발간등록번호 1 1-1 4 8 5 2 3-3698- 1 N IE R - R P 2 1 8-2 4 1 생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 환경건강연구부위해성평가연구과 엄익춘, 심일섭, 유진, 임성광, 김혜원, 김웅, 김필제, 유승도 218
목차 목 차 목차 i 표목차 iii 그림목차 v Abstract vii Ⅰ 서론 Ⅱ 연구내용및방법 시험물질및연구개요 세포독성평가 가 세포주 나 세포손상평가 다 세포군집형성시험 동물호흡기독성평가 가 실험동물 나 기관내점적시험방법 다 흡입노출시험방법 라 일반증상관찰및체중측정 마 기관지폐포세척액채취및폐독성분석 바 조직병리학적분석 통계처리 독성스크리닝기법 가 급성흡입독성및세포독성자료의문헌조사 나 폐세포 세포를이용한 실험데이터생산 다 상관성분석 Ⅲ 연구결과및고찰 세포실험을위한시험물질조사 i
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 가 물리 화학적특성및유해성 세포독성평가결과 가 세포독성스크리닝 나 세부농도세포독성시험 동물호흡기독성평가결과 가 동물실험용시험물질선정 나 기관내점적시험결과 동물무게및장기무게 혈액생화학적분석 폐세포손상분석 폐염증세포분석 조직병리학적분석 다 흡입노출연구결과 단회흡입노출에의한영향 반복흡입노출에의한영향 독성스크리닝기법 가 급성흡입독성및세포독성자료의문헌조사 나 폐세포 세포를이용한 실험데이터생산 다 상관성분석 Ⅳ 결론 참고문헌 부록 ii
목차 표목차 <Table 1> Calculated IC5 values ( μg /ml) by MTT assay results and information of 14 listed candidates for chemical selection 17 <Table 2> Summary of physical-chemical properties and toxicological information of Glycolic acid (GA) 18 <Table 3> Summary of histopathological lesions of intratracheally instilled glycolic acid (GA) exposure groups 23 <Table 4> Summary of histopathological lesions of intratracheally instilled glycolic acid (GA) recovery group rats 25 <Table 5> Analysis of Glycolic acid concentration in each chamber in acute exposure 27 <Table 6> Analysis of aerosolic particle size distribution in GA acute exposure 31 <Table 7> Summary of histopathological lesions of acutely inhaled Glycolic acid (GA) exposure group 33 <Table 8> Summary of histopathological lesions of acutely inhaled Glycolic acid (GA) recovery group 34 <Table 9> Analysis of aerosolic particle size distribution in GA subacute exposure 35 <Table 1> Summary of histopathological lesions in repeatedly inhaled exposure group with Glycolic acid (GA) 4 <Table 11> Summary of histopathological lesions in repeatedly inhaled recovery group with Glycolic acid (GA) 41 <Table 12> Number of acute inhalation toxic substances according to GHS classification 42 <Table 13> List of survey items for LC 5 and IC 5 data 43 <Table 14> Cytotoxic data of A549 cell for inhalation toxic substances 43 <Table 15> Classification of substances for acute inhalation toxicity 46 iii
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) <Annex table 1> LC 5 (dust/mist exposure) and IC 5 (lung and bronchial cells) 73 <Annex table 2> LC 5 (gas/vapor exposure) and IC 5 (lung and bronchial cells) 76 iv
목차 그림목차 <Figure 1> Histological sections of nasal cavity 8 <Figure 2> Scheme for identification of in vitro-in vivo correlation 9 <Figure 3> Cell viability (MTT assay) of human lung epithelial cells was tested for toxicity screening with 6 selected chemicals 12 <Figure 4> LDH leakage effects of 6 chemicals on human lung epithelial cells membranes 13 <Figure 5> Cell viability (MTT assay) treated with specific concentration of 5 chemicals on human lung epithelial cells 14 <Figure 6> LDH leakage assay with specific concentration of 5 chemicals on human lung epithelial cell membranes 15 <Figure 7> Inhibition of cell colony formation induced by 6 different chemicals in human lung epithelial cells 16 <Figure 8> Body weight changes in rats treated with glycolic acid by intratracheal instillation 19 <Figure 9> Analysis of pulmonary toxicity using bronchoalveolar lavage fluid (BALF) after intratracheal instillation of glycolic acid 2 <Figure 1> Pulmonary inflammation induced by glycolic acid (GA) intratracheal instillation in rats 21 <Figure 11> Analysis of pulmonary toxicity by percent PMN in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) 22 <Figure 12> Histological features of representative lung of each ITI study group 24 <Figure 13> Histological features of representative lung of each ITI recovery group 26 <Figure 14> The change of body weight measured in acutely inhaled rats with aerosolic GA 28 <Figure 15> Pulmonary toxicity induced by acute inhalation of Glycolic acid (GA) in v
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) rats 29 <Figure 16> Pulmonary inflammation identified by the BALF cell polymorphonuclear leukocytes (PMNs) count 29 <Figure 17> Pulmonary inflammation induced by Glycolic acid (GA) acute inhalation exposure in rats 3 <Figure 18> Analysis of aerosolic particle count in chamber during acute inhalation exposure 31 <Figure 19> The body weight changes by sub-acute inhalation of aerosolic GA for 5 weeks 35 <Figure 2> Analysis of pulmonary cytotoxicity using bronchoalveolar lavage fluid (BALF) 36 <Figure 21> Pulmonary inflammation induced by Glycolic acid (GA) sub-acute exposure in rats 37 <Figure 22> Analysis of aerosolic particle size distribution in subacute exposure38 <Figure 23> Analysis of aerosolic particle count in chamber during subacute inhalation exposure 38 <Figure 24> In vitro-in vivo correlation (total 38 substances) 45 <Figure 25> In vitro-in vivo correlation (gas or vapor, 17 substances) 46 <Figure 26> In vitro-in vivo correlation (dust/mist, 21 substances) 47 <Figure 27> In vitro-in vivo correlation (dust/mist) 47 <Figure 28> Modified flow chart of inhalation toxicity screening method 49 vi
Abstract μ μ μ μ β α β α vii
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 2.35±.46, 9.9±1.79, 49.5±8.5 mg/m 3 α β r 2 =.3916) r 2 =.6195) viii
Ⅰ 서론 우리는일상생활속에서수많은화학물질에노출되며그로인해발생가능한여러유해영향또한꾸준히제기및보고되고있다 그럼에도불구하고현존하는수많은화학물질에비해독성정도가정확하게알려진화학물질은충분치않으며 특히흡입노출에인한유해영향연구에대한결과는시험적제약으로인해매우부족한실정이다 인체에노출로인한우려가있는화학물질의정확한독성정보확보가시급하며 따라서우리는호흡기를통한노출의우려가높으나그로인한흡입독성이알려지지않은물질을선별해독성영향을파악하는데주력해왔다 금년에는 Benzotriazole (BT), Sodium benzoate (SB), Sodium gluconate (SG), Phenoxyethanol (PE), Trisodium nitrilotriacetate (NTA), Trichloroisocyanuric acid (TCCA) 6종의화학물질과작년시험물질중하나인 Glycolic Acid (GA) 를대상으로세포독성및흡입독성연구를통해그유해성을확인하고자하였다 흡입독성연구의우선순위선정은세포독성시험결과및물질사용정보를 기반으로하였으며 그결과선정된 는무색무취고체상의물질로개인위생용품 화장품 세정제 세척제및용제등의용도로사용되어누구나생활속에서자주접할가능성이있는화학물질중하나이다 또한 는랫드나토 끼에경구독성이있고심한눈손상및피부자극성이유발가능하다고보고 되었으며 흡입노출로인한독성영향도보고되었으나 에따른반 복노출실험은전무한실정이다 한편 세포독성과동물독성결과의상관성확인을위한연구는다방면으로 진행되어왔으나 아직은유전독성 경구독성 피부독성등의분야로한정적이다 특히 경구독성의경우 급성독성값인 값과세포독성값인 값의 상관성을확인하여 급성동물실험의시작투여량을결정할수있는방안이제시 되었으며 로제공되기도하였다 최근엔흡입독성을예측하기위한대체시험법으로의접근이시도되고있다 또한 미국 유럽등의선진국에서도고속대량스크리닝기법 방법혹은계산독성학기법등의여러대체시험법을통해동물실험을감
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 소하고자하는추세이며 앞으로도이러한경향은지속될것으로예상된다 따라서우리도여기에맞추어연구방향을설정할필요가있다 년도에제안한흡입독성스크리닝기법은화학물질의흡입독성동물실험의우선순위를결정할수있는도구로활용될것으로기대된다 본연구에서는추가적인세포독성결과및동물독성결과의문헌조사및실험을통해흡입독성스크리닝기법을보완하고자하였다 이를통해고비용및장기간이소요되는흡입동물실험을저감시키는데스크리닝기법의활용성을제고하고자하였다 2
Ⅱ. 연구내용및방법 Ⅱ 연구내용및방법 시험물질및연구개요가. 시험물질본실험에서시험물질로사용된 Benzotriazole (BT), Sodium benzoate (SB), Sodium gluconate (SG), Phenoxyethanol (PE), Trisodium nitrilotriacetate (NTA), Trichloroisocyanuric acid (TCCA) 등의시험물질 (Sigma-Aldrich) 을구입하였다. 나. 연구개요 217년도에제작한흡입독성스크리닝기법흐름도에준하여흡입독성시험물질선정을위해, 생활화학제품내포함된화학물질중그흡입독성을연구해야할필요성이있다고판단한 6개의물질을선정하여폐세포에처리, 세포손상정도와그원인을분석하였다. 세포실험결과및독성정보를토대로흡입시험을수행하기적합한물질을선정하여, 기관내점적, 단회및반복흡입노출시험을수행하였다. 이를통해본시험물질이에어로졸형태로흡입시실험동물의호흡기에독성을나타내는지의여부와호흡기독성및독성발생의원인을연구하고자하였다. 세포독성평가 가. 세포주인체폐포상피세포주 (human alveolar epithelial cells) 인 A549 세포를한국세포주은행 (Korean Cell Line Bank) 를통해분양받은세포독성시험에사용하였다. 이세포는세포배양기 (5 % CO 2, 37 ) 에서배양하였으며, 배지로는 1 % 3
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) fetal bovine serum 과함께 1 % penicillin streptomycin 를넣은 RPMI 164 (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA) 을사용하였다. 나. 세포손상평가 6종의시험물질처리시폐포상피세포 A549의생존율은미토콘드리아손상지표에해당하는 3-(4,5-dimethylthialzol- 2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 시험 13 로확인하였고, 배지내의젖산탈수소화효소 (Lactate dehydrogenase, LDH) 14 의활성을측정하여세포막의손상정도를알아보았다. 15 독성시험수행시 6가지물질을동일하게작년보고서에서제시한바와같이 1, 1, 1, 1,, 5, µg/ml 의농도로세포에 24 시간동안노출시켰다 16. 이후독성변화양상이급격히떨어져서정확도가상대적으로떨어지는물질의경우농도구배를세부설정하여독성시험을실시하였다. 세포독성실험수행시위상차현미경을통해세포모양변화및세포형태변화를관찰하였다. 다. 세포군집형성시험세포성장과함께세포분열및군집형성능력을평가하기위해군집형성시험 (Clonogenic assay) 을수행하였다. 본시험에서는 6 well plate 에 2 cells/well 로 A549 세포를 seeding하여 24 시간배양후, 7일간 6 종의물질을노출시킨뒤배지를버리고메탄올로세포를고정시켰다. 세포고정후.1 % 의 Crystal violet 과 2 % 의메탄올을혼합한용액으로세포를염색하여관찰하였다. 동물호흡기의독성평가 가. 실험동물실험동물로는국 내외에서보편적으로흡입독성및폐독성평가용으로널리사용되는 6 주령의특정병원체부재 (Specific pathogen free, SPF) 수컷 Sprague-Dawley 랫드 (Orient bio Inc., Sungnam, South Korea) 를구입하였다. 1 주일간순화후발육이상이나타나지않고건강하다판단되는개체를선별하여사용 4
Ⅱ. 연구내용및방법 하였다. 사육환경에대한조건은온도 22 ± 3, 상대습도 5 % ± 2 %, 조명 12 시간 ( 인공조명, 오전 9 시 오후 9 시 ) 으로하며물과사료는자유롭게섭취하도록하였다 (OECD TG에서명시한바를따름 ). 순화기간동안개체의건강을확인하며체중을측정한후무작위법을통해평균체중에가까운개체를선택하여군분리를실시하였다. 군별평균체중에대한차이확인은 ANOVA 검정 (Tukey's multiple comparison test) 을통해이루어졌다. 랫드개체식별을위해사육케이지별로 tag 표시법과함께피모색소표시법을함께이용하였다. 모든실험동물의사육및실험을위해국립환경과학원실험동물윤리위원회의승인 (NIER-218-1) 을받은후제시된실험동물관리지침에따라실시하였다. 나. 기관내점적시험방법 기관내점적방법 Isofluran을이용하여 7주령의랫드를마취후, 개체를보정틀에고정하여경구를통해기관지로시험물질을주입하는기관내점적법 (Intratracheal instillation, ITI) 으로 GA를투여하여이물질의폐독성을평가하였다. GA는각각군별 2 마리씩저농도군, 중농도군, 고농도군 (.1 mg/b.w. kg, 1 mg/b.w. kg, 1 mg/b.w. kg) 에기관내점적투여하였고, 대조군에는용매로사용한식염수를투여하였다. 노출하루후반수를부검하였으며, 7일간회복기간을가진남은반수의실험동물을부검하여대조군대비나타나는폐독성을다양한지표를통해측정하였다. 다. 흡입노출시험방법 흡입노출방법랫드를전신흡입노출장치내에넣어에어로졸발생기를통해시험물질을챔버의공기중에에어로졸의형태로분사시켜랫드의호흡기로노출을시켰으며, 챔버의환기는시간당 12 회로설정하였다. GA의급성독성을확인하기위해저농도군, 중농도군, 고농도군 (2, 1, 5 μg /m 3 ) 을설정한후에어로졸로분사하여 4 시간동안각군별 2 마리의랫드에게노출을시켰다. 노출당일에 5
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 각군당 1 마리씩, 그리고 7 일후에각군당 1 마리씩을부검하여대조군대비폐독성을확인하였다. GA의아급성노출에의한독성을확인하기위해진행한반복흡입노출시험의경우저농도군, 중농도군, 고농도군 (2, 1, 5 μg /m 3 ) 으로설정한후에어로졸로분사하여하루 6 시간, 주당 5 일씩, 4 주간 (28 일 ) 노출시켰다. 군당 2 마리씩노출진행후, 마지막노출하루뒤에실험동물의반수를부검하였으며, 7 일간의회복기간이지나남은반을부검해대조군대비나타나는폐독성을확인하였다. 노출환경모니터링시험물질의노출기간동안각군별흡입챔버내환경조건들을모니터링하였다. 흡입챔버내환경조건들 ( 습도, 온도, 공기유속및압력등 ) 은환경모니터링장치 (Model VT3-X15, Sibata Scientific Technology LTD, Saitama, Japan) 로연속모니터링하였다. 노출중흡입챔버내 GA 노출농도측정은 Quartz Fiber 필터로포집하여포집전후필터의무게를비교하는방법 (Weighing) 으로측정하였다. 노출중발생시킨시험물질의입자크기는 Portable aerosol spectrometer (Model 1.19, Grimm aerosol technik, GmbH & Co. KG, Ainring, Germany) 를사용하여측정하였다. 또한, 입도분석은다단충격기 (AN-2) 를통해각여과단별여지 (MDI-135-43, Φ8) 를흡입유량 25 L/min으로급성흡입노출에서는 2, 5, 6 분간, 그리고아급성흡입노출시에는 2, 6, 18 분간채취하고포집전후필터의무게를비교하는방법으로분석하여, 공기역학중량평균지름 (MMAD; Mass Median Aerodynamic Diameter) 을구하였다. 라. 일반증상관찰및체중측정실험기간및회복기간동안매일 1회이상동일한시간대에모든실험동물을대상으로하여일반상태의변화, 사망동물의유무, 독성증상발현및시험물질노출로의해발생가능성이있는일반증상에대해관찰하였다. 일반적독성증상지표로관찰된것으로는피부, 피모상태, 호흡기계, 순환계, 안구, 점막, 신경계, 행동양식, 진전, 경련, 운동량, 설사, 타액분비, 기면, 수면과혼수상태등이관찰되었다. 시험에사용된모든실험동물의체중측정은매주 2 회각각개 6
Ⅱ. 연구내용및방법 체별로행하였다. 마. 기관지폐포세척액채취및폐독성분석랫드를 isoflurane 으로흡입마취시키고부검하여폐독성및염증평가를위해기관지폐포세척액 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 17 을채취하였다. 기관지에실린지를삽입한후 phosphate-buffered saline(pbs) 를 5 ml 주입및채취하는방법으로총 25 ml(5 회반복채취 ) 를채취하였다. 처음실시한 5 ml은원심분리후, 상등액을따로분리하여세포독성지표인 Lactate dehydrogenase (LDH) 활성과 Total protein 농도, 그리고염증사이토카인인 Interleukin-1beta (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6), Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), Macrophage Inflammatory Protein2 (MIP-2) 및 Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) 을분석하였다. 총세포수의측정은총 5 회에걸쳐채취한기관지폐포세척액을모두혼합하여 Vi-Cell XR analyzer (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) 로측정하였다. 측정된세포농도에따라모든개체의기관지폐포세척액내세포를 2 1 5 cells/ml의농도로맞춰 6 μl 주입하고 Shandon cytospin (Shandon, pittsburgh, PA, USA) 에원심분리후 Diff-Quik으로염색하여검경하였다. 실험물질에의한폐세포의독성영향분석을위해채취한기관지폐포세척액내의총단백질농도를 Bicinchoninic acid (BCA) protein assay 정량법 (Intron, Korea) 을통해측정하였으며, BALF내젖산탈수소화효소 (LDH) 는 EZ-LDH Cell Cytotoxicity Assay Kit (DAEILLAB SERVICE CO., LTD, Korea) 를사용하여분석하였다. 염증사이토카인인 IL-6, IL-1β, TNF-α, MCP-1(R&D systems, minneapolis, MN, USA) 및 MIP-2(Invitrogen, Korea) 는 ELISA Kit를이용하여매뉴얼에따라분석하였다. 바. 조직병리학적분석동물실험후에모든시험동물은개체별로부검하였으며, 부검당시육안관찰을동시에진행하였다. 장기는적출즉시무게를측정하고 1 % 중성포르말린에고정하였다. 고정한폐장및비강조직을 SOP에따라삭정후일반적인 7
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 조직처리를하고파라핀으로포매하였다. 비강은탈회한후 SOP에따라네부분 (level 1-4) 으로삭정하여조직을만들었다 (Figure 1). 박절기를이용하여파라핀으로포매된조직을 3 5 μm의두께로절편을제작하고 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색을실시후, 광학현미경 (Olympus, BX41, Japan) 을통해조직병리학적검사를실시하였다. 각각의병변에대해그병변의정도를정상 (No specific lesion, ), 아주미약함 (minimal, 1+), 미약함 (mild, 2+), 중정도심함 (moderate, 3+), 심함 (severe, 4+) 으로각각등급을매겨평가하였다 18,19,2. <Figure 1> Histological sections of nasal cavity. 통계처리모든결과값은평균 ± 표준오차의상태로표시하였다. 각항목의분석결과에대한통계학적분석은등분산일때 One-way analysis of variance (ANOVA) 검정을실시하였으며, ANOVA 검정에서유의성이나온경우에한해 Student's t-test를 P 값이 <.5, <.1, <.1 수준에서실시하였으며, 이때통계프로그램으로는 GraphPad prism 5. (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 을사용하였다. 8
Ⅱ. 연구내용및방법 독성스크리닝기법가. 급성흡입독성및세포독성자료의문헌조사흡입독성스크리닝기법을보완하기위해 GHS 흡입급성독성분류물질을확인하였다. 확인한물질을대상으로국내외보고서, 데이터베이스, 논문등의문헌을이용하여동물흡입급성독성값및세포독성값을확인하였으며, 정리한데이터를이용하여각동물실험과세포실험의독성값간의상관성을확인하는작업을수행하였다 (Figure 2). <Figure 2> Scheme for identification of in vitro-in vivo correlation 나. 폐세포 A549 세포를이용한 cell viability 실험데이터생산 In vitro-in vivo 데이터의상관성을확인하기에는데이터가부족하여이를보충하기위해서세포독성실험을수행하였다. 217년도에제시한세포독성측정방법대로대표적인인체폐세포인 A549 세포주및 WST-1 방법을이용하였으며, 물질농도는 5,μg/ml로먼저실험한후, 추가실험이필요한경우세부농도실험을통해화학물질의 IC 5 값을도출하였다 21. 다. In vitro-in vivo 상관성분석 수집및실험을통해얻은흡입급성독성값및세포독성값데이터를근거로, 9
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 회귀분석 (regression analysis) 을통해상관성을확인하였다. 이를위해 GraphPad prism 5. (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) 을사용하였 다. 1
III. 연구결과및고찰 Ⅲ 연구결과및고찰 세포실험을위한시험물질조사가. 물리 화학적특성및유해성생활화학제품내포함된화학물질중문헌조사를통해연구의필요성이보이는시험물질을 6종의독성평가대상물질로선정하였다. 이들선정한 6종의시험물질은 Benzotriazole (BT), Sodium benzoate (SB), Sodium gluconate (SG), Phenoxyethanol (PE), Trisodium nitrilotriacetate (NTA), Trichloroisocyanuric acid (TCCA) 로, 이들에대한물리, 화학적특성및유해성정보를확인하였다 (Table 1). 11
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 세포독성평가결과 가. 세포독성스크리닝 6가지물질각각의미토콘드리아손상으로인한세포독성을확인하기위해 A549 세포에이물질들을 24 시간노출하고미토콘드리아손상도를측정하는 MTT assay 및세포막손상도를측정하는 LDH assay를수행하였다. 넓은농도범위에서 ( ~ 5, μg /ml) 각화학물질을세포에노출시켰을때세포생존율의변화를관찰한결과, SG를제외한모든시험물질에대해시험물질농도증가에따른세포생존율의감소유발을확인하였다. 세포생존율실험결과 6 가지물질중에서는 TCCA, BT, SB, PE, NTA, SG 순서로독성이높게관찰되었다 (Figure 3). <Figure 3> Cell viability (MTT assay) of human lung epithelial cells was tested for the toxicity screening with 6 selected chemicals. A549 cells were treated with chemicals for 24 h. (One-way ANOVA test, *,**,***P <.5,.1,.1 vs. control) 12
III. 연구결과및고찰 인체폐상피세포주인 A549 세포에 24시간동안넓은설정농도값에서 ( ~ 5, μg /ml) 6종의화학물질을노출시켜세포막손상시험 (LDH assay) 에의한세포독성을확인한결과 BT, TCCA, NTA, PE 순으로독성이관찰되었으며, SB와 SG에서는처리농도에따른변화가나타나지않았다 (Figure 4). <Figure 4> LDH leakage effects of 6 chemicals on human lung epithelial cell membranes. A549 cells were treated with chemicals for 24 h. Mean ± SE (One-way ANOVA test, *,**,***P <.5,.1,.1 vs. control) 나. 세부농도세포독성시험정확한 IC 5 값을도출하기위해독성이관찰되지않은 SG를제외한나머지 5 개시험물질에대해세부농도를설정하여세포독성시험을진행하였으며, 세포생존도및세포막손상시험에대한세포독성결과는 Figure 5와 Figure 6과같이나타났다. 그결과, 세포생존율은농도의존적으로감소하였으며이때얻은 IC 5 값은 TCCA < BT < PE < SB < NTA 순으로관찰되었으며, 그값은각각 127.9, 563.8, 1,449, 1,72, 2,164 μg /ml 로측정되었다 (Figure 5). 세포막손상관찰결과 TCCA는세포생존율결과에비해감수성이예민하지않게나왔으며, 13
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) BT 와 SB 에대해서는세포생존율과는달리어떠한변화도관찰되지않았다. 하 지만 PE 와 NTA 의경우세포생존율과같이세포막손상정도도농도의존적으 로확인되었다 (Figure 6). <Figure 5> Cell viability (MTT assay) treated with specific concentration of 5 chemicals on human lung epithelial cells. A549 cells were treated with each chemicals for 24 h. (One-way ANOVA test, *,**,***P <.5,.1,.1 vs. control) 14
III. 연구결과및고찰 <Figure 6> LDH leakage assay with specific concentration of 5 chemicals on human lung epithelial cell membranes. A549 cells were exposed to each chemicals for 24 h. Mean ± SE (One-way ANOVA test, *,**,***P <.5,.1,.1 vs. control) 15
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 한편, 6종의실험물질을가지고세포군집시험을한결과, SG를제외한나머지 5종의물질에서농도의존인군집수감소가관찰되었으며, 이중에서도특히 TCCA, BT, PE, NTA에서군집의수가현저히억제됨이관찰되었다 (Figure 7). <Figure 7> Inhibition of cell colony formation induced by 6 different chemicals in human lung epithelial cells. A549 cells were exposed to chemicals for 7 days. Mean ± SE (Student s t-test, ** p <.1, *** p <.1 vs. control. 16
III. 연구결과및고찰 동물호흡기독성평가결과 가. 동물실험용시험물질선정흡입대상물질을선정하기위해후보시험물질들의독성정보및사용에대한정보, 그리고세포독성정보등이고려되었다. 동물의흡입독성을연구할물질을선정하는데올해세포독성실험을수행한 6종의화학물질외에작년도에세포독성실험을수행한 8종의화학물질도포함, 총 14종의물질을고려하여이중에서가장적합하다판단한 Glycolic acid (GA) 를선정하였다 (Table 1, Table 2). GA는또한, 세정제, 세척제, 계면활성제, 용제등으로다양하게사용되어생활중빈번히노출가능한물질이었으며 ( 화학물질안전원자료 ), 특히제품특성상일상에서흡입노출가능성이높아연구가필요하다고판단되었다. <Table 1> Calculated IC 5 values ( μg /ml) by MTT assay results and informations considered in the 14 listed candidates for chemical selection. 연번 물질명 CAS No. 흡입독성값 (LC5) 유독물여부 제조수입량 ( 톤 ) 사용제품 IC5 (µg/ml) 선정제외이유 1 2 Cetyltrimethyl ammonium bromide Cetylpyridinium chloride 57-9- 123-3-5 3 Cinnamaldehyde 14-55-2 4 Triclosan 338-34-5 5 Trichloroisocyanur ic acid 87-9-1 6 Glycolic acid 79-14-1.18 mg/l/.5hr (LOEC)¹).54 mg/l/4hr²) >2.3 mg/l/4hr³).286 mg/l/4hr¹) >.9 mg/l, <.29 mg/l 4hr³) O 3 세정제 1.39 낮은수용해도 X 23 X 6 O 13 > 5.26 mg/l/4hr 1) X 372 세정제, 탈취제, 소독제, 섬유유연제세정제, 합성세제, 코팅제세정제, 탈취제, 소독제, 합성세제 8.18 '17 년도시험물질 27.18 낮은수용해도 71.34 기시험물질 O 293 세정제, 소독제 127.9 낮은수용해도 세정제, 세척제, 계면활성제, 용제 44.8 '18 년도시험물질 7 Benzyl alcohol 1-51-6 >4.178 mg/l/4hr¹) X 4,253 세정제, 합성세제, 섬유유연제, 접착제 489.9 독성비교시우선순위낮음 8 1,2,3-Benzotriazole 95-14-7 1,9 mg/m3⁴) X 643 세정제 563.8 독성비교시우선순위낮음 9 Sodium hydroxide 131-73-2 - O 911,132 1 Phenoxyethanol 122-99-6 자료없음 X 3,482 11 Sodium benzoate 532-32-1 12 Trisodium nitrilotriacetate 13 Sodium nitrite 7632-- >12,2 mg/m3/4hr¹) X 2,92 564-31-3 >5 mg/l/4hr¹) X 211.95 mg/l/4hr¹) 14 Sodium gluconate 527-7-1 자료없음 X 7,35 세정제, 표백제, 합성세제, 섬유유연제세정제, 탈취제, 소독제, 합성세제, 코팅제, 접착제, 방충제세정제, 탈취제, 소독제, 합성세제, 섬유유연제, 코팅제, 김서림방지제세정제, 합성세제, 섬유유연제 631.9 독성비교시우선순위낮음 1,449 독성비교시우선순위낮음 1,72 독성비교시우선순위낮음 2,164 독성비교시우선순위낮음 O 8,517 세정제, 합성세제 2426 독성비교시우선순위낮음 세정제, 표백제, 합성세제 > 5, 독성비교시우선순위낮음 17
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) ¹) European Chemicals Agency (ECHA) ²) Scientific Committee on Consumer Safety (SCCS) ³) United States Environmental Protection Agency (US EPA) 4 ) Hazardous Substances Data Bank (HSDB) <Table 2> Summary of physical-chemical properties and toxicological information of Glycolic acid (GA). 구조 : 분자식 : C 2 H 4 O 3 MW: 76.5 외관 : 무색투명의고체 mp: 79.5 d: 1.26 g/cm 3 at 2 vp:.2 mmhg at 25 bp: 1 (decompose) sol.( 물 ): 1, g/l at 25 Glycolic acid (CAS No. 79-14-1) 급성독성 아만성독성 유전독성 분해성 환경독성 경구 (LD 5, rat, 7% aq solution): 1,938 mg/kg/bw (US EPA) 경구 (LD 5, rat, 5% aq sloution): 1,95 mg/kg (NIOSH) 경구 (LD 5, guinea pig, 5% aq solution): 1,92 mg/kg (NIOSH) 경피 (LD 5, rat): 자료없음흡입 (LC 5, rat): 7.7 14 mg/l/4hr 흡입 (LC 5, rat): 3.6 mg/l/4hr( ), 5.2 mg/l/4hr( )(US EPA) 기타 - 심한눈손상또는자극성물질 / 피부부식성또는자극성 (7% 용액 )(US EPA) 경구 (NOAEL, rat): 15 mg/kg b.w. 9 days(us EPA) Ames 시험 : 음성 (HSDB) 염색체이상시험 : 음성 (HSDB) 소핵시험 : 음성 (HSDB) 기타 : 자료없음미생물분해성 : 2주내 86% 분해 (NITE) 비생물적분해 : 5x1 5 OH radical/cm 3 농도의대기중반감기 3.44일, 일반적인조건에서분해성낮음 (HSDB) 기타 : 자료없음어류 : Pimephales promelas, 96hr-LC 5 164 mg/l(us EPA) 무척추 : Daphnia magna, 48hr-EC 5 141 mg/l(us EPA) 조류 : Pseudokirchneriella subcapitata, 72hr-EC 5 21.6 ~ 44 mg/l(us EPA) 농축성 (BCF): 3, Log K ow (-1.11)(HSDB) * NITE: National Institute of Technology and Evaluation. Tokyo, Japan 18
III. 연구결과및고찰 세포실험을통해확인된 GA 의폐세포내독성작용을확인하기위해서랫드를 이물질에각각기관내점적방법과전신흡입노출챔버를통한에어로졸분사방 법으로노출시켜나타나는임상증상및호흡기계의독성발현을확인하였다. 나. 기관내점적시험결과 동물무게및장기무게 GA가폐에미치는독성영향을알아보기위해랫드에 GA를저농도, 중농도, 고농도로설정하여 (.1 mg/b.w. kg, 1 mg/b.w. kg, 1 mg/b.w. kg) 기관내점적기법으로투여하고, 노출 1 일및 7 일후에부검을진행하였다. 그결과실험기간동안특이적임상증상및사망동물은관찰되지않았으나, 체중변화에대해서는고농도에서 2 일차부터미미하게감소하는경향이관찰되었으며, 기관내점적후 7 일차에유의성이관찰되었다 (Figure 8). 하지만, 부검시랫드의상대장기무게에유의한변화는관찰되지않았다. <Figure 8> Body weight changes in rats treated with glycolic acid by intratracheal instillation. Results show the body weight change from when the intratracheal instillation was held to day 7 (recovery time). Mean ± SE (Student s t-test, ** p <.1, *** p <.1 vs. control. 19
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 혈액생화학적분석 GA를기관내점적한노출시험에서혈구및혈청의생화학적검사를수행하여백혈구, 적혈구등 23 가지항목을분석하였다. 검사결과전지표모두정상범위로나왔으며대조군대비유의성이나타나지않음을확인하였다. 폐세포손상분석세포손상지표인젖산탈수소효소 (LDH) 를기관지폐포세척액에서분석한결과, 노출군의경우고농도에서증가하는경향이보이나유의성은나타나지않는반면, 회복군인 7일차의경우고농도에서뚜렷한증가가일어남이관찰되었다. 또한, 폐기능손상지표인총단백질 (TP) 의경우에는노출군과회복군의고농도에서증가하는경향이관찰되었으나유의성은나타나지않았다 (Figure 9). <Figure 9> Analysis of pulmonary toxicity in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) after intratracheal instillation of glycolic acid. (A) Lactate dehydrogenase (LDH), (B) Total protein (TP) in BALF. Mean ± SE (Student s t-test), ** p <.1 vs. control. 2
III. 연구결과및고찰 폐염증세포분석 GA에기관내점적노출후폐염증과기도과민반응성 22 및폐섬유화 22,23,24 관련대다수의인자는시험물질노출에따른변화를관찰할수있었다 (Figure 1). 사이토카인을측정한 5개인자 (IL-1β, TNF-α, MCP-1, MIP-2, IL-6) 중 IL-6만유일하게 GA 기관내점적에따른 BALF 내변화가관찰되지않았다. TNF-α, MCP-1, MIP-2의경우회복군의경우고농도로감에따라유의한증가가관찰되었으며, IL-1β의경우노출군및회복군의고농도에서증가하는경향이보였으나, 노출군의중농도에서만유의성이관찰되었다. <Figure 1> Pulmonary inflammation induced by glycolic acid (GA) intratracheal instillation in rats. (A) Interleukin-1beta (IL-1β), (B) Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), (C) Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) (D) Macrophage inflammatory protein-2 (MIP-2) in BALF. Male rats were once intratracheally installed with GA and recovered for 7 days. Mean ± SE. (one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison test, *, ** P.5,.1 vs. control). 21
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 염증세포인다형핵백혈구 (PMNs) 가 GA 노출군의농도군에서유의성은나타나지않았으나증가하는경향성이나타났다. GA를처리한회복군의경우, 저농도, 중농도, 그리고고농도군에서대조군대비증가하는경향이보다뚜렷하게관찰되었으며, 고농도에서는대조군대비유의한증가가나타나며노출군대비회복군의염증세포 25,26,27 가뚜렷이증가함을확인할수있었다 (Figure 11). 이에따라 GA는기관내점적으로인한노출후에 7일간의시간이경과함에따라회복이일어나지않음을확인할수있었다. <Figure 11> Analysis of pulmonary toxicity by percent PMN in bronchoalveolar lavage fluid (BALF). Con-R: Control in recovery group. High-R: High dose treated recovery group. Mean ± SE (Student s t-test), ** p <.1, *** p <.1 vs. control. 조직병리학적분석 Glycolic acid를기관내점적한후 1일에실시한폐장에대한조직검사결과시험물질에의노출과관련된독성반응이농도상관성있게관찰되었다. 시험물질과관련되어나타난폐장에서의독성변화는폐부종, 폐포염, 기관지및세기관지상피세포의괴사와탈락등으로저농도군이상에서모두관찰되었다 (Table 3). 폐부종의경우고농도흡입군의 3/5예에서관찰되었으며, 그정도도중등도까지심하게관찰되었다. 일부세기관지강내에서는호중구가차있는모습을보이는국소성폐포염이저농도군에서 2/5예, 중농도와고농도군에서각각 3/5예씩관찰되었으며, 그정도에있어서도저농도군에비해고농도군으로감에따라중등도이 22
III. 연구결과및고찰 상이관찰되어발생빈도와정도에있어농도상관성을나타내었다 (Table 3, Figure 12). 따라서, 국소성폐포염은폐부종과함께시험물질의기관내점적에의한독성변화로판단된다. 이와더불어기관지와세기관지상피세포의괴사가고농도투여군중폐포염과폐부종을나타낸동일한개체에서심한정도로관찰되어역시시험물질에의노출과관련이있는것으로판단된다. <Table 3> Summary of histopathological lesions of intratracheally instilled glycolic acid (GA) exposure groups. Organ/Histopathology Group Control Low Middle High Lung No. examined No specific lesion Alveolar macrophage aggregation, (multi)focal Grades: minimal Cell infiltration, mononuclear or mixed cells, perivascular Grades: minimal mild Pulmonary edema Grades: minimal mild moderate Inflammation, chronic active, bronchiolar/ alveolar bronchopneumonia, (multi)focal Grades: minimal mild Inflammation, acute, alveolar/interstitial, (multi)focal Grades: minimal mild moderate Cell necrosis and desquamation, bronchial/ bronchiolar epithelia Grades: moderate severe Inflammation, interstitial, granulomatous, focal Grades: minimal Vascular mineralization, focal Grades: minimal 5 2(4.) 1(2.) 1 2(4.) 2 (.) 2(4.) 1 1 (.) (.) (.) (.) 5 1(2.) 1(2.) 1 1(2.) 1 (.) (.) 2(4.) 1 1 (.) 1(2.) 1 1(2.) 1 5 2(4.) (.) (.) (.) 1(2.) 1 3(6.) 2 1 (.) (.) (.) 5 2(4.) (.)) 3(6.) 2 1 3(6.) 2 1 (.) 3(6.) 3 3(6.) 1 2 (.) (.) 23
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) <Figure 12> Histological features of representative lung of each ITI study group. Note the normal pulmonary morphology with bronchioles (b) and alveoli (a). In Low, note the focal acute inflammation with hemorrhage (circle) and also note the bronchiole filled with neutrophils (b). In Middle, note the multifocal inflammation around the terminal bronchioles (b) and in the associated alveolar ducts and alveoli (a). In High, note the diffuse fibrinous pulmonary edema (a) with severe necrosis of alveolar epithelia (arrows in b). H&E. Mag.=X1 Glycolic acid를기관내에단회점적한후 7일후에실시한폐장에대한조직검사결과시험물질에의노출과관련된독성반응이만성의형태로변화하여관찰되었다. 폐부종의경우고농도투여군의 1/5예에서심한정도로관찰되었으며, 만성폐포염은중농도및고농도투여군에서각각 2/5예와 5/5예에서관찰되었으며, 심한정도가농도상관성을나타내었다 (Table 4, Figure 13). 기관내점적노출군에 24
III. 연구결과및고찰 서관찰된기관지와세기관지상피세포의괴사와탈락은 1주일후에도고농도군에서는아직회복되지않은채관찰되었다 (Figure 13). 한편, 폐실질내큰포식세포의국소성침착과혈관주변백혈구의침윤은기관내점적회복시험에서중농도이상의시험물질노출군에서그빈도와정도에있어다소심하여진것으로판단되었는데, 이는시험물질노출에의해활성화된염증반응과관련이있는것으로추정된다. <Table 4> Summary of histopathological lesions of intratracheally instilled glycolic acid (GA) recovery groups. Organ/Histopathology Group Control Low Middle High Lung No. examined No specific lesion Alveolar macrophage aggregation, (multi)focal Grades: minimal mild Cell infiltration, mononuclear or mixed cells, perivascular Grades: minimal mild Pulmonary edema Grades: minimal mild moderate Inflammation, alveolar/interstitial, chronic, (multi)focal Grades: minimal mild moderate severe Pulmonary fibrosis, (multi)focal Grades: minimal mild Cell necrosis and desquamation, bronchial/ bronchiolar epithelia Grades: severe Polypoid inner growth, bronchus & bronchiole Grades: mild moderate Peribronchial/bronchiolar fibrosis & epithelial hyperplasia Grades: moderate 5 4(8.) (.) 1(2.) 1 (.) (.) (.) (.) (.) (.) 5 3(6.) 1(2.) 1 1(2.) 1 (.) (.) (.) (.) (.) (.) 5 1(2.)) 4(8.) 2 2 1(2.) 1 (.) 2(4.) 2 2(4.) 1 1 (.) (.) (.) 5 (.) (.) 4(8.) 2 2 1(2.) 1 5(1) 2 2 1 1(2.) 1 2(4.) 2 2(4.) 1 1 2(4.) 2 25
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) Histological features of representative lung of each ITI recovery group. In the lungs of normal and low dose group, no specific abnormal findings were noted. Multifocal chronic inflammation was noted in the middle and high dose groups. Note the alveolar fibrosis with mild inflammatory cell infiltration (circle). In the high dose group, pulmonary edema (R-High-1) was evident, and multifocal chronic inflammation with alveolar fibrosis (R-High-2) were observed in all animals. In R-High-1, also note the necrotic bronchiolar epithelia (b). In R-High-3, note the polypoid inner growth of bronchiolar lamina propria (b) with epithelial hypertrophy and hyperplasia. H&E. Mag.=X1. 26
III. 연구결과및고찰 다. 흡입노출연구결과 단회흡입노출에의한영향 ( 가 ) GA의농도설정및실측농도 GA를흡입했을시나타나는흡입독성을평가하기위해 4개의군으로 ( 대조군, 저, 중, 고농도군 ) 분리하여에어로졸의형태로 GA를공기중에분사시켜 4 시간동안수컷랫드에전신흡입노출시킨직후및 7일후의독성영향을부검을통하여살펴보았다. 챔버내 GA의실측농도는저, 중, 고농도군에서각각 18.1±1.53, 1±3.46, 458.3±2.89 mg/m 3 으로측정되었다 (Table 5). <Table 5> Analysis of Glycolic acid concentration in each chamber in acute exposure. Exposure group Mean (mg/m3) SD Low 18.1 1.53 Middle 1 3.46 High 458.3 2.89 ( 나 ) 동물무게및장기무게단회전신흡입노출챔버에서 GA 노출전후로랫드의장기무게및몸무게에변화가나타나는지관찰하였다. 대조군대비각군별체중및장기무게를비교한결과, 7일차에서모든군의체중이대조군대비감소하는추세를보였으나장기무게와함께유의한변화는관찰되지않았다 (Figure 14). 27
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) <Figure 14> The change of body weight measured in acutely inhaled rats with aerosolic GA. Body weight was measured from one day after the day of exposure. Mean ± SE. ( 다 ) 혈액생화학적분석 GA 단회흡입시험을통해채취한혈구및혈청의생화학검사를통해백혈구, 적혈구등 23가지항목을분석하였다. 검사결과이들지표는모두정상범위에해당되었으며대조군대비유의성은나타나지않았다. ( 라 ) 폐세포손상분석 GA를단회흡입노출시킨직후폐독성지표인 BALF 내총단백질수치는고농도군에서증가하는양상을보였으나유의성은나타나지않았으며, LDH 측정결과군간변화추이를확인할수없었다. (Figure 15). 28
III. 연구결과및고찰 <Figure 15> Pulmonary toxicity induced by acute inhalation of Glycolic acid (GA) in rats. Male rats were inhaled with aerosolic GA for 4 h. (Student s t-test, * P <.5 vs. control) ( 마 ) 폐염증세포분석염증관련지표인다형핵백혈구 (PMNs) 의경우시험물질노출에의해농도의존적으로증가하는경향이관찰되었으나, 노출군과회복군의고농도에서만통계적유의성을나타났다 (Figure 16). <Figure 16> Pulmonary inflammation identified by the BALF cell polymorphonuclear leukocytes (PMNs) count. Male rats were inhaled with glycolic acid by acute inhalation exposure. Mean ± SE. (one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison test, *, **, *** P.5,.1,.1 vs. control). 29
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 폐강내에서염증사이토카인들 ( 염증세포발생및활성화를유발의지표 ) 을측정해본결과 TNF-α는회복군고농도에서, MCP-1은노출군의고농도에서대조군대비유의한증가가일어남을확인할수있었다. 이결과를바탕으로처리이후회복기에서 TNF-α와연관된염증반응이일어나며, MCP-1에서는노출군에서미미한증가반응이일어났으나회복군에서는정상수치로돌아옴을확인할수있다 (Figure 17). <Figure 17> Pulmonary inflammation induced by Glycolic acid (GA) acute inhalation exposure in rats. (Mean ± SE). (one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison test, * P.5 vs. control). ( 바 ) 에어로졸입자분석 GA의에어로졸입자를분석한결과, 발생된에어로졸은저, 중, 고농도군모두에서 MMAD가 OECD Test guideline의기준에부합하는크기로분포되어있음을확인하였으며, 물질농도가증가함에따라에어로졸의입자크기와농도가증가됨을관찰할수있었다 (Table 6). 입자수측정기로농도별입자분포를측정한결과, 입자수가농도구배로증가하는것을확인할수있었다. 또한, 발생된입자수의대다수가폐내로침투할수있는 2.5 μm이하의크기로농도별로폐장내에유입되는 GA의양이뚜렷하게증가하여폐독성에영향을미칠것으로보인다 (Figure 18) 3
III. 연구결과및고찰 <Table 6> Analysis of aerosolic particle size distribution in GA acute exposure. Exposure group MMAD GSD Low 1.74 2.68 Middle 3.8 2.51 High 2.57 2.87 <Figure 18> Analysis of aerosolic particle count in chamber during acute inhalation exposure. Mean ± SE. ( 사 ) 조직병리학적분석 1) 비강비강을 4개의부분으로나누어조직검사를수행한결과노출군저농도군의 1/5예 level4부위에서상피층내작은낭이관찰되었으나그정도가미약하고후 31
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 각상피층내낭의형성은분비물의국소성축적에따른것으로생각되어시험물 질의흡입과는무관한것으로판단되었으며, 회복군에서도노출군과마찬가지로 특이할만한이상변화는관찰되지않았다 (Table 7, Table 8). 2) 폐장조직관찰노출군의폐장에서대조군과저농도군에서각각 1/5예씩큰포식세포의국소성침착이미약하게관찰되었으나, 이와같은소견은아무것도처치하지않은나이든랫드에서도자연적으로자주관찰되는소견이며, 본시험의대조군에서또한관찰된것으로보아시험물질의흡입과는관련성이없을것으로판단된다. 따라서시험물질흡입과관련된병리학적소견은관찰되지않았다 (Table 7). 회복군폐장의경우고농도흡입군의 1/5예에서폐실질내국소성섬유화가관찰되었으나, 국소적으로한군데에서만아주미약한수준으로관찰되어시험물질의흡입에의한영향으로는보기어렵다판단되며, 따라서흡입된시험물질의독성으로판단되는병리학적소견은관찰되지않았다 (Table 8). 32
III. 연구결과및고찰 <Table 7> Summary of histopathological lesions of acutely inhaled Glycolic acid (GA) exposure groups. Organ/Histopathology Group Control Low Middle High Nasal cavity Lung No Alveolar No. examined Level 1 No specific lesion Microcyst, intra-respiratory epithelium, present Level 2 No specific lesion Level 3 No specific lesion Level 4 No specific lesion Microcyst, intra-olfactory epithelium, present No. examined specific lesion macrophage aggregation, (multi)focal Grades: minimal Cell infiltration, mononuclear or mixed cells, perivascular Grades: minimal 5 4(8.) 1(2.) 5(1) 5(1) 5(1) (.) 5 4(8.) 1(2.) 1 (.) 5 5(1) (.) 5(1) 5(1) 4(8.) 1(2.) 5 3(6.) 1(2.) 1 1(2.) 1 5 4(8.) 1(2.) 5(1) 5(1) 5(1) (.) 5 5(1) (.) (.) 5 5(1) (.) 5(1) 5(1) 5(1) (.) 5 4(8.) (.) 1(2.) 1 33
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) <Table 8> Summary of histopathological lesions of acutely inhaled Glycolic acid (GA) recovery groups. Organ/Histopathology Group Control Low Middle High Nasal cavity No. examined Level 1 No specific lesion Microcyst, intra-respiratory epithelium, present Level 2 No specific lesion Level 3 No specific lesion Level 4 No specific lesion Microcyst, intra-olfactory epithelium, present Lung No. examined No specific lesion Alveolar macrophage aggregation, (multi)focal Grades: minimal Cell infiltration, mononuclear or mixed cells, perivascular Grades: minimal Inflammatory cell infiltration, focal, alveolar Grades: minimal Pulmonary fibrosis, focal, alveolar Grades: minimal 5 4(8.) 1(2.) 5(1) 5(1) 5(1) (.) 5 3(6.) (.) 1(2.) 1 1(2.) 1 (.) 5 5(1) (.) 5(1) 5(1) 5(1) (.) 5 4(8.) (.) (.) (.) 1(2.) 1 5 5(1) (.) 5(1) 5(1) 5(1) (.) 5 4(8.) 1(2.) 1 (.) (.) (.) 5 5(1) (.) 5(1) 5(1) 5(1) (.) 5 1(2.) 1(2.) 1 2(4.) 2 (.) 1(2.) 1 (2) 반복흡입노출에의한영향 ( 가 ) 반복흡입실험의 GA 실측농도단회흡입노출실험결과를바탕으로 GA의 28일반복노출흡입시험으로인한호흡기등의독성영향을확인하기위하여하루 6 시간, 일주일에 5 일간랫드에전신노출챔버안에서에어로졸을발생하여노출하였다. 랫드에노출되는물질의실측농도를알아보기위해챔버내 GA를포집하여중량법으로무게를측정한결과저, 중, 고농도에서각각 2.35±.46, 9.9±1.79, 49.5±8.5 mg/m 3 로노출농도가확인되었다 (Table 9). 34
III. 연구결과및고찰 <Table 9> Analysis of aerosolic particle size distribution in GA subacute exposure. Exposure group Mean (mg/m3) SD Low 2.35.46 Middle 9.9 1.79 High 49.5 8.5 ( 나 ) 동물무게및장기무게 GA 를반복흡입노출시키면서실험동물의체중을측정한결과노출후체중변 화에서유의성을확인할수없었다 (Figure 19). <Figure 19> The body weight changes by sub-acute inhalation of aerosolic GA for 5 weeks. Mean ± SE. 부검시적출한장기들의무게를측정한후상대장기무게를계산한결과, 노 출군및회복군에서장기무게의변화가유의하지않음을확인하였다. ( 다 ) 혈액생화학적분석 GA 흡입시험을 4 주간수행후채취한혈구및혈청의생화학검사를수행해 23가지항목을분석하였다. 검사결과모두정상범위를나타내었으며대조군대비유의하지않음을확인하였다. 35
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) ( 라 ) 폐세포손상분석 4 주간의아급성노출실험이후폐세척액내총단백질농도는노출군의고농도에서유의하게증가하였으며, 젖산탈수소화효소활성확인시험에서노출군에농도대비증가하는경향이관찰되었으나노출군과회복군모두에서통계적으로유의한증가는없었다 (Figure 2). <Figure 2> Analysis of pulmonary cytotoxicity using bronchoalveolar lavage fluid (BALF). (A)Lactate dehydrogenase(ldh) (B)Total protein. Mean ± SE. (One-way ANOVA, * p <.5) ( 마 ) 폐염증세포분석 4 주간의아급성흡입반복노출이끝난후부검을통해채취한 BALF 내의염증세포인다형핵백혈구 (PMNs) 의경우아급성노출에의해농도의존적인대조군대비변화양상이노출군에서는증가하는경향이보였으나, 통계적유의성은나타나지않았다. 아급성노출실험완료후채취한 BAL fluid 내의염증세포유입및활성화유발과관련된염증사이토카인을측정하였다. 그결과 MIP-2, IL-1β, TNF-α 지표에관해서는대조군대비유의한차이가관찰되었으나, IL-6와 MCP-1은 GA 노출에의한대조군대비변화가관찰되지않았다 (Figure 21). 36
III. 연구결과및고찰 <Figure 21> Pulmonary inflammation induced by Glycolic acid (GA) sub-acute exposure in rats. (A) Tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), (B) Macrophage inflammatory protein 2 (MIP-2), (C) Interleukin-1beta (IL-1β) in BALF. Male rats were inhaled with aerosolic GA for 4 wk. Mean ± SE. (one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison test, *, ** P.5,.1 vs. control). ( 바 ) 에어로졸입자분석각챔버내 GA 에어로졸입자의입도분포를다단충격기로분석한결과공기역학중량평균지름 (Mass Median Average Diameter, MMAD) 은.87 1.82 μ m 범위로나타났으며, 기하표준편차 (Geometric standard deviation, GSD) 는 1.9 ~ 2.57 으로단회노출과흡사한양상으로증가하였음을확인하였고, 이수치는 OECD Test guideline에부합하였다 (Figure 22). 또한입자수측정기를이용해확인을해본결과농도에의존하여그입자수가유의하게증가함을확인할수있었다. 대다수의발생입자는폐내로유입이가능한 2.5 μm이하로 GA가폐내로유입되는양이증가하여폐독성을야기할수있음을확인하였다 (Figure 23). 37
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) Exposure group MMAD GSD Low.87 2.57 Middle 1.38 2.51 High 1.82 1.9 <Figure 22> Analysis of aerosolic particle size distribution in subacute exposure <Figure 23> Analysis of aerosolic particle count in chamber during subacute inhalation exposure. Mean ± SE. 38
III. 연구결과및고찰 ( 사 ) 조직병리학적분석 1) 비강비강에대한조직검사결과, 모든실험군의전체개체에서특이할만한이상변화는관찰되지않았다. 따라서본시험조건하에서 Glycolic acid (GA) 를 4주노출시킨후비강조직에병리학적이상소견은관찰되지않았다. 2) 폐장조직관찰폐장에대한조직검사결과, 시험물질인 GA 흡입으로인한것으로판단되는병리학적소견은관찰되지않았으며노출군과회복군에서큰포식세포의국소성침착, 혈관주변부의백혈구침윤, 폐실질내국소성염증혹은혈관벽의국소성무기질침착등이관찰되었으나그정도가미약하고정상랫드에서도자주관찰되는소견으로, 본실험의대조군에서도확인되었다. 따라서노출군의경우본시험조건하에서개체간독성발현의차이를확인할수있었으나, 위와같은근거로 Glycolic acid는폐장에유의한독성변화를유발하지않은것으로판단된다. 39
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) <Table 1> Summary of histopathological lesions in repeatedly inhaled exposure group with Glycolic acid (GA). Organ/Histopathology Group Control Low Middle High Nasal cavity No. examined Level 1 No specific lesion Microcyst, intra-respiratory epithelium, present Level 2 No specific lesion Level 3 No specific lesion Level 4 No specific lesion Lung No. examined No specific lesion Alveolar macrophage aggregation, (multi)focal Grades: minimal Cell infiltration, mononuclear or mixed cells, perivascular Grades: minimal Vascular mineralization, focal Grades: minimal 5 4(8.) 1(2.) 5(1) 5(1) 5(1) 5 2(4.) 1(2.) 2(4.) 2 (.) 5 3(6.) 2(4.) 5(1) 5(1) 5(1) 5 4(8.) (.) 1(2.) 1 (.) 5 5(1) (.) 5(1) 5(1) 5(1) 5 1(2.) 2(4.) 2 1(2.) 1 (.) 5 5(1) (.) 5(1) 5(1) 5(1) 5 2(4.) 2(4.) 2 2(4.) 2 1(2.) 1 4
III. 연구결과및고찰 <Table 11> Summary of histopathological lesions in repeatedly inhaled recovery group with Glycolic acid (GA). Organ/Histopathology Group Control Low Middle High Nasal cavity No. examined Level 1 No specific lesion Microcyst, intra-respiratory epithelium, present Level 2 No specific lesion Level 3 No specific lesion Level 4 No specific lesion Lung No. examined No specific lesion Alveolar macrophage aggregation, (multi)focal Grades: minimal Cell infiltration, mononuclear or mixed cells, perivascular Grades: minimal Vascular mineralization, focal Grades: minimal 5 4(8.) 1(2.) 5(1) 5(1) 5(1) 5 3(6.) (.) 2(4.) 2 (.) 5 5(1) (.) 5(1) 5(1) 5(1) 5 3(6.) (.) 2(4.) 2 (.) 5 5(1) (.) 5(1) 5(1) 5(1) 5 4(8.) 1(2.) 1 1(2.) 1 (.) 5 4(8.) 1(2.) 5(1) 5(1) 5(1) 5 2(4.) 2(4.) 2 1(2.) 1 1(2.) 1 41
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 독성스크리닝기법가. 급성흡입독성및세포독성자료의문헌조사흡입독성스크리닝기법을보완하기위해급성흡입독성 LC 5 값과세포독성 IC 5 값의상관성을확인하고자하였다. 이를위해먼저, GHS 분류에서흡입급성독성 (H33 H332) 으로분류된물질을확인하였다 28. 그결과, 총 66개물질중, H33(acute tox 1) 은 12개, H33(acute tox 2) 은 164개, H331(acute tox 3) 은 27개, H332(acute tox 4) 는 277개의물질로확인되었다 (Table 12). <Table 12> Number of acute inhalation toxic substances according to GHS classification Class H33 (Acute tox 1) H33 (Acute tox 2) H331 (Acute tox 3) H332 (Acute tox 4) No. 12 164 27 277 흡입급성물질인 개물질을대상으로흡입급성독성 5 값을조사하였으며 이를위해 등의보고서및 등의독성데이터베이스를활용하였다 또한 를이용한문헌조사를통해폐혹은기관지세포의세포독성 5 값을아래의항목에따라조사하였다 지난연구로얻은 5 값 역시추가로수집하였다 42
III. 연구결과및고찰 <Table 13> List of survey items for LC 5 and IC 5 data For LC 5 For IC 5 Species Strain Cell type Substance form Cell name (mist, dust, gas or vapor) Exposure time Exposure time Test method Exposure method IC 5 value LC 5 value Reference GLP or non-glp Reference 사용된동물종, 노출시간과상관없이수집한화학물질의 LC 5 값은총 263개였으며, LC 5 값이수집된화학물질을대상으로 IC 5 값을수집한결과, 지난연구로얻은 IC 5 값을포함하여총 32개가확인되었다. 이중 LC 5 값과 IC 5 값이모두확보된화학물질의수가적어, 실험을통해폐세포주인 A549의 IC 5 값을추가확보하였다. 나. 폐세포 A549 세포를이용한 cell viability 실험데이터생산문헌자료를통해얻은 LC 5 값과 IC 5 값의상관성을확인하기에는자료가부족하여, 추가실험을통해 LC 5 값은확인되나 IC 5 값이확인되지않는화학물질 3 종의 IC 5 값을도출하였다 (Table 14). <Table 14> Cytotoxic data of A549 cell for inhalation toxic substances No. Substances IC 5 (µg/ml) 1 1,1,2,2-Tetrabromoethane 321.5 2 Chromium(VI) trioxide 12 3 Potassium dichromate 4.694 4 Sodium dichromate dihydrate 3.534 5 Sodium chromate.8988 43
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 6 Dimethyltin dichloride 39.8 7 Xylene > 5, 8 Ethylbenzene >5, 9 Styrene 3,314 1 1,1,2-trichloroethane 1,154 11 1,1,2,2-tetrachloroethane 396.4 12 1,3-dichloropropene 26.1 13 1,2,3-trichloropropane 851.9 14 2-butoxyethanol > 5, 15 Furfuryl alcohol 2,2 16 Epichlorhydrin 98.9 17 Sodium dichloroisocyanurate (NaDCC) 132.4 18 2-dimethylaminoethanol 1826 19 2,2'-bioxirane 42.54 2 Glycidol 9.2 21 But-2-yne-1,4-diol > 5, 22 2-furaldehyde 111.3 23 Glutaral 98.61 24 Chloroacetic acid 37.63 25 o-phenylenediamine 76 26 3,4-dichloroaniline 1.7 27 ε-caprolactam > 5, 28 Octhilinone 26.5 29 1,3,5-tris(oxiranylmethyl)-1,3,5-triazine-2,4,6 (1H,3H,5H)-trione; TGLC 19.39 3 3-iodo-2-propynyl butylcarbamate 62.96 * 대구가톨릭대학교에서수행함. 44
III. 연구결과및고찰 다. In vitro-in vivo 상관성분석문헌조사와추가세포독성실험을통해얻은흡입급성독성값및세포독성값데이터를근거로, 회귀분석 (regression analysis) 을통해상관성을확인하였다. 우선, 수집한 LC 5 값중에서 GHS 분류기준을참고하여랫드를이용하고 4시간노출을통해얻어진 LC 5 값을선정하였다 3. IC 5 값의경우, 폐세포주혹은기관지세포주를이용한 submerge 방법으로 24시간노출하여얻어진데이터만을선정하였다. 이중범위값을나타내는값들은제외하였다. 그결과, 선정한데이터에서 LC 5 값과 IC 5 값이모두확보된화학물질은총 38개로확인되었다. LC 5 값중 ppm 단위는 mg/l 단위로환산하여단위를통일하였다. 38개물질의 LC 5 값과 IC 5 값을이용하여회귀분석 (regression analysis) 을한결과, r 2 이.4664로도출되어상관성이낮은것으로확인되었다. <Figure 24> In vitro-in vivo correlation (total 38 substances) 38개의물질에는가스, 증기, 분진, 미스트노출실험으로도출된 LC 5 값이모두포함되어있다. GHS 및국내기준에따르면, 가스, 증기, 분진 / 미스트는독성수준을분류하는농도가다르게되어있다 3,31 (Table 15). 또한, 가스나증기의경우, 물질이휘발하는특성이있어현재수집하고추가실험한 submerge 방법으로 IC 5 값을도출하기에한계가있다는점을고려하여물질의형태 ( 가스, 증기, 분진 / 미스트 ) 를구분하여상관성을확인하였다. 45
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) <Table 15> Classification of substances for acute inhalation toxicity GHS 분류 구분 ( 국내 ) 흡입급성독성값 (LC 5, 4시간 ) 가스증기분진 / 미스트 (mg/l) (ppm) (mg/l) H33 (Acute tox 1) 1 1.5.5 H33 (Acute tox 2) 2 5 2.5 H331 (Acute tox 3) 3 25 1 1 H332 (Acute tox 4) 4 2 2 5 * 참고문헌 (3, 32) 가스및증기물질을선택하여상관성을확인한결과, 물질의수는 17 개였으며, r 2 이.3916으로도출되어상관성이낮은것으로확인되었다 (Figure 25). 가스및증기물질은보통휘발성이높아 submerge 방법으로는세포실험을진행하기에적합하지않아 ALI(air-liquid interface) 등의다른방법을이용하는것이더적합할것으로사료된다. <Figure 25> In vitro-in vivo correlation (gas or vapor, 17 substances) 분진 / 미스트물질을선택하여상관성을확인한결과, 물질의수는 21 개였으 며, r 2 이.6195 로도출되어상관성이있는것으로확인되었다 (Figure 26). 46
III. 연구결과및고찰 <Figure 26> In vitro-in vivo correlation (dust/mist, 21 substances) 분진 / 미스트의경우, 상관성이있는것으로확인되나물질의수가충분히확보되지않았기때문에추가데이터의확보가필요하다. 데이터가부족한상황이나, 현재데이터를근거로이전에제안한흡입독성스크리닝기법을 1차적으로보완하였다 (Figure 28). LC 5 값이 1 mg/l이하의물질은 IC 5 값과의상관성이낮게확인되었으며, LC 5 값이높으면상관성이높아지는것을확인하였다 (Figure 27). <Figure 27> In vitro-in vivo correlation (dust/mist). (A) LC 5 1mg/L, (B) LC 5 >1mg/L 따라서 GHS 분류기준에서독성이낮은 H332(acute tox 4) 의기준을정할수 있는가능성을확인하였으며, 1 차적으로현자료를근거로하여 LC 5 값이 5 mg/l 에해당하는 IC 5 값은 1,262 μg/ml 으로확인하였다. 흡입독성스크리닝기 47
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 법에서는우선순위가매우낮은물질을확인하는기준으로적용하였으며, 1,3 μg/ml를보수적인 IC 5 값으로 1차제안하였다 (Figure 28). 화학물질의등록및평가등에관한법률시행령에따르면, 설치류에대한급성흡입독성으로유독물질이지정되는기준은 LC 5 값이 1 mg/l 이하인화학물질이다 32. 이유독물기준인 1 mg/l 이하에해당하는물질을동물실험을수행하기에우선순위가높은물질로제시하려하였으나, 현데이터로는상관성이낮게나타나이 LC 5 값에대한 IC 5 값을제시하기에는한계가있다. LC 5 값이 1 mg/l 이하인물질의 IC 5 값 (~321.5 μg/ml) 을포함하는값으로 LC 5 =2 mg/l에해당하는값인 453 μg/ml를선정하였다 (Figure 26). 따라서우선순위가높아동물실험을바로권장하는 IC 5 값을 5 μg/ml를 1차로제안하였다 (Figure 28). 이세포실험값으로우선순위가낮은물질로선정되었다고해서정확한예상을할수는없다. 실제로독성이강한물질이세포실험값으로는독성이약하게판단될수있기때문에, 우선순위가낮게판별된물질중에서독성이강한물질을선별하기위해서 ALI, clonogenic assay 등다른실험법을검색할필요가있다. 48
III. 연구결과및고찰 <Figure 28> Modified flow chart of the inhalation toxicity screening method. Targeted chemicals cytotoxicity tests are performed in a consecutive order, and chemicals are screened for the final whole body inhalation or intratracheal instillation tests as above. 49
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) Ⅳ 결론 본연구에서는독성자료가부족한유통중인생활주변화학물질을대상으 로세포 기관내점적 흡입독성연구를단계적으로수행하여이를통해인체위해성평가에필요한기초자료를확보하고자하였다 또한 고비용및장기간 소요되는동물실험을보다효율적으로진행가능하도록우선순위를제시하는데활용이가능한흡입독성스크리닝기법을보완하였다 년부터 년간에걸쳐유통량 흡입독성자료유무 물질의제품사용형태및물리화학적특성등을고려하여총 종의화학물질을선정 세포실험을진행하여 를산출하였다 그중금년에세포실험을진행한 종에대한 값은 로각각 에대해산출되었으며 는처리최고농도인 에서도독성이나타나지않았다 또한세포의만성노 출에의한영향을알아보는세포군집시험을통해이들시험물질에의한영 향을관찰한결과 에의해서는농도의존적으로군집 수가현저히억제됨이관찰되었다 년동안수행한세포실험결과및제품내사용정보와독성자료등에기 반하여동물실험을진행할시험물질을 로선정하여저 중 고농도에서각각 로설정하여기관내점적실험을수행하였다 기관내점적후 일및 일후에부검시채취한 용액을분석한결과 회복군의고농도에서 내젖산탈수소 효소및염증성세포인다형핵백혈구가유의하게증가됨이관찰되었다 염 증지표인 α β 를 로측정한결과 는유의한변화가관찰되지않았으며 β에서는노출군의중농도에서의유의적증가및고농도군에서의증가경향이관찰되었으며 α 의경우회복군의고농도에서유의적증가가확인되었다 조직병리결과 노출군에서호중구침윤및출혈 다발성염증 고농도에서심각한괴사등이관찰되었으며 회복군중농도와고농도일부개체에서섬유화가관찰되었다 5
Ⅳ. 결론 의급성흡입독성영향을알아보고자저 중 고농도의챔버내에 를 으로발생시켜 시간단회노출실험을진행하였다 용액을분석한결과염증지표인 α 이고농도의노출군에서증가함이관찰되었다 노출시염증성세포인다형핵 백혈구의경우고농도에서통계적으로유의한증가를보였으며 전체적으로 농도의존적으로증가하는경향이나타났다 하지만 조직병리결과대조군 대비노출군에서유의한병변이확인되지않았다 의아급성흡입독성영향을알아보고자저 중 고농도를 으로설정하여 시간씩주 회총 일간실험을진행하였다 고농도처리군에서 내총단백질이통계적유의한증가를보였으나 내젖산탈수소효소및염증성세포인다형핵백혈구가통계적유의성은없으나 노출로인해증가하는경향이관찰되었다 를통해측정한염증지표인 α β는노출군에서증가경향이확인 되었으며 α 는회복군고농도에서 는회복군저농도및고농도에 서 β 는노출군중중농도에서통계적유의성이확인되었다 폐와비강의 조직병리결과 대조군대비노출군및회복군에서시험물질에의한영향으로나타나는유의한병변은확인되지않았다 한편 문헌조사및추가실험을통해확보한 5 값및 5 값을활용하여 상관성을확인한결과 전체물질 r 2 =.4664) 및가스혹은증기형 태 r 2 =.3916) 의물질을대상으로한상관성은낮은것으로확인되었으나 분 진 미스트형태물질의경우에는상관성이 r 2 =.6195 로확인되었다 이결과 를토대로흡입독성스크리닝기법중동물실험을위한우선순위를정하는 기준을 5 으로 차적으로제안하였다 다만 충분 한신뢰도를확보하기에는현재자료수가부족하여추가적인데이터확보가필요하며 아울러추가적인여타실험법의검색을통해향후보완이필요한 실정이다 또한 가스혹은증기물질에적합한스크리닝기법역시추후개 발될필요가있다 적절한흡입독성스크리닝시험법확립을통해불필요한동물실험을감소시켜비용과시간효율적이고윤리적인연구가가능할것으로기대된다 51
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 참고문헌 52
참고문헌 53
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 심일섭 김현미 유진 임연미 김혜원 김은지 김필제 유승도 생활주변유해화 학물질인체독성연구 국립환경과학원 54
참고문헌 심일섭 김현미 유진 임연미 김혜원 김은지 김필제 유승도 생활주변유해화 학물질인체독성연구 국립환경과학원 55
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 화학물질정보시스템 분류기준 단일물질 건강유해성 급성독성물질 화학물질의등록및평가등에관한법률시행령 별표 유독물질의기정기준 제 조관련 56
참고문헌 기존화학물질관리를위 한안전성연구 57
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 김현미 조은혜 심일섭 권정택 류태권 서균백 이미미 김탁수 이병춘 엄익 춘 이두희 백용욱 노희영 남규찬 김필제 최경희 독성유전체기술을이용한환 경독성연구 국립환경과학원 심일섭 김현미 서정관 남규찬 권정택 류태권 이진석 이미미 이두희 유선 58
참고문헌 경 김필제 최경희 생활공감화학물질안전성확보를위한흡입독성스크리닝기 법연구 국립환경과학원 김현미 권정택 권도영 김은지 임연미 이두희 노희영 김필제 최경희 혼합물 질유해성평가를위한흡입독성스크리닝기법연구 국립환경과학원 59
생활주변유해화학물질인체독성연구 (II) 6
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부록 1 흡입독성스크리닝기법연구를위한세포독성 표준작업수순서 (SOP)- 개정사항 SOP No. 내용변경전변경후 제목변경 세포독성측정 (MTT assay) 세포독성측정 (WST-1 & MTT assay) SOP II 4-2.1 변경 MTT assay Kit WST-1 assay Kit 4-2.2 의 1) 중 1 1 5 / w e l l /.1 1 1 4 / w e l l /. 1 세포농도변경 ml 농도 ml 농도 SOP III 4-2 의 1) 중 세포농도변경 1 1 5 / w e l l /.1 ml 농도 1 1 4 / w e l l /. 1 ml 농도 변경된 SOP 전문은붙임과같음 62
[ 붙임 ] Ⅰ. A549 세포배양 1. 목적본표준작업지침서는인간폐암유래세포 (A549) 등을이용하여다양한세포독성실험을수행하기위한전단계로 A549 세포배양방법과주의사항에대하여설명함을목적으로한다. 2. 원칙 A549 세포배양실험을하기위한시험절차를참고하여수행한다. 3. 원리세포는동물과식물의개체를형성하는최소단위이다. 사람을비롯한고등다세포생물은동일한성질을갖는세포가모여서조직을형성한다. 세포배양은개체를형성하는세포를분리하여생체내의본래세포기능을갖는상태에서플래스크등의인공적인세포배양용기에서키우는기술로생물개체의복잡한생명현상을연구하기위해필수적과정이다. 생체로부터조직을꺼내가위나메스로잘게자른후트립신등단백질분해효소로처리하면세포가개별로나누어지고배지에넣어배양하게되면이를 1차배양이라고한다. 1차배양세포가배양용기바닥에서증식을시작하여시트형태로된후트립신등으로처리하고새로운배양용기에옮겨배양을할경우이를계대배양이라고한다. 한편, 일정기간계대를반복한후세포집단이안정된증식능력을가져죽지않게된세포집단을세포주 (Cell line) 라고부른다. 세로는배양조건에따라성장이달라질수있으므로, 실험에사용되는세포의적절한배양조건을미리알고배지등세포배양시약등을주의하여선택하여야한다. 63
4. 실험재료및방법 4-1. 실험준비재료 1) A549 세포 ( 한국세포주은행 ) 2) Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI-164) 3) Fetal bovine serum (FBS) 4) 1X Penicillin-Streptomycin 5).5 % Trypsin-EDTA 6).4 % Trypan blue solution 7) Dulbecco s phosphate-buffered saline (DPBS)) 8) Lamina flow cabinet, Centrifuge, Light microscope, Hemocytometer, 3 7 waterbath, 37, 5 % CO 2 incubator 9) Conical tubes (15, 5 ml), Pipettes (1 μl ~ 25 ml), T75 cell culture flasks, 1.5 ml microreaction tubes 4-2. 실험방법 4-2.1. 세포해동 1) 액화질소통에보관된 A549 세포를꺼내 37 waterbath에서녹인다. 2) 오염방지를위해 7 % ethanol을분사한뒤 Lamina flow cabinet으로옮긴다. 3) 5 ml conical tube에미리예열한 complete 세포배지 2 ml에녹인 A549 세포를분주한다. 4) 원심분리실시 : 15 rpm, 5 분, 상온 5) 상층액제거후 resuspend한세포는미리예열한 complete 세포배지 2 ml을넣은 T75 culture flask에분주한다. 6) 37, 5 % CO 2 incubator에배양한다. 7) 다음날세포를확인하고 7% 이상 confluency가될때계대배양을하도록한다. 세포를해동하고적어도 3 번의계대배양후본실험에사용해야세포가안정적이다. 64
4-2.2. 계대배양 1) 계대배양전 complete 세포배지, DPBS는 37 로예열하고.5 % Trypsin-EDTA 완전히녹여둔다. 2) T75 culture flask의배지를제거한다. 3) DPBS 1 ml를분주하고세척한다. 2번반복한다. 4).5 % Trypsin-EDTA 2 ml을분주하고 37, 5 % CO 2 incubator에 3 분간반응시킨다. 5) flask 바닥에서세포가떨어졌는지확인한다. 6) Complete 세포배지 8 ml 첨가하여 3 ~ 4 번 pipetting 후 5 ml conical tube로옮긴다. 7) 원심분리실시 : 15 rpm, 5분, 상온 8) 상층액을제거한다. 9) complete 세포배지 1 ~ 5 ml 첨가하여단일세포로분리되게 pipetting 하며거품이생기지않도록유의한다. 1) 세포카운트하기 1 세포부유액을 1 μl씩취하여 9 μl의.4 % Trypan blue solution 과섞은후 hemocytometer에분주한다. 2 A, B, C, D 구역에있는모든세포를카운트한다. 3 평균세포수계산 65
4 1 ml 당세포수계산 11) 카운트결과에따라 T75 flask 하나당세포농도 5 1 5 ~ 1 1 6 /2 ml 로만든후 37, 5 % CO 2 incubator 에배양한다. 12) 2 ~ 3 일간격, 7% 이상 confluency 이면계대배양한다. 66
Ⅱ. 세포독성측정 (WST-1 & MTT assay) 1. 목적 본표준작업지침서는인간폐암유래세포를이용하여 MTT 시험방법과 WST-1 방법및절차와주의사항에대하여설명함을목적으로한다. 2. 원칙 실험을하기위한실험물질별노출방법과노출시간및시험을시험절차를참 고하여수행한다. 3. 원리 Tetrazolium-based colorimetric (MTT) 시험법은많은시료를쉽게빠르게판독할수있어배양된세포에서세포독성에관한연구에주로사용된방법이다. 이방법은대사과정이온전한세포의미토콘드리아내의탈수소효소가노란색수용성 Tetrazolium salt [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide] (MTT) 를비수용성의짙은자주색 MTT formazan 결정으로환원시키는원리를이용하여세포독성을평가할수있다. 4. 실험재료및방법 4-1. 실험의준비재료 1) MTT 용액 (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide, CAS No. 298-93-1, 2 ~ 5 mg/ml로 PBS에녹인뒤, 필터처리후암실상태로냉장보관 ) 또는 MTT assay kit 2) Dimethyl sulfoxide (DMSO, CAS No. 67-68-5) 67
3) Dulbecco s phosphate buffered saline (DPBS) 4) 1 ~ 1 μl Micropipettes, 96 well plate (flat bottom) 5) Plate reader 4-2. 실험방법 4-2.1. WST-1 assay Kit 1) A549 세포를 1 1 4 /well/.1 ml 농도로 96 well plate에분주한다. 2) 5, 1, 1, 1, 1, μg /ml 농도로제조된실험물질을각 well에 1 μl씩첨가한다. 이때, DMSO 최종농도는 1 % 이하여야한다. 3) 실험물질이처리된세포를 24 시간동안 37, 5 % CO 2 로설정된 incubator에서반응시킨다. 4) EZ-CYTOX 1 μl를각 well에첨가해준다. 5) 37, 5 %, CO 2 incubator에서 3 분 ~ 1 시간동안반응시킨다. 6) 흡광도를측정하기전 plate를 1 분정도부드럽게 shaking 한다. 7) Plate reader를이용하여 45 nm에서 (Reference wavelength 6 ~ 65 nm) 흡광도를측정한다. 4-2.2. MTT assay 용액제조시 1) A549 세포를 1 1 4 /well/.1 ml 농도로 96 well plate에분주한다. 2) 5, 1, 1, 1, 1, μg /ml 농도로제조된실험물질을각 well에 1 μl씩첨가한다. 이때, DMSO 최종농도는 1 % 이하여야한다. 3) 실험물질이처리된세포를 24 시간동안 37, 5 % CO 2 로설정된 incubator에서반응시킨다. 4) 5 mg/ml MTT 용액을넣는다. (MTT 용액은빛에민감하므로빛의노출은최소화 ) 5) 37, 5 %, CO 2 incubator에서 4 시간동안반응시킨다. 6) MTT 용액을제거또는제거하지않은채로 DMSO를 1 μl씩첨가한다. 7) 빛차단한상태에서 plate를 1 ~ 3 분동안충분히흔들어준다. 8) Plate reader를이용하여 57 nm에서 (Reference wavelength 63 nm) 흡 68
광도를측정한다. 4-3. IC 5 (5 % inhibitory concentration of cell proliferation) 결정 1) 1 ~ 5 μg /ml 농도에서 Standard curve를그린다. (Y axis (absorbance, linear), X axis (concentration, log), 4 parameters) 2) 시험물질 μg /ml well의 OD (Optical density) 값을 1% survival 로보고이것의 1/2 OD값을 IC 5 으로한다. 3) IC 5 OD값을 standard curve에대입하여시험물질농도계산한다. 69
Ⅲ. 세포독성측정 LDH assay 1. 목적본표준작업지침서는인간폐암유래세포를이용하여 LDH (Lactate Dehydrogenase, 젖산탈수소효소 ) 시험방법및절차와주의사항에대하여설명함을목적으로한다. 2. 원칙 실험을하기위한실험물질별노출방법과노출시간및시험을시험절차를참 고하여수행한다. 3. 원리 LDH assay는젖산탈수소효소의활성을측정하는시험법으로빠르고, 간단하며신뢰성이높은것이특징이다. 젖산탈수소효소는일반적으로세포막을통과하지못하여세포밖으로배출되지않으나, 세포막이손상되거나세포가죽는경우배지중으로방출된다. 따라서배지중의젖산탈수소효소양은치사또는상해를입은세포의수와비례하게된다. 4. 실험재료및방법 4-1. 실험의준비재료 1) LDH assay kit 2) 1 ~ 1 μl Micropipettes, 96 well plate (flat bottom) 3) Working Solution 제조 1 Water soluble tetrazolium salt (WST) substrate Mix 용액제조 : Kit에있는 WST subtrate mix 시약병하나에증류수 1.1 ml을첨가한뒤 1 분간부드럽게교반기를사용하여완전히혼합하여용해한다. 이때절 7
대 vortex를하면안된다. 2 Reaction Mixture 용액제조 : LDH Assay buffer 와 WST substrate Mix 용액을 5 : 1 비율로혼합한다. ( 예, I tests 경우 1 ml LDH assay buffer, 2 μl WST substrate Mix 용액 ) 4) Control 제조 1 Background control: 배지의 FBS에포함되어있는 LDH 양을측정한다. 2 Low control: 세포에배지만처리한것으로실험과정중자연적으로죽거나손상된세포에서방출되는 LDH 양을측정한다. 3 High control: Lysis 용액 1 μl를첨가시켜세포를인위적으로손상을주어세포에서방출가능한최대의 LDH 양을측정한다. 4 Volume control: 세포없이배지만처리한 well에 lysis 용액 1 μl를첨가하여 LDH의양을측정하며, High control에서는 lysis 용액사용에의해늘어난 volume을보정한다. 5) Plate reader 4-2. 실험방법 1) A549 세포를 1 1 4 /well/.1 ml 농도로 96 well plate에분주한다. 2) 5, 1, 1, 1, 1, μg /ml 농도로제조된실험물질을각 well에 1 μl씩첨가한다. 이때, DMSO 최종농도는 1 % 이하여야한다. 3) 실험물질을 24 시간동안 37, 5 %, CO 2 incubator에서반응시킨다. 4) High control, Volume control군에 lysis 용액 1 μl씩각 well에첨가해준다. (lysis가잘되게 pipetting 또는상온에서 5분간반응시킨다.) 5) 원심분리기 (6 xg, 5분 ) 를이용하여, 배지중에떠있는세포를침전시킨다. 6) 상층액 1 μl씩취하여새로운 96 well plate로옮긴다. 7) LDH reaction mixture를제조하여 1 μl씩각 well에첨가한뒤가볍게섞어준다. 8) Plate는빛을차단하고상온에서 3 분간반응시킨다. ( 흡광도범위 : Low control OD 45.8, High control OD 45 2.) 9) Plate reader를이용하여 45 nm에서 (Reference wavelength 6 ~ 65 nm) 흡광도를측정한다. 71
4-3. Cytotoxicity 산출법 A: Experimental - Background control B: Low control Background control C: High control Volume control 72
부록 2 상관성확인을위한 LC 5 -IC 5 자료 Ⅰ. 분진 / 미스트형태의물질 ANNEX Table 1. LC 5 (dust/mist exposure) and IC 5 (lung and bronchial cells) 물질명 CAS No 흡입급성독성분류 동물종 물질형태 노출시간 LC 5 세포주 IC 5 (ug/ml) Chromium (VI) trioxide 1333-82- 33 (AcuteTox2) Rat Aerosol 4h 217 mg/m3 (113mgCr(VI)/m3) A549 12 Potassium dichromate 7778-5-9 33 (AcuteTox2) Rat Aerosol 4h 99 mg/m3 (35mgCr(VI)/m3) A549 4.46 Sodium dichromate 1588-1-9 33 (AcuteTox2) Rat Aerosol 4h 2 mg/m3 (7mgCr(VI)/m3) A549 3.11 73
Sodium chromate 7775-11-3 33 (AcuteTox2) Rat Aerosol 4h 14 mg/m3 (33mgCr(VI)/m3) A549.9 Dimethyltin dichloride 753-73-1 1,1,2,2-tetrabromoeth ane 79-27-6 Glutaral 111-3-8 Polyhexamethylene biguanide (PHMB) 2783-27-8 3,4-dichloroaniline 95-76-1 Octhilinone 2653-2-1 1,3,5-tris(oxiranylmeth yl)-1,3,5-triazine-2,4, 6(1H,3H,5H)-trione (TGIC) 3-iodo-2-propynyl butylcarbamate 2451-62-9 5546-53-6 33 (AcuteTox2) 33 (AcuteTox2) 33 (AcuteTox2) 33 (AcuteTox2) 331 (AcuteTox3) 331 (AcuteTox3) 331 (AcuteTox3) 331 (AcuteTox3) Rat Aerosol 4h.115 mg/l A549 39.8 Rat 4h 549 mg/m3 A549 321.5 Rat - 4h.125mg/L A549 98.6 Rat Aerosol 4h.29 mg/l A549 5.6 Rat Gas/aerosol 4h 3.3 mg/l A549 1.7 Rat Aerosol 4h.58 mg/l A549 26.5 Rat Dust 4h 65 mg/m3 A549 19.39 Rat Aerosol 4h.67 mg/l A549 62.96 74
Glyoxal 17-22-2 332 (AcuteTox4) Rat Aerosol 4h 244 mg/m3 BEAS-2B 42.5 o-phenylenediamine 95-54-5 332 (AcuteTox4) Rat - 4h 3.6mg/L A549 76 Polyhexamethylenegua nidine phosphate (PHMG-Phosphate) 89697-78-9 - Rat Aerosol 4h.94 mg/l A549 3.78 PHMG-HCl 5728-96-3 - Rat Aerosol 4h 276.9 mg/m3 A549 5.33 Didecyl Dimethyl Ammonium Chloride (DDAC) 7173-51-5 - Rat - -.7 mg/l A549 16.6 Triclosan 338-34-5 - Rat Aerosol 4h 436 mg/m3 A549 8.17 Paraquat 4685-14-7 - Rat Aerosol 4h.6 mg/m3 A549 64.3 Glycolic acid 79-14-1 - Rat Aerosol 4h 36 mg/m3 A549 44.8 Sodium nitrite 7632-- - Rat Aerosol 4h 55 mg/m3 A549 2426 * IC 5 : 24hours exposure References (1, 33 56) 75
II. 가스혹은증기형태의물질 Annex table 2. LC 5 (gas/vapor exposure) and IC 5 (lung and bronchial cells) 물질명 CAS No 흡입급성독성분류 동물종 물질형태 노출시간 LC 5 세포주 IC 5 (ug/ml) acrolein 17-2-8 33 (AcuteTox1) Rat Vapor 4h 18 mg/m 3 A549 2.2 1,1,2,2-tetrachloroethane 79-34-5 33 (AcuteTox2) Rat 4h 1256ppm (86 mg/m 3 ) A549 396.4 2,2'-bioxirane 1464-53-5 33 (AcuteTox2) Rat 4h 9 ppm (316.9 mg/m 3 ) A549 42.54 trichloronitromethane 76-6-2 33 (AcuteTox2) Rat - 4h 6.6ppm (44.37 mg/m 3 ) HBEpC 7.4 ammonia 7664-41-7 331 (AcuteTox3) Rat Gas 4h 4923 mg/m 3 A549 26.16 furfuryl alcohol 98-- 331 (AcuteTox3) Rat 4h 233 ppm (934.9 mg/m 3 ) A549 22 76
epichlorhydrin 16-89-8 331 (AcuteTox3) Rat 4h 5ppm (1892.2 mg/m 3 ) A549 98.9 glycidol 556-52-5 331 (AcuteTox3) Rat 4h 58ppm (1757.3 mg/m 3 ) A549 9.2 formaldehyde 5-- 331 (AcuteTox3) Rat - 4h 48 ppm (578 mg/m 3 ) A549 55.3 2-furaldehyde 98-1-1 chloroacetic acid 79-11-8 hydrogen peroxide 7722-84-1 331 (AcuteTox3) 331 (AcuteTox3) 332 (AcuteTox4) Rat 4h 6 mg/m 3 A549 111.3 Rat - 4h 18 mg/m 3 A549 37.63 Rat Vapor 4h 2 mg/m 3 A549.34 styrene 1-42-5 332 (AcuteTox4) Rat 4h 277ppm (118 mg/m 3 ) A549 3314 1,1,2-trichloroethane 79--5 332 (AcuteTox4) Rat - 4h 2 ppm (1914 mg/m 3 ) A549 1154 1,3-dichloropropene 542-75-6 332 (AcuteTox4) Rat 4h 2.7 mg/l A549 26.1 77