VEGF, vascular endothelial growth factor
대한소아신장학회지 : 제 14 권제 2 호 2010년 England Biolab, Berverly, MA, USA) 를이용하 여 -2578C/A, -1154G/A, +936C/T 는 37 에 서, -1498T/C 는 60 에서 8시간이상반응시켰 고, -634G/C 는 65 에서 3 시간동안반응시켰다. 이를에티디움브로마이드 (ethidium bromide) 를 포함한 2.5% 아가로즈젤 (agarose gel) 에서전기 영동하여자외선하에서 DNA 절편크기를관찰하 였다. 제한효소에의해절단된후의 DNA 절편길이 에따라서유전자형을기술하였다. 4) 통계분석 연속변수는평균± 표준편차로표시하였다. 통계적 분석에는 SPSS (version 12.0 for Windows) 를 사용하였고, 유의수준 미만일때통계적으로 유의한것으로판정하였다. 임상지표들과복막평형 검사결과값의상관관계는 Spearman 상관분석을 시행하여분석하였고유전자형또는배수체형에따 라각군간의복막평형검사결과값의차이는 Mann- Whitney U test 또는 Kruskall-Wallis test를사 용하여분석하였다. 결 1. 대상환자의기본특성 대상환자는모두 21명으로남자는 9 명, 여자는 12 명이었으며, 연령은 9.3± 4.5 세, 체표면적은 0.96 ±0.32 m 2, 복막평형검사시행시기는복막투석시 작후 과 2.4± 2.1 개월, 복막평형검사에사용된복막투 석액의부피는 1,091 ± 36 ml/m 2 이었다. 만성신부 전의기저질환으로는국소성분절성사구체경화증 6 명, 역류성신병증 2 명, 기타 7명이있었고그외 원인불명이 6 명이었다. 0.13, 4시간 D/D 0 glucose 는 0.43± 0.11 이었다. 4 시간 D/P creatinine 값과연령(Spearman's rho= -, P=0.559), 체표면적 (Spearman's rho= -0.04, P =0.876), 복막평형검사에사용된체표면 적당복막투석액주입량 (Spearman's rho=-0.24, P =0.302), 복막평형검사시행전까지복막투석 기간 (Spearman's rho=0.39, P =0.080) 사이에 는유의한상관관계가관찰되지않았다 3. VEGF 유전자다형성과복막용질이동성 VEGF -2578C/A 와 -1498T/C 의유전자다형 성분석결과 VEGF -2578 C allele과 allele, VEGF -2578 A allele과 이모두일치하여 -1498 T -1498 C allele 100% 연관되어있었다. VEGF 유전자형에따라 4시간 D/P creatinine 과 4시간 D/D 0 glucose 의평균을비교하였을때모두통계적 으로유의한차이는없었다 (Table 2). VEGF 유전자다형성에대한배수체의빈도를 Phase 프로그램 (version 2.0) 을이용하여구하였 다. 5% 이상의빈도를가지는네종류의배수체를 확인하였고배수체의빈도는 CTGGC 21%, CTGCC 45%, CTCGT 12%, ACAGC 19% 였다. 배수체형 에따라 4시간 D/P creatinine 과 4시간 D/D 0 glu- cose 의평균을비교하였을때배수체 CTGGC 의이 형접합체또는동형접합체인경우가배수체 CTGGC 를가지지않은경우에비해 4시간 D/P creatinine (0.67 ± vs 0.50± 0.09, P =0.007) 은유의하 게높았고 4시간 D/D 0 glucose (0.35± vs 0.47± 0.08, P =0.037) 는유의하게낮았다 (Table 3). 고 찰 2. 복막평형검사결과 대상환자들의 4시간 D/P creatinine 은 0.56± 소아복막투석에서복막평형검사의기준치를제 공한 Warady 등[2] 의연구에서대상환자에는복 막염의병력이있었고복막투석기간이 5년인환자
최현진외 6 인 : 소아복막의용질이동성과 VEGF SNP Table 2. Peritoneal Transport Characteristics of Patients with Different VEGF Genotypes Genotype Number 4hr-D/P creatinine P -value 4hr-D/D 0 glucose P -value -2578 C/A -1498 T/C -1154 G/A -634 G/C +936 C/T CC CA TT TC GG GA GG GC CC CC CT 13 8 13 8 12 9 4 9 8 16 5 0.59± 0.15 0.51± 0.06 0.59± 0.15 0.51± 0.06 0.61± 0.50± 0.06 0.60± 0.59± 0.50± 0.11 0.58± 0.50± 0.311 0.311 0.102 0.208 0.215 0.39± 0.48± 0.39± 0.48± 0.39± 0.13 0.48± 0.41± 0.40± 0.46± 0.10 0.41± 0.47± 0.09 1 1 5 0.728 0.283 Abbreviations : VEGF, vascular endothelial growth factor; 4hr-D/P creatinine, 4 hour dialysateto-plasma ratio for creatinine; 4hr-D/D 0 glucose, 4 hour dialysate glucose to baseline dialysate glucose ratio Table 3. Peritoneal Transport Characteristics of Patients with Different VEGF Haplotypes Haplotype * Number 4hr-D/P creatinine P -value 4hr-D/D 0 glucose P -value CTGGC (+) CTGGC (-) CTGCC (+) CTGCC (-) CTCGT (+) CTCGT (-) ACAGC (+) ACAGC (-) 7 14 15 6 5 16 8 13 0.67± 0.51± 0.09 0.56± 0.57± 0.11 0.50± 0.58± 0.51± 0.06 0.59± 0.15 0.007 0.640 0.215 0.311 0.35± 0.47± 0.08 0.42± 0.44± 0.11 0.47± 0.09 0.41± 0.48± 0.39± 0.037 0.533 0.283 1 * -2578C/A, -1498T/C, -1154G/A, -634G/C, +936C/T Abbreviations : VEGF, vascular endothelial growth factor; 4hr-D/P creatinine, 4 hour dialysateto-plasma ratio for creatinine; 4hr-D/D 0 glucose, 4 hour dialysate glucose to baseline dialysate glucose ratio 들까지포함되어있는반면, Yoshino 등[3] 은복막 평형검사값이복막투석시작후 터변화하는경향을보이고투석시작후 2년이지나면서부 2년째까지 는복막평형검사가크게바뀌지않았음을보이면서 복막투석 2년째까지의값을복막평형검사기준치를 구하는데에사용해야한다고주장하였다. 복막투석 기간및복막염의병력은복막투과성의변화에영향 을미치는중요한요인으로, 이들이미치는영향을 줄이기위해본연구에서대상환자를복막투석 1년 이내에복막평형검사가시행되고복막평형검사전 에복막염이없는환자만을대상으로하였다. VEGF 유전자다형성외의, 복막용질이동과관련 이있다고보고된바있는임상적요인들가운데연 령, 표면적, 복막평형검사에사용된복막투석액주 입량, 복막평형검사시행전까지복막투석기간등 과복막평형검사결과값사이에는유의한상관관계 가관찰되지않았다. 그외잔여신기능과같이관련 가능성이있는임상적인요인들에대해서추가적인 연구가필요할것으로사료된다. 본연구에서대상으로한 VEGF 유전자다형성은
대한소아신장학회지 : 제 14 권제 2 호 2010년 촉진자부위(promoter region) 에위치한 -2578 C/A, -1498T/C, -1154G/A, 5 미전사부위(5 - UTR) 에위치한 -634G/C, 3 미전사부위(3 - UTR) 에포함된 +936C/T 로모두다섯가지였다. 이가운데 VEGF -2578C/A 와 -1498T/C 의대립 유전자가각각연관되어있었다. 유방암과 VEGF 유 전자다형성의상관관계를살핀다른연구에서도 VEGF -2578C/A 와 -1498T/C 가 Caucasian 은 높은 linkage disequilibrium (r 2 =0.968) 을보였 으며 African American 은더낮은 linkage disequilibrium (r 2 =0.587) 을보이고있었다 [16]. VEGF 유전자다형성이복막용질이동성에영향 을미치는지살펴보았을때 VEGF -2578C/A, -1498T/C, -1154G/A, -634G/C, +936C/T 유 전자각각의유전자형에따른복막평형검사결과값 은유의한차이가관찰되지않았다. 그러나배수체 CTGGC 의이형접합체또는동형접합체인경우와 배수체 CTGGC 를가지지않은경우를비교했을때 두군간에복막평형검사결과값에유의한차이가있 었다. 기존의복막투석환자에서 VEGF 유전자다형 성에관한연구로는 152명을대상으로한 Gillerot 등[13] 의연구(VEGF -2578C/A, -1154G/A, +4058G/C) 와 135명을대상으로한 Szeto 등[15] 의연구(VEGF -2578C/A, -1154G/A) 가있다. 두연구모두에서초기복막평형검사와 VEGF 유전 자다형성사이에는상관관계가없었다. 다만, Szeto 등[15] 의연구에서는 12개월뒤추적관찰한 83명 의환자중 -2578AA 유전자형을가진경우 24시 간 D/P creatinine 값이유의하게증가하였다. 또 -2578CC 유전자형을가진경우복막투석액에서 VEGF mrna 발현이감소되어있었고 VEGF 단백 농도도약간감소되어있었다. 이러한소견및 VEGF 유전자다형성 (-2578C/A, -634G/C, +936C/T) 에따라 VEGF 가생산되는정도가다르다는보고들 [17-19] 을고려할때복막투석액에서 VEGF 농도 를측정하여배수체 형접합체인경우와배수체 CTGGC 의이형접합체또는동 CTGGC 를가지지않은 경우에있어서복막에서 VEGF 발현율를조사하면 복막투과성과이배수체의상관관계를확인하는데 에도움이될것이다. 요약하면, 단일 VEGF 유전자다형성과복막용 질이동성간에는상관관계가관찰되지않았으나배 수체분석에서는배수체 CTGGC 의동형접합제또 는이형접합체인경우그렇지않은경우에비해복막 용질이동속도가높게관찰되었다. 향후충분한수의 환자를대상으로하여실제복막에서 VEGF 발현율 조사를포함한연구가필요할것으로사료된다. 요 목적 : 복막투석환자에서복막의용질이동성에영 향을미치는요인으로유전적요인과임상적요인이 있다. 복막평형검사는복막투석환자의복막용질이 동속도를평가하는데에유용한검사로, 본연구에서 는소아복막투석환자에서복막평형검사결과를이 용하여혈관내피성장인자 (VEGF) 의유전자다형성 약 과복막용질이동성의상관관계를연구하였다. 방법 : 서울대학교어린이병원과삼성서울병원의 소아복막투석환자중에서복막염의병력이없고복 막투석시작한지 1년이내에복막평형검사가시행 된환자를대상으로하였다. VEGF 유전자 -2578 C/A, -14978T/C, -1154G/A, -634G/C, +936 C/T 의단일유전자다형성분석을시행하였고 VEGF 유전자다형성의분포와복막평형검사결과간의상 관관계를분석하였다. 결과 : 복막평형검사를분석한결과, 4시간크레 아티닌의투석액 / 혈장비 (D/P creatinine) 는 0.56± 0.13 였고 4 시간투석액 /0 시간투석액포도당비 (D/D 0 glucose) 는 0.43± 0.11 였다. 배수체 CTGGC 의이 형접합체또는동형접합체인경우가배수체 CTGGC 를가지지않은경우에비해높은 4시간 D/P creatinine (0.67± vs 0.50± 0.09, P =0.007) 과 낮은 4시간 D/D 0 glucose (0.35± vs 0.47± 0.08, P =0.037) 를보였다.
최현진외 6 인 : 소아복막의용질이동성과 VEGF SNP 결론 : VEGF 유전자다형성은복막용질이동성 에영향을미칠수있다. References 1) Twardowski ZJ, Nolph KO, Khanna R, Prowant BF, Ryan LP, Moore HL, et al. Peritoneal equilibration test. Perit Dial Int 1987; 7:138-48. 2) Warady BA, Alexander SR, Hossli S, Vonesh E, Geary D, Watkins S, et al. Peritoneal membrane transport function in children receiving long-term dialysis. J Am Soc Nephrol 1996;7:2385-91. 3) Yoshino A, Honda M, Fukuda M, Araki Y, Hataya H, Sakazume S, et al. Changes in peritoneal equilibration test values during long-term peritoneal dialysis in peritonitisfree children. Perit Dial Int 2001;21:180-5. 4) Davies SJ. Peritoneal solute transport--we know it is important, but what is it? Nephrol Dial Transplant 2000;15:1120-3. 5) Combet S, Miyata T, Moulin PV. Vascular proliferation and enhanced expression of endothelial nitric oxide synthase in human peritoneum exposed to long-term peritoneal dialysis. J Am Soc Nephrol 2000;11:717-28. 6) Margetts PJ, Churchill DN. Acquired ultrafiltration dysfunction in peritoneal dialysis patients. J Am Soc Nephrol 2002;13:2787-94. 7) Miyata T, Devuyst O, Kurokawa K, Van Ypersele De Strihou C. Toward better dialysis compatibility: Advances in the biochemistry and pathophysiology of the peritoneal membranes. Kidney Int 2002;61:375-86. 8) Gillerot G, Devuyst O. Molecular mechanisms modifying the peritoneal membrane exposed to peritoneal dialysis. Clin Nephrol 2003;60: 1-6. 9) Pecoits-Filho R, Araujo MRT, Lindholm B, Stenvinkel P, Abensur H, Romao JE, Jr., et al. Plasma and dialysate IL-6 and VEGF concentrations are associated with high peritoneal solute transport rate. Nephrol Dial Transplant 2002;17:1480-6. 10) Rumpsfeld M, McDonald SP, Purdie DM, Collins J, Johnson DW. Predictors of baseline peritoneal transport status in Australian and New Zealand peritoneal dialysis patients. Am J Kidney Dis 2004;43:492-501. 11) Passlick-Deetjen J, Chlebowski H, Koch M, Grabensee B. Changes of peritoneal membrane function during long-term CAPD. Adv Perit Dial 1990;6:35-43. 12) Davies SJ. Longitudinal relationship between solute transport and ultrafiltration capacity in peritoneal dialysis patients. Kidney Int 2004;66:2437-45. 13) Gillerot G, Goffin E, Michel C, Evenepoel P, Biesen WV, Tintillier M, et al. Genetic and clinical factors influence the baseline permeability of the peritoneal membrane. Kidney International 2005;67:2477-87. 14) Wong T, Szeto C-C, Szeto C, Lai K-B, Chow K-M, Li P. Association of ENOS polymorphism with basal peritoneal membrane function in uremic patients. Am J Kidney Dis 2003;42:781-6. 15) Szeto C-C, Chow K-M, Poon P, Szeto CY-K, Wong TY-H, Li PK-T. Genetic polymorphism of VEGF: Impact on longitudinal change of peritoneal transport and survival of peritoneal dialysis patients. Kidney Int 2004;65:1947-55. 16) Schneider BP, Radovich M, Sledge GW, Robarge JD, Li L, Storniolo AM, et al. Association of polymorphisms of angiogenesis genes with breast cancer. Breast Cancer Res Treat 2008;111:157-63. 17) Watson CJ, Webb NJA, Bottomley MJ, Brenchley PEC. Identification of polymorphisms within the vascular endothelial growth factor (VEGF) gene: correlation with variation in VEGF protein production. Cytokine 2000; 12:1232-35. 18) Renner W, Kotschan S, Hoffmann C, Ober-
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