학술연구용역사업최종결과보고서 결핵균잠복감염진단을위한 정량검사법개발 결핵균잠복감염진단을위한 정량검사법개발 주의 ( 주의내용기재 ) ( 글 14 point 고딕체 ) 주관연구기관 : 연세대학교 질병관리본부 질병관리본부 1

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1 학술연구용역사업최종결과보고서 결핵균잠복감염진단을위한 정량검사법개발 결핵균잠복감염진단을위한 정량검사법개발 주의 ( 주의내용기재 ) ( 글 14 point 고딕체 ) 주관연구기관 : 연세대학교 질병관리본부 질병관리본부 1

2 주의내용 주 의 1. 이보고서는질병관리본부에서시행한학술연구용역사업의최종결 과보고서입니다. 2. 이보고서내용을발표할때에는반드시질병관리본부에서시행한 학술연구용역사업의연구결과임을밝혀야합니다. 3. 국가과학기술기밀유지에필요한내용은대외적으로발표또는공개 하여서는아니됩니다. 2

3 목 차 Ⅰ. 연구개발결과요약문 3 ( 한글 ) 결핵균잠복감염진단을위한 정량검사법개발 ( 영문 ) Ⅱ. 학술연구용역사업연구결과 제1장최종연구개발목표 5 제2장최종연구개발내용및방법 11 제3장최종연구개발결과 21 제4장연구결과고찰및결론 30 제5장연구성과및활용계획 31 제6장기타중요변경사항 32 제7장연구비사용내역 33 제8장첨부서류 35 2

4 과제명 중심단어 결핵균잠복감염진단을위한 정량검사법개발 결핵 진단 인터페론감마 주관연구기관연세대학교주관연구책임자신전수연구기간 결핵균잠복감염진단을위하여현재가장널리사용되는 IFN-γ release assay (IGRA) 에서 IFN-γ 를정량적으로측정하는 sandwich ELISA법은수입하는제품으로고가의비용이소요되어일선의료기관에서사용하기어려운실정이어서수입 IGRA를대체하는 sandwich ELISA 개발이필요하다. 또한 IFN-γ를정량적으로측정하는 sandwich ELISA 법보다신속하고민감한방법인나노바이오센서기술을이용하여 IFN-γ를간편하게정량할수있는새롭고값싼검출법을개발은결핵의조기퇴치달성에필요하다. 본연구는결핵균잠복감염진단을위하여널리이용되고있는 IFN-γ 정량적측정키트를국산화하고또한 IFN-γ 측정용나노바이오센서프로브를개발하기위하여다음 3 가지목적을가지고연구를진행하였다. 첫째, 사람 IFN-γ를클로닝하고순수정제하는것, 둘째, sandwich ELISA 개발을위하여사람 IFN-γ에대한마우스단클론항체를제작및특징을분석하고이를이용하여 sandwich ELISA로의사용가능성을제시하는것, 셋째, 나노바이오센서를이용하여신속간편한사람 IFN-γ 검사가능성을제시하는것이다. 본연구에서사람 IFN-γ를형성하는유전자를클로닝하여단백질을 E. coli에발현시켜서순수분리정제하여재조합사람 IFN-γ를제조하였다. 제조한재조합단백질은 Western blot, ELISA 법으로 IFN-γ 단클론항체에반응하는것을확인하였으며 IFN-γ 측정으로사용하는 Quantiferon-TB gold 및 BD 회사의 IFN-γ와결합력이유사한반응결과를나타내어 standard IFN-γ로사용될수있을것으로판단된다. 나노바이오센서를이용하여 IFN-γ 측정을위하여 capacitance 센서를제조하였으며, 이센서에 IFN-γ 단클론항체 (BD회사 ) 를결합시킨후농도별로 IFN-γ의결합을전기신호로측정하여농도의존적으로신호가변함을관찰하였고, 그결과 ELISA 결과와상관성이있음이확인되었다. IFN-γ 정량을위하여단클론항체 (BD회사) 를이용한 sandwich ELISA법을정립하였고, 본실험실에서제조한 IFN-γ를정량을위한대조항원 ( 표준화곡선 ) 으로사용가능성을제시하였고, 실제결핵환자샘플을이용하여 IFN-γ를측정한결과 Quantiferon-TB gold에서얻은결과와유사하였다. 결론적으로본연구에서결핵균잠복감염진단정량법개발을위하여필요한재조합 IFN-γ 단백질을확보하였으며, 또한신속측정을위하여 Capacitive 바이오센서를개발하여활용가능타당성을확립하였고, sandwich IFN-γ ELISA 법을확인하여실제환자샘플에서 IFN-γ 측정이가능함을확인하였다. 3

5 Title of Project Key Words Institute Project Leader Project Period For diagnosis of latent tuberculosis infection, interferon gamma release assays (IGRAs) have been increasingly used in the world. An ELISA based whole blood assay kit, QuantiFERON Gold, has become commercially available with higher sensitivity and specificity compared to a conventional method, Tuberculin Skin Test (TST). However, due to high expense, it has been difficult to be commonly utilized and recommended by clinicians in the nation. To complement this limitation, it is now important to locally develop a comparable sandwich ELISA to measure IFN-γ production specific to M. tuberculosis (M.tb). In addition, it is essential to advance a novel diagnostic method for measuring IFN-γ or other cytokines levels using a nano-biosensor technique, which may provide with higher sensitivity and specificity than existing methods. The overall goals of this study are to locally produce key materials for an in-house sandwich ELISA kit and also develop a nano-biosensor probe to quantify IFN-γ response. To approach these goals, the study was conducted with following three objectives: 1) cloning human IFN-γ and purification of the recombinant protein, 2) production and characterization of mouse monoclonal anti-ifn-γ antibody for the use of sandwich ELISA, 3) measurement of IFN-γ response by the nano-biosensor as an easy and quick diagnosis tool. We successfully cloned a gene encoding human IFN-γ and produced a recombinant IFN-γ protein in E. coli, which can be used as a standard IFN-γ comparable to rhifn-γ from Company source (Quantiferon or BD). Also, we developed a capacitance biosensor engineered with monoclonal anti-ifn-γ antibody and observed changes in electric signals from antigen-antibody binding when controlling concentration of IFN-γ. We set up in-house sandwich ELISA using monoclonal antibodies using BD source. Our rhifn-γ showed similar standard curve as like rhifn-γ protein from Quantiferon ELISA or BD company source. And the assay for the measurement of IFN-γ in the samples of tuberculous patients were comparable to that of Quantiferon ELISA kit. In conclusion, we produced rhifn-γ protein for IFN-γ assay as a positive control standard protein and set up in-house sandwich ELISA assay, which results are comparable to those of Quantiferon-TB gold ELISA, using monoclonal antibodies of BD source. We also developed a capacitive biosensor which is a quick and sensitive diagnostic tool for measuring IFN-γ response. 4

6 학술연구용역사업연구결과 제 1 장최종연구개발목표 1.1 목표 가. 연구목적 결핵균잠복감염진단을위하여널리이용되고있는 IFN-gamma release assay (IGRA) 에서 IFN-gamma를정량적으로측정하는 sandwich ELISA를국산화하여보급하고, 신속하고간편한현장검사용 IFN-gamma 검사키트를개발하여결핵의조기퇴치정책에활용하고자함. 나. 필요성필요성 : 결핵균잠복감염진단을위하여현재가장널리사용되는 IFN-gamma release assay (IGRA) 에서 IFN-gamma를정량적으로측정하는 sandwich ELISA법이고가의비용이소요되어일선의료기관에서사용하기어려운실정임. IFN-gamma를정량적으로측정하는 sandwich ELISA법이복잡하고많은시간이소요되어분자생물학적기술과나노바이오센서기술을이용하여 IFN-gamma를신속하고간편하게정량할수있는검출법을개발하여, 결핵균잠복감염을진단하여결핵의조기퇴치달성에필요함. 다. 연구범위 개발생산된 IFN-gamma sandwich ELISA 키트를검체를이용한유용성검정 나노바이오센서기술을이용한 IFN-gamma 정량검사키트와 sandwich ELISA 키트의비교 임상시험을통하여결핵균잠복감염평가및양성기준값제시 1.1) 사람 IFN-gamma sandwich ELISA 키트개발및유용성검정 - 유전자재조합사람 IFN-gamma 에대한단클론항체생산 (* E. coli 유래혹은동물세포유래사람 IFN-gamma 이용하여사람 IFN-gamma 에반응하며특이성있는단클론항체추가생성 ) 1) 단클론항체의특이도검사및생물학적생화학적특성분석 2) 단클론항체의대량생산 - IFN-gamma를정량적으로측정하는 sandwich ELISA 키트개발 1) 단클론항체 (Capture Ab) 의 EIA 플레이트에부착 2) IFN-gamma의농도에따른민감도분석 3) 단클론항체 (Detection Ab) 의 biotinylation 4) Streptavidin-tagged HRP 5) 표준사람말초혈액 IFN-gamma 단백질을이용한정량 5

7 6) 임상샘플을이용한 IFN-gamma 측정및타회사제품과비교분석 - 사람 IFN-gamma 에대한유전자재조합단백질생산및정제 1.2) 신속간편한사람 IFN-gamma 검사키트개발 : - IFN-gamma 검출용프로브개발 - 단클론항체를이용한인터페론-gamma 검출용 capacitive 바이오센서개발 ( 완료 ) - IFN-gamma 검출용 Capacitive Biosensor를개발하여상용화가능한진단시스템을확립하고이의시제품을제작 / 검증 ( 현재 capacitance biosensor에대한특허는유경화교수팀보유 ) - Biosensor의측정치와 sandwich ELISA 값의비교분석및표준화 표. Capacitive 바이오센서를이용한사람 IFN-gamma 검출용프로브개발전략 주요개발내용 Capacitive biosensor 의제작및특성연구 IFN-gamma 항체를이용한항원단백질검출기법확립 IFN-gamma capacitive sensor 최저감지농도를데이터화 IFN-gamma를감지하기위한 capacitive biosensor 제작임상진단을위한 capacitive biosensor chip 제작및최적화 추진전략 l 전극의넓이와전극간길이별민감도측정 ( 완료 ) l 항원항체의최적측정 frequency 측정 ( 완료 ) l Equivalent circuit을이용한측정값의계산및분석도구구축 ( 완료 ) l 항체고정화기술 ( 완료 ) l 항체안정화기술 ( 완료 ) l 임상시료측정을위한 blocking 등최적화기술확립 ( 완료 ) l Capacitive sensor를이용하여 IFN-gamma 대한측정한계농도의데이터화 ( 완료 ) l Chip 의제작 ( 완료 ) l l l Chip 의실시간측정시스템구축단백질의 chip 고정화와효과적시료전달을위한 microfluidic system 개발효과적진단을위해임상시료를통한판별율데이터베이스화 l Prototype 의 chip 제작 ( 완료 ) l 제작된 chip 의 blind test 를통한신뢰도측정 ( 완료 ) 1.2 목표달성도및관련분야에대한기여도 6

8 구분월별추진일정 연구내용 사람 IFN-gamma에대한유전자재조합단백질클로닝및생산 Capacitive biosensor의제작및특성연구 IFN-gamma capacitive sensor 최저감지농도를데이터베이스화 IFN-gamma 를감지하기위한 capacitive biosensor 제작 IFN-gamma 항체를이용한항원단백질검출기법확립 사람 IFN-gamma에대한유전자재조합단백질에대한단클론항체추가생산및분석 IFN-gamma를정량적으로측정하는 sandwich ELISA 키트개발및정성분석 (BD 단클론항체를이용한정량측정 ) 임상진단을위한 capacitive biosensor의사람 IFN-gamma의실제임상샘플측정및최적화 임상진단실험을위한샘플확보 임상시험을통한상용 QFT-GIT assay kit, 개발한 sandwich ELISA kit, biosensor 의측정결과비교및결핵균잠복감염평가및양성기준값제시 (BD 단클론항체를이용한정량측정 ) 비고완료완료완료완료진행중완료완료완료완료 추진진도 나 관련분야연구에의기여도 결핵균잠복감염진단을위하여현재가장널리사용되는 IFN-gamma release assay (IGRA) 에서 IFN-gamma를정량적으로측정하는 sandwich ELISA 법이고가의비용이소요되어일선의료기관에서사용하기어려운실정임. 현재 IGRA 법은 Cellestis International 회사 ( 호주 ) 에서개발한 QuantiFERON-TB, QuantiFERON-TB Gold, QuantiFERON-TB Gold In-Tube assay 법, 그리고 Oxford Immunotec( 영국 ) 의 ELISPOT TSPOT-TB assay 제품으로판매되고있음. 본연구에서 IFN-gamma assay 법의개발을위한단클론항체개발및 assay 법의국산화는국내진단의료비용의절감및수입대체효과를나타낼것으로생각됨. IFN-gamma를정량적으로측정하는 sandwich ELISA법이복잡하고많은시간이소요되어분자생물학적기술과나노바이오센서기술을이용하여 IFN-gamma를신속하고간편하게정량할수있는검출법을개발하여, 결핵균잠복감염을진단하여결핵의조기퇴치달성에기여함. 1.3 국내 외기술개발현황 7

9 국내 외관련분야에대한기술개발현황과연구결과가국내 외기술개발현황에서차지하는위 치등을기술 2006년도 WHO 통계에따르면결핵은전세계인구의 1/3 정도 ( 약 20억명 ) 가감염되어있으며매년 800만명정도가현성감염이발생하고 200만명정도가사망함 (1). 이는 HIV 감염의증가와결핵제어프로그램을소홀히하여온결과이나최근에는약제내성균의출현과신규결핵균발생이한몫을하였다 년결핵발생중 20% 가표준치료요법에저항성이있으며 2% 정도가 2차약제에내성이있다 (2). 결핵발생은국가마다매우다르고나이에따라다양하나주로청소년혹은젊은성인에서발생이높고, 선진국의경우노인과면역결핍환자에서자주발생한다. 따라서결핵을제어하는것은진단기법, 백신, 치료약물에서다양한접근이필요함을암시한다. 결핵은활동성결핵환자에서전파가되므로신속하게활동성환자를구별해내는것이효과적인전파차단에중요함 (1). 결핵균은 CD4+ 및 CD8+ T 세포를강력하게자극하여면역반응을일으켜 Interferon-gamma와 TNF-alpha를생성하는제1형염증반응과같은반응을유발한다 (3). 결핵균항원은대개지연형과민반응을일으키므로지금까지 PPD 단백질을이용한 tuberculin skin test (TST) 방법으로환자진단에사용되어왔으나이는 BCG 예방접종을한정상인에서도양성이나타나므로진짜환자를구병하는데제한점이많다 (4). 최근에는이와같은문제점을해결하고자결핵균의주요면역항원인 6-kDa early secretory antigenic target (ESAT-6) 를이용하여결핵진단에사용하고자시도하고있으며, 이는 BCG와교차반응이없다. 또한결핵균 (H37Rv) 와 BCG의유전자를비교하여결핵균에만존재하는유전자부위 (RD1~RD16) 를찾아 RD-1 유전자유래항원인 ESAT-6와 CFP10을결핵진단에사용하고자하고있다 (5-7). 이와더불어면역학적으로결핵균에노출된환자는동일한결핵균항원에노출될경우 IFN-gamma를생성하는현상을이용하여서 IFN-gamma 측정을이용한진단법 (IFN-gamma release assay, IRMA) 을이용하고있다. ESAT-6과 CFP10은 BCG 뿐만아니라대개의토양에서유래된항산균에없으므로결핵균특이하게진단을할수있는장점이있으므로 TST 보다우수한테스법으로꼽히고있다. 현재 IGRA 법은 Cellestis International 회사 ( 호주 ) 에서개발한 QuantiFERON-TB, QuantiFERON-TB Gold, QuantiFERON-TB Gold In-Tube assay 법, 그리고 Oxford Immunotec( 영국 ) 의 ELISPOT TSPOT-TB assay 제품으로판매되고있다. IGRA 법이개발된이후기존의 TST 법과 IGRA법을이용한진단법이나라마다혼용되고있다. 미국과일본, 프랑스등은 TST법과 IGRA법을함께사용하고있으며 (5세이상의경우 ), 독일과스위스등의국가는 anti-tnf-alpha 치료를받는사람의경우에 IGRA법을사용하게하는등의가이드라인이제정하여사용하고있다 (8). 영국, 캐나다, 독일등은결핵환자와접촉이있었던경우 TST 법을먼저사용하고, 이후에다시 IGRA법을사용한다. 우리나라는 KCDC의가이드라인을 2009년에제정하여 IGRA법과 TST법을함께사용하여 6세이상에서 TST법양성 (5 mm BCG 비접종자, 10 mm BCG 접종자 ) 인경우결핵감염을확인할때사용한다. 또한 TST 반응이음성인경우 IGRA 법은의사의임상적인판단에따라 IGRA법을사용하며, 활동성결핵이나반복적인테스트로사용하지는않도록하고있다. PPD 를이용한 TST 법은숙련된테스트기법과결과해석경험, 그리고피험자가최소한 2 회이상 8

10 병원을방문해야한다는점, 이로인한인건비증가, PPD 항원의 BCG 혹은기타항산균과교차반응에의한위양성, 면역저하환자를검사시위음성등의단점이있는반면에 IGRA법은피험자가 1회방문으로가능하므로검사자의인건비가적게들고, 결핵진단에대한민감도 (~93%) 및특이도 (92-97%) 가높고 [ 참고로 TST법은 56-95% 의특이도 ] BCG 접종자나기타항산균에의한위양성이거의없어검사자가달라져도그리편차가크지않다는장점이있다. 경제적인비용은나라마다다르나위양성, 위음성이적어서이를확인하기위한추가검사비용이적게들어오히려더경제적인면도있으나, 영국의시스템에서는 dual test법이용한검사법이한가지검사법을이용하는것보다비용이덜든다는보고가있다 (9). 위에서언급한대로결핵감염의진단에 IFN-gamma 검사법이필요한데, 이 ELISA를이용한현검사법은고가이고, ELISA 시행의현장성및측정시간면에서어려움이있다. 또한그림에서나타난것과같이 IFN-gamma 진단의판별농도가 sub-ng/ml이므로본연구진에서개발한나노바이오센서가 Capacitance nanosensor가신속진단 kit로 IFN-gamma 측정진단에적절하다고볼수있다. 그림 1. 결핵균특이항원 (ESAT6, CFP10) 자극에결핵환자에서 IFN-gamma 의생성. 인터페론감마는사람, 소, 양, 돼지, 마우스, 랫의아미노산의유사성은아래와같으며사람과마우스 는 40% 의유사성이있음 ( 사람, 소, 양, 돼지, 마우스, 랫의순서임 ). 9

11 - 그림 2. 인터페론감마의종 (species) 간아미노산서열비교. 사람 IFN-gamma 의 glycosylation site 와구조 : 사람인터페론감마는두군데의 N-glycosylation site 가존재하며 6 개의 alpha-helix 를이루고있음. Homodimer 형태로 non-covalent binding 을이 루고있음. 10

12 그림 3. 사람인터페론감마의 glycosylation 부위 ( 왼쪽위. 다이아몬주구조가있는곳 ), 3 차구 조. 제 장최종연구개발내용및방법 가 연구방법 (1) 사람 IFN-gamma ELISA 키트개발 ( 가 ) 사람 IFN-gamma 에대한유전자재조합단백질생산및정제 : 사람 IFN-gamma 에대한유전자를클로닝하기위하여사람말초혈액단핵구 (PBMCs) 분리및총 RNA 순수정제하였다. 총 RNA를이용하여 random primer labeling 법을통하여 cdna를제조한후 ( 혹은사람 IFN-gamma 가클로닝되어있는플라스미드를이용하여 ) IFN-gamma primer set을이용하여서 RT-PCR을시행하여 PCR 산물을순수정제한후 Topo vector에클로닝하고단백질생산을위하여 prset vector에클로닝을시행하였다. 클로닝을마치면염기서열을분석한후 E. coli에형질변환 (transformation) 을하여서단백질을발현시킨다. 발현된균주는균체를파쇄한후원심분리에의해 inclusion body를분리한후 refolding을실시하고 FPLC를이용하여고순도의단백질을순수분리하였다. 순수분리한단백질은기존의 IFN-gamma 단백질과함께 SDS-PAGE, Western blot을통하여확인하였다. ( 나 ) 유전자재조합사람 IFN-gamma 에대한단클론항체생산 : 고순도 IFN-gamma 단백질 (R&D, BD회사제품, 본실험실제조 IFN-gamma, NK92 세포유래사람 IFN-gamma) 을 BALB/c 마우스에복강내주사혹은발바닥주사를실시한후면역이잘된마우스를선택하여, mouse tail vein을통하여 boosting을실시하였다. 이후세포융합은 Kohler와 Milstein의방법을이용하여실시하며, 잘면역된 BALB/c 마우스로부터비장또는 lymph node를채취하여단세포로분리한후암세포인 myeloma 세포 (V653) [hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) 가결핍된세포 ] 와 polyethylene glycol (PEG) 를처리하여융합시킨후, hypoxanthine aminopterine thymidine (HAT) 가첨가된배양액으로융합이된세포를선별하였다. 선별된세포의세포배양액을 enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 를통하여특이적으로반응하는융합세포를선별하여양성세포는클론닝을시행하였다. 세포배양액을이용하여 Western blot 분석, 유세포 (flow cytometry) 분석, 면역침강 (immunoprecipitation) 법을실시하여항체의사용가능특성을분석하였다. 단클론항체의항원특이성분석을위하여사람다른사이토카인에대한교차반응성을 ELISA 혹은 Western blot으로확인하였다. 11

13 ( 다 ) IFN-gamma를정량적으로측정하는 sandwich ELISA 키트개발 : IFN-gamma sandwich ELISA 키트를개발하기위하여위에서개발된단클론항체를 capture Ab로이용하고인터페론단백질을정량하여서표준 (standard) 으로사용하였다. 가장적정한 capture Ab의농도와 detection Ab의농도를선정하고자하였다. Detection Ab는 HRP가결합된 conjugate Ab를제조하여사용하며이후 TMB 기질로발색반응을시켰다. Detection Ab로 biotin-labelled 항체를이용하였으며이경우 streptavidin-tagged HRP 혹은 streptavidin-tagged Ab-HRP를이용하였다. (2) 신속간편한사람 IFN-gamma 검사키트개발 : IFN-gamma 검출용프로브개발 ( 가 ) Capacitive biosensor의작동원리 : Annodized Aluminum Oxide (AAO) 를기반으로한 capacitive biosensor의개략도는그림 4과같다. 알루미늄을양극산화하면아래와같이균일한크기의 nanopore를가지는 AAO가형성된다. 이를 template로사용하여전기도금방법으로금나노선을성장시켜바닥전극을제작하고, AAO template 위에금박막을증착하여덮개전극을형성하여 capacitor 구조를완성하였다. 그림 4. Capacitive Biosensor 의개략도 기본적으로 capacitance C=εA/d 로주어진다. 여기서 ε 은유전상수, A 는전극의넓이, d 는전 극간거리이다. 대부분의생체분자들은전하를띠고있기때문에금전극에생체분자가붙으면 유전상수가바뀌므로 capacitance 변화량측정을통해생체를검출할수있었다. 특히본과제에서제시하는 AAO 기반 capacitive biosensor 는바닥전극역할을하는금나노선의 길이를조정하여전극간거리인 d 값을 100 nm 수준으로낮출수있어이를통한탁월한민감 도의향상효과를얻을수있었다. ( 나 ) 면역반응을이용한결핵균잠복감염진단용 capacitive biosensor IFN-γ 면역반응으로인한축전용량신호변화의주파수의존도측정 - 위에서언급한바와같이전극표면에서의생체물질간결합반응에대한센서의반응은인가되는교류전압의주파수에의존하는데, 이중이러한면역반응에가장민감한변화를보이는주파수를 frequency sweep 모드측정을통해확인하였다. 이때, 주파수는 20Hz~1kHz까지 10Hz 간격으로측정하였는데, 이러한주파수광역을사용한것은일반적으로체액이위의주파수대에서 capacitive한성질을보이는것으로알려져있기때문이다. 이보다높은주파수 12

14 에서는 conductive 한성질이강해져용액의유전성질을파악하기어렵게된다. - 위와같은주파수영역을사용하여측정은다음과같이이루어졌다. 먼저, 실험방법에언급된순서로소자를제작하고, ph 7.4 PBS 1x buffer에희석된 protein G를소자표면에빽빽한단일층을형성하도록결합한후결합되지않은물질들을같은 PBS로씻어낸후 frequency sweep 모드로용액의축전용량을측정하였다. 그후이위에 IFN-γ의단일클론항체가완벽한단일층을형성하도록 100 ul 용액을 ELISA 측정권장량인 1/100 희석하여고정한후, 결합되지않은항체들을 buffer 용액으로 washing하였다. 이때다시주파수 sweep 모드로용액의축전용량을측정하는데, 이상태는 target 분자를결합하기직전의상태이므로이를축전용량의기저수준으로설정하게된다. 마지막으로표준농도로희석된항원을소자에주입하여미리고정된항체에결합하게하고다시 PBS로면역특이적으로결합하지않은분자들을씻어냄으로써항원-항체반응으로안정된항원만이신호에영향을주도록한다. 이때다시 sweep 모드로축전용량을측정하여어느주파수에서면역결합에의한신호가가장큰지를비교하였고, 그결과는다음과같다. 그림 5. 면역반응에의한측정신호 변화량의주파수의존도. 그림에서와같이용액은높은주파수일수록더작은유전특성을보였으며, 희석된생체분자 간결합에의한신호는 200Hz 에서가장두드러짐을확인할수있었다. 이와같은주파수 sweep 측정을통해축전용량측정에가장적합한진동수를구할수있었다. 축전용량신호의농도의존도확인 - 열역학적으로두가지 chemical species가반응할때, 한종의반응물의농도가고정되어있고, 다른한종의농도를변화시키면서결과물의생성정도를살펴보면, 농도를변화시키는반응물과생성물의함수적관계는로그함수로표현되어지는것이잘알려져있다. 우리의실험에서, 센서표면에안정화된항체의농도를고정하고, 투입하는항원의농도를변화시키면서검출되는신호의변화량을비교해보면전형적인로그함수의존도를보이는것을확인하였다. 13

15 비특이적결합존재유무확인 - 제작한센서가임상적으로사용되려면 IFN-γ 외의다른단백질에의한효과가최소화되어야한다. 이를위해서는먼저 IFN-γ 항체가빽빽한단일층으로센서표면에형성되어야하고, 항체의표적단백질에대한특이도도높아야한다. 따라서이러한특이도의분석을위해 IFN-γ 이외의다른단백질을투입하여센서의축전용량변화를확인하였고, 그결과는다음과같다. 그림에서와같이, 표적단백질대신 IL-6 cytokine을투입하였을때에는농도에따라신호변화가로그함수적인특성을보이는 IFN-γ의특이적항원-항체결합의경우와는달리표면에고정된 IFN-γ 항체와의결합으로인한축전용량변화가거의감지되지않았음을확인할수있었다. 이는 capacitive sensor 표면에서면역적으로비특이적인결합으로인해용액의전기적성질변화가거의일어나지않음을나타내는중요한결과이다. 우리는 IL-6 실험에서와같이단일단백 14

16 질종뿐아니라여러종류의단백질에대한 capacitive sensor 표면의항체특이도를검증하기위해다양한단백질의 pool인 FBS( 우태아혈청 ) 에대해서도위와같은실험을하였고, 그결과는 IL-6의경우와마찬가지로항체에대한이종 ( 異種 ) 단백질에대한비특이적결합에의한신호가미미 ( 微微 ) 함을확인할수있었다. 그림 8. 우태아혈청 (FBS) 을사용한 비특이적면역반응의확인. 아울러, 센서표면을높은특이도로개질하고자하여, 우리는 IFN-γ의다클론항체 (pab) 와단일클론항체 (mab) 의항체표준농도에대한반응을비교하였다. Body에항체가붙을수있는 site 가하나만있는 mab의경우항체에대한반응도는 pab에비해떨어지나특이도는더높을것으로기대되었다. 따라서우리는다음과같이두가지종류의항체에대해항원농도대비신호의변화량을측정하였다. 그림 9. 다클론항체와단일클론항체고정층에 의한센서반응도비교. 그림에서와같이, 항체에대한반응도는 pab가더우수하였으나, mab의경우한항체와만결합하므로더좋은로그함수적경향을보이는것을확인하였다. 마지막으로, mab 항체의농도별축전용량신호변화를확인하였는데, 이는항체가완벽한단일층을형성하여센서의특이도를높이고, 또한지나치게많은항체가결합되어센서의민감도를떨어뜨리는현상을방지하기위 15

17 해서이다. 우리는 ELISA kit 권장농도인 100ul 항체 1/100 희석용액부터 1/50, 그리고 1/10 샘 플에대하여항체의농도에따른센서의반응도를살펴보았는데그결과는다음과같다. 그림 10. 단일클론항체농도별 신호변화량비교. 그림에서와같이, 적은농도의항체 sample에서센서가더잘반응하는것을볼수있었는데, 이는 1/100보다높은농도의경우단일층보다더많은층을형성하면서, 항체가전극주변에형성되는전기이중층바깥에결합하게하여측정되는축전용량값에더적게영향을주기때문이라고해석된다. 이를통하여 ELISA kit의권장농도에서가장최적화된센서특성을얻을수있음을확인할수있었다. 본과제에서는이러한 capacitor 구조를바탕으로결핵잠복감염여부를판별할수있는 IFN-gamma 항체를이용하여체액에있는항원을검출함으로써만성결핵을진단할수있는시스템에대해연구하였다. 항원-항체간 ( 間 ) 반응은상호특이적이며이들대부분이전하를띠고있기때문에이분자들의전극근처에서의분포변화를 capacitance 값의추이분석을통해그반응을검출할수있었다. 그림 11는결핵진단을위한 capacitive biosensor의모식도이다. 우선항체를금전극에고정시키고, 표준농도로분산된표적단백질을미세유체 channel 내에주입하여면역특이적결합을통해농도별항원의면역반응이 capacitance 값에미치는변화량을비교 / 분석하였다. 16

18 ( 다 ) AAO 기반 Capacitive Biosensor 제작및특성연구 : 고민감도, 고재현성소자제작을위한 Capacitor 구조의최적화 : 고민감도, 고재현성의 capacitor 센서제작을위해소자의구조적측면과측정적부분의문제를검토하였다. 먼저구조적인면에서민감도와신뢰도가높은측정을위해각소자의기저 level capacitance 값이적절히, 또한소자간 ( 間 ) 일관되게유지되는것이매우중요하였다. 위에서언급하였듯이 capacitance를결정하는가장기본적인식 C=εA/d 을살펴보면, 양전극의넓이 (A) 와전극사이의거리 (d) 를적절히조절함으로써소자의기저 capacitance 값을최적화할수있게된다. 이에본연구에서는광식각공정을사용하여축전전극의넓이를결정하고양극산화반응시간을조절하여전극간거리를변화시킴으로써항원-항체반응의최적기저 capacitance 값을발견하였다. 또한이러한 capacitance 값을갖는소자를균일하게생산함으로써측정의재현성과민감도를향상시켰다. 측정적인측면에서는 IFN-γ의농도를가장민감하게구분할수있는교류인가전압의최적주파수를찾는것이중요하다. Capacitive biosensor는양전극사이에교류전기장을가할때, 측정생체분자의전극주변고정화를통한전기이중층의형성으로유발되는축전용량변화의추이를관찰할수있게된다. 이러한전기이중층의형성은생체물질의크기, 물질구성, 전하량에따라외부전기장의진동수에의존적으로변하게된다. 결론적으로측정하고자하는물질에따라가장민감하게물질의반응을감지해낼수있는인가교류전압의최적주파수가달라지게된다. 이에본연구에서는 IFN-gamma frequency sweep 측정을통해최적으로항원-항체반응을감지할수있는주파수를선택하였다. 17

19 ( 라 ) 임상시료기반의 IFN-γ 검출을위한최적화 IFN-γ 항체의고정 & 안정화기술 : 센서가특이도를가지고 IFN-γ를검출할수있는근거는항원에대한항체의특이적결합에기인한다. 그러므로센서의민감도와특이성을높일수있는요인중하나가활성을가진단일항체를소자의표면에고정하는작업이다. 그리하여본연구에서는아래그림과같이항체의활성을유지시키면서전극에고정하기위해 cys-proteing를먼저금표면에결합시키고그위에항체를고정하였다. Cysteine 에있는 thiol 작용기는금표면의 dangling bond와공유결합을잘하는물질로알려져있으며, 또 proteing는단일항체의 constant region과만결합하여항원과의결합부위인 epitope만을바깥쪽으로노출시켜표적단백질을반응효율을증대시켜준다. 또한나노수준에서 rough한 AAO 표면은생체물질들이결합하기용이하여녹색형광을표지하고있는단일항체를투입했을때, 항체가센서반응면에 compact한단일층을형성하였음을확인하였다. 그림 단일항체의센서표면단일층형성확인실험 (3) 임상샘플을통한개발키트검증임상샘플을통한개발중인키트의검증을위하여대상자를모집하여실제로사용하는검사법과비교관찰하고자검체를수집하고있다. ( 가 ) 대상자모집 : 1 활동성결핵환자 30명 18

20 2 잠복결핵감염자 ( 밀접접촉자 ) 30 명 3 건강인 (PPD 양성자 20 명 / 음성자 20 명 ) 40 명 ( 나 ) 임상자료및검체수집 : 전혈 3 ml 이상채혈 ( 다 ) 검사실시 : 각대상자로부터채취한혈액을이용하여 QFT-GIT Assay를실시하고전혈을결핵균특이항원으로자극한후상측액을모아 IFN-gamma의양을다음키트를이용하여정량적으로측정함. 1 상용화된 QFT ELISA kit, 2 본연구를통하여개발된 IFN-gamma 측정 sandwich ELISA kit 3 본연구를통하여개발된 Nano-biosensor kit ( 라 ) 통계분석 : 1 QFT ELISA kit 에서측정된 IFN-γ 수치를기준으로국내개발키트에서측정된 IFN-γ 수치 와의상관관계 (Pearson Correlation, r) 를분석하여비교평가함. 2 QFT ELISA 키트에서측정된 IFN-γ 수치를기준 (Gold standard) 으로국내개발키트의민 감도 (Sensitivity) 와특이도 (Specificity) 를측정함. 나 연구내용 (1) 사람 IFN-gamma ELISA 키트개발 ( 가 ) 사람 IFN-gamma 에대한유전자재조합단백질생산및정제 1 사람말초혈액단핵구 (PBMCs) 분리및총 RNA 순수정제 2 cdna 생성, IFN-gamma RT-PCR 및클로닝 3 E. coli에형질이입및단백질생성조건확인 4 단백질순수정제및확인 : ( 나 ) 유전자재조합사람 IFN-gamma 에대한단클론항체생산 1 마우스면역및항체가측정 2 단클론항체스크리닝및선별 3 단클론항체의특이도검사및무한희석법에따른클론닝 4 단클론항체의생물학적생화학적특성분석, 항체 isotype 구별 5 단클론항체의대량생산 ( 다 ) IFN-gamma를정량적으로측정하는 sandwich ELISA 키트개발 1 단클론항체 (Capture Ab) 의 EIA 플레이트에부착 2 IFN-gamma의농도에따른민감도분석 3 단클론항체 (Detection Ab) 의 biotinylation 4 Streptavidin-tagged 이차항체-HRP 19

21 5 IFN-gamma 단백질을이용한정량 6 임상샘플을이용한 IFN-gamma 측정및타회사제품과비교분석 (2) 신속간편한사람 IFN-gamma 검사키트개발 : IFN-gamma 검출용프로브개발 ( 가 ) 단클론항체를이용한인터페론-gamma 검출용 capacitive 바이오센서개발 ( 나 ) IFN-gamma 검출용 Capacitive Biosensor를개발하여상용화가능한진단시스템을확립하고이의시제품을제작 / 검증 그림 본연구의흐름도 20

22 제 장최종연구개발결과 3.1. Human recombinant IFN-γ 단백질발현 - 위에서클로닝한플라스미드를 E. coli에서단백질발현을유도한후 Western blot으로확인 (anti-his Ab로확인함 ) 주 그림 15. 사람인터페론감마단백질발현. - Human IFN-γ 단백질순수정제 : NTA column, size exclusion (Sephadex G75), endotoxin removing column 이용 (anti-ifn-γ 를이용하여 IFN-gamma 를순수정제한후다시 Western blot 으로 IFN-gamma 임을확인함 ). 그림 사람인터페론감마단백질의순수 분리및확인 - 순수정제한 IFN-γ 를다른이용하여 BD sandwich 항체를이용하여 capture ELISA 를시행하였을 때 BD 회사의 IFN-gamma 와마찬가지로 pg/ml 의범위에서거의동일한결합을나타냄. 21

23 그림 17. 사람인터페론감마순수정제후확인및타회사제품과비교 결론 : 사람재조합인터페론감마의 E. coli 에서발현정제를완료함 개발키트검증을위한임상샘플확보 (1) 대상자모집을아래와같이계획하였으며현재계획대로임상샘플을확보함. - 활동성결핵환자 30명 - 잠복결핵감염자 ( 밀접접촉자 ) 30명 - 건강인 (PPD 양성자 20명 / 음성자 20명 ) 40명 (2) 임상자료및검체수집을완료함 - 전혈 3 ml 이상채혈 3.3. 사람재조합 IFN-γ에대한단클론항체생성 1) 마우스면역및항체가측정을다음과같이 4가지인테페론을가지고시도함 - 마우스 : BALB/c - 면역원 : recombinant human IFN-γ 1 R&D 회사, rhifn-γ (E. coli-origin) 2 Sino 회사, rhifn-γ (CHO cell-origin) 3 우리실험실제조, rhifn-γ (E. coli origin, our lab) 4 BD 회사, rhifn-γ (E. coli-origin) - 면역원농도 : μg/mouse 22

24 2) 세포융합및단클론항체스크리닝 i) R&D 회사 rhifn-γ 에대한면역및단클론항체생성 - Ab 발현클론선별하여 3 개클론확보함. 표 1. 단클론항체의특성 - Western blot 및 cross-reactivity 테스트 : Western blot 분석결과 HIFNgC6, HIFNgC8, HIFNgD2 클론항체는면역항원으로사용한 IFN-γ(R&D) 뿐만아니라본실험실에서순수정제한 IFN-γ, chinese hamster ovarian (CHO) 에서생산된 IFN-γ(Sino회사 ) 에잘결합하며, monomer 및 dimer 형태 (Sino 회사의 CHO 유래인터페론은 oligomer) 의인터페론이존재함을관찰할수있음. P1, P2 (BD Pharmingen) 는양성대조항체. V653 cell lysate 및사람 IL-2 단백질을결합은관찰할수없어서특이성이있음을확인함. 본실험실에서제조한인터페론은 His 및 linker 아미노산이결합되어있어서 R&D 회사의인터페론과약간크기가다른것으로판단되며양성대조항체인 P1에의하여잘반응함을보여줌. 그림 18. 사람인터페론감마및제조된항체의 Western blot 을통한상호반응확인. - Role of mabs as capture or detecting Abs: 제조된단클론항체가 detecting Ab로서의역할을할수있는지알아보기위하여 HIFNgC6 및 HIFNgC8 항체를 biotin으로부착시킨후 ELISA를시행함. 양성대조항체는 BD사의항체를사용함. 결론적으로 HIFNgC6 및 HIFNgC8 항체는 detecting 항체로서의사용가능성을제시함 ( 아래그림 i). 그러나사람말초혈액자극에의한인터페론검사에사용한결과반응하지않았고, HIFNgC6, HIFNgC8 및 HIFNgD2 항체가 capture 항체로사용가능성이있는지를실험하였으나사람 IFN-gamma를 detecting 할수없었음. rhifn-gamma (Invitrogen, Sino 등 ) 단백질을이용하여재시도예정 23

25 그림 19. Capture ELISA 를이용한 IFN-gamma 결합측정 3.4. 사람 IFN-γ를이용한 sandwich ELISA 법의개발 - Sandwich ELISA 법을이용한 IFN-gamma 측정은 BD 회사에서판매하는단클론항체를이용하여측정법을 setting 한후 Quantiferon-TB in tube Gold (QFT-IT) 법과비교함. 먼저 BD in-house sandwich IFN-gamma ELISA 측정법을이용하여 QFT-IT에서제공하는 rhifn-gamma와우리실험실에서제조한 SJS rhifn-gamma의표준농도곡선을작성함. 우선두인터페론모두상관계수 (R2가 SJS, QFT 인터페론각각 0.997, ) 가이어서각각측정한 2.0 IU/ml 및 300 pg/ml 이하의농도에서유의있는농도대비 OD 값사이에상관관계가있음을보여줌. 그림 20. rhifn-gamma 의농도따른 ELISA 값의상관관계비교 - QFT 법으로환자샘플을 TB 항원으로자극혹은아무자극도없는값을뺀값으로아래와같이양성 여부를판정하며, 0.35 IU/ml 의값을양성기준으로함. BD assay 로표준곡선을구한후양성에해당하 는값을정하여 QFT-IT kit 의결과와 BD assay 의결과를비교함. BD assay 에서 QFT-IT 의 0.35 IU/ml 에 24

26 해당하는 OD 값에맞는 SJS IFN-gamma 의농도를구하여양성기준을정함. 표 2. QFT-IT 의 IFN-gamma 결과에의한결핵환자판정기준. - 결핵환자샘플 28개를 QFT-IT test와 BD test 법으로측정하여비교하면다음과같음. BD test 및 QFT-IT의경우 28개의샘플의 2 IU/ml의농도까지는 IFN-gamma 값이비슷하나 3 이상의경우차이가있음. 아마도 BD test의경우고농도 (3 IU/ml) 에서 IFN-gamma 측정치가낮은것은 capture Ab coating 농도가낮기때문으로생각됨. 결핵환자양성여부판정기준이 0.35 IU/ml 이므로 BD assay 법으로평가를하여도양성여부판정에는 QFT-IT와일치한결과를보여줌. 그림 21. 결핵환자샘플의 QFT-IT 및 BD inhouse sandwich ELISA 법을 이용한결과 IFN-gamma 정량비교. - 위결핵환자샘플 28 개를 QFT-IT test 와 BD 의 inhouse test 법으로검사하여 blind 하게측정한결과 다음과같이민감도와특이도에서일치된결과를얻음. 25

27 - 결핵환자샘플 28개에대하여 QFT-IT으로측정한인터페론결과 (IU 단위표시 ) 와 BD in-house sandwich ELISA 법으로본실험실생산 rhifn-gamma를표준인터페론으로정량분석 (pg/ml 표시 ) 을한결과를상관관계가있음을보여줌 ( 오른쪽위그림 ). w142 환자의경우 QFT-IT nil 값이높아 QFT-IT 환산표 ( 표 2) 에의하면양성이며, BD ELISA에의한값도양성으로두시험결과가일치함. 참고로아래빨강선은 0.35 IU/ml로 QFT-IT 판정으로양성기준선이고, 검은 bar line은 0 IU/ml 농도를표시한것임. 회색 bar: SJS rhifn-gamma를표준곡선으로정량한정량값으로 200 pg/ml까지표현, 붉은점 : QFT-IT의 IFN-gamma를표준곡선으로이용하여정량한 IU/ml 값으로 3.5 IU/ml까지표현함. QFT-IT 정량및 BD inhouse 검사법에의한두측정법의일치도평가결과 ( 오른쪽아래 ) 저농도 (QFT-IT 2 IU/ml, BD inhouse assay 400 pg/ml 이하농도 ) 에서상관관계가있음. 위에서언급한대로고농도에서는 BD inhouse ELISA 측정법의정량값이상대적으로낮음. QFT-IT과 BD assay로측정한값에대한상관관계그림에서 2 IU/ml의농도에서 QFT-IT와 BD assay 법에의한농도가상관관계가있음을보여줌. 그림 22. 결핵환자검체의 QFT-IT 및 BD in-house IFN-gamma 정량의상관 관계분석 26

28 3.5. Capacitive biosensor 제작및특성연구 - Capacitive biosensor의작동원리 : Annodized Aluminum Oxide (AAO) 를기반으로한 capacitive biosensor 의개략도는그림 20과같다. 알루미늄을양극산화하면아래와같이균일한크기의 nanopore를가지는 AAO가형성된다. 이를 template로사용하여전기도금방법으로금나노선을성장시켜바닥전극을제작하고, AAO template 위에금박막을증착하여덮개전극을형성하여 capacitor 구조를완성하였다. 그림 의개략도 - 기본적으로 capacitance C=εA/d 로주어진다. 여기서 ε 은유전상수, A 는전극의넓이, d 는전극간거리이다. 대부분의생체분자들은전하를띠고있기때문에금전극에생체분자가붙으면유전상수가바뀌므로 capacitance 변화량측정을통해생체를검출할수있다. - 이러한평행판축전기모델에우리가제작한소자가잘부합하는지확인하기위해 AAO 두께가다른센서를이용하였는데, PBS의축전용량값을측정한결과, capacitance가 AAO의두께가작아질수록커진다는결과를얻었다. 그림 두께대비축전용량변화 - PBS나 FBS에 IFN-γ를 spiking한시료를이용하여센서의특성을확인하였으며, 또한사람혈청에 IFN-γ를 spiking 하여결핵진단킷으로의적용이가능한지를확인하였다. 이때, PBS / FBS의경우와는달리, IFN-γ가 spiking되어있지않은 pure serum에의하여비특이결합문제가발생하였는데, 이를해결하기위해통상적으로사용하는 3wt% BSA blocking 단백질을사용하였고, 더나아가기존의단백질정량분석법인 ELISA와의임상실험비교를위해필요한 ELISA diluent (RPMI에 1:20 으로희석된 Human antiserum) 에 spiking 된 IFN-γ의양을특이도를가지고정량화할수있었다. 또한, PBS 27

29 와 RPMI 는유사한 ion strength 를가지므로, 두매질에서일정농도의 IFN-γ 에의한신호변화폭역 시거의일치하는것을확인할수있었다. 그림 와 매질에서 γ 에의한전기신호변화추이 - 위의실험을통해임상시료측정의가능성을확인한축전형센서를실제임상진단에사용하기위해 진단판별에필요한 IFN-γ 농도범위에서표준곡선을얻을수있었고, 센서신호의신뢰성확인을 위해 ELISA 를통해서도표적단백질의표준곡선을구하였다. 그림 축전형센서와 간 γ 농도대비대한표준곡선비교 - 우리가개발한축전형센서의신뢰도를확인하기위해동일한임상시료를대상으로본과제에서개 발된축전형센서와 ELISA 를이용하여그결과를비교분석하였다. 아래와같이양 ( 兩 ) assay 의 dynamic range 에서신호에의해산출된항체의농도가비교적잘일치하는것을확인할수있었다. 28

30 그림 24. 결핵환자샘플을이용한측정센서와 ELISA 의 IFN-gamma 측정비교 29

31 제 4 장연구결과고찰및결론 재조합사람 γ 단백질생산 환자 γ 측정을위하여 에필요한 의생성을완료함 로측정하여볼때이단백질은기존 회사 혹은 회사제품의 와동일농도에서 값이유사하여앞으로개발될 혹은 의 측정의표준단백질로사용가능할것으로생각된다 이는수입대체효과가있을것으로생각되며 오염을제거하므로생물학적실험으로사용해도문제가없으므로수입하는 대용으로사용가능할것으로생각된다 제작된 가임상실험에도사용할수있는수준의높은특이도와민감도를보임을확인할수있었다 기존 γ 의표준곡선을살펴보면다음과같은데 이를통해개발된센서로측정가능성이있음을제시하였다 지금까지살펴본전 임상단계의실험들을통해센서가임상실험에서유의미한결과를보여줄수있는가능성을확인하였으며 이는 로얻은데이터와의비교를통해그신뢰도를실험실적인방법으로확인할수있었다 앞으로많은샘플의반복측정및 와비교분석을통하여진단에있어서의신뢰성 효율성및실제환경에서접근성을높이기위한방법을높여야할것으로생각된다 결핵환자샘플을이용한 측정환자샘플에서 측정을위하여 회사단클론항체를이용한 법을구축한후 키트법과비교하였다 우선본실험실에서생산한 이표준 로사용가능한지여부를확인하기위하여 에서제공하는 함께 로비교하였다 그결과농도와흡광도가일정하게상관관계를가지고변하는것을확인 하여표준단백질로사용가능함을제시하였다 표준정량곡선 를얻은후결핵환자샘플 개를 법과 법과 하게비교한결과양성과음성의판정결과가일치하였다 두방법의정성분석결과 법으로검체검사가가능할것으로판단되나좀더많은환자샘플을통한비교분석을하여일치도의더검증하는것이좋을것으로판단된다 나노바이오센서기술을이용한 γ 정량검사키트와 의비교 다양한임상시료에대하여나 노바이오센서와 측정을통해그결과를비교하였으며 두기기에서상당한신호일치도를보이 는것을확인할수있었다 샘플의숫자를증가하여확인할필요가있다고생각된다 30

32 제 5 장연구성과및활용계획 5.1 활용성과 과제명결핵균잠복감염진단을위한 정량검사법개발 과제책임자신전수 / 연세대학교 / 면역학 번호논문제목저자명저널명집 ( 권 ) 페이지 Impact factor 1 2 국내 / 국외 SCI여부 번호발표제목발표형태발표자학회명연월일발표지 1 2 국내 / 국제 번호출원 / 등록 1 2 특허명출원 ( 등록 ) 인출원 ( 등록 ) 국출원 ( 등록 ) 번호 IPC 분류 기타관련정책에활용예를구체적으로기술함. 타연구및차기연구에활용된예를구체적으로기술함. 언론홍보및대국민교육내용, 일자등을간략히기술함. 임상시험, 관련 DB 구축, 워크샾또는심포지움개최등의경우구체적으로기술함. 31

33 5.2 활용계획 기대효과 현재투베르클린피부반응검사가 BCG 접종에따른위양성효과때문에문제가있으며, 결핵진단의체외 IFN-gamma 검사방법을사용한다. 이는잠복결핵뿐아니라활동성폐결핵을진단할수있는가능성을가지고있기때문에결핵진단에있어많은도움을주리라예상된다. 또한미국을위시한소수의선진국외에는 IFN-gamma 방법이개발되어있지않기때문에이를통한진단기술의획득은여전히블루오션이라할수있다. 게다가본연구단에서제시하는센서가소형화 / 휴대화가가능한전기측정법이므로기존의 ELISA 기반의진단보다훨씬적은비용과시간으로결핵을진단할수있는장점을가지고있다. 활용방안 우선전기기반 IFN-gamma 진단킷은 ELISA가없는소형병원에서도진단이가능하다는장점이있으며, 또한쉽게진단하기어려운잠복결핵을판별할수있다는점에서큰장점이있다. 또한원론적으로 IFN-gamma를통해활동성폐결핵을진단할수도있어, 폐결핵의진척도도판별할수있는다기능센서로활용될수있다. 또한결핵의발생빈도가높고 ELISA 등고가의대형장비의도입이어려운개발도상국등에판매 / 보급할수있다면그들의복지향상및우리의의료시장확장에크게기여할수있으리라예상된다. 위와같이 in vitro 수준에서검증된센서를사용하여임상샘플을적용하고 ELISA에서의신호와비교하여그신뢰도를확인한후에 chip화하여간편하고사용자친화적인결핵진단 chip set platform을설계할계획이다. 결핵균잠복감염자검출및결핵발병고위험군관리사업에의활용 제 6 장기타중요변경사항 측정을위하여 단클론항체를이용한 를사용하여 방법과비교하였다 본실험실에서생산한 를이용하여표준정량곡선을실험한결과 를측정할수있으며 아울러 법이사용가능함을제시하였다 방법에서 단클론항체를사용하였으며이는가격적인면에서 QFT-IT의 96well plate 1개의가격에비하여약 1/10 이하의가격으로측정이가능하여 QFT-IT 보다경제적이었다. 이를이용하여결핵환자임상검체 개의 를측정하여 방법을비교한결과양성의정확도와음성의특이도가일치함을알수있었다 본실험실에서생산한 은사용이가능하며 아울러앞으로 단클론항체의국산화도필요하다 그동안단클론항체의생산이어려워 항체를이용한 측정이가능함을밝혔다 신뢰성있는판단을위하여좀더많은검체를가지고추가확인될필요가있다고판단된다. 32

34 제 7 장연구비사용내역및연구원분담표 7.1 연구비사용내역 단위 원 구 분 비 목 금액구성비비고 인건비소계 19,774, 책임연구원 총 명 8,719, 연구원 총 명 1,170, 연구보조원 총 명 8,711, 보조원 총 명 1,173, 경비소계 70,713, 여 비 유 인 물 비 전 산 처 리 비 시약및연구용재료비 회 의 비 임 차 료 교 통 통 신 비 감 가 상 각 비 위 탁 정 산 수 수 료 158, ,713, , 일반관리비 4,512, 이윤 계 95,000, 질병관리본부학술및전산용역사업편람에따라구체적으로작성하시기바랍니다 33

35 7.2 연구분담표 구분소속직위성명성별분담내용 인건비지 급여부 단 참여율 위 원 책임연구원 미생물학과 교수 신전수 남 인터페론감마측정법개발을위한전체 적인실험관리 책임연구원급 물리학과 교수 유경화 여 나노바이오센서개발총괄관리 책임연구원급 미생물학과 교수 조상래 남 임상샘플및측정법개발 연구원 미생물학과 연구교수 곽만섭 남 단백질생산및분리 연구보조원 미생물학과 석사과정 장선미 여 단클론항체개발인테페론측정실행 연구보조원 미생물학과 연구원 권민경 여 단클론항체개발인테페론측정실행 1,554, % 연구보조원 미생물학과석사과정 이용준 남 단클론항체개발인테페론측정실행 2,800, % 연구보조원 미생물학과 연구원 임아람 여 단클론항체개발인테페론측정실행 1,557,738 19% 특성 연구보조원 물리학과 박사과정 김주형 남 연구 항체를이용한 항원단백질검출기법확립 최저 연구보조원 물리학과 박사과정 박민지 여 감지농도를데이터화 임상진단을위한 제작및최적화 보조원 미생물학과 기수 고시환 남 단클론항체생산및특성분석 세포주관리 질병관리본부학술및전산용역사업편람에따라구체적으로작성하시기바랍니다 34

36 제 8 장참고문헌 서울대학교병원제공의학상세정보 결핵 편 이정연 심태선 체외 검사를이용한결핵감염의진단 제 9 장첨부서류 본학술연구용역사업의성과로기술된게재된학술지논문전체사본 ( 게재허가를받은경우게재 증명서 ) 과산업재산권등록증 ( 또는출원서 ) 사본을반드시첨부할것. 35