간암의단계적발생에서암억제 유전자의전사조절부위메틸화 연세대학교대학원의과학과엄태희
간암의단계적발생에서암억제 유전자의전사조절부위메틸화 지도교수박영년 이논문을석사학위논문으로제출함 2008 년 12 월 연세대학교 대학원 의과학과 엄태희
엄태희의석사학위논문을 인준함 심사위원 : 인 인 인 연세대학교대학원 2008 년 12 월
감사의글 결실을맺는오늘이있기까지많은관심과격려로이끌어주신많은분들께감사의말씀을전합니다. 우선연구를할수있도록이끌어주시고지도편달해주신박영년교수님께진심으로감사드립니다. 부족한점을짚어주시며과학도로서의자세와마음가짐을알려주신오봉경교수님, 본논문을위해충고와조언을주신김경식교수님께마음을담아감사드립니다. 그리고오늘을있도록인도해주신김호근선생님께고개숙여감사드립니다. 또한실험을위해도움주신병리학교실선생님들, 실험실생활을시작하면서관심과조언으로도움주시고함께동고동락한유정은선생님, 윤소미선생님과실험에아낌없는조언을주신이재은선생님, 강호진선생님께감사드립니다. 힘들어할때어깨를다독여주고좋은일을함께기뻐하며힘이되어준하나, 선, 수영, 은지, 보라, 그리고희수오빠에게감사와사랑을전합니다. 무엇보다부족한딸을믿고사랑하며늘함께해주신어머니께이논문을드립니다. 저자씀.
차 례 국문요약... 1 Ⅰ. 서론... 4 Ⅱ. 실험재료및방법... 8 1. Tissues... 8 2. genomic DNA 추출... 8 3. genomic DNA modification... 9 4. 프라이머와탐침자의설계... 10 5. Real-time PCR... 16 6. 결과분석... 16 Ⅲ. 결과... 19 1. 암억제유전자의과메틸화와간암의단계적발생의상관관계... 19 2. 간암의진행단계별암억제유전자전사조절부위의
과메틸화변화... 22 Ⅳ. 고찰... 27 Ⅴ. 결론... 30 Ⅵ. 참고문헌... 31 Abstract... 35
그림차례 Figure 1. Location of primer and probe in APC, p16, RASSF1A, SOCS1, and COX2... 14 Figure 2. Real-time PCR analysis of p16 and ACTB in HCCs, normal liver tissues, and dysplastic nodules... 17 Figure 3. Distribution of percent of methylation ratio (PMR) at each of 5 tumor suppressor genes... 20 Figure 4. Summary of MethyLight results of APC, p16, RASSF1A, SOCS1, COX2 in 136 liver samples from 46 hepatectomy patients... 25 표차례 Table 1. Primer and probe sequences for MethyLight... 13
국문요약 간암의단계적발생에서암억제유전자의 전사조절부위메틸화 간암은전세계적으로흔히발생하는암중하나이며, HBV 또는 HCV 감염이가장큰요인으로알려져있다. 간암의발생은다단계로일어나며전암병변인형성이상결절이있는경우간암의발생률이높다. 형성이상결절은조직의특성에따라저등도 (low-grade) 와고등도 (high-grade) 로분류되며, 고등도형성이상결절은간암의발생과유의한연관이있다. 암에서 DNA의메틸화는암억제유전자의전사조절부위에있는 CpG 섬 (CpG island) 에서이루어져유전자침묵 (gene silencing) 을유도한다. 간암에서는암억제유전자의전사조절부위에과메틸화가일어나있으며형성이상결절에서도간경변조직보다암억제유전자의과메틸화가증가해있다. 그러나저등도형성이상결절과고등도형성이상결절의임상적 1
차이가있음에도불구하고, 형성이상결절의단계적구분에따른분자생물학적연구가부족한실정이다. 본연구에서는전암병변인형성이상결절의저등도와고등도를구분하여세포주기를조절하는암억제유전자인 APC, p16, RASSF1A, SOCS1, COX2, DCC, SPRY2, GNMT의전사조절부위에대한과메틸화가간암의단계적발생에서어떻게변하는지 32개간암, 15개조기간암, 14개고등도형성이상결절, 29개저등도형성이상결절, 53개암주변조직과 15개의 HBV 감염이없는간조직에서확인하였다. 그결과저등도형성이상결절에서부터 APC, RASSF1A, SOCS1의과메틸화가이루어지고있으며, 특히매단계에서 APC와 COX2의과메틸화가유의하게증가하는것을확인할수있었다. 이연구에서는형성이상결절의각단계에서부터암억제유전자의전사조절부위과메틸화에대한변화를보여줌으로써저등도형성이상결절과고등도형성이상결절, 간암의후생적차이에대한정보를제공하여형성이상결절의치료에대한정보를제공할것으로기대된다. 2
Keywords : hepatocellular carcinoma, multi-step hepatocarcinogenesis, dysplastic nodule, tumor suppressor gene, DNA hypermethylation, 3
간암의단계적발생에서암억제유전자의 전사조절부위메틸화 < 지도교수박영년 > 연세대학교대학원의과학과 엄태희 Ⅰ. 서론 간암은전세계적으로 5번째로흔한암으로서매년 50만명의환자가발생하며, 그중 80% 가아시아와아프리카지역에서나타나고있다 1. 간암의원인은 HBV 또는 HCV 감염이가장큰요인으로알려져있으며남성이여성보다발병률이높은경향을보인다 2, 3. 간암은단계적발생을하며, 전암병변인형성이상결절 (dysplastic 4
nodule, DN) 을거쳐소간세포암종 (small HCC) 으로진행되는것으로여겨지고있다 4-6. 형성이상결절은구성하는간세포가세포및구조형성이상을보이지만암은아닌병변이며, 앞으로간세포암종이발생할가능성이높은전암병변으로정의되어있다. 형성이상결절의진단은증가하고있는추세이며형성이상결절을가지고있는경우간암의발생률이높다고알려져있다 6-8. 조직의특성을관찰하여그정도에따라저등도형성이상결절 (low-grade DN, LGDN) 과고등도형성이상결절 (high-grade DN, HGDN) 으로분류되며간혹소간세포암종 (early HCC, ehcc) 을포함하고있는경우도있다 9-11. 저등도형성이상결절은세포의밀도가증가해있으나결절을구성하는간세포의세포및구조이형성이적다. 고등도형성이상결절은저등도형성이상결절과비슷하지만세포의구조이형성이중증도이상으로관찰된다 9. 형성이상결절중고등도는치료가필요한전암병변이며, 저등도는암종으로의진행위험도가높지않으므로추적관찰해야한다는보고가있다 7, 12. DNA 메틸화는유전자의후생적조절에영향을미친다 13. 암에서 DNA 반복서열은탈메틸화되어염색체불안정성이증가하고, 억제되어있던유전자가발현되게한다. 반대로암억제유전자의전사조절부위에있는 CpG 섬 (CpG island) 이과메틸화되어유전자 5
침묵 (gene silencing) 을유도한다 13-17. 암억제유전자는주로세포주기, DNA 수리, 발암물질대사, 세포간결합, 세포자멸사, 신생혈관유도의조절에연관된유전자들로, 암에서는이유전자들이발현되지않거나단백질이변형되어제기능을수행하지못하는것으로보고되어있다 15, 17. 간암의단계적발생에서, 암억제유전자의전사조절부위과메틸화는암주변조직과형성이상결절에비해암에서더많이관찰되었다 18-21. 특히암억제유전자인 APC, SOCS1, p16의전사조절부위메틸화가간경변조직보다간암에서증가해있으며 21, 형성이상결절과간경변조직을비교하였을때일부암억제유전자에서전사조절부위메틸화의유의한차이를보였다 20. 현재까지암억제유전자의전사조절부위메틸화가전암병변과간암에서정상조직보다증가되어있다는보고가있으나, 전암병변인형성이상결절의저등도와고등도의차이를확인한보고는없었다. 그러나저등도형성이상결절과고등도형성이상결절에서임상적차이가보고된바있어, 저등도형성이상결절과고등도형성이상결절사이의분자생물학적연구가필요한실정이다. 이와관련하여본연구에서는세포주기의조절과연관되어있는유전자인 APC, p16, RASSF1A, SOCS1, COX2, SPRY2, DCC, ERK, GNMT의전사조절부위에서 6
MethyLight 를수행하여간암의발생단계에따른과메틸화의양상을 관찰하고, 간암의발달단계별로비교하여간암발달과정에서세포 주기를조절하는암억제유전자의메틸화의영향을확인하고자한다. 7
Ⅱ. 실험재료및방법 1. Tissues 세브란스병원에서간절제수술을한 B 형간염 (hepatitis B virus, HBV) 감염환자 46 명으로부터 32 개의간암조직, 46 개의암주변조직, 7개의 LRN, 29 개의 low grade DN, 14 개의 high grade DN, 15 개의 early HCC를채취하였다. 환자의나이는 32세부터 69세까지분포하였고, 평균나이는 52 세였다. 전체 46 명의환자중 11 명이여성이고, 35 명이남성이었다. 대조군으로 HBV 감염이없는 15 명의환자로부터 15 개의정상간조직을채취하였다. 15개정상간조직은각각간문부담관암 (klatskin tumor) 1 명, 전이성위암 (metastatic stomach cancer) 2 명, 전이성대장암 (metastatic colon cancer) 5 명, 전이성난소암 (metastatic ovarian cancer) 2 명, 전이성직장암 (metastatic rectal cancer) 3 명, 외상성간열상 (traumatic laceration) 1명, 건강간공여자 (health living donor) 1명으로부터채취하였다. 모든조직은채취직후액체질소에서냉동되었고, -80 초저온냉동고에보관되었다. 2. Genomic DNA 추출 8
냉동보관되어있던간조직에서 DNA를추출한다. 간조직 20~40 mg을액체질소를이용해얼린상태에서막자와막자사발을이용해가루로만들고, 20 μg/ml LaboPass protease K (Cosmo Genetech, Seoul, Korea) 과 20 mm Tris HCl (ph 8.0), 5 mm EDTA (ph 8.0), 400 mm NaCl, 1% SDS가함유된 700 µl의용해완충액 (lysis buffer) 을넣어 42 의항온수조에서하룻밤동안진탕배양한다. 동일한양의 phenol:chloroform:isoamylalcohol (25:24:1) 을넣고 10분간진탕해준후 15분간 13000 rpm으로원심분리하여상층액을취한다. 동일한작업을 3회수행하고같은부피의 isopropanol을넣어 -20 에서한시간배양하였다. 이후 4 에서 25분간 13000 rpm으로원심분리하고, 상층액을분리하여침전물만남긴다. 침전물에 70% 에탄올 1mL을넣고 5분간 13000 rpm으로원심분리한후에탄올을제거한다. DNA 침전물은물 300µL에용해되어 NanoDrop ND-100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) 으로정량되었다. 3. Genomic DNA modification 추출한 DNA 는 1 µg 을취하여 EZ DNA modification kit (ZymoResearch, Orange, CA, USA) 로 sodium-bisulfite 처리를하였 9
다. 실험지침서에따라 DNA 1 µl에 M-dilution buffer 5 µl를넣고물로 50 µl를맞춘후 15 분간 37 에서배양되었다. 배양된샘플은 210 µl의 M-dilution buffer와 750 µl의물에녹인 CT conversion reagent 100 µl 을넣고 50 진탕배양기에서 15 시간배양되었다. 이후샘플을 4 에서 10 분간보관하고, 400 µl 의 M- binding buffer를넣어 Zymo-Spin IC Column으로옮겼다. 컬럼에옮긴샘플을 30초간 13000 rpm 으로원심분리하고, 하층액을제거하였다. DNA의정제를위해컬럼에 200 µl 의 M-wash buffer를넣어 30초간 13000 rpm으로원심분리하여컬럼을세척하였다. M-wash buffer는처음사용전 96 ml 의 99% 에탄올을넣어사용하였다. 이후 200 µl의 M-desulphonation buffer를넣어 15분간실온에서배양하고샘플을 30초간 13000 rpm으로원심분리하였다. 세척을위해하층액을버리고 200 µl의 M-wash buffer를넣어 30초간 13000 rpm 으로원심분리하는작업을 2회수행하였다. 이후칼럼을 1.5 ml tube로옮겨, 30 µl의물에 DNA를용출시켰다. 용출된 DNA는곧장 real-time PCR에사용되거나 -20 에냉동보관되었다. 4. 프라이머와탐침자의설계 간암의다단계발생이세포분열을억제하는암억제유전자 10
의과메틸화와관련되어있음을확인하기위해세포분열을억제하는것으로알려진암억제유전자 8 개와 Ras 신호전달계에서중요한 ERK/MAPK를선택하였다. 정량화를위한참조유전자로 β- actin(actb) 의전사조절부위에서 CpG 서열이포함되지않는프라이머와탐침자를사용하였다. 선택한암억제유전자와 ERK에대하여 MethyLight를위해제작된프라이머와탐침자를 PubMed에서검색하였다. 논문을통해보고된프라이머와탐침자서열은 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 데이터베이스에서검색한유전자의염기서열을 Bisulfite Conversion Reaction (http://bioneer.kaist.ac.kr/~yhahn/util/bisulfite-web/index.html) 을통해 CpG 서열이아닌사이토신이티민으로전환된염기서열로바 꾼후유전자내에서의위치를확인하였다. MethyLight 가수행된 보고가없는 GNMT와 ERK는 NCBI와 Human Genome Browser Gateway (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hggateway) 데이터베이스에서유전자염기서열을검색하여 MethPrimer (http://www.urogene.org/methprimer/) 에서 MSP를위한프라이머다섯쌍을선택하였다. 선택된프라이머서열에대하여유전자염기서열내에서의위치와시작코돈에서의거리를확인하고, 시작코돈서열로부터 1kb 내에있는프라이머중가장가까이에있는프라이 11
머를선택하였다. 선택된프라이머쌍에의해증폭되는서열을가지고 GenScript (http://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer) 를통해탐침자를디자인하였다. 사용한프라이머와탐침자는 Table 1 에나타내었다. APC, p16, RASSF1A, SOCS1, COX2 에대한프라이머와탐침자의유전자내에서의위치는 Figure 1에나타내었다. 12
Table 1. Primer and probe sequences for MethyLight Gene GeneBank Accession Number Amplicon Location Forward Primer sequence Probe Reverse Primer Reference APC U02509 759-832 p16 NM_000077 66-133 RASSF1A AC002481 18107-18171 SOCS1 AC009121 108805-108888 COX2 AF044206 6779-6924 SPRY2 NM_005842 450-625 PTEN AF143312 1060-1147 GNMT AF101475 696-827 ERK NM_002745.4 349-466 ACTB Y00474 390-552 GAACCAAAACGCTCCCCAT TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT 22 6FAM-CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA-BHQ-1 TGGAGTTTTCGGTTGATTGGTT AACAACGCCCGCACCTCCT 22 6FAM-ACCCGACCCCGAACCGCG-BHQ1 ATTGAGTTGCGGGAGTTGGT ACACGCTCCAACCGAATACG 22 6FAM-CCCTTCCCAACGCGCCCA-BHQ-1 GCGTCGAGTTCGTGGGTATT T CCGAAACCATCTTCACGCTA A 22 6FAM-ACAATTCCGCTAACGACTATCGCGCA-BHQ1 CGGAAGCGTTCGGGTAAAG AATTCCACCG CCCCAAAC 23 6FAM-TTTCCGCCAAATATCTTTTCTTCTTCGCA-BHQ-1 GGGCGGTAGATCGGTTTGGGACG CAATAAATAACGTCATATAAATCCG 24 6FAM-CCGATCCCAACTCATTAACTCCGC-BHQ1 GTTTCGCGTTGTTGTAAAAGTCG CAATATAACTACCTAAAACTTACTCGAACC 22 6FAM-TTCCCAACCGCCAACCTACAACTACACTTA-BHQ-1 GTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTC CTAAATCCTTTTAACCAACCTACGA 6FAM-CCAACCCTCTATACAATCCCACGACG-BHQ-1 GAACCAAAACGCTCCCCAT TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT 6FAM-CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA-BHQ-1 TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA 25 6FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-BHQ-1 13
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Figure 1. Location of primer and probe in APC, p16, RASSF1A, SOCS1, and COX2. Light gray box indicates promoter region, dark gray box indicates untranslated region (UTR), and black box indicates exon region. Green boxes under CpGs indicate MethyLight primers, and red box indicates probe. The size of PCR product is shown under primers and probe. The distance from PCR product to start codon (ATG) is shown next to 3 primer. 15
5. Real-time PCR Sodium-bisulfite 처리를하여사이토신을티민으로전환시킨 DNA 1 µl 를주형으로하여 3 µg/µl의전사프라이머 3µL (0.3µg/µL), 3 µg/µl의역전사프라이머 3µL (0.3 µg/µl), 1µg/µL의탐침자 3µL (0.1 µg/µl), 2x TaqMan PCR Master Mix (ABI 4324018, Foster City, CA, USA) 를넣고물로총부피 30 µl를맞추었다. 96- well plate에샘플을넣고 ABI 7300 real time PCR 기계를이용해 95 에서 10 분간전변성 (pre-denature) 후, 95 에서 15초변성, 60 에서 1분어닐링 (annealing) 하여 45회증폭을수행하였다. 양성대조군으로 sodium-bisulfite 처리를수행한 CpGenome Universal Methylated DNA(chemicon S7821, Billerica, MA, USA) 를사용하였으며, 동일한 DNA를가지고 1/4, 1/16, 1/64, 1/256으로희석하여표준곡선을그렸다. β-actin(actb) 은모든유전자에대하여참조유전자로사용되었다. p16과 ACTB에대한 standard curve와 realtime 증폭곡선과표준곡선을그림 2에서확인할수있다. 6. 결과분석 각샘플에대하여 real-time PCR 을수행한유전자의평균량 을 ACTB 의평균량으로나눠주었다. 이수치를다시양성대조군에 16
Figure 2. Real-time PCR analysis of p16 and ACTB in HCCs, normal liver tissues, and dysplastic nodules. PCR amplification of p16 is shown in HCCs and dysplastic nodules, not in normal liver tissues. Amplification of ACTB is shown in all samples. 17
대한계산값으로나누어 PMR(Percent of methylation ratio) 을구하였다. PMR은사용된샘플의 DNA 양을보정하기위해참조유전자인 ACTB의정량값으로유전자의정량값을나눠주었고, 이결과를다시양성대조군을가지고계산한수치로나눠주었다. 퍼센트로나타내기위해얻은수치에 100을곱하였다. PMR을구하는공식을정리하면다음과같다. 간암발달단계에서메틸화의변화를비교하기위하여 PMR 을가지 고 student s t-test 를수행하였다. 18
Ⅲ. 결과 1. 암억제유전자의과메틸화와간암의단계적발생의상관관계총 46명의환자중 17명이형성이상결절을가지고있었고, 이중 3명은간암과형성이상결절을동시에가지고있었다. 46명중 29명은암주변조직과간암조직만가지고있었고, 이중 15명은 grade 2, 14명이 grade 3로진단되었다. 간암의단계적발생과정중암억제유전자의전사조절부위과메틸화는각유전자별로다른양상을보였다. 선택한 9개의유전자중 APC, p16, RASSF1A, SOCS1, COX2는정상간에서간암으로발달하는동안전사조절부위의과메틸화가증가하는경향을보였다 (Figure 3). 그러나 ERK와 DCC에서는정상간부터간암까지모든단계에서 PCR에의한증폭이확인되지않았다. PTEN과 GNMT에서는 PCR에의한증폭이나타났으나, PMR이모두 5% 미만으로확인되었다. APC의 PMR 평균은정상간조직에서 9%, 암주변조직에서는 8%, 저등도형성이상결절에서 30%, 고등도형성이상결절에서 51%, 초기간암에서 46%, 간암에서 44% 로나타났다. p16의 PMR 평균은정상간조직, 암주변조직, 저등도형성이상결절, 고등도 19
Figure 3. Distribution of percent of methylation ratio (PMR) at each of 5 tumor suppressor genes. The overall distribution of PMR was observed in normal liver, non-hcc, low-grade dysplastic nodules, high-grade dysplastic nodules, early HCCs, and HCCs. 20
형성이상결절, 초기간암, 간암에서각각 0.003%, 1%, 6%, 7%, 28% 로나타났다. RASSF1A는정상간조직에서 11%, 암주변조직에서 10%, 저등도형성이상결절에서 21%, 고등도형성이상결절에서 36%, 초기간암에서 20%, 간암에서 32% 의 PMR을보였다. SOCS1 의 PMR은정상간에서 6%, 암주변조직에서 5%, 저등도형성이상결절에서 16%, 고등도형성이상결절에서 14%, 초기간암에서 57%, 간암에서 14% 로나타났고, COX2에서 PMR은정상간 0.4%, 암주변조직 0.3%, 저등도형성이상결절에서 1%, 고등도형성이상결절에서 7%, 초기간암 13%, 간암에서 20% 로나타났다. 간암의진행단계에서암억제유전자의과메틸화가증가한다는가설을확인하기위해각단계에서암억제유전자의 PMR을 t- test로비교하였다. 다섯개의암억제유전자에서정상간조직, 과암주변조직사이에서암억제유전자의과메틸화는통계적으로유의한차이가나타나지않았다. 그러나정상간조직이나암주변조직과간암의과메틸화정도를비교하였을때, 모든유전자에서과메틸화정도의증가가통계적으로유의한차이를보였다. APC 는정상간조직과암주변조직간의과메틸화정도의차이가없었으나, 정상또는암주변조직보다저등도형성이상결절, 고등도형성이상결절, 조기간암, 간암에서과메틸화가증가하였다. 형성이상결절과간암 21
조직사이에서 APC 의과메틸화는유의한차이가나타나지않았다. p16은정상간조직, 암주변조직과조기간암, 간암에서과메틸화가통계적으로유의하게증가해있음이확인되었다. 또한저등도형성이상결절, 고등도형성이상결절, 조기간암에비해간암에서과메틸화가증가해있었다. 그러나형성이상결절과조기간암사이에서는유의한차이가나타나지않았다. RASSF1A는정상간조직과저등도형성이상결절, 고등도형성이상결절을비교하였을때형성이상결절에서더과메틸화되어있음을확인하였으나조기간암과는차이가없었다. 그러나간암에서는과메틸화되어있었다. 암주변조직에서도같은결과를확인할수있었다. SOCS1의경우정상간조직, 암주변조직보다저등도형성이상결절, 조기간암, 간암에서과메틸화되어있었으나, 고등도형성이상결절과는차이가나타나지않았다. COX2에서는정상간조직, 암주변조직과형성이상결절, 간암의모든단계에서과메틸화가증가하였다. 또한저등도형성이상결절과고등도형성이상결절사이에서도과메틸화의유의한증가를확인할수있었다 (Figure 3). 2. 간암의진행단계별암억제유전자전사조절부위의과메틸화변 화 22
PMR은 % 에따라 5% 미만, 10% 미만, 15% 미만, 20% 미만, 20% 이상으로구분되었고, 10% 이상인경우를과메틸화되어있다고정의하였다. 형성이상결절을가지고있는 17 case에서, APC와 RASSF1A, SOCS1은암주변조직에서부터과메틸화된경우가관찰되었고, p16과 COX2는고등도형성이상결절에서부터과메틸화된경우가확인되었다. 각단계에따른유전자의과메틸화경향을확인한결과, APC는과메틸화된경우가암주변조직에서 53개중 10개, 저등도형성이상결절에서 29개중 23개, 고등도형성이상결절에서 14개중 9개, 조기간암에서 15개중 12개, 간암에서 32개중 24개관찰되었다 (19%, 79%, 64%, 80%, 75%). p16은암주변조직과저등도형성이상결절에서과메틸화된경우가관찰되지않았고, 고등도형성이상결절에서 14개중 3개, 조기간암에서 15개중 5개, 간암에서 32개중 12개가과메틸화되어있었다 (0%, 0%, 21%, 33%, 38%). RASSF1A는암주변조직 53개중 11개, 저등도형성이상결절 29개중 17개, 고등도형성이상결절 14개중 8개, 조기간암 15 개중 8개, 간암 32개중 16개에서과메틸화가관찰되었다 (21%, 59%, 57%, 53%, 50%). SOCS1은암주변조직에서 4개, 저등도형성이상결절에서 11개, 고등도형성이상결절에서 6개, 조기간암에서 12개, 간암에서 10개가과메틸화되어있었다 (8%, 38%, 43%, 80%, 23
67%, 31%). COX2도암주변조직과저등도형성이상결절에서는과메틸화가관찰되지않았고, 고등도형성이상결절에서 4개, 조기간암에서 4개, 간암에서 15개가과메틸화되어있었다 (0%, 0%, 29%, 27%, 47%). 정상간조직에서도 APC, RASSF1A, SOCS1의과메틸화된경우가각각 6개, 7개, 2개관찰되었다 (40%, 47%, 13%). 이결과는 Figure 4에정리하여나타내었다. 24
25
Figure 4. Summary of MethyLight results of APC, p16, RASSF1A, SOCS1, COX2 in 136 liver samples from 46 hepatectomy patients. No*, case number ; No, number of genes methylated ; 7 cases of LRN are not presented. 26
Ⅳ. 고찰 간암은다단계발생을하는암으로서전암병변인형성이상결절을거쳐암이발생하며, 고등도형성이상결절이있는간에서암의발생률이높다는보고가있다 7, 11, 12. 본연구에서는메틸화에의해전사가조절되는암억제유전자중세포주기를조절하는유전자들이간암의각발생단계별로전사조절부위의메틸화가어떻게변하는지를확인하였다. 세포주기를조절하는암억제유전자의전사조절부위메틸화는저등도형성이상결절에서부터증가하는경향을보였다 (Fig 3). APC, RASSF1A, SOCS1은정상또는암주변조직에서도과메틸화되어있는경우가있었지만, p16과 COX2는과메틸화된경우가나타나지않았다. 저등도형성이상결절에서 APC, RASSF1A, SOCS1, COX2의전사조절부위메틸화가증가하였으나, p16에서는변화가없었다. APC, RASSF1A, COX2는고등도형성이상결절에서정상또는암주변조직보다메틸화가증가해있었다. APC, p16, SOCS1, COX2는조기간암에서정상또는암주변조직보다메틸화가증가되어있었으며, 모든유전자의메틸화는암주변조직에비해암에서증가되어있었다. 전암단계와정상간조직, 암주변조직에서암억 27
제유전자의전사조절부위메틸화정도를비교해보았을때 APC와 COX2는간암이발달하는매단계가정상또는암주변조직에비해전사조절부위의메틸화가증가해있었다. p16은암주변조직과저등도형성이상결절, 고등도형성이상결절사이의차이는없었으나조기간암에서암주변조직이나형성이상결절에비해메틸화가증가해있음을확인하였다. RASSF1A 는저등도형성이상결절과고등도형성이상결절에서정상또는암주변조직보다과메틸화되어있었다. SOCS1은저등도형성이상결절과조기간암에서메틸화가증가해있었다. 흥미롭게도형성이상결절에서의과메틸화양상은한환자로부터얻은여러개의조직에서비슷한패턴을보였다. 또한저등도형성이상결절에서과메틸화가증가한유전자는같은환자의고등도형성이상결절이나조기간암에서도과메틸화되어있는경우가관찰되었다. 이결과는각병변이유전자침묵의변이가생긴하나의세포로부터출발하여생긴단일클론이라는사실을뒷받침한다 (Figure 4). 각전암단계에서세포주기를조절하는유전자의전사조절부위에과메틸화가증가함으로써전암병변에서의세포주기가활발하게돌아가형성이상결절을만드는것으로보인다. APC는 Wnt/βcatenin 신호전달경로에서전사조절인자인 β-catenin의활성을 28
26, 27 억제하는인자이며 RASSF1A 는 Ras 신호전달경로와연관되어 세포주기를조절하고세포자살을유도하며, 미소관형성을조절하 는인자이다 28, 29. SOCS1 또한 JAK/STAT 신호전달경로에서전 사인자를억제하는것으로알려진인자이고, Ras 신호전달계와연 관하여 AKT 경로를억제하기도한다 30-32. 기존의연구에서간암의 발생이 Wnt 신호전달계와 Ras 신호전달계에의한세포분열의촉 진및종양유전자의발현과연관이있음이밝혀진바있다 6, 18. 이 와관련하여 APC, RASSF1A, SOCS1 은전암병변이형성되는초기 단계에서부터메틸화가되는것으로나타났다 (Figure 3). 또한이유 전자들의메틸화는저등도형성이상결절이고등도형성이상결절이 나조기간암, 또는간암으로진행되는동안유지되거나증가하게된 다. 이는전암병변이발달하는초기에서부터 Wnt 신호전달계나 Ras 신호전달계를조절하는암억제유전자의유전자침묵이메틸 화에의해일어난다는것을시사한다. 또한형성이상결절이고등도 로발달하면서 p16 과 COX2 의과메틸화가증가함으로써, 전암병변 이암으로진행될가능성이높아지는것으로보인다. 29
Ⅴ. 결론 간암의다단계발생과정에서세포주기조절과연관된암억제유전자의전사조절부위과메틸화는저등도형성이상결절에서부터증가해있음을확인하였다. 특히 Wnt/β-catenin 신호전달계와 Ras 신호전달계에연관된암억제유전자의전사조절부위가저등도형성이상결절에서부터과메틸화되어있었고, 고등도형성이상결절과조기간암으로갈수록메틸화가더많이이루어지는것을관찰할수있었다. 이연구에서는형성이상결절의각단계에서암억제유전자의전사조절부위과메틸화에대한변화를보여주고, 저등도형성이상결절과고등도형성이상결절의차이를보여줌으로써저등도형성이상결절과고등도형성이상결절의구분및전암병변의치료에의중요한정보를제공해줄수있다. 30
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Abstract Promoter hypermethylation of tumor suppressor genes during multi-step hepatocarcinogenesis Um, Tae-hee Department of Medical Science The Graduate School, Yonsei University (Directed by Professor Young Nyun Park) Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common cancers worldwide and its risk factors are well established including hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV). Hepatocarcinogenesis is a multistep process evolving from pre-cancerous lesions known as dysplastic nodules (DNs). DNs are divided into lowgrade and high-grade, and high-grade DNs are significantly associated with HCC formation. In cancer, DNA methylation induces dysfunction of tumor suppressor genes by CpG island hypermethylation on promoter region. 34
Promoter hypermethylation of tumor suppressor gene is increased in HCCs and DNs than cirrhotic liver. However, the molecular difference between low-grade and high-grade DNs are poorly understood. In this study, promoter hypermethylation was investigated during multistep hepatocarcinogenesis using 32 HCC, 15 early HCC, 14 highgrade DN, 29 low-grade DN, 53 corresponding non-cancerous liver and 15 normal liver samples, in cell cycle related 8 tumor suppressor gene APC, p16, RASSF1A, SOCS1, COX2, DCC, SPRY2, GNMT and 1 Ras signal related gene ERK. Promoter hypermethylation of APC, RASSF1A, SOCS1 was increased from low-grade DN, and hypermethylation ratio of APC and COX2 was significantly increased in every step. These data provide evidence for epigenetic difference during multi-step hepatocarcinogenesis and give information to clinical treatment. 35