차 례 1. 서 론 2. 재료 및 방법 1) 식물재료 및 시험포장 2) 개화시기의 기상조건 3) 야생형과 비선택성 제초제저항성 들잔디의 교배가능성 조사 4) 근거리 (50 cm) 에서의 교배율 조사 5) 반경 3 m 이내의 야생형 들잔디 구역에서의 교배가능성 조사 6)

(2008 년 중점연구소 온라인 강의자료) 제 3세부과제: GM 작물의 환경위해성평가 제목: GM 작물의 환경위해성평가 방법에 대한 이해 (1) 제초제저항성 들잔디 "Jeju Green 21"의 동종간의 유전자이동 가능성 검정 배 태 웅 제주대학교 아열대원예산업연구소

차 례 1. 서 론 2. 재료 및 방법 1) 식물재료 및 시험포장 2) 개화시기의 기상조건 3) 야생형과 비선택성 제초제저항성 들잔디의 교배가능성 조사 4) 근거리 (50 cm) 에서의 교배율 조사 5) 반경 3 m 이내의 야생형 들잔디 구역에서의 교배가능성 조사 6) 반경 3 m 이상 9 m 이내에서 동종 및 근연종과의 교배가능성 조사 7) 비선택성 제초제저항성 들잔디로부터 42 m 이내의 거리에서 교배가능성 조사 8) 반경 3 km 이내의 자연환경에서 유전자 이동 가능성 조사 9) 비선택성 제초제저항성 실험 및 PCR 검정방법 3. 결과 및 고찰 1) 비선택성 제초제저항성 들잔디와 야생형 들잔디의 교배가능성 검정 2) 비선택성 제초제저항성 들잔디로부터 1 m 이내의 거리에서 유전자이동 가능성 검정 3) 반경 3 m 이내 거리의 야생형 들잔디 구역에서 유전자이동 가능성 검정 4) 자연 교배된 야생형 들잔디 후대에서 bar 유전자의 검출 5) 반경 9 m 및 42 m 이내에서 유전자이동성 검정 6) 반경 3 km 이내의 거리에서의 유전자 이동성 4. 적 요

1. 서 론 유전자변형 (genetically modified) 작물의 환경위해성평가는 유전자변형생물체의 국가간 이동등에 관한 법률로서 2008 년 1 월 1 일부터 국내에서도 시행되어졌다. 따라서 모든 GM 작물은 수입, 수출을 위해서는 환경위해성평가를 거쳐야하며, 재배용 작물일 경우에는 국내의 시험포장에서 인체 및 환경위해성평가를 수행되어야 한다. 따라서 GM 작물의 환경위해성평가는 세계적인 GM 농산물의 유통구조에서 필수적인 항목이 되었으며, 환경과 인간에 안전성을 확보하기위한 과학적 검정기법이 발전되어왔다. 본 강의에서는 국내에서 진행중인 제초제저항성 들잔디의 환경위해성평가 사례를 통해서 GM 작물의 환경위해성평가를 이해할 수 있을 것으로 기대된다. 들잔디 (Zoysia japonica Steud.)는 난지형 잔디로 Zoysia 속 (genus)의 22 종 (species) 잔디 중에서 하나이다. 들잔디의 종간 교배친화성 및 유전양식에 대해 조사한 결과 Zoysia 속간의 교배가 가능하다고 보고되었다 (Hong et al., 1985; Joo et al., 1997; Choi and Yang 2004). 종간 교배에 의한 들잔디의 형태적 특징 및 생육특성은 F 1 형질이 양친의 중간형을 보이며, 생육속도에 있어서는 잡종강세를 보인다고 하였다. 자생지인 들과 해안의 잔디는 교배에 의해서 논뚝과 같은 중간형의 잔디가 형성되는 것으로 보아서 이러한 잡종형은 오랜 세월 동안에 형성되어서 안정화되어진 것이라 할 수 있다 (Hong et al., 1985). 근연종 및 이종간의 교배가능성은 유전자변형 작물에 환경위해성평가에서 가장 중요한 부분이다. GM 작물에 도입된 외래유전자가 재배포장을 벗어나 자연 생태계의 동종, 근연종 및 이종 식물체로의 유전자가 유입되어 환경문제를 유발할 수 있기 때문이다. 따라서 유전자변형 작물의 환경위해성평가 시에 GM 작물이 교배될 수 있는 동종 및 근연종의 분포를 조사하고, 교배 가능한 거리 내에 있을 경우 이를 제거하여 외부로 유출되지 않도록 하여야 한다고 규정하고 있다 (MFA, 2002). 일반적으로 GM 작물의 도입유전자가 외부로 유출되는 경우는 작물의 화분비산이나 곤충에 의해서 일어나고, 재배면적, 개화시기, 화분의 활력이 유지되는 시간, 풍속, 곤충활동 반경 등의 요인에 따라서 재배포장 밖의 동종 식물과 교배가 일어날 수 있다 (Kim, 2006). 최근에는 GM 작물에 삽입된 외래 유전자가 생태계 다양성에 미치는 부정적인 영향에 대한 우려가 높아지고 있다. 옥수수의 경우에 원산지인 멕시코 오아하카 지방에서 재배중인 재래종 옥수수에 유전자변형 옥수수의 유전자가 유입 되었다고 보고되었다 (Quist et al., 2001). 또한 수분형태가 자가수분인 콩의 경우에 개화시기를 유사하게 조절하여 야생형 콩을 50 cm 간격으로 배치한 결과, 평균 5.89%의 자연교배가 관찰되었다고 보고하였다 (Nakayama and Yamaguchi, 2002). 비선택성 제초제저항성 벼 (Pons et al., 2000)의 경우에 1 m 의 거리에서 0.19%, 2 m 거리에서 0.05%, 5 m 와 10 m 거리에서 0.01%로 타가수분이 낮은 빈도 (Messeguer et al., 2004)를 나타내지만 재배되고 있는 벼 (Oryza sativa)로부터 약 40m 거리까지의 야생 벼 (Oriza rufipogon)와 자연교배가 가능하다고 보고되었다 (Song et al., 2003). GM 벤트그라스 (Hartman et al., 1994; Lee et al., 1996)의

경우에 반경 3 m 거리에서 약 2%의 교배율이 나타났고, 반경 6 m 거리에서 약 1.3%, 반경 9 m 거리에서 약 0.7%로 나타났다 (Belanger et al., 2003). 최근 보고에 의하면 GM 벤트그라스의 화분비산 거리가 21 km 의 먼 거리 까지 확산되는 것이 보고되었다 (Watrud et al., 2004). GM 작물에 도입된 외래 유전자의 비의도적 방출은 자연서식지의 동종 및 근연종의 오염을 초래하고 있다. 따라서 환경위해성평가에서는 GM 작물과 야생형의 교배가능성 및 비산거리를 측정하고, GM 작물의 격리거리 설정하여 자연환경으로 유전자의 이동을 억제해야 한다. 본 제초제저항성 들잔디의 환경위해성평가에서는 유전자 이동가능성에 대해서 조사하기 위하여 GM 들잔디와 야생형 들잔디의 교배가능성을 검정하였고, 동종간의 교배친화성을 이용하여 거리에 따른 교배율을 조사 하였다. 2. 재료 및 방법 1) 식물재료 및 시험포장 본 시험에 사용된 야생형 들잔디 (Zoysia japonica Steud.)는 제주잔디 (주)에서 판매한 야생형 들잔디를 사용하였다. 비선택성 제초제저항성 들잔디는 bar (bialaphos resistant) 유전자가 삽입된 형질전환 식물체 (Toyama et al., 2003)를 선발하였고, 본 실험에서는 후세대에서 안전하게 발현되는 제초제저항성 들잔디를 사용하였다. Zoysia 속의 금잔디 (Zoysia matrella)도 제주잔디 (주)에서 구입하여 식재하였고, 갯잔디 (Zoysia cinica)는 제주도 월정리와 하귀리 해안에서 자생하는 것을 채취하여 사용하였다. 한지형잔디인 페레니얼라이그라스 (Lolium perenne L.)와 포장 법면보호를 위한 톨페스큐 개량품종인 Kentucky 31 은 덕창농축산 (주)에서 종자를 구입하여 파종하였다. 시험포장은 제주대학교 내의 망실포장과 서귀포시 위미리의 GMO 격리포장을 이용하였고, 망실포장은 화분, 종자, 곤충 등의 출입이 최대한 차단될 수 있도록 직경 5 mm 의 방충망을 제주대학내의 포장 (약 21 평)에 설치하였다 (Figure 1). GMO 격리포장은 남제주군 위미리에 위치한 약 3000 평 규모의 격리포장 (농림부고시 2002-2 호에 규정에 준하여 조성된 포장)으로서 6개의 독립된 시험구역을 조성하였다 (Figure 1C).

A B C Figure 1. 환경위해성평가 시험포장 A와 B: 제주대학교 망실포장, C: 서귀포 위미리의 개방형 포장 2) 개화시기의 기상조건 서귀포시 위미리의 GMO 격리포장에서 들잔디의 개화는 4 월말에 시작하였고, 비선택성 제초제저항성 들잔디의 개화는 5-7 일 후에 관찰되었다. 최적의 화분수정시기인 5 월 1 일에서 5 월 30 일까지의 기상조건은 Figure 2 과 같이, 평균온도 17.3, 강수량 119 mm, 평균 풍속 5 m/s 이었고, 풍향은 동풍 39%, 남서풍 20%, 북풍 16%, 남풍 13%, 서풍과 남동풍이 각각 6% 이었다. 2005 년 5월 육지부의 평균풍속이 2.8 m/s 인 것에 비하면 GMO 격리포장의 평균풍속은 약 2 배정도 강하였다. 본 기상자료는 제주지방기상청 자료 중 악기상 감시용으로 측정된 위미리 지역의 기상자료를 제공받아 기록하였다.

* * Average temp.: 17.3 C, Max.: 21.2 C, Min. 13.4 C * Prec. : 119mm/m WSW 6% SW 20% S 10% SSE SE 3% 6% NNE 16% ENE 13% E 10% ESE 16% wind velocity (m/s/m) 10 8 6 4 2 0 NNE ENE E ESE SE SSE Direction S SW WSW Figure 2. 시험포장의 기상조건 (May 1-May 31, 2005) 각 시험포장은 평균온도 17.3, 강수량 119 mm, 평균 풍속 5 m/s 이었고, 동풍 (39%)과 남풍 (36%)이 주로 불었다. 3) 망실포장에서 야생형과 비선택성 제초제저항성 들잔디의 교배가능성 조사 비선택성 제초제저항성 들잔디의 외래유전자가 화분비산을 통해서 근접하고 있는 야생형 들잔디에 유입될 가능성을 확인하기위해 다음과 같은 방법으로 비선택성 제초제저항성 들잔디 구역에 야생형 들잔디를 배치하였다. 망실포장 내에 2 개의 비선택성 제초제저항성 들잔디 구역에 야생형 들잔디 (반경 25cm 화분)를 각각 3 개씩 배치하고, 1 개 비선택성 제초제저항성 들잔디 구역에 5개의 야생형 들잔디를 배치하였다 (Figure 3). Figure 3. 근접 거리에서 GM 들잔디와 야생형 들잔디의 교배 가능성 검정 모형

4) 근거리 (50 cm) 에서의 교배율 조사 비선택성 제초제저항성 들잔디가 화분비산을 통해서 50 cm 거리의 야생형 들잔디와의 교배가능성 및 교배율을 조사하기위해 GMO 격리포장에서 임의배치법과 난괴법으로 야생형 들잔디와 GM 들잔디를 배치하였다. 난괴법은 비선택성 제초제저항성 들잔디 5 개 블록 (1 12 m 2 ) 과 야생형 들잔디 4 개 블록 (반경 25 cm 화분 4 개)을 교차배열 하였다 (Figure 4a). 임의배치법은 비선택성 제초제저항성 들잔디가 식재된 구역에 야생형 들잔디 화분 (반경 25 cm)을 50 cm 간격으로 무작위로 18 개를 배열하였다 (Figure 5). GM Zoysia grass block 0.5m N S 3m Wild-type Zoysia grass GM WT Figure 4b. 난괴법에 의한 교배가능성 검정 모형(from 2004 to 2005).

Figure 4b. 난괴법에 의한 교배가능성 검정 모형(Random Completely Block Design). Figure 5. 임의 배치법에 의한 교배가능성 검정 모형(completely randomized plot).

5) 반경 3 m 이내의 야생형 들잔디 구역에서의 교배가능성 조사 비선택성 제초제저항성 들잔디로 부터 반경 3 m 내의 야생형 들잔디와 교배 가능성을 검정하기위해 야생형 들잔디 포장 (6 16 m 2 )을 이용하였다. 야생형 들잔디포장 내에 3 m 간격으로 비선택성 제초제저항성 들잔디 (반경 25 cm)를 4 개 배치하였다. 성숙종자의 수집을 위해 각 배치된 비선택성 제초제저항성 들잔디 묘를 중심으로 반경 1 m 씩으로 96 개의 들잔디 블록 (1 1 m 2 )을 분획하였다 (Figure 6). 0/4 0/20 0/17 0/68 0/76 0/21 0/56 0/57 0/53 0/43 0/59 0/30 0/18 0/25 1/28 0/25 0/1 0/13 0/17 0/22 0/4 0/65 0/39 0/40 0/39 0/30 0/29 0/66 0/31 0/35 0/5 0/20 0/5 0/31 0/26 0/8 1/30 0/35 0/8 0/14 0/23 0/39 0/33 0/16 0/22 0/10 0/8 0/9 0/25 0/24 1 2 3 4 0/27 0/19 0/27 0/30 0/32 0/24 0/78 0/18 0/39 0/36 1/24 0/16 0/6 0/7 0/38 0/7 0/36 0/46 0/9 0/22 0/40 0/46 0/41 0/17 0/18 0/15 0/9 0/12 0/3 0/14 0/24 0/8 0/46 0/31 0/10 0/28 0/35 0/64 0/30 0/22 0/23 0/13 0/1 0/20 0/9 0/4 # Pot number of GM zoysiagrass # Number of germinated wild-type zoysiagrass from seeds # Number of interspecies hybridizaton Figure 6. GM 들잔디로부터 반경 3m 이내의 야생형 들잔디와의 교배가능성 검정 모형 (2004-2005).

격리온실에서 반경 1-m, 2-m, 3-m 거리의 야생형 들잔디를 18 plots 을 배치하여 GM 들잔디로부터 유전자 이동성 및 교배율을 검정하였다. 6) 반경 3 m 이상 9 m 이내에서 동종 및 근연종과의 교배가능성 조사 비선택성 제초제저항성 들잔디로부터 반경 9 m 이내의 야생형 들잔디 및 근연종과의 교배가능성을 조사하기 위하여 시험포장을 조성하였다. GMO 격리포장 내에서 반경 9 m 정육각형 구역의 중심에 비선택성 제초제저항성 들잔디 (반경 2 m)를 식재하였다. 비선택성 제초제저항성 들잔디를 중심으로 3 m, 6 m, 9 m 거리에서 총 36 개의 시험처리 구를 배치하였다. 각 시험처리 구에는 3 종의 Zoysia 속인 들잔디, 금잔디, 갯잔디와 2 종의 한지형 잔디인 페레니얼 라이그라스, 켄터키블루 그라스가 식재되었다. 7) 비선택성 제초제저항성 들잔디로부터 42 m 이내의 거리에서 교배가능성 조사 비선택성 제초제저항성 들잔디로부터 42 m 이내의 야생형 들잔디와 교배가능성을 조사하기위해 격리포장 내에 비선택성 제초제저항성 들잔디 구역 (3 12 m 2 )을 조성하였고, 비선택성 제초제저항성 들잔디로부터 3 m 간격으로 야생형 들잔디 (반경 25 cm)를 식재하여 42 m 거리 까지 배치하였다. 각 3 m 마다 배치된 블록에는 5 개의 야생형 들잔디 묘를 식재하였고, 42 m 거리 까지 14 개의 블록을 배치하였다. 8) 반경 3 km 이내의 자연환경에서 유전자 이동 가능성 조사 비선택성 제초제저항성 들잔디의 유전자가 화분비산을 통해서 격리포장 밖의 자연서식지에서 자생 및 식재된 야생형 들잔디로의 유전자 유입을 검정하기 위해서 제초제 살포 실험 및 PCR 분석을 시행하였다. 시험 구역은 비선택성 제초제저항성 들잔디 (약 900 m 2 )가 식재된 격리포장으로부터 반경 3 km 내의 야생형 들잔디 90 개 지점을 선택하였다. 총 90 개중 85 개 지점은 제초제 살포 시험을 하였고, 15 개 지점은 들잔디 잎에서 DNA 를 추출하여 PCR 분석을 하였다.

9) 비선택성 제초제저항성 실험 및 PCR 검정방법 본 실험에서 사용한 유전자 이동가능성에 대한 검정방법은 비선택성 제초제저항성 개체의 존재 및 PCR 을 이용한 bar 유전자의 존재여부를 확인하였다. 종자의 전처리는 성숙된 종자를 채종하여 일주일간 자연광에서 건조시킨 후, 30% KOH 용액에 25 분간 종피 연화처리를 하였다. 전처리된 종자는 증류수에 5 번 씻어서 광 조건하에서 발아시켰고, 발아적온은 33 ±2 로 10 시간 이상 유지하였다. 비선택성 제초제저항성 시험은 시판용 바스타 (Bayer CropScience Co., Korea)를 규정된 사용량 내에서 최종농도를 0.1% (glufosinate) 농도로 희석하여 발아된 유식물체 및 시험구역에 살포하였다. 또한 비선택성 제초제저항성 개체 및 시험구역에서 채취한 식물체의 DNA 는 AccuPrep Genomic DNA extraction kit (Bioneer Co., Korea)를 사용하여 추출하였다. Bar 유전자의 존재를 확인하기위한 PCR primer 는 5 -GGTCTGCACCATCGTCAACC -3'와 5 - ATCTCGGTGACGGGCAGGA-3'을 사용 하였고, 들잔디에서 발현되는 Z-A2 Actin primer 는 열을 사용 하였다. PCR 증폭을 위한 반응액은 100ng DNA 에 10 pmol 의 primer 와 TaKaRa Ex Taq TM polymerase (Takara Co., Korea)가 포함된 Perfect premix (Takara Co., Korea)를 희석하여 사용하였고, PCR 조건은 denaturation 온도 94 에서 30 초, annealing 온도 61 에서 30 초, elongation 온도 72 에서 45 초로 설정하여 35 cycle 하였다. PCR 산물은 0.8% 아가로스 (Sigma, USA) 겔에 전기영동 하였고, 마커는 Takara 에서 제공된 DNA ladder 마커를 사용하였다. 3. 결과 및 고찰 1) 비선택성 제초제저항성 들잔디와 야생형 들잔디의 교배가능성 검정 비선택성 제초제저항성 들잔디 포장에서 근접하게 (>0 m) 배치된 야생형 들잔디와 교배가능성을 조사한 결과, 야생형 들잔디 3 개의 실험구역에서 각각 3%, 4.5%, 9%의 교배율이 나타났으며, 비선택성 제초제저항성 들잔디 포장 내에서 평균 교배율은 6%이었다 (Table 1). 들잔디의 교배율은 개화시기와 일조시간에 따라서 차이가 발생하고, 수정수분시기에 습도와 밀접한 관련이 있는 것으로 생각된다.

Table 1. GM 들잔디와 근접거리에서 야생형 들잔디의 교배율 검정 (>0 cm). Block 1 Block 2 Block 3 Total Number of plants Number of resistant plants % of resistant plants 40 22 164 48 58 110 25 82 72 82 43 746 3 0 2 1 4 6 2 6 9 8 4 45 8 0 1 2 7 5 8 7 12 10 9 6 Average 3% 4.7% 9% 6 The data presented are from the WT parents only. 들잔디의 개화는 암술부터 시작하고, 암술의 개화 5~7 일 후에 수술이 성숙하기 시작하여 14-17 일이 지나면 화분이 소멸된다. 들잔디는 암술과 수술이 동일한 포영에서 시간적 차이를 두고 일어나 자가수정이 27%이루어지고, 수술이 바람에 의해서 다른 개체의 암술로 전이되어 타가수정이 34% 일어난다고 보고되어있다 (Kitamura, 1967). 자가수정의 조건에서도 타가수정이 일어나는 것은 암술과 수술의 성숙시기의 차이 때문으로 판단된다. 그러나 비선택성 제초제저항성 들잔디의 개화시기는 야생형 들잔디 보다 약 5-7 일 정도 늦어서 Kitamura (1967)가 보고한 타가수정에 의한 교배율 보다 낮은 결과를 나타낸 것으로 생각된다. 들잔디 수술의 출현은 일반적으로 일출 후 1 시간에서 시작하고, 화분의 유출은 오전 11-12 시에서 시작하여 오후 13 시-14 시에 완료되는 것으로 보고되었다 (Kitamura, 1967). 3 개의 비선택성 제초제저항성 들잔디 구역은 각각 오전에 음지가 형성되는 구역, 일반적인 광 조사 구역, 오후에 음지가 형성되는 구역으로 나눌 수 있으며, 오전에 음지가 형성된 구역에서는 평균 3%, 일반적인 광 조사구역에서는 평균 4.5%, 오후에 음지가 형성되는 구역에서 9%의 교배율이 나타났다. 이러한 조사결과는 화분 출아 시기가 온도와 광주기에 따라서 달라지고, 고온 조건에서는 화분건조로 인해 교배율이 낮게 나타나는 것으로 생각된다. 2) 비선택성 제초제저항성 들잔디로부터 1 m 이내의 거리에서 유전자이동 가능성 검정 격리포장에서 0.5 m 간격에 야생형 들잔디와 비선택성 제초제저항성 들잔디의 유전자 이동성을 검정한 결과 각 배치법에 따라서 각각 평균 1.24%, 1.22%의 비선택성 제초제저항성 식물체가 얻어졌다 (Table 2-3).

Table 2a. 난괴법에 의한 GM 들잔디와 0.5 m 거리의 야생형 들잔디와 교배가능성 검정 Block 1 Block 2 Block 3 Block 4 Total Number of plants 346 199 258 164 967 Number of resistant plants 5 2 2 3 12 % of resistant plants 1.45 1.01 0.78 1.83 1.24 난괴법으로 배치한 구역에서는 최대 1.83%, 최소 0.78%, 평균 1.24%의 교배율이 나타났고(Table 2a), 임의배치법에서는 최대 4.2%, 최소 0%, 평균 1.22%의 교배율이 나타났다(Table 3). block 내의 교배율은 편차가 적었고, plot 간의 교배율에서는 편차가 높게 나타났으나 두 배치법에서의 평균 교배율은 유사하게 나타났다. 이러한 결과는 비선택성 제초제저항성 들잔디 구역의 0 에 근접한 거리에서의 교배율과 비교하면 1/6 로 감소한 결과이다. Table 2b. 난괴법에 의한 3 종의 잔디류에 대한 교배율 검정: 0.5-m (from 2006) RCBD 1 RCBD 2 RCBD 3 Total EV 들잔디 Plant 73 69 103 245 81.7 Resistant 1 1 2 4 1.3 % 1.37 1.45 1.94 1.63 1.59 금잔디 Plant 12 48 8 68 Resistant 0 0 0 0 % 0 0 0 0 켄터키블루 그라스 Plant 64 59 107 230 Resistant 0 0 0 0 % 0 0 0 0

2006 년도 포장시험중 난괴법에 의한 0.5-m 거리의 야생형 들잔디에서 나타난 유전자 이동에 따른 교배율은 Table 2b 와 같이 평균 1.6%가 나타났다. 최저 교배율은 1.37%, 최고 교배율을 1.94% 이었으며, 2004-2005 년도 포장시험에서 나타난 1.3% 보다 0.3%가 높게 나타났다. Table 3. 임의 배치법에 의한 0.5m 거리의 야생형 들잔디와의 교배율 검정 Plots 2 3 4 5 6 7 11 12 14 16 17 Total Number of plants 22 44 34 85 45 72 28 24 40 33 64 491 Number of resistant plants 0 0 1 0 1 0 0 1 0 1 2 6 % of resistant plants 0 0 2.9 0 2.2 0 0 4.2 0 3.0 3.1 1.22 3) 반경 3 m 이내 거리의 야생형 들잔디 구역에서 유전자이동 가능성 검정 비선택성 제초제저항성 들잔디를 중심으로 반경 3m 이내 거리에서의 유전자 이동가능성을 조사한 결과 Table 4 와 같이 나타났다. 반경 1 m 이내의 거리에서 교배율은 약 1.4%이었고, 2 m 이내의 거리에서 교배율은 0.3% 이었으며, 3 m 이내의 거리에서 교배율은 0.12%로 나타났다. 따라서 들잔디의 교배가능성 및 교배율은 거리에 따라서 상당한 차이가 있을 것으로 추측된다. 제초제저항성 벼 (Pons et al., 2000)의 경우에 1 m 거리에서 0.19%, 2 m 거리에서 0.05%, 5 m 와 10 m 거리에서 0.01%로 타가수분이 낮은 빈도 (Messeguer et al., 2004)로 관측되었다. 야생 벼 (Oryza rufipogon)의 경우에 재배 품종인 Minghui-63 으로부터 0.5 m 거리의 난괴법에서 2.19%, 반경 1.2 m 거리에서 2.75%가 유전자 이동에 의해서 교잡되었다고 하였다 (Song et al., 2003). 야생 벼 및 잡초성 벼의 월동 후 자연발아는 품종에 따라서 30-85%의 발아율을 나타내어 (Hong et al., 1998) 유전자가 유입된 야생 벼의 후세대 확산은 클 것으로 생각된다. 반면에, 들잔디의 경우에는 0.5 m 거리에서 1.2%, 반경 3 m 거리에서 0.12%로서 교배율이 유사하지만 후대의 발아율은 1-4% (Yeam et al., 1985; Kitamura, 1967)로 낮아서 자연환경에서 확산될 가능성이 매우 낮다. 또한 자연환경에서 우점잡초로 인해 생육이 억제되고, 관리되지 않을 시에는 소멸하여 자연환경에 악영향을 미치지 않을 것으로 생각된다.

Table 4a. 반경 3 m 이내의 거리에서 야생형 들잔디와의 교배율 검정. Radius (m) 1m 2m 3m Number of plants 72 660 2536 Number of resistant plants 1 2 3 % of resistant plants 1.39 0.3 0.12 한편, 격리온실에서의 교배율 검정결과, 반경 1m 에서 0.82%를 나타내고, 최저 0%, 최고 2.1%의 교배율이 나타났다. 반경 2m 에서는 평균 0.7%가 나타났고, 최저 0%, 최고 2.3%의 교배율이 나타났으며, 반경 3m 에서는 교배율이 관찰되지 않았다. 따라서 2006 년도 격리온실 시험포장에서의 반경 3m 이내의 거리에서 교배율은 0.7~0.8%로 2004-5 년 데이터에 비교하면 근소한 차이를 보이나 교배율 검정 곡선에선는 크게 벗어나지 않는다. 4) 자연 교배된 야생형 들잔디 후대에서 bar 유전자의 검출 자연교배에 의해서 비선택성 제초제저항성이 나타난 식물체는 PCR 반응 결과 그림 7 과 같이 약 0.5 kb 크기의 bar 특이적 밴드가 확인되었다. 따라서 제초제에 저항성을 나타내는 개체들은 형질전환 들잔디에 삽입된 bar 유전자가 화분비산에 의해서 전이된 것으로 판단된다. Figure 7. PCR 분석을 통한 유전자 이동성 검정. M: molecular marker, Lane 1: WT Zoysia grass, Lane 2-5: Herbicide-tolerant plants after gene flow test, P: positive control.

5) 반경 9 m 및 42 m 이내에서 유전자이동성 검정 반경 3 m 이상의 시험모형에서 들잔디 654 개체, 금잔디 137 개체, 갯잔디 338 개체, 라이그라스 358 개체에 대해서 교배가능성을 조사한 결과 비선택성 제초제저항성 개체는 관찰되지 않았다 (Table 5). 들잔디는 종간 교배친화성이 나타나는 것으로 보고 (Hong et al., 1985)되었으나, 본 시험구역인 반경 3 m 이상의 거리에서는 관찰되지 않았다. Table 5. 반경 9 m 이내의 거리에서 GM 들잔디와 동종 및 근연종과의 교배가능성 검정. Distance Zoysia japonica Zoysia matrella Zoysia cinica Lolium perenne resistant resistant resistant resistant Plants Plants Plants Plants plants plants plants plants 3 m 231 0 0-83 0 89 0 6 m 209 0 79 0 151 0 176 0 9 m 214 0 58 0 104 0 93 0 GMO 격리포장내의 42 m 거리까지 유전자이동 가능성을 검정한 결과 14 개 블록 (3 m 간격)의 야생형 들잔디 178 개체에서 비선택성 제초제저항성 개체는 관찰되지 않았다 (Table 6). 또한 시험포장 내에서 발생한 톨페스큐 (ky-31) 1492 개체에 대해서 교배 가능성을 검정한 결과 자연교배에 의한 비선택성 제초제저항성 개체는 관찰되지 않았다. 따라서 Figure 8 에 나타낸 그래프 결과를 미루어 본다면 3 m 이상의 거리에서 화분비산에 따른 유전자 이동가능성은 매우 낮을 것으로 생각된다.

Percent hybrid seeds (%) 12 10 8 6 4 2 0 y = 5.57e -1.2792x near 0 0.5 1 2 3 6 9 Distance from pollen doner (m) Figure 8. GM 들잔디로부터 반경 9 m 이내의 거리에서의 교배 가능성 검정 그래프. The observed data can be best fit by an exponential equation as indicated in red line. (Near 0: The nearest are never distance Zero) Table 6. GM 들잔디로부터 42 m 거리 내의 야생형 들잔디와의 교배 가능성 검정. Distance (m) Tall fescue ky-31 Number of resistant Number of plants plants Zoysia grass Number of Number of plants resistant plants 3 76 0 41 0 6 47 0 12 0 9 89 0 42 0 12 112 0 16 0 15 70 0 20 0 18 121 0 0-21 68 0 19 0 24 121 0 25 0 27 166 0 28 0 30 103 0 16 0 33 166 0 57 0 36 179 0 48 0 39 68 0 31 0 42 106 0 76 0

6) 반경 3 km 이내의 거리에서의 유전자 이동성 GMO 격리포장 주변 자연서식지에 대해서 화분비산에 의한 유전자이동 가능성을 검정한 결과, 85 개의 지점에서 비선택성 제초제저항성 개체는 발견되지 않았다. 또한 15 개 지점에서 채취한 식물체의 DNA 를 추출하여 bar primer 를 이용한 PCR 분석을 시행한 결과 bar 특이적 밴드는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 들잔디의 화분비산 거리가 짧아 교배가능성이 낮고, 비선택성 제초제저항성 들잔디의 유전자가 유입 되었다고 해도 노지에서 자연 발아율이 1-4% 미만 (Kitamura, 1967) 으로 낮아서 bar 유전자의 이동성이 관찰되지 않은 것으로 생각된다. Bar primer 0.5 kb Actin 0.2 kb Figure 9. PCR 분석을 통한 GM 들잔디로부터 반경 3 km 이내의 자연환경에서 야생형 들잔디로의 유전자이동 가능성 검정. Lane 1: DNA maker, lane 2-16: tested site of WT Zoysia grass, Lane 17: GM Zoysia grass. 이상의 결과를 종합해 보면, 비선택성 제초제저항성 들잔디는 근거리에서 야생형 들잔디와 교배친화성에 관찰되었으나, 3 m 이상의 거리에서는 교배 가능성이 매우 낮은 것으로 생각된다. 비선택성 제초제저항성 들잔디 시험포장으로부터 반경 3 km 이내의 자연환경에 대해서 유전자이동 가능성을 검정한 결과 도입 유전자의 검출은 관찰되지 않았다. 또한 비선택성 제초제저항성 들잔디는 발아율이 낮아서 자 연환경에 확산될 가능성이 낮고, 우점잡초에 의해 생육이 억제되어 위해성이 없을 것으로 생각된다.

4. 적 요 본 연구에서는 비선택성 제초제저항성 들잔디로부터 야생형 들잔디로의 유전자 이동가능성을 조사하였다. 교배가능성 검정은 비선택성 제초제인 바스타 살포시험과 PCR 검정을 통해서 확인하였다. 그 결과 비선택성 제초제저항성 들잔디의 동종관계인 야생형 들잔디와 교배친화성이 교배율은 각 확인되었고, 각 거리에 따른 교배율을 조사하였다. 근접거리 (>0 m)에서의 블록에서 각각 4.5%, 6%, 9%로 나타났고, 평균 6%의 교배율이 관찰되었다. 두 들잔디 간의 0.5 m 거리에서 난괴법과 임의배치법으로 교배가능성을 검정한 결과, 각각 1.24%, 1.22%의 교배율이 관찰되었다. 비선택성 제초제저항성 들잔디로부터 반경 3 m 이내의 야생형 들잔디와 교배가능성을 조사한 결과 1m 이내에서 1.3%, 2 m 이내에서 0.3%, 3 m 이내에서 0.12%의 교배율이 관찰되었고, 3 m 이상의 거리에서는 자연 교배된 식물체가 관찰되지 않았다. GM 격리포장 내의 비선택성 제초제저항성 들잔디 포장 (936-m 2 )으로부터 반경 3 km 이내의 자연환경에서 교배가능성을 조사한 결과, 자연교배에 의해서 저항성을 나타내거나 bar 특이적 밴드를 나타내는 구역은 관찰되지 않았다. 따라서 비선택성 제초제저항성 들잔디의 유전자이동 가능성은 반경 3 m 이상의 거리에서 매우 낮을 것으로 생각된다. 또한 화분비산 및 종자 유출에 의한 bar 유전자의 이동이 낮은 빈도로 발생 하더라도 매우 낮은 자연발아율과 비우점성으로 인해 자연환경에서 생육이 억제되어 점차로 소멸하여 위해성이 없을 것으로 생각된다.