제3 장 유전검사 - 세포유전검사 및 결과의 해석 31
익혀야할내용 세포유전학의 개요를 이해한다. 세포분열 단계를 이해한다. 인간의 염색체에 대해 이해한다. 염색체검사의 적응증을 이해한다. 통상적인 염색체검사의 기법 및 molecular cytogenetics 기법에 대해서 이해한다. 흔히 접하게 되는 염색체질환들을 열거할 수 있다. 32
III-1. 개요 유전검사 유전적인 질병과 관련된 이상을 진단하기 위하여 사람의 DNA, RNA, 염색체, 단백질 또는 그의 부산물 등을 분석하는 과정 유전자 검사 시행하는 방법 세포유전검사(Cytogenetic tests): 말초혈액 또는 양수세포를 배양하여 염색체의 수적, 구조적 이상을 확인하는 검사. 염색체 검 사, 형광동소교잡법(fluorescence in-situ hybridization; FISH) 등. 분자유전검사(Molecular genetic tests): 특정한 유전질환의 원인으로 생각되는 유전자(gene)를 이루는 DNA나 RNA를 직접 검사하거나 특정 유전자와 같이 유전되는 표지자(marker)를 이용 하여 질환의 유전 여부를 알아보는 검사 생화학유전검사(Biochemical genetic tests): 유전적 이상에 의한 효소활성의 저하, 대사산물을 축적 등을 검사. 효소측정법 (enzyme assay), 탠덤질량분석법(tandem mass spectrometry; MS/MS), 아미노산 분석, 유기산 분석 등 33
세포유전학(cytogenetics) 유전물질을 세포수준 즉, 염색체(chromosome)를 통해서 연구하는 학문 분열세포에서 관찰할 수 있는 염색체의 숫자와 구조를 현미경을 통해서 관찰하는 방법 염색체검사의 발전 1956년 Tjio 등이 사람의 염색체 수가 46개임을 보고 림프구 배양, 분염법(banding technique), 고해상도분염법 (high resolution banding technique) 염색체 연구의 중요성 선천성 이상이나 기형을 보이는 여러 질환의 원인 규명의 중요한 방법 여러 종양의 진단, 예후 결정과 발암 기전을 이해하는데 중요한 정 보를 제공 종양학 연구의 중요한 수단이 되었음 34
III-2. 세포분열 : 유사분열 성세포를 제외한 모든 체세포에서 일어남 두 개의 유전적 동일성(genetically identical)을 갖는 딸세 포(daughter cell)를 생성 진핵세포의 세포주기 S phase : DNA 합성부터 시작, 약 8시간 정도 소요 G2 phase : 4시간 정도 G2 phase(gm-2)에는전체유전체의양이배로증가 M phase : 유사분열시기, 약 l시간 정도 G1 phase : 분열이 끝난 세포 G0 phase : 더이상세포가분열하지않는시기 35
유사분열 36
세포주기 37
III-2. 세포분열 : 감수분열 생식세포의 생성 감수분열과 유사분열이 구별되는 점 1 상동염색체의 짝짓기(pairing of homolog-ous chromosomes) 2 상동염색체끼리의 주기적인 유전물질 교환(crossing-over) 3 감수분열 l 단계 (meiosis I) 동안에 염색체수가 반(23개)으로 줄어드는 현상 감수분열 세포주기 감수분열 I 단계(meiosis I) : 유전자 복제로부터 시작 1 Prophase I : 자매염색분체(sister chromatids)를 형성, 상동 염색체의 짝짓기(pairing of homologous chomosomes) 현상 2 Metaphase I : 유전자재조합(genetic recombination) : 상동 염색체가 짝을 이룬 시기에 근접부위 상동 염색분체 (juxtapositioning homologous chromatids) 사이의 교차 (chiasma)와 유전물질 교환(exchange) 3 Anaphase I :각 상동염색체들이 양극으로 이동하는 단계 감수분열 II 단계 자매염색분체의 종적 분리(longitudinal division)와 뒤이은 세포 분열이 일어남 결과적으로 각기 다른 유전정보를 가진 단배체(haploid)의 딸세포 4개를 형성 38
감수분열 39
유사분열과 감수분열 40
III-3. 염색체 : 염색체의 구조 DNA와 핵단백질 (nucleoprotein)로 이루어져 있음 세포주기에서 세포분열(mitosis)의 전기(prophase) 가느다란 실같은 형태를 하고 있던 DNA 이중나선(double helix)은 구조단백질 인 히스톤(histone)을 중심으로 코일모양으로 압축되고 포개지게 되어 굵은 끈 과 같은 형태의 염색질(chromatin)을 이루고, 좀더 응축하여 염색분체(chromatid)를 형성 두 개의 자매염색분체가 중심절의 이염색질(heterochromatin) 부분에 모여 한 개의 염색체를 이룸 염색질 이염색질(heterochromatin) Constitutive heterochromatin : 활성화된 유전자를 포함하지 않고 반복염기서열만 으로 구성된 부위로 고도로 응축이 되어 있으며 대부분 염색체의 중심절 주위에 존재 Facultative heterochromatin : 유전자는 포함하고 있지만 대부분 불활성화된 상태 이며 여성의 불활성화 X 염색체(inactivated X chromo-some)가 대표적인 예임 진염색질(euchromatin) 이염색질보다 덜 응축되어 있고 활성화된 유전자를 포함하고 있는 부분 핵소체 형성부위(nucleolar organizer region, NORs) rrna 합성을 조절하는 유전자가 존재하는 부위이며 끝곁매듭염색체의 단완 에 위치함 41
염색체의 구조 42
염색체의 구조 43
염색체의 구조 중심절을 기준으로 단완(shortarm, p)과 장완(long arm, q)으로 구 성되고 각각의 종말체(telomere: pter, qter)로 끝남 중심절 세포분열시에 방추사(spindle fiber)가 붙게 되는 동원체(kinetochore) 를갖고있음 종말체 염색체 양쪽 말단 부위에 매우 일정한 반복염기서열 (TTAGGG)이 반복 세포분열과 노화에 관련되어 있는 것으로 알려져 있음 염색체의 분류 중앙매듭염색체(metacentric chromosome): 단완과 장완의 길이가 같 은 염색체 중앙곁매듭염색체(submetacentric chromosome) : 단완의 길이가 짧 을때 끝곁매듭염색체(acrocentric chromosome) : 단완부의 길이가 매우 짧 아 거의 보이지 않을 때 (l3번, 14번, 15번, 21번,22번 염색체) 44
인간 염색체 45
III-3. 염색체 : 정상인의 분열중기세포 46개(23쌍)의 염색체 44개(22쌍)는 상염색체(autosomes)이고, 2개 (XX 또는 XY)는 성염색체(sex chromosomes) 로구성 각각 대립되어 있는 염색체중 하나는 아버지로부터 유 전되며 또 다른 하나는 어머니로부터 유래 정상인의 염색체 남성에서 46,XY, 여성에서 46,XX로 표시 46
III-4. 염색체검사 : 적응증 1. 발육장애 또는 지능장애를 포함하는 다발성 기형 2. 염색체 이상의 보인자로 의심될 때 - 불임, 반복적 자연유산 - 이전에 기형아를 출산한 경력이 있는 경우 3. 반복유산 및 사산아 4. 성분화 이상 5. 산전진단 6. 취약 X 증후군 7. 염색체절단증후군 (chromosome breakage syndrome) - Fanconi 빈혈, Bloom 증후군, 혈관확장성 운동 실조증(ataxia telangiectasia) 8. 악성종양, 특히 혈액종양 47
염색체 검사에 필요한 검체 선천성 유전 질환이나 기형을 의심하는 경우 산전 검체 : 양수세포나 융모막(chorionic villi) 출생 후 : 말초혈액의 림프구(T-lymphocyte) 모자익형(mosaicism)의 진단 림프구 외에도 피부조직으로부터 섬유아세포 (fibroblast)를 배양 악성종양의 염색체 검사 반드시 종양조직내의 종양세포를 사용하여 염색 체 검사를 실시해야 함 48
염색체 분석 방법 적절한 대상 검체 내에서 분열세포를 얻어야 함 잘 분열하지 않는 세포인 경우에는 적절한 조건으 로 배양하여 세포분열을 유도함 세포를 배양하고 양질의 염색체를 수확하기 위해서 는 검체 내에 포함되어 있는 세포가 살아있는 세포 (viable cell)이어야 함 검체의 채취부터 검사실에서 배양이 시행되기까지 의 시간이 염색체 분석에 매우 중요 49
염색체 분석 방법 1) 직접법 (Direct method) 세포배양 과정을 거치지 않고 직접 분열중기세 포를 얻는 방법 주로 종양세포의 염색체검사에 이용 단점 : 검사시간을 단축할 수 있으나 분열세포를 충분히얻지못할수있음 2) 배양법 (Culture method) 말초혈액, 양수, fibroblast 등 대부분의 검체 에이용 대상이 되는 세포에 적합한 방법과 일정시간 세 포배양 후 분열세포를 관찰 50
염색체 분석 방법 3) 고해상도분염법 (High resolution banding technique) 세포배양단계에서 DNA 합성억제제인 methotrexate(mtx)와 그 해제를 위한 thymidine이 첨 가되는 방법 시간이 단축되고 더 많은 분열세포와 질적으로 우수한 염색 체를 얻을 수 있어서 염색체의 미세구조를 확인할 때 사용 4) 염색체 절단분석법 말초혈액에 분열촉진물질(mitogen)인 phytohemagglutinin (PHA)을 첨가 염색체 절단을 유발하는 mitomcycin C나 diepoxybutane을 넣은 후 정상인과 비교하여 염색체 절단 정도를 비교 Fanconi 빈혈을 비롯한 염색체절단중후군의 진단에 이용 51
염색체의 수확 (Harvest) 1) 세포주기를 중기에서 멈추게 하기 위하여 세포분열에 필수적 인 방추(spindle)의 형성을 방해하는 colchicine 제제 (Colcemid )등을 사용 2) 분열중기에서 멈춘 세포에 저장용액(hypotonic KCl)을 처 리하여 세포를 팽창시키고 염색체들이 세포막안에서 잘 퍼지 도록 만듬 3) 고정용액(acetic acid-methanol)을 처리하여 염색체를 고정하고 단백질과 핵산의 변성과 침전을 일으킴 - 염색질을 강화하고 염색체 형태의 질을 향상시키며, 세포막이 깨 지는 것을 방지하여 염색체가 흩어지는 것을 방지 4) 고정된 염색체를 슬라이드에 떨어뜨리고 건조 5) 적절한 염색을 실시 6) 현미경으로 염색체의 형태를 관찰 52
분염법 (Banding technique) 1) G-분염법 (Giemsa banding) 가장 많이 사용되는 분염법 단백분해효소(주로 trypsin)로 전처리한 다음에 Giemsa 염색 하는 방법 2) Q-분염법 (Quinacrine mustard banding) 형광염료인 quinacrine mustard나 DAPI등을 사용 adenine-thymine(at)이 많은 부위를 염색하는 방법 분염 양상은 G-분염법과 유사 3) R-분염법 (Reverse banding) GC-rich DNA 부위를 염색하는 방법 G 또는 Q-분염법과 반대의 염색양상 4) C-분염법 (Constitutional heterochromatin banding) 중심절 주위의 heterochromatin 부위를 염색 5) Silver-NOR 분염법 (Nucleolus organizer region) 부수체(satellite)의 핵소체 형성부위(NOR)를 염색 53
핵형분석(karyotyping) 현미경상에서 염색체 사진을 찍은 후, 염색체 크기 와 중심절 위치 동을 기준으로 번호순서대로 배열 하여 염색체 이상을 판독하는 과정 상염색체는 1번부터 22번까지 길이가 감소하는 순 서로 우선 배열하고 다시 중심절의 위치에 따라 구 분하여 배열 최근에는 이러한 과정을 자동화한 자동화 핵형분석 시스템(automated karyo-typing system)을 개발하여 사용하고 있음 54
염색체의 명명법 (Nomenclature) 염색체 핵형을 문자로 표현 인체세포유전학명명법에 관한 국제규약 (International System for Human Cytogenetic Nomenclature, ISCN 2005) 에 따라 모든 염색체의 표기를 통일 55
염색체의 명명법 먼저 염색체의 수를 기술하고, 다음에 성염색 체를 기록 정상인의 핵형은 46,XX 혹은 46,XY로 기술 각각의단완과장완은여러개의염색대 (band)로 이루어져 있는데 염색대는 ISCN 2005의 규칙에 따라 번호를 부여 56
염색체 이상의 표기 염색체 수와 성염색체를 표기한 후 수적 이상 : + 또는 - 부호를 쓰고 해당하 는 이상 염색체의 번호를 기재 구조적 이상 : 약자로 표기 전좌(tanslocation; t), 결손(deletion; del), 역위(inversion; inv), 환상염색체(ring chromosome; r) 등완염색체 (isochromosome; i) 등의 형태로 표현 46,XY,t(9;22)(q34;q1l.2) 45,XX,-7 46,XX,del(5)(p15) 57
염색체 이상의 표기 : 모자익형 다른 세포군을 표기해야 하는 할 때 slant line(/)으로 각 군을 표기 핵형 뒤에 [ ]로 각각의 세포군의 절대숫자를 표기 정상적인 세포군이 있는 경우는 항상 마지막에 표 기 비정상 세포군이 2개 이상 있는 경우는 가장 큰 것 을 먼저 표기하고 그 다음으로 큰 세포군을 표기 (예) 45,X[12]/47,XXX[3]/46,XX[5] 58
III-5. 분자세포유전학 (Molecular Cytogenetics) 전통적인 염색체 검사 방법에 분자유전학적 검사 기 법을 접목 형광동소교잡법(Fluorescent in situ hybridization, FISH) 현재 가장 많이 사용하고 있는 방법 개발 초기: 염색체의 수적인 이상이나 상호전좌를 진단 최근: 염색체내의 특정 DNA 염기서열에만 특이하 게 결합하는 DNA 소식자(specific DNA probe) 개발 59
FISH의 유용성 분열세포가 아닌 상태에서도 염색체이상의 정보 수 집가능 세포의 형태를 그대로 유지하면서 유전자 변화 관 찰이 가능 한번에 많은 유전자 변화를 동시에 조사 정량적 분석이 가능 60
관찰시기에 따른 FISH 종류 세포분열중기 동소교잡법 (Metaphase in situ hybridization : ISH) 분열기의 염색체에 여러 종류의 소식자를 반응시킴 미세결실 증후군을 진단하는데 큰 도움이 되며, 특정 유전자의 염색체내 위치 확인에 이용 (e.g.prader- Willi syndrome) 46,XY.ish del(15)(q11.2q13)(snrpn-) 61
예제 Prader-Willi 증후군 46,XY.ish del(l5)(q11.2q11.2)(snrpn-,dl5sl0-) ish del(l5)(q11.2q11.2) 세포분열중기 동소교잡법에 의해 염색체 l5번 장완의 1l.2 염색대의 결실이 확인되었다는 표시 D15S10, SNRPN 실험에 이용된 특정 DNA 염기서열소식자(specific DNA sequence probe)의 명칭과 각각의 반응 여부를 +와 -로 표시한 것 고식적인 염색체 검사에서는 정상소견이었음을 같이 기술하였다 62
관찰시기에 따른 FISH 종류 세포분열간기 동소교잡법 (Interphase/nuclear in situ hybridizatin: nuc ISH) 세포배양이나 염색체의 추출과정을 거치지 않고, 세포를 슬라이드에 도말 한 후 세포에 직접 여러 종류의 소식자를 반응시킴 특히 분열 세포를 얻기 어려운 악성종양세포의 유전적 변화를 관찰하는데 매우 유용 혈액종양에서 질환의 진단뿐 아니라 잔존암을 정량화 하거나 재발을 조기에 발견할 목적으로 활발히 사용 63
Metaphase FISH Conventional Cytogenetics Interphase FISH
III-6. 대표적인 염색체 질환 상염색체 질환 성염색체 질환 염색체 불안전성으로 인한 절단증후군 65
염색체의 수적 이상 : 상염색체증가 다운 증후군 (Down syndrome) 혹은 Trisomy 21 Incidence : around 1 in 650 live births 산모의 나이 증가와 연관 발생원인: 난자의 감수분열 1단계에서 일어나는 21번 염색체 의 비분리 부모 염색체가 정상이라면 1%미만의 재발 위험성 부모중의 Translocation carrier에 의한 것이라면 재발 빈 도가더높음 염색체 이상: Trisomy 21(93%); Mosaicism: 2-3%, 46,XX/47,XX+21; Translocation: 3-5%, Robertsonian translocation(14, 22, 13, 15, 21), reciprocal translocation 66
염색체의 수적 이상 : 상염색체증가 Trisomy 18(Edward syndrome) Incidence: around 1 in 6,000-8,000 live births 대부분 임신 중 유산 또는 사산되어 출생하는 율은 낮음 95%에서 모체 감수분열 2단계에서의 비분리 현상 이원인 산모의 나이 증가와 연관 부모 염색체가 정상이라면 1%미만의 재발 위험성 부모중의 Translocation carrier에 의한 것이라 면재발빈도가더높음 67
염색체의 수적 이상 : 상염색체증가 Trisomy 13(Patau syndrome) Incidence: around 1 in 12,000 live births 모체내 감수분열 비분리현상이 원인 임신 중 유산 또는 사산되어 출생하는 율은 낮음 68
염색체의 수적 이상 : 성염색체증가 Klinefelter syndrome(47,xxy) Incidence : around 1 in 700-900 live male births Infertility, atrophic testes, aspermia, female breast 50%가 부계의 감수분열 1단계 과오에 의해 발 생하나 아버지의 나이는 발생빈도에 영향을 주 지않음 산모의 나이는 어머니 유래의 47,XXY 발생 빈 도에 매우 큰 영향을 미침 69
염색체의 수적 이상 : 성염색체증가 Triple X syndrome(47,xxx) Incidence : around 1 in 800 live female births 정상적인 수정 능력과 정상적인 자녀를 가짐 모체의 감수분열 1단계의 과오로 인하여 산모의 나이와 연관 70
염색체의 수적 이상 : 성염색체증가 Turner syndrome(monosomy X/ 45,X) Incidence : around 1 in 2,500 live female births 대부분은 임신 초기에 유산 감수분열 단계의 비정상적 성염색체 분배 아버지 유래의 성염색체 소실이 가능성 더 높음 45,X(monosomy X) 45,X/46,XX or 45,X/46,XY(increased gonadoblastoma risk) 46,X,i(X)(q10) or Xp and Xq deletion 71
염색체의 구조적 이상 : 결실 (deletion) Cri-du-chat syndrome (5p-) Cat cry syndrome 비정상적인 후두 발달로 인한 고양이 울음소리 85%: sporadic de novo deletion 15%: 부모중의 translocation carrier에 의 하여 이차적으로 발생하며 다음 출산시 재발 위 험성이 높음 Critical region: 15p15.2 and 15p15.3 72
염색체의 구조적 이상 : 결실 (deletion) Wolf-Hirschhorn syndrome(4p-) 특징적인 얼굴 기형, 소두증, frontal bossing, hypospadia 87%: sporadic de novo deletion 13%: 부모중의 translocation carrier에 의 하여 이차적으로 발생하며 다음 출산시 재발 위 험성이 높음 73
염색체의 구조적 이상 : 결실 (deletion) 미세결실증후군(Microdeletion syndrome 혹 은 contiguous gene syndrome) 염색체에서 한 개 내지 두 개의 아주 작은 부분 의 염색대(band) 소실에 의하여 발생하는 여러 가지 질환들을 통칭 고정도 분염법(high resolution banding technique)이 일반화되기 이전에는 현미경상 에서 거의 염색체 이상을 확인할 수 없었던 질환 Prader-Willi 증후군, Angelman 증후군, retinoblastoma, Miller-Dieker 증후군, Di George 증후군, WAGR 증후군 등이 포함 74
미세결실증후군 CATCH22(DiGeorge syndrome, del 22q11.2) Cardiac anomaly, Abnormal face, Thymic aplasia/hypoplasia, Cleft palate, Hypocalcemia Williams syndrome(del 7q11.23) 심기형, 요정 같은 얼굴(elfin face), 사교적인 성격, 지 능저하 혹은 성상홍채 Prader-Willi syndrome / Angelman syndrome(del 15q11.2-13) 발생빈도: 25,000 출생중한명꼴 전체환자의 약 65%에서 특징적 염색체 이상이 관찰 Prader-Willi 증후군 환자 비정상적 행동이나 식습관, 비만, 정신박약 등으로 소아정 신과 영역에서 발견 염색체의 결실이 매우 작기 때문에 판독에 많은 경험이 필 요한 질환 FISH 기법을 이용하여 진단 75
염색체전위 (Translocation) Robertsonian translocation Relatively common and found in about 1 in 1000 people Only involve acrocentric chromosome : 13, 14, 15, 21, 22 Reciprocal translocation Occurring in around 1 in every 930 people 76
Robertsonian Translocation 77
Reciprocal Translocation Quadriradial figure for pairing at meiosis 78
염색체전위 (Translocation) Balanced: any loss or gain of chromosome material 부모가 무증상이면서 translocation carrier 일 경우 자녀 가 같은 염색체 이상을 물려받더라도 문제가 되지 않음 자녀가 염색체 이상을 보이는데 부모의 핵형이 정상일 경우에 는문제가될수도있음 염색체의 전좌가 생기는 부분에 중요한 유전자가 존재하는지 여부가 중요 부부가 이러한 염색체 이상을 가진 경우 산전 검사 등이 권장 됨 Unbalanced translocation Balanced reciprocal translocation 을 가진 배우자의 경우 유산이나 unbalanced translocation을 가진 자녀가 출생할 수 있는 위험이 존재함 Robertsonian translocation 을 가진 배우자가 있을 경 우 유산과 남성 불임의 위험이 존재함 79
Ring, Inversion, and Insertion Ring chromosome: 말단의 결실에 의하여 염색 체의 양끝이 붙어서 생성 Inversion - Pericentric inversion : centromere 포함 - Paracentric inversion: centromere 의 어느 한쪽에서만 일어남 - Inversion 9: normal polymorphism Insertion: 어떤 염색체의 일부가 다른 염색체 부 위에 끼어 들어간 형태 80
취약 X 증후군(fragile X syndrome) 염색체의 획득이나 결실이 없이 발생하는 유전성 질환 증상 : 조산이나 경기, 발육지연, 지능저하, macroorchidism, 성격장애 빈도 : 남성은 1,200~1,500명, 여성은 2,000명의 출생아 당 한명으로 발생 원인 : familial mental retardation 1 (FMR1) 유전자의 반복염기서열인(CGG)n 의 길이가 증가 하여 발생 여성보인자(carrier)의 진단과 산전진단 81
주요 염색체 질환 1. 주요 상염색체 질환 A. 염색체 수의 이상 1) Down 증후군(trisomy 21) : 47, XX(XY), +21 2) Edwards 증후군(trisomy 18) : 47, XX(XY), +18 3) Patau s 증후군(trisomy 13) : 47, XX(XY), +13 B. 염색체의 구조적 이상 1) Cri-du-chat 증후군 : del(5)(p15) 2) Retinoblastoma : del(13)(q14) 3) Parder-Willi 증후군 : del(15)(q11.2q12) 4) Miller-Dieker 증후군 : del(17)(p13.3) 2. 주요 성염색체 질환 1) Klinefelter 증후군 : 47, XXY 2) Turner 증후군 : 45, X 3) Triple X female : 47, XXX 4) Double Y male : 47,, XYY 3. 취약 X 증후군(Fragile X syndrome) 4. 염색체 절단 증후군(Chromosome breakage syndrome) 1) Spontaneous Chromosome Breakage : Ataxia-telangiectasi, Fanconi 증후군, Bloom 증후군, Xeroderma pigmentosa 2) Induced Chromosome Aberrations Irradiation, Chemical agents, biological factors 82
참고문헌 1. Van Dyke DL. Cytogenetics In: MaClatchey KD, ed. Clinical Laboratory Medicine 2002 pp553-730. 2. Rooney DE, Czepulkowski BH, editors. Human Cytogenetics: A Practical Approach. Oxford: IRL Press at Oxford University Press; 1992. 3. ISCN (2005): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Shaffer LG, Tommerup N.(eds); S. Karger, Basel 2005. 4. Heim S, Mitelman F. Cancer cytogenetics. New York; Wiley-Liss; 1995 83