3 - 과제명 중심단어결핵, 진단, 인터페론감마, ELISA 주관연구기관연세대학교주관연구책임자신전수 연구기간 2011. 05. 16-2011. 12. 15 γ γ γ γ γ γ γ γ γ γ γγ γ γ γγ γ γ 농도별로 γ 의존적 으로신호가변함을관찰하였다. 본연구에서 γ γ γ Title of Project Key Words Institute Project Leader Project Period For diagnosis of latent tuberculosis infection, interferon gamma release assays (IGRAs) have been increasingly used in the world. An ELISA based whole blood assay kit, QuantiFERON Gold, has become commercially available with higher sensitivity and specificity compared to a conventional method, Tuberculin Skin Test (TST). However, due to high expense, it has been difficult to be commonly utilized and recommended by clinicians in the nation. To complement this limitation, it is now important to locally develop a comparable sandwich ELISA to measure IFN-γ production specific to M. tuberculosis (M.tb). In addition, it is essential to advance a novel diagnostic method for measuring IFN-γ or other cytokines levels using a nano-biosensor technique, which may provide with higher sensitivity and specificity than existing methods. The overall goals of this study are to locally produce key materials for an in-house sandwich ELISA kit and also develop a nano-biosensor probe to quantify IFN-γ response. To approach these goals, the study was conducted with following three objectives: 1) cloning human IFN-γ and purification of the recombinant protein, 2) production and characterization of mouse monoclonal anti-ifn-γ antibody for the use of sandwich ELISA, 3) measurement of IFN-γ response by the nano-biosensor as an easy and quick diagnosis tool. We successfully cloned a gene encoding human IFN-γ and produced a recombinant IFN-γ protein in E. coli. Also, we examined if this purified recombinant protein reacted with monoclonal antibody using Western blot and ELISA. Using a purified recombinant human IFN-γ protein commercially produced by R&D as an immunogen, the monoclonal antibodies (IgG1 and IgM isotypes) were purified from culture supernatant. These antibodies reacted with human IFN-γ produced by R&D, Sino (CHO cell derived) as well as our laboratory. In addition to an in-house sandwich ELISA, we developed a capacitance sensor engineered with monoclonal IFN-γ antibody and observed changes in electric signals from antigen-antibody binding when controlling concentration of IFN-γ. In conclusion, we produced the recombinant human IFN-γ protein and mouse anti-human IFN-γ antibodies for an in-house sandwich ELISA. Also, we developed a capacitive biosensor and tested its usefulness as quick and sensitive diagnostic tool for measuring IFN-γ response. Based on these preliminary findings, in-house materials for a sandwich ELISA and nanobiosensor will be compared with existing diagnostic tools in the near future.
5 - 학술연구용역사업연구결과제1장최종연구개발목표 1.1 목표 1.2 목표달성도및관련분야에대한기여도 연구개발목표에입각한연구목표의달성도및관련분야연구에의기여도등을기술함. 1.3 국내 외기술개발현황 국내 외관련분야에대한기술개발현황과연구결과가국내 외기술개발현황에서차지하는위 치등을기술
7 -
9 - 제 2 장최종연구개발내용및방법 εε
11 - ε γ ( 라 ) 임상시료기반의 IFN-γ 검출을위한최적화 IFN-γ 항체의고정 & 안정화기술 : 센서가특이도를가지고 IFN-γ를검출할수있는근거는항원에대한항체의특이적결합에기인한다. 그러므로센서의민감도와특이성을높일수있는요인중하나가활성을가진단일항체를소자의표면에고정하는작업이다. 그리하여본연구에서는아래그림과같이항체의활성을유지시키면서전극에고정하기위해 cys-proteing를먼저금표면에결합시키고그위에항체를고정하였다. Cysteine 에있는 thiol 작용기는금표면의 dangliing bond와공유결합을잘하는물질로알려져있으며, 또 proteing는단일항체의 constant region과만결합하여항원과의결합부위인 epitope만을바깥쪽으로노출시켜표적단백질을반응효율을증대시켜준다. 또한나노수준에서 rough한 AAO 표면은생체물질들이결합하기용이하여녹색형광을표지하고있는단일항체를투입했을때, 항체가센서반응면에 compact한단일층을형성하였음을확인하였다.
13 - γ γ γ 그림 6. 본연구의흐름도 ( 점선이있는부위까지본연구를진행을목표로함 )
15 - 제3장최종연구개발결과 γ α γ Δ γ γ γ prset ligation - T4 DNA ligase(bio Lab) - incubation condition : 4, O/N α γ γ γ
17 - γ γγ γ γ γ μ
19-1. IFN-γ 면역반응으로인한축전용량신호변화의주파수의존도측정 γ - 위에서언급한바와같이전극표면에서의생체물질간결합반응에대한센서의반응은인가되는교류전압의주파수에의존하는데, 이중이러한면역반응에가장민감한변화를보이는주파수를 frequency sweep 모드측정을통해확인하였다. 이때, 주파수는 20Hz~1kHz까지 10Hz 간격으로측정하였는데, 이러한주파수광역을사용한것은일반적으로체액이위의주파수대에서 capacitive한성질을보이는것으로알려져있기때문이다. 이보다높은주파수에서는 conductive한성질이강해져용액의유전성질을파악하기어렵게된다. - 위와같은주파수영역을사용하여측정은다음과같이이루어졌다. 먼저, 실험방법에언급된순서로소자를제작하고, ph7.4 PBS 1x buffer에희석된 protein G를소자표면에빽빽한단일층을형성하도록결합한후결합되지않은물질들을같은 PBS로씻어낸후 frequency sweep 모드로용액의축전용량을측정하였다. 그후이위에 IFN-γ의단일클론항체가완벽한단일층을형성하도록 100ul 용액을 ELISA 측정권장량인 1/100 희석하여고정한후, 결합되지않은항체들을 buffer 용액으로 washing하였다. 이때다시주파수 sweep 모드로용액의축전용량을측정하는데, 이상태는 target 분자를결합하기직전의상태이므로이를축전용량의기저수준으로설정하게된다. 마지막으로표준농도로희석된항원을소자에주입하여미리고정된항체에결합하게하고다시 PBS로면역특이적으로결합하지않은분자들을씻어냄으로써항원-항체반응으로안정된항원만이신호에영향을주도록한다. 이때다시 sweep 모드로축전용량을측정하여어느주파수에서면역결합에의한신호가가장큰지를비교하였고, 그결과는다음과같다. 그림에서와같이용액은높은주파수일수록더작은유전특성을보였으며, 희석된생체분자 간결합에의한신호는 200Hz 에서가장두드러짐을확인할수있었다. 이와같은주파수
21 - sweep 측정을통해축전용량측정에가장적합한진동수를구할수있었다. 2. 축전용량신호의농도의존도확인 - 열역학적으로두가지 chemical species가반응할때, 한종의반응물의농도가고정되어있고, 다른한종의농도를변화시키면서결과물의생성정도를살펴보면, 농도를변화시키는반응물과생성물의함수적관계는로그함수로표현되어지는것이잘알려져있다. 우리의실험에서, 센서표면에안정화된항체의농도를고정하고, 투입하는항원의농도를변화시키면서검출되는신호의변화량을비교해보면전형적인로그함수의존도를보이는것을확인하였다. 그림에서와같이, 표적단백질대신 IL-6 cytokine을투입하였을때에는농도에따라신호변화가로그함수적인특성을보이는 IFN-γ의특이적항원-항체결합의경우와는달리표면에고정된 IFN-γ 항체와의결합으로인한축전용량변화가거의감지되지않았음을확인할수있었다. 이는 capacitive sensor 표면에서면역적으로비특이적인결합으로인해용액의전기적성질변화가거의일어나지않음을나타내는중요한결과이다. 우리는 IL-6 실험에서와같이단일단백질종뿐아니라여러종류의단백질에대한 capacitive sensor 표면의항체특이도를검증하기위해다양한단백질의 pool인 FBS 세럼에대해서도위와같은실험을하였고, 그결과는 IL-6의경우와마찬가지로항체에대한이종 ( 異種 ) 단백질에대한비특이적결합에의한신호가미미 ( 微微 ) 함을확인할수있었다. 3. 비특이적결합존재유무확인 - 제작한센서가임상적으로사용되려면 IFN-γ 외의다른단백질에의한효과가최소화되어야한다. 이를위해서는먼저 IFN-γ 항체가빽빽한단일층으로센서표면에형성되어야하고, 항체의표적단백질에대한특이도도높아야한다. 따라서이러한특이도의분석을위해 IFN-γ 이외의다른단백질을투입하여센서의축전용량변화를확인하였고, 그결과는다음과같다. 아울러, 센서표면을높은특이도로개질하고자하여, 우리는 IFN-γ의다클론항체 (pab) 와단일클론항체 (mab) 의항체표준농도에대한반응을비교하였다. Body에항체가붙을수있는 site가하나만있는 mab의경우항체에대한반응도는 pab에비해떨어지나특이도는더높을것으로기대되었다. 따라서우리는다음과같이두가지종류의항체에대해항원농도대비신호의변화량을측정하였다.
23-4. 임상실험을위한 serum 기반실험 - 제작한센서가임상에서도신뢰도있게사용되기위해서는 PBS buffer 기반이아닌 serum 용액에서도특이도있는결과를얻어야하며, 또한 PBS에서와 FBS에서의결과가일치하여야한다. 이를위해우리는 PBS 기반실험과 FBS 용액에서의실험을비교하였는데, 그결과는다음과같다. 그림에서와같이, 항체에대한반응도는표적단백질에대한결합 site가많은 pab가더우수하였으나, mab의경우한항체와만결합하므로더좋은로그함수적경향을보이는것을확인하였다. 마지막으로, mab 항체의농도별축전용량신호변화를확인하였는데, 이는항체가완벽한단일층을형성하여센서의특이도를높이고, 또한지나치게많은항체가결합되어센서의민감도를떨어뜨리는현상을방지하기위해서이다. 우리는 ELISA kit 권장농도인 100ul 항체 1/100 희석용액부터 1/50, 그리고 1/10 샘플에대하여항체의농도에따른센서의반응도를살펴보았는데그결과는다음과같다. 그림 18. PBS 희석항원과 FBS 희석항원에의한 신호차이비교. 그림에서와같이우리는 PBS를기반으로한측정과 FBS 용액을사용하는실험의결과가거의일치함을확인할수있었고, 이는우리가제작한센서가높은특이도를보이며, 1 pg/ml 이하의저농도의표적단백질까지감지할수있음을보여준다. 결핵에대한 IFN-γ의진단기준농도가수십 pg/ml임을감안할때에, 위와같은 calibration 그래프는우리의소자가임상에서도충분히유의미한결과를낼수있음을나타낸다. 그림에서와같이, 적은농도의항체 sample에서센서가더잘반응하는것을볼수있었는데, 이는 1/100보다높은농도의경우단일층보다더많은층을형성하면서, 항체가전극주변에형성되는전기이중층바깥에결합하게하여측정되는축전용량값에더적게영향을주기때문이라고해석된다. 이를통하여 ELISA kit의권장농도에서가장최적화된센서특성을얻을수있음을확인할수있었다.
25 - 제 4 장연구결과고찰및결론 총괄연구개발과제의연구결과해석및다른결과와의비교분석등에대해고찰하고결론을서술함. 1. 재조합인터페론감마 (rhifn-γ) 단백질생성 - 본실험실에서제조한인터페론감마를생성함. 이단백질은다른회사의항체를이용하여서검증이되었으며, 또한본실험실에서제조한인테페론감마단클론항체에의해서도확인됨. 또한인터페론감마측정법으로이단백질을테스트하였을때기존인터페론감마양성대조단백질과아주유사함을나타냄. 이로써본실험에서제조한 rhifn-γ는기존의양성대조인터페론감마를대치할수있을것으로생각됨. 지금까지살펴본전 ( 前 ) 임상단계의실험들을통해우리는우리의센서가임상실험에서유의미한결과를보여줄수있는가능성을확인하였으며, 이는다른 assay 방법으로얻은데이터와의비교를통해그신뢰도를더욱높일수있을것이다. 향후연구에서임상실험및 ELISA 방법으로부터의결과를비교 / 분석하여결핵진단에있어서의효율성 / 환자접근성을제고할수있으리라기대된다. 2. rhifn-γ에대한단클론항체개발 - 3개클론의단클론항체를개발하였으며이중 2개는 IgG(kappa), 1개는 IgM(kappa) isotype을나타냄. 이단클론항체는상업화된기존인터페론감마와결합하고본실험실에서제조한인터페론감마를인지하고, 뿐만아니라사람말초혈액에서분비하는인터페론감마도인지함. 개발된 3개의단클론항체는동일한에피토프를인지하는것으로판단되어현재는 capture Ab 혹은 detecting Ab로사용가능하며, 본연구에서개발중인인터페론감마나노바이오센서의 capture Ab로활용할예정임. - 특이도검사를위하여다른 lymphokine과의교차반응성을 2차년도에확인할예정이며, 또한다른에피토프를인지하는단클론항체를추가로생성할예정임. - 개발이완료되면환자샘플을이용하여기존방법과본연구에서개발한방법을비교하여유용성평가를시행할예정임. 3. 위의결과로부터, 우리는제작된 capacitive nanosensor가임상실험에도사용할수있는수준의높은특이도와민감도를보임을확인할수있었다. 기존 IFN-γ assay의표준곡선을살펴보면다음과같은데, 이를통해우리의센서가알려진결핵진단판별선부근에서더욱효과적으로사용될수있음을알수있다. γ
27 - 제 5 장연구성과및활용계획 5.1 활용성과 임상시험, 관련 DB 구축, 워크샾또는심포지움개최등의경우구체적으로기술함. 과제명 과제책임자신전수 / 연세대학교 / 면역학 번호논문제목저자명저널명집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 2 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지 1 2 번호출원 / 등록 1 2 국내 / 국외 SCI여부 국내 / 국제 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류 기타관련정책에활용예를구체적으로기술함. 타연구및차기연구에활용된예를구체적으로기술함. 5.2 활용계획 언론홍보및대국민교육내용, 일자등을간략히기술함.
29 - 제 6 장기타중요변경사항 처음선정시와비교하여변경된내용을명시 제 7 장연구비사용내역 28,151,606 28.15 7,619,999 2,922,000 17,609,607 0 7.62 2.92 17.61 66,460,824
31 - 제 8 장참고문헌 제 9 장첨부서류 본학술연구용역사업의성과로기술된게재된학술지논문전체사본 ( 게재허가를받은경우게재 증명서 ) 과산업재산권등록증 ( 또는출원서 ) 사본을반드시첨부할것.