J Korean Oriental Med 2011;32(1):141-150 Original Article TOSC 방법을이용한참당귀뿌리용매분획 (Angelica gigas) 의항산화활성평가 이숙영 1, 서영배 2*, 우원홍 1* 1 원광대학교한의학전문대학원한약자원개발학과 2 대전대학교한의과대학한의학과 Evaluation of Antioxidant Activity of Solvent Fractions of Angelica gigas Root Using TOSC Assay Sook-Young Lee 1, Young-Bae Seo 2*, Won-Hong Woo 1* 1 Department of Herbal Resources, Professional Graduate School of Oriental Medicine, Wonkwang University, Iksan 570-749, Korea 2 Department of Herbalogy, College of Oriental Medicine, Daejeon University, Daejeon, 300-716, Korea Objectives: The aim of this study was to elucidate the antioxidant effect of solvent fractions of Angelica gigas root. Methods: The ethanol extract of Angelica gigas root was suspended in water and then partitioned with dichloromethane (MC Fr.), ethyl acetate (EA Fr.) and butanol (BuOH Fr.), sequentially. The antioxidant activities of solvent fractions of Angelica gigas root were evaluated for radical scavenging activity against stable free radicals (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) DPPH, hydrogen peroxide and superoxide anion radicals. In addition the antioxidant activities of solvent fractions of Angelica gigas root against peroxyl radicals, hydroxyl radicals and peroxynitrites were determined by the total oxy-radical scavenging capacity (TOSC) assay. Results: Among the solvent fractions of MC Fr., EA Fr., and BuOH Fr., BuOH Fr. was found to have stronger antioxidant activity with IC 50 values of 59.72, 14.36, 30.96 and 44.75 μg / ml on the DPPH radical, nitrite, superoxide anion and hydrogen peroxide, respectively, than BHA used as a positive control. Moreover, specific TOSC values (564.8, 276.4 and 405.5 TOSC/mM) of BuOH fr. against peroxyl radicals, hydroxyl radical and peroxynitrite were 4 times higher than GSH (136.5, 67.4 102.6 TOSC/mM) used as a positive control. Conclusions: These results suggest that the BuOH fr. of Angelica gigas root has a high antioxidant activity and can be useful to develop functional food against oxidative stress conditions. Key Words : Angelica gigas root, BuOH Fr., antioxidant activity, specific TOSC 서론 당귀는미나리과 (Umbelliferae) 의식물로써일본 은왜당귀 (Angelica acutiloba) 1) 중국은중국당귀 (Angelica sinensis) 2) 한국은참당귀 (Angelica gigas) 3) 를기원으로하는데, 전통적으로당귀는어린순을 Received:13 December 2010 Revised:7 January 2011 Accepted:10 January 2011 Correspondence to: 우원홍 (Won-Hong Woo) 전라북도익산시신용동 344-2 원광대학교한의학전문대학원한약자원개발학과 Tel:+82-63-850-6845, Fax:+82-63-850-5195, E-mail:whwoo@wonkwang.ac.kr 서영배 (Young-Bae Seo) 대전광역시동구용운동 96-3 대전대학교한의과대학한의학과 Tel:+82-42-280-2625, Fax:+82-42-280-2644, E-mail:genin@dju.ac.kr 141
(142) 나물로식용하고뿌리를약용으로사용하였다. 최근에당귀에대한연구가활발히이루어지고있어진통효과, 신장독성경감효과, 당뇨성고혈압치료등여러가지생리활성이있다고알려져있다 4-6). 산소는호흡을통해체내로들어와혈관을타고운반되며, 음식물소화를비롯한대사에관여하는과정에서불안정한상태로변하는데, 이런산소를활성산소라한다. 일반적으로호흡으로들이마신산소의약 1-2% 가산화적스트레스 (oxidative stress) 에의해서활성산소로변하며, 일부는몸속에서저절로없어지거나각종감염을막는면역기능도하지만, 과잉생산된활성산소가문제다. 이러한과잉의활성산소는정상세포막과세포를손상시키며, 피부를구성하는콜라겐을산화시켜노화를촉진하고, DNA를손상시켜암을유발하는가하면세포막의불포화지방산을산화작용을통해이물질로바꿔동맥경화, 뇌졸중등여러가지질병을야기한다고알려져있다 7-9). 따라서항산화물질은여러가지질병치료제뿐만아니라건강기능식품, 향장품등의소재로광범위하게연구되고있다. 대표적인항산화물질로는비타민 A, C로서독성화학물질이나흡연으로인한피해를막아주며면역력을증진하고, 성인병을예방해준다. 또한녹차의카테킨성분이항산화활성이강하다고알려져있으며이밖에키위, 양배추, 오렌지, 브로콜리, 버섯, 당근등이대표적인천연항산화식품들이다. 생체에서발생하는활성산소와관련된대표적인산화성물질은산소에서유래된 singlet oxygen, superoxide radical, 과산화수소 (hydrogen peroxide), hydroxyl radical, peroxyl radical, alkoxyl radical과질소에서유래된 nitric oxide와 peroxynitrite 그리고 myeloperoxidase에서생성되는 hypochlorous acid 등이있다 10-12). 이들산화성물질중에서 superoxide radical과 nitric oxide는반응성이낮아생체의거대분자를산화시키는능력은낮으나두물질이반응하여생성되는 peroxynitrite는매우반응성이강하여세포에독성을유발한다 13). 과산화수소는반응성이 낮아 mm 농도에서독성을유발하나세포막을투과할수있으며최근신호전달물질로작용하는것으로제안되고있다 13). Hydroxyl radical의공격에의해산화된 carbon-centered radical이산소와반응하여생성되는 peroxyl radical은반응성이강하며 hydroxyl radical에비하여긴반감기를가진다. 일반적으로항산화활성을평가하는방법은 2,2-diphenyl-l-picrylhydrozyl (DPPH) assay가대표적이다 15). DPPH assay 방법은가장광범위하게사용되며 high-throughput system에적용될수있어시간과경비를절약할수있는장점이있다. 한편, Total oxy-radical scavenging capacity (TOSC) 법은 DPPH assay 방법과는달리실제로생체내에서발생하는 peroxyl radical, hydroxyl radical 및 peroxynitrite에대한개별적인항산화활성을평가하는방법으로산화성물질이 alpha-keto-gammamethiobutyric acid (KMBA) 와반응하여생성되는 ethylene을 gas chromatography를이용하여검출한다 16,17). 이방법은시간에따른 ethylene gas의농도를측정하여 area under the curve (AUC) 를산출하고이값을대조군에서의 AUC와비교함으로써 TOSC 값을계산한다. 또한대표적인항산화물질인 trolox나 glutathione (GSH) 를표준물질로사용함으로써정량적으로항산화활성을실험간에비교할수있다. 따라서이방법은실질적인체내산화성물질에대한항산화활성을정량적으로측정할수있다. TOSC assay는항산화활성외에도조직액이나, 혈장, 혈청등에서항산화활성을측정하여산화적스트레스의 biomarker로사용되고있다 18). 강등 19) 은이미참당귀열수추출물이 DPPH free radical 소거활성이보고한바있다. 이에본연구는보다구체적으로국산당귀의어느물질이항산화활성을나타내는지관찰하고자국산당귀뿌리추출물을용매극성의순서즉, 디클로메탄 (dichloromethane), 에틸아세테이트 (ethylacetate) 및부탄올 (butanol) 순으로용매분획한후 DPPH free radical 소거활성이외에여러가지방법을이용하여국산당귀뿌리용매분획의항산화활성을측정하고자하였다. 또한 142
이숙영외 2 인 : TOSC 방법을이용한참당귀뿌리용매분획 (Angelica gigas) 의항산화활성평가 (143) TOSC 방법을이용하여실제적으로생채내에서발생하는 peroxyl radical, hydroxyl radical 및 peroxynitrite와같은여러가지 oxy-radicals에대한항산화활성을측정하고자하였다. 실험재료및방법 1. 재료및추출방법시약으로사용한 2,2-diphenyl-l-picrylhydrozyl (DPPH), GSH, ascorbic acid, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), ferrous ammonium sulfate, H 2O 2, 2,2'-azobisamidinopropane (ABAP), BHA(Butylated hydroxy-anisole), lpha-keto-gamma-methiobutyric acid (KMBA), tbhp, tetraethoxypropane (TEPP), diethylenetriaminopentacetic acid (DTNB), 2,6-ditertbutyl-4-methylphenol (BHT), NADPH, sodium nitrite, acetic acid, hydrochloric acid, sulfanilic acid, naphthylamine, 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, butylated hydroxy-anisole, nitro blue tetrazolium, xanthine, xanthine oxidase, potassium phosphate monobasic, potassium phosphate dibasic, PBS, peroxide 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 에서, 에탄올은 ( 주 ) 삼전에서구입하였으며, 기기로사용한 GC는 Shimadze사 (Tokyo, Japan) 의 GC-2010를사용하였다. 또한국산당귀 (Angelica gigas, 국내산, 강원도 ) 는송학약초영농조합에서구입하여건조된국산당귀뿌리 1 Kg을분쇄기를이용하여분쇄한후 6리터라운드플라스크에넣고 3리터의 70% 에탄올수용액을넣어 3시간동안환류추출하였다. 같은조작을 3회반복추출후여과한뒤감압농축하여국산당귀추출물 420.1 g을얻었다. 위에서얻은국산당귀뿌리추출물 420.1 g을 2 리터의증류수로현탁한후 2리터의디클로로메탄, 에틸아세테이트및부탄올순으로각각 3회추출하여 83.1 g의디클로로메탄추출물 (MC Fr.), 7.9 g의에틸아세테이트추출물 (EA Fr.) 및 36.13 g의부탄올뿌리추출물 (BuOH Fr.) 을얻어실험에사용하 였다. 용매분획추출방법은 Scheme 1에나타내었다. 2. 총폴리페놀의정량총폴리페놀화합물은 Folin-Denis 방법 20) 으로측정하였으며, 시료 (10%) 1 ml에 95% 에탄올 1 ml와증류수 5 ml를첨가하고 1N Folin-ciocalteu reagent 0.5 ml를넣어잘섞어주고, 5분간방치한후, 10% Na 2CO 3 1 ml를가한후, 725 nm에서 1시간이내에흡광도를측정하여 gallic acid를이용하여미리작성된검량선으로부터양을환산하였다. 이때검량선은탄닌산표준품 10 mg을에탄올 5 ml에용해시켜표준원액을제조한다음적당히희석하여작성하였다. 3. DPPH 라디칼소거능 DPPH free radical에대한소거활성은 Blois의방법 21) 을변형하여측정하였다. 각시료 20 μl에 0.1 mm DPPH 180 μl를넣고 vortex한후, 30분동안방치한다음 560 nm에서흡광도를측정하였다. DPPH 라디칼소거능은다음식으로나타내었다. DPPH 라디칼소거능 (%) = [ 대조군의흡광도 - 반응군의흡광도 / 대조군의흡광도 ] 100 4. 아질산염소거작용아질산염소거작용은 Kato 등 22) 의방법에따라다음과같이측정하였다. 즉, 1 mm의 NaNO 2 용액 30 μl에시료추출물을 60 μl를첨가하고여기에 0.1 N HCl 용액 210 μl를가하여전체를 300 μl로하였다. 그리고 37 에서 1시간동안반응시켜얻은반응액을 40 μl씩취하고여기에 2% 초산용액 200 μl를첨가한다음 Griess 시약 16 μl를가하여혼합시켜실온에서 15분간방치시킨후흡수분광광도게를사용하여 520 nm에서흡광도를측정하여잔존하는아질산염의백분율로나타내었다. 공시험은 Griess시약대신증류수를가하여같은방법으로행하였다. N(%) = [1-(A-B)/(C-D)] 100 143
(144) Angelica gigas Root (1 Kg) 70% EtOH (reflux, 3 hours, 3LX3 times) Filtration, Evaporation Concentrated EtOH extract (420.1g) Suspended with H 2O (2L) Extracted with dichloromethane (2LX3 times) MC Fr. (83.1g) Residue Extracted with ethylacetate (2LX3 times) EA Fr. (7.9g) Residue Extracted with buthanol (2LX3 times) BuOH Fr. (36.13g) Residue Scheme 1. Extraction and Solvent Fractionation of the Root of Angelica gigas N : 아질산소거능 (%) A : 시료의흡광도 B : 시료대조군의흡광도 C : Control의흡광도 D : Control 대조군의흡광도 5. Superoxide anion 소거능 Superoxide anion 소거활성은 Okamura등 23) 의방법을변형하여측정하였다. 즉, 시료 20 μl, 2 mm xanthine과 0.1mM NBT 혼합액 160 μl를넣고 0.05 mm EDTA가포함된 50mM potassium phosphate buffer (ph 7.4) 에녹인 xanthine oxidase (0.5 unit/ ml ) 20 μl를첨가하여 37 에서 30분동안반응시켰다. 다음, 여기에 2.5N HCl 80 μl를첨가하여반응을중지시키고 560 nm에서흡광도를측정하였다. 6. Hydrogen peroxide 소거능측정 Hydrogen peroxide 소거활성은 Park 등 24) 의방법 에따라 96-well microplate에 phosphate buffered saline (PBS) 100 μl, 분획물 20 μl를넣고 1 mm H 2O 2 를가하여 5분방치한다음, 1.25 mm ABTS 30 μl와 PBS에녹인 peroxidase (1unit/ ml ) 30 μl를첨가하여 37 에서 10분간반응시킨후 405 nm에서흡광도를측정하였다. 7. TOSC assay TOSC assay는 Winston 25) 에의해제안되고같은저자들에의해수정된방법 16,17) 을사용하여실시하였다. Peroxyl radical은 2,2'-azobisamidinopropane (ABAP) 를 35 에서 thermal homolysis시켜발생시켰다 17). Hydroxyl radical은 Fe와 ascorbate를이용한 Fenton reaction으로, peroxynitrite는 3-morpholinosydnonimine (SIN-1) 의자발적인붕괴를통해발생시켰다. 발생한각각의 oxy-radical은 KMBA와반응하여 ethylene을발생하며이때의 TOSC 값은일정범위내에서는온도에따른차이를나타내지않는것으로 144
이숙영외 2 인 : TOSC 방법을이용한참당귀뿌리용매분획 (Angelica gigas) 의항산화활성평가 (145) 보고된바있다 25). 반응은 1 ml의반응액을고무마개로밀폐된 15ml용기에넣어진행시켰으며생성된 ethylene은반응용기의 head space 공기 0.4 ml을취하여 GC (GC-2010, Shimadze, Tokyo, Japan) 로분석하여검출하였다. Oven, injector와 flame ionization detector의온도를각각 60, 180 로설정하고 Supelco SPB-1 caillary column (30 m 0.32 mm 0.25 μm ) 를장착한 gas chromatograph 장치를사용하였다. Carrier gas로는 helium을사용하였으며 split ratio 30:1로설정하였다. TOSC 값은 TOSC=100- (SA/CA 100) 의식으로구했다 25). SA는시간에따른 sample의적분값이고, CA는시간에따른 control의적분값이다. Control로는 3차증류수를사용하였으며시료로는국산당귀추출물외에양성대조군으로 GSH를사용하였다. 따라서 oxy-radical scavenging capacity를전혀갖지못하는시료의 SA/ CA = 1이되며 TOSC = 0의값을갖는다. 반대로 SA 0일때는 TOSC 값은 100에접근한다. Specific TOSC 값은얻어진 TOSC 값을시험물질에농도에따라좌표화하고선형회귀분석 (linear regression analysis) 을통해기울기를얻은후이값을시험물질의농도로나누어구하였다. TOSC 값은대조군에서의값과비교하게되므로이론적으로기기의감도나사용시약, 기타반응조건에영향을받지않는다. 통계처리모든실험결과는평균 ± 표준편차로표시했으며군간에서통계적인유의성은 GraphPad Prism program (version 4.0) 을이용하여 One-way ANOVAtest 후 Dunnett s Multiple Comparison Test 및 Newman-Keuls multiple range test로확인하였다. 실험결과및고찰 1. 총폴리페놀함량식물체에함유되어있는페놀성화합물은콜레스테롤저하작용, 정작작용항암및항산화작용등의다양한항산화생리활성을나타내는물질이다 26,27). 폴리페놀은항산화작용과관련하여최근생체내에서의산소 free radical 반응이생체조직의노화나질병과관련이있으며페놀성물질의 hydroxyl group이주요한역할을한다고알려져있다. 본실험에서폴리페놀함량은 gallic acid를표준물질로 15-500 μg / ml농도범위에서표준곡선을작성하여이를환산하여정량하였다. 실험결과는 Fig. 1. 에나타내었다. 국산당귀뿌리디클로로메탄용매분획물 (MC Fr.) 의폴리페놀함량은 98.05±2.16 mg /g, 에틸아세테이트용매분획물 (EA Fr.) 에서는 113.07±0.60 mg /g, polyphenol content (mg/g) 160 120 80 40 0 c b a MC Fr. EA Fr. BuOH Fr. Fig. 1. Effect of Solvent Fractions of Angelica gigas Root on Total Polyphenol Content. MC Fr.: Methylene fraction of Angelica gigas Root, EA Fr.: Ethylacetate fraction of Angelica gigas Root, BuOH Fr.: Butanol fraction of Angelica gigas Root. Data are means ± S.D. of 5 experiments. Values with different letters are significantly different from each other (One-way ANOVA followed by Newman-Keuls multiple range test, P < 0.001). 145
(146) 부탄올용매분획물 (Bu Fr.) 에서는 126.67±2.17 mg /g 으로서비교적극성이큰부탄올과같은용매분획물에서가장높게나타났다. 즉, 국산당귀중에분자량이작은비극성물질보다는분자량이큰극성물질들의폴리페놀함량이높다는것을알수있었다. 2. DPPH free radical 소거활성 Free radical로서 DPPH를이용하여국산당귀용매분획물을농도별로 free radical 소거활성을측정하여그결과를 Table 1에나타내었다. 국산당귀뿌리용매분획물을농도별로 0.1 mm DPPH용액에첨가하여 free radical 소거활성을측정한결과양성대조군으로사용한합성항산화제인 BHA (Butylated hydroxy-anisole) 의 IC 50 값은 64.70 ±0.88 μg / ml이었으며, 국산당귀뿌리디클로로메탄용매분획물 (MC Fr.), 국산당귀뿌리에틸아세테이트용매분획물 (EA Fr.) 및국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 의 DPPH free radical 소거활성 IC 50 값은각각 481.16±0.99 μg / ml, 88.66±0.41 μg / ml및 59.72±1.02 μg / ml로서양성대조군으로사용한합성항산화제인 BHA에비해서강한국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 이유의적으로가장큰 DPPH free radical 소거활성을나타내었다 (P<0.01). 즉, 국산당귀뿌리중에분자량이작은비극성물질보다는분자량이큰극성물질들의 DPPH radical 소거활성이높다는것을알수있었다. 3. 아질산염소거작용아질산염은니트로사민의전구체인 nitrous anhydride (N 2O 3) 와같은활성니트로소화물질을생성하고, 이 nitrous anhydride가 2차아민과결합하여 N-nitrosamine 을생성한다. 이에따라니토로사민생성억제인자에대한실험을실시하였다. GR (Griess Romigin) 아질산시약과아질산염이반응시자적색을띄고이를이용하여시료가아질산염을얼마나소거하는지측정하는방법으로서실험결과를 Table 1에나타내었다. 국산당귀뿌리용매분획물을농도별로 1 mm의 NaNO 2 용액에첨가하여아질산염소거활성을측정한결과양성대조군으로사용한 BHA의 IC 50 값은 12.70±0.09 μg / ml이었으며, 국산당귀뿌리디클로로메탄용매분획물 (MC Fr.), 국산당귀뿌리에틸아세테이트용매분획물 (EA Fr.) 및국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 의아질산염소거활성 IC 50 값은각각 250.87±32.26 μg / ml, 212.60±27.52 μg / ml및 14.36±0.47 μg / ml로서양성대조군으로사용한합성항산화제인 BHA와거의동등하게국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 이유의적으로가장큰아질산소거활성을나타내었다 (P<0.05). 즉, 국산당귀뿌리중에분자량이작은비극성물질보다는분자량이큰극성물질들의아질산소거활성이강하다는것을알수있었다. 4. Superoxide anion 소거능 Table 1. Scavenging Activities of Solvent Fractions of Angelica gigas Root on DPPH Free Radical, Hydroxyl Peroxide, Nitrites and Superoxide anion Superoxide DPPH free radicals Hydroxyl peroxide Nitrites Sample anion IC 50 ( μg / ml ) BHA 64.70 ± 0.88 19.11 ± 0.39 12.70 ± 0.09 52.72 ± 0.63 MC Fr. 481.16 ± 0.99 78.62 ± 1.24 250.87 ± 32.26 546.03 ± 4.41 EA Fr. 88.66 ± 0.41 ** 74.24 ± 0.21 212.60 ± 27.52 68.57 ± 1.17 BuOH Fr. 59.72 ± 1.02 ** 44.75 ± 1.45 ** 14.36 ± 0.47 * 30.96 ± 0.74 ** MC Fr.: Methylene fraction of Angelica gigas Root, EA Fr.: Ethylacetate fraction of Angelica gigas Root, BuOH Fr.: Butanoasfraction of Angelica gigas Root. Data are means ± S.D. of 5 experiments. ** :s <0.01 significantly different as com ared tos ositive contvel(bha)[one-way ANOVA followed by Dunnett s Multiple Comparison Test]. 146
이숙영외 2 인 : TOSC 방법을이용한참당귀뿌리용매분획 (Angelica gigas) 의항산화활성평가 (147) Superoxide anion은활성산소의일종으로 O 2- 로표기한다. 분자상산소 (O 2) 에 1개의전자가첨가된것으로정확히는초과산화물음이온라디칼 (superoxide anion radical) 이라고한다. 생체내에서의여러가지산화환원효소에의한반응결과로생산되며반응성이아주높고많은화합물을산화시키는매우유해한물질로서실험결과를 Table 1에나타내었다. 국산당귀뿌리용매분획물의 superoxide anion 소거활성을측정한결과양성대조군으로사용한 BHA의 IC 50 값은 52.72±0.63 μg / ml이었으며, 국산당귀뿌리디클로로메탄용매분획물 (MC Fr.), 국산당귀뿌리에틸아세테이트용매분획물 (EA Fr.) 및국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 의 superoxide anion 소거활성 IC 50 값은각각 546.03± 4.41 μg / ml, 68.57±1.17 μg / ml및 30.96±0.74 μg / ml로서양성대조군으로사용한합성항산화제인 BHA와거의동등하게국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 이유의적으로가장큰 superoxide anion 소거활성을나타내었다 (P<0.05). 즉, 국산당귀뿌리중에분자량이작은비극성물질보다는분자량이큰극성물질들의 superoxide anion 소거활성이강하다는것을알수있었다. 5. Hydrogen peroxide 소거능측정 Hydrogen peroxide(h 2O 2) 는산소분자의 2전자가환원된물질로서생체내에서는 superoxide anion의 불균등화반응및여러가지산화효소에의해생성되며, 산소독의대표적화합물이기도하다. 생체내에서는과산화효소류와카탈라아제에의해제거되며실험결과를 Table 1에나타내었다. 국산당귀뿌리용매분획물의 hydrogen peroxide 소거활성을측정한결과양성대조군으로사용한 BHA의 IC 50 값은 19.11±0.39 μg / ml이었으며, 국산당귀뿌리디클로로메탄용매분획물 (MC Fr.), 국산당귀뿌리에틸아세테이트용매분획물 (EA Fr.) 및국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 의 hydrogen peroxide 소거활성 IC 50 값은각각 78.62± 1.24 μg / ml, 74.24±0.21 μg / ml및 44.75±1.45 μg / ml로서양성대조군으로사용한합성항산화제인 BHA에비해서는약하였지만비교적강하게국산당귀부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 이유의적으로가장큰 hydrogen peroxide 소거활성을나타내었다 (P<0.01). 즉, 국산당귀중에분자량이작은비극성물질보다는분자량이큰극성물질들의 hydrogen peroxide 소거활성이강하다는것을알수있었다. 6. TOSC 방법에의한 oxy-radical 소거능평가 Peroxyl radical, hydroxyl radical 및 peroxynitrite 에대한국산당귀뿌리용매추출물과양성대조군으로사용한생체내에서강한항산화활성을나타내는 GSH의소거능을 TOSC 법으로평가하였으며실험결과를 Table 2에나타내었다. Table 2. Specific TOSC Values of Solvent Fractions of Angelica gigas Root against Peroxyl Radicals, Hydroxyl Radicals and Peroxynitrites Sample Peroxyl radicals Hydroxyl radicals Peroxynitrites TOSC/mM GSH 136.5 ± 25.6 67.4 ± 10.1 102.6 ± 20.5 MC Fr. 67.4 ± 11.2 47.6 ± 10.3 85.4 ± 15.6 EA Fr. 165.9 ± 20.3 105.8 ± 17.3 ** 136.5 ± 15.6 BuOH Fr. 564.8 ± 20.6 ** 276.4 ± 15.1 ** 405.5 ± 45.7 ** MC Fr.: Methylene fraction of Angelica gigas Root, EA Fr.: Ethylacetate fraction of Angelica gigas Root, BuOH Fr.: Butanol fraction of Angelica gigas Root. The results are expressed as the means ± SD of 5 experiments. Linear regression was calculated using GraphPad Prism, version 4.0. * : p<0.05, ** : p<0.01 significantly different as compared to positive control(gsh)[one-way ANOVA followed by Dunnett s Multiple Comparison Test]. 147
(148) 국산당귀뿌리용매분획물의 peroxyl radical에대한소거능을측정한결과양성대조군으로사용한 GSH의 specific TOSC은 136.5±25.6 TOSC/mM이었으며, 국산당귀뿌리디클로로메탄용매분획물 (MC Fr.), 국산당귀뿌리에틸아세테이트용매분획물 (EA Fr.) 및국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 의 specific TOSC은각각 67.4±11.2 TOSC/mM, 165.9±20.3 TOSC/mM 및 564.8±20.6 TOSC/mM로서양성대조군으로사용한 GSH에비해서국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 은유의적으로 4배이상강한 peroxyl radical 소거능을나타내었다 (P<0.01). 국산당귀용매분획물의 hydroxyl radical 소거능을측정한결과양성대조군으로사용한 GSH의 specific TOSC은 67.4±1oxy TOSC/mM이었으며, 국산당귀뿌리디클로로메탄용매분획물 (MC Fr.), 국산당귀뿌리에틸아세테이트용매분획물 (EA Fr.) 및국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 의 specific TOSC은각각 47.6±10.3 TOSC/mM, 105.8±17.3 TOSC/mM 및 276.4±15.1 TOSC/mM로서양성대조군으로사용한 GSH에비해서국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 은유의적으로 4배이상강한 hydroxyl radical 소거능을나타내었다 (P<0.01). 또한국산당귀뿌리용매분획물의 peroxynitrite 소거능을측정한결과양성대조군으로사용한 GSH 의 specific TOSC은 102.6±20.5 TOSC/mM이었으며, 국산당귀뿌리디클로로메탄용매분획물 (MC Fr.), 국산당귀뿌리에틸아세테이트용매분획물 (EA Fr.) 및국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 의 specific TOSC은각각 85.4±15.6 TOSC/mM, 136.5±15.6 TOSC/mM 및 405.5±45.7 TOSC/mM로서양성대조군으로사용한 GSH에비해서국산당귀뿌리부탄올용매분획물 (BuOH Fr.) 은유의적으로 4배이상강한 peroxynitrite 소거능을나타내었다 (P<0.01). 즉, 전반적으로국산당귀뿌리중에분자량이작은비극성물질보다는분자량이큰극성물질들의 peroxyl radical, hydroxyl radical 및 peroxynitrite 소 거능이강하다는것을알수있었다. 종합적으로볼때여러가지방법을통해서국산당귀의항산화활성을관찰한결과극성이낮은용매보다는극성이높은용매에활성물질이존재한다는것을관찰하였다. 강등 19) 은참당귀의열수추출물의 DPPH free radical 소거활성은메탄올추출물보다높게농도의존적으로자유기를소거한다는것을보고한바있다. 또한참당귀섭취에의한간과혈장내지질과산화물농도, 간과혈장내단백질산화물농도및항산화효소 (SOD: superoxide dismutase) 활성도의변화를측정함으로써참당귀의항산화활성을평가하였다. 한편 Kim 28) 등은참당귀추출물이단삼, 솔잎, 현미녹차, 홍차등에비해서약한자유기소거활성을나타낸다고보고한바있다. 그러나이러한실험결과는 Scheme 1과같은용매분획물이아닌용매추출물의결과로써비교적약한항산화활성이나타났다고판단된다. 본실험에서는국산당귀뿌리부탄올용매분획물이양성대조군으로사용한 BHA보다활성이강한것으로보아항산화활성을나타내는물질들이대부분부탄올층에존재한다는것을의미하는것으로써이러한국산당귀뿌리부탄올용매분획물과기존의항산화활성이우수한한약재들과의활성비교연구를수행할필요가있다고판단된다. 또한향후단순히참당귀뿌리추출물보다는부탄올용매분획물을이용한여러가지항산화관련제품개발에도관심을가질필요가있다고판단된다. 결론국산당귀뿌리에탄올추출물을용매의극성순으로분획하여 MC Fr., EA Fr. 및 BuOH Fr. 을각각얻은후국산당귀뿌리용매분획물의 polyphenol 함량, DPPH free radical 소거활성, 아질산염소거활성, superoxide anion 소거활성, hydrogen peroxide 소거활성및 TOSC 방법에의한실제적으로생채내에서발생하는여러가지 oxy-radicals에대한소거활성을측정하여다음과같은결론을얻었다. 148
이숙영외 2 인 : TOSC 방법을이용한참당귀뿌리용매분획 (Angelica gigas) 의항산화활성평가 (149) 항산화생리활성을나타내는 polyphenol의총함량은비교적극성이높은국산당귀뿌리 MC Fr.<EA Fr.<BuOH Fr. 순으로극성이높은용매분획물의함량이가장높게나타났다. DPPH radical 및 superoxide anion 소거활성역시 MC Fr.<EA Fr. <BuOH Fr. 순이었으며특히 BuOH Fr. 은양성대조군으로사용한합성항산화제인 BHA보다강한활성을나타내었다. 아질산염소거활성의경우역시 MC Fr.<EA Fr.<BuOH Fr. 순이었으며 BHA와거의동등한활성을나타내었다. Hydrogen peroxide 소거활성의경우 MC Fr.<EA Fr.<BuOH Fr. 순으로활성이강하였으나 BHA에비해서는활성이약하였다. 한편, 실제적으로생체내에서발생하는 peroxyl radical, hydroxyl radical 및 peroxynitrite와같은 oxy-radicals에대한소거능을 TOSC 방법을이용하여측정한결과 MC Fr.<EA Fr.<BuOH Fr. 순으로활성이강하였다. 특히, BuOH Fr. 의경우모든 oxy-radicals에대한 specific TOSC 값이양성대조군으로사용한 GSH에비해서 4배이상높게나타나강력한항산화활성을나타냄을알수있었다. 종합적으로볼때국산당귀뿌리에서강력한항산화활성을나타내는물질은부탄올과같은비교적극성이큰용매분획 (BuOH Fr.) 에존재함을알수있었으며, 이를이용하여항산화제로의활용가능성이매우크다고판단된다. 향후국산당귀뿌리부탄올용매분획 (BuOH Fr.) 으로부터활성을나타내는순수물질을분리하는추가연구가필요하다고판단된다. 참고문헌 1. 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典一部. 北京, 中國醫藥科技出版社, 2010;124 2. 日本藥局方解說書編集委員會. 日本藥局方解說書 15 改定. 東京 : 廣川書店. 2005:1321 3. 대한약전제9개정, 식품의약품안전청고시제 2010-10호, 의약품각조 2부, 916 4. Kang YG, Lee JH, Chae HJ, Kim DH, Lee SH, Park SY. HPLC analysis and extraction methods of decursin and decursinol angelate in Angelica gigas roots. Kor. J. Pharmacogn. 2003;34(3): 201-205. 5. Chi HJ, Kim HS. Studies on the components of Umbelliferae Plants in Korea. Kor. J. Pharmacogn. 1970;1:25-32. 6. Bae EA, Han MJ, Kim NJ, Kim DH. Anti- Helicobacter pylori activity of herbal medicines. Biol Pharm Bull. 1998;21:990-992. 7. Lee YY, Lee S, Jin JL, Yun-Choi HS. Platelet anti-aggregatory effects of coumarins from the roots of Angelica genuflexa and A. gigas. Arch Pharm Res. 2003;26:723-726. 8. Wen JJ, Gupta S, Guan Z, Dhiman M, Condon D, Lui C, et al. Phenyl-a -tert-butyl-nitrone and benzonidazole treatment controlled the mitochondrial oxidative stress and evolution of cardiomyopathy in chronic chagasic rats. Journal of the American College of Cardiology. 2010;55(22):2499-2508. 9. Arif IA, Khan Haseeb A. Environmental toxins and Parkinso s disease: putative roles of impaired electron transport chain and oxidative stress. Toxicology and Industrial Health. 2010;26(2): 121-128. 10. Pellegrini M, Baldari CT. Apoptosis and oxidative stress -related diseases: the p66 Shc connection. Current Molecular Medicine. 2009; 9(3):392-398. 11. Bayir H. Reactive oxygen species. Crit. Care Med. 2005;3;498-501. 12. Malle E, Marsche G, Arnhold J, Davies MJ. Modification of low-density lipoprotein by myeloperoxidase-derived oxidants and reagent hypochlorous acid. Biochim. Biophys. Acta. 2006;1761:392-415. 13. Kamat JP. Peroxynitrite: a potent oxidizing and nitrating agent. Indian J. Exp. Biol. 2006;44: 436-447. 14. Rhee SG, Kang SW, Jeong W, Chang TS, Yang 149
(150) KS, Woo HA. Intracellular messenger function of hydrogen peroxide and its regulation by peroxiredoxins. Curr Opin Cell Biol. 2005;17: 183-189. 15. Nomura T, Kikuchi M, Kubodera A, Kawakami Y. Proton-donative antioxidant activity of fucoxanthin with 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Biochem Mol. Biol. Int. 1997;42:361-370. 16. Regoli F, Gorbi S, Frenzilli G, Nigro M, Corsi I, Focardi S, et al. Oxidative stress in ecotoxicology: from the analysis of individual antioxidants to a more integrated approach. Marproach. M. Res. 2002;54:419-423. 17. Regoli F, Winston GW. Quantification of total oxidant scavenging capacity of antioxidants for peroxynitrite, peroxyl radicals, and hydroxyl radicals. Toxicol. Appl. Pharmacol. 1999;156: 96-105. 18. Aruoma OI. Methodological considerations for characterizing potential antioxidant actions of bioactive components in plant foods. Mutat. Res. 2003;523-524:9-20. 19. Kang SA, Han JA, Jang KH, Choue RW. DPPH radical scavenger activity and antioxidant effects of Cham-Dang-Gui(Angelica gigas). Korean Soc Food Sci Nutr. 2004;33(7):1112-1118. 20. Folin AD, Denis W. A colorimetric method for the determination of phenols and phenol derivatives in urine. Biol. Chem. 1995;22:305-308. 21. Blois MS. Antioxidant determination by the use of a stable free radical. Nature. 1958;181:1199-1200. 22. Kato H, Lee IE, Chuyen NV, Kim SB, Hayase F. Inhibition of nitrosamine formation by nondialyzable melanoidines. Agric. Biol. Chem. 1987;51:1333-1338. 23. Okamura H, Mimura A, Yakou Y, Niwano M, Takahara Y. Antioxidant activity of tannins and flavonoids in Eucalptus rostrata. Phytochemistry. 1993;33:557-561. 24. Park SW, Chung SK, Park JC. Active oxygen scavenging activity of luteolin-7-o-β-d-glucoside isolated from Humulus japonicus. Korean Soc Food Sci Nutr. 2000;29:106-110. 25. Winston GW, Regoli F, Dugas AJ Jr, Fong JH, Blanchard KA. A rapid gas chromatographic assay for determining oxyradical scavenging capacity of antioxidants and biological fluids. Free Radic. Biol. Med. 1998;24:480-493. 26. Oi N, Jeong CH, Nadas J, Cho YY, Pugliese A, Bode AM et al. Dong Z. Resveratrol, a red wine polyphenol, suppresses pancreatic cancer by inhibiting leukotriene a4 hydrolase. Cancer Res. 2010;70(23):9755-64. 27. Shen JL, Man KM, Huang PH, Chen WC, Chen DC, Cheng YW, et al. Honokiol and magnolol as multifunctional antioxidative molecules for dermatologic disorders. Molecules. 2010;15(9): 6452-65. 28. Kim SM, Cho YS, Kim EJ, Bae MJ, Han JP, Lee SH, et al. Effect of hot water extracts of Salvia miltiorrhiza Bge., Prunus persica Stokes, Angelica gigas Nakai and Pinus strobus on lipid oxidation. J Korean Soc Food Sci Nutr. 1998; 27:399-405. 150