(19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2012-0040026 (43) 공개일자 2012년04월26일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) A61K 36/258 (2006.01) A61P 13/12 (2006.01) (21) 출원번호 10-2010-0101526 (22) 출원일자 2010 년 10 월 18 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 4 항 2010 년 10 월 18 일 (71) 출원인 동국대학교경주캠퍼스산학협력단 경상북도경주시석장동 707 (72) 발명자 박용기 경상북도경주시원화로 257 ( 황오동 ) (74) 대리인 이종우 (54) 발명의명칭단삼을포함하는신부전예방및치료용약제학적조성물 (57) 요약 본발명은단삼을포함하는신부전예방및치료용약제학적조성물에관한것으로, 구체적으로단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련및대황으로이루어지는 7 가지의혼합한약재의추출물로부터신장질환에대한항염증및신장조직의섬유화억제효과가우수한약제학적조성물에관한것이다. 본발명에따르면, 신장세포에섬유화가일어나고주변대식세포의염증반응으로병이심화되는신부전환자에있어서, 항산화작용을통해세포손상을방지하고, 항염증효과및항섬유화작용이있어만성신부전증과급성신부전증의병증을예방하거나치료할수있으며, 항염증효과로인하여신우신염, 방광염, 대장염, 위염, 퇴행성뇌질환및관절염등을치료하거나완화시킬수있고, 항산화효과로인하여신부전증뿐만아니라노화방지, 항암, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 고혈압, 당뇨병, 비만등을예방하거나치료할수있다. 대표도 - 도 4-1 -
이발명을지원한국가연구개발사업 과제고유번호 B090075 부처명 보건복지부 연구사업명 한의?e선도기술개발사업( 임상시험 ) 연구과제명 만성신부전환자에대한 WHW의임상2상시험 주관기관 동국대학교경주캠퍼스산학협력단 연구기간 2009.11.01 ~ 2011.10.31-2 -
특허청구의범위청구항 1 단삼추출물로이루어지는신부전예방및치료용약제학적조성물. 청구항 2 단삼 20 ~ 26중량 %, 백출 9 ~ 15중량 %, 저령 9 ~ 15중량 %, 백복령 9 ~ 15중량 %, 반하 12 ~ 18중량 %, 황련 6 ~ 12중량 % 및대황 12 ~ 18중량 % 의혼합한약재추출물로이루어지는신부전예방및치료용약제학적조성물. 청구항 3 제 2항에있어서, 상기추출물은단삼 150g, 백출 80g, 저령 80g, 백복령 80g, 반하 100g, 황련 60g 및대황 100g으로이루어지는혼합한약재로부터추출된것임을특징으로하는신부전예방및치료용약제학적조성물. 청구항 4 제 1항또는제 3항에있어서, 상기추출물은한약재의열수추출액을동결건조한것임을특징으로하는신부전예방및치료용약제학적조성물. 명세서 [0001] 기술분야본발명은단삼을포함하여이루어지는한약재추출물을포함하는신부전예방및치료용약제학적조성물에관한것으로, 구체적으로단삼추출물또는단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련및대황으로이루어지는 7가지의혼합한약재추출물을포함하는신장질환에대한항염증및신장조직의섬유화억제효과가우수한약제학적조성물에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 배경기술일반적으로신장의주된기능은노폐물을걸러소변을만들면서몸의수분과전해질, 산과염기의균형을조절하여몸의체액상태를항상적절하게유지하며, 칼슘과인을조절하여뼈를튼튼한상태로유지하고, 조혈호르몬을만들어빈혈을방지하면서혈압을조절하는호르몬을분비하여혈압이정상으로유지하도록한다. 그러나신부전은여러원인에의해신장기능이점진적으로회복불능의상태로저하되는질환으로초기증상이요독증의초기에나타나는메스꺼움, 식욕부진, 야뇨증, 수면장애, 피로, 소화불량등과같이지나치기쉬운것이대부분이어서예방하거나초기에진단하기가어렵고, 신부전이심해지면숨을쉴때소변냄새가나고, 부기가려움증, 기억력감퇴등을보이다가심하면호흡곤란, 경련, 혼수등의증상이발생된다. 신부전은신장세포의섬유화와염증세포의활성화로인한염증반응이주로나타나기때문에, 신장세포의섬유화를줄이고염증반응을억제함으로써계속해서신장세포가파괴되어만성신부전으로진행되는것을막아줄수있다. 이에, 신부전치료의목표는신장의기능이마지막단계 ( 정상신장기능의 10 ~ 15%) 로진행되는것을멈추거나늦추는것으로, 신장의기능이나빠지게한주요원인인고혈압과당뇨병을치료하는것이필수적이며, 이를위해안지오텐신전환효소억제제나안지오텐신 2 수용체길항제가사용되고있다. 그러나신장기능의상실은멈출수없으며결국에는혈액투석이나복막투석, 신장이식등신대체요법을사용하게된다. 따라서신부전은아직특이한치료제가없는실정이며더욱이신부전의핵심병리기전인신장섬유화를억제하는약물은개발된적이없다. 그러나신부전의경우약물을지속적으로복용해야하고, 이에대한부작용으로인하여최근에는염증반응을억제하고신장섬유화를조절하는한약재와같은천연약물을연구하여만성신부전을치료하고자하는시도가활발히진행되고있다. 이에, 본발명자들은부작용이거의없는한약재를이용하여신부전을예방및치료할수있는조성물을개발하 - 3 -
기위하여예의연구노력한결과, 단삼추출물또는단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련및대황을특정비 율로혼합한한약재로부터의추출물이, 부작용이거의없고신부전의예방및치료에높은효과를나타내는것 을확인하고, 본발명을완성하게되었다. 발명의내용 [0009] 해결하려는과제 따라서, 본발명의목적은단삼추출물또는단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련및대황을특정비율로혼합 한한약재로부터추출한추출물을포함하여이루어지는신부전치료용약제학적조성물을제공하는것이다. [0010] [0011] 과제의해결수단상기와같은목적을달성하기위한본발명의한양태에따르면, 본발명은단삼추출물로이루어지는신부전예방및치료용약제학적조성물을제공한다. 본발명의다른양태에따르면, 본발명은단삼 20 ~ 26중량 %, 백출 9 ~ 15중량 %, 저령 9 ~ 15중량 %, 백복령 9 ~ 15중량 %, 반하 12 ~ 18중량 %, 황련 6 ~ 12중량 % 및대황 12 ~ 18중량 % 의혼합한약재추출물로이루어진신부전예방및치료용약제학적조성물을제공한다. [0012] [0013] [0014] [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] 이하, 본발명을상세히설명하기로한다. 이때, 사용되는기술용어및과학용어에있어서다른정의가없다면, 이발명이속하는기술분야에서통상의지식을가진자가통상적으로이해하고있는의미를가진다. 또한, 종래와동일한기술적구성및작용에대한반복되는설명은생략하기로한다. 본발명은단삼추출물또는단삼, 백출, 저령, 백복령, 반하, 황련및대황으로이루어지는 7가지의혼합한약재의추출물로부터신장질환에대한항염증및조직의섬유화억제효과가우수한약제학적조성물을개발한것이다. 단삼 ( 생약명 :Salviae miltiorrhizae radix, 학명 : Salvia miltiorrhiza BGE) 은뿌리를건조하여한약재로사용하는데, 한방에서강장약, 통경약, 진통약, 항염약, 지혈약으로월경불순, 복통, 폐경, 산후통, 류마치스증상에사용하는것으로알려져있다. 본발명에서는상기효능이외에역할을한다. 이때, 본발명에서는단삼을주자 ( 酒炙 ) 로법제한것을사용하는것이바람직하다. 백출 ( 생약명 :Atractylodis macrocephalae rhizome, 학명 : Atractylodes macrocephala KOIDZ.) 은한방에서는방향성건위약으로소화불량에사용되거나, 몸안에있는여분의물을몸밖으로배출하는효능이있어소화기관이나피하에수분이정체되어있는증상을치료하는데사용하는것으로알려져있는데, 본발명에서는상기한인진, 택사, 백봉령및저령과함께신장기능을원활하게하는역할을한다. 백복령 ( 생약명 : Poria, 학명 : Poria cocos SCHW.) 은한방에서비장이나위장이허약하여잘붓거나소화불량또는배뇨곤란의증상등에사용하는것으로알려져있는데, 본발명에서는상기한인진, 택사, 백출및저령과함께배뇨에상승효과를제공하고신장기능을원활하게하는역할을한다. 특히백복령은반하와함께거담 ( 祛痰 ) 의효과를제공한다. 저령 ( 생약명 : Polyporus, 학명 :Polyporus umbellatus PERS. FRIES) 은이뇨, 항균, 항종양, 해열, 급성요도염등의비뇨기계통의소변장애에주로사용하는것으로알려져있는데, 본발명에서는이외의한약재들과함께신장이제기능을할수있도록하는역할을한다. 반하 ( 생약명 : Pinelliae rhizome, 학명 : Pinellia ternata THUNB. BREIT.) 는구토약, 진경약및가래삭히는약으로써위하수, 임신구토, 구토, 기침, 어지러움증, 두통, 급성위염, 인후통증상에사용하는것으로알려져있는데, 통상적으로독성을제거하기위하여생강으로법제한반하를사용하는것이바람직하다. 본발명에서는백복령과함께거담제의역할을한다. - 4 -
[0021] [0022] [0023] [0024] [0025] [0026] [0027] [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] 황련 ( 생약명 : Coptis rhizome, 학명 : Coptis chinensis FRANCH) 은소염제, 진정제로써신경불안, 충혈및염증등에사용하는것이알려져있는데, 일반적으로술에담궜다가말려서법제한황련을사용하는것이바람직하다. 본발명에서는상기신부전유래의염증발생을억제하는역할을한다. 대황 ( 생약명 : Rhei radix et rhizoma, 학명 :Rheum palmatum L.) 은한방에서건위약으로소화불량, 만성위장염, 고창, 기무력증과설사약으로반성변비, 습관성변비증상에사용되고있는데, 본발명에서는상기효능이외에해열제의역할을한다. 통상적으로는잿불에묻어구워서법제한것을사용하는것이바람직하다. 본발명의약제학적조성물은천연물로부터추출하여장기간복용해도부작용이미미하고, 염증을유발하는활성질소종, 염증사이토카인과신장세포의섬유화를유도하는 TGF-β(tumor growth factor-β), Smad2(Sma- and Mad-related protein2) 및 α-sma(α-smooth muscle actin) 의발현을억제하면서활성산소생성효소의활성을억제하는항산화효과에의하여신부전증을치료하거나예방하게된다. 이때, 본발명에서상기한약재로부터추출물을제조하기위해사용되는물은보건부기준하여음용기준에적합한물을말하는것으로, 일반적으로여과기나정수기등으로여과시킨정제수, 멸균수, 음이온수등의물이나수돗물, 생수등을사용할수있다. 하지만, 본발명에서한약재의유효성분을추출하기위해사용하는용매는물에한정되는것은아니며, 인체에해롭지않을정도로제거하는장치를사용한다면메탄올, 에탄올, 아세톤, 디에틸에테르등의유기용매를사용할수있다. 또한, 한약재중량의 1 내지 10배, 바람직하게는 2 내지 6배의물을첨가하여추출할수있으며, 일주일간 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 5회추출한후여과하고, 그여과액을감압농축할수있다. 이때본발명의추출온도는특별히한정되는것은아니나, 상온에서이루어지는것이바람직하다. 하지만, 본발명에서사용되는성분들은상기법제된약재로만국한되어사용되는것은아니며, 본발명의목적에부합되는것이라면부작용이최소화시키는선에서다른방법으로법제화된약재를사용해도무방하다. 그리고본발명의한양태에서단삼 20 ~ 26중량 %, 백출 9 ~ 15중량 %, 저령 9 ~ 15중량 %, 백복령 9 ~ 15중량 %, 반하 12 ~ 18중량 %, 황련 6 ~ 12중량 % 및대황 12 ~ 18중량 % 를사용하는데, 이는각한약재당상술한최대사용량을초과하여사용하면다른필요성분을충분하게사용하지못하고, 최소사용량미만을사용하면각한약재의유효효과가저감되고, 상술한각한약재당사용범위가신부전에대한최대의효과를나타내는데바람직하기때문이다. 이때, 구체적으로더바람직하게는단삼 150g, 백출 80g, 저령 80g, 백복령 80g, 반하 100g, 황련 60g, 대황 100g으로이루어지는혼합한약재와물을첨가하여열수추출한것을사용한다. 하지만, 본발명에서는물이외에도신부전증을예방또는치료하기위하여상기한약재의유효성분을충분히추출하면서인체에전혀무해하다면유기용매를사용하여추출한다음, 유기용매를제거하는공정을거치게할수도있다. 본발명에따른약제학적조성물은식품의약안정청 (KFDA) 의통상적인약제학적제제로의제형화기준에의거하여제형화할수있다. 상기추출물은그자체를사용하거나약제학적제제로의제형화기준에허용이가능한부형제, 예를들어미결정셀룰로오즈, 콜로이드성이산화규소, 옥수수전분및붕해제, 예를들어옥수수전분, 크로스포비돈, 전젤라틴화전분및활택제, 예를들어글리세릴베헤네이트및제피제, 예를들어오파드라이등과함께제형화할수있다. 그리고본발명의한약재추출물및제형화된제제는통상적인방법으로, 투여방법, 투여형태및치료목적에따라약제학적으로허용가능한담체와함께혼합하여희석하거나, 용기형태의담체내에봉입시키는것이바람직하다. 상기담체가희석제로사용되는경우에는염수, 완충제, 물, 링거액및에탄올로이루어진군에서선택된적어도 1종이상의담체를사용한경구투여와비경구투여용으로분말, 과립, 주사액, 시럽, 용액제, 정제등과같은제형으로제조한다. 다만, 본발명의담체가상기의담체로한정되는것은아니다. 이때, 비경구투여는경구이외에정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강등을통한유효성분의투여를의미한다. 상기제형에충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제등을추가로포함하여포유동물에투여된후활성성분의신속, 지속또는지연된방출을제공할수있도록제형화할수있다. 그리고본발명의투여량은환자의상태, 투여경로및투여형태에따라조절될수있어한정되지않으며증상에따라본발명의분야에서통상의지식을가진자라면자명하게다양한범위내에서사용할수있으나, 통상적으로본발명에서는실험적인유효량으로체중 1kg당 100mg내지 200mg을하루에연속적또는간헐적으로투여가가능할것으로판 - 5 -
단된다. [0033] 이와같이, 본발명에따른한약재의추출물은상술한바와같이상호효능간의적절한조화로인하여신부전 증과관련한전반적인병증에대하여부작용은최소화하면서예방또는치료의시너지효과를제공할수있게 된것이다. [0034] 발명의효과이상설명한바와같이, 본발명에따르면, 신장세포에섬유화가일어나고주변대식세포의염증반응으로병이심화되는신부전환자에있어서, 항산화작용을통해세포손상을방지하고, 항염증효과및항섬유화작용이있어만성신부전증과급성신부전증의병증을예방하거나치료할수있으며, 항염증효과로인하여신우신염, 방광염, 대장염, 위염, 퇴행성뇌질환및관절염등을치료하거나완화시킬수있고, 항산화효과로인하여신부전증뿐만아니라노화방지, 항암, 뇌혈관질환, 심혈관질환, 고혈압, 당뇨병, 비만등을예방하거나치료할수있다. [0035] 도면의간단한설명 도 1 은본발명의조성물 ( 실시예 1 및 2) 을대식세포에처리한다음염증물질인활성질소종 (nitric oxide, NO) 생성억제효과를나타낸그래프이다. 도 2는본발명의조성물 ( 실시예 2) 을농도별로대식세포에처리한다음염증물질인활성질소종 (nitric oxide, NO) 생성억제효과를나타낸그래프이다. 도 3은본발명의조성물 ( 실시예 1 및 2) 처리후, 대식세포로부터염증사이토카인인 TNF-α의분비억제효과를나타낸그래프이다. 도 4는본발명의조성물 ( 실시예 2) 을농도별로처리한후, 대식세포로부터염증사이토카인인 TNF-α의분비억제효과를나타낸그래프이다. 도 5는본발명의조성물 ( 실시예 1 및 2) 처리후, 대식세포로부터염증사이토카인인 IL-1β의분비억제효과를나타낸그래프이다. 도 6은본발명의조성물 ( 실시예 2) 을농도별로처리한후, 대식세포로부터염증사이토카인인 IL-1β의분비억제효과를나타낸그래프이다. 도 7은 TGF-β로자극한 MDCK 신장세포에서본발명의조성물 ( 실시예 1 및 2) 처리에대한섬유화 (fibrosis) 억제효과를나타낸도면이다. 도 8은 TGF-β로자극한 MDCK 신장세포에본발명의조성물 ( 실시예 1 및 2) 을처리한후, 신장섬유화의핵심인자인 α-sma의발현억제효과를나타낸도면이다. 여기서, C는정상세포, T는 TGF-β 유도섬유화세포를나타낸다. 도 9는 TGF-β로자극한 MDCK 신장세포에본발명의조성물 ( 실시예 1 및 2) 을처리한후, 신장섬유화의핵심인자인 Smad2/3의발현억제효과를나타낸도면이다. 여기서, C는정상세포, T는 TGF-β 유도섬유화세포를나타낸다. 도 10은본발명의조성물 ( 실시예 2) 에대한독성활성산소반응기들의소거효과를나타낸도면이다. 여기서, 각수치는 3회측정한값의평균 ± 표준편차이며, TEAC는총항산화능 (trolox equivalent antioxidant capacity), ORAC는반응성산소기제거능 (oxygen radical absorbance capacity), DPPH는 1,1-디페닐-2-피크릴- 히드라질 (1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 을나타낸다. 도 11은신부전이유발된쥐 (mouse) 에본발병의조성물 ( 실시예 2) 을처리한후혈액으로부터분리한혈장내크레아티닌감소효과를나타낸그래프이다. 도 12는본발명의조성물 ( 실시예 2) 이신부전쥐의신장조직에서항산화효소들의활성증가효과및지질과산화와단백질산화억제효과를나타낸도면이다. 여기서, 각수치는 6회측정한값의평균 ± 표준편차이다. 또한, - 6 -
a는정상과의통계적의의, b는대조군과의통계적의의를나타내며 (* P < 0.05, * P < 0.01, * P < 0.001), TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances) 는지질과산화정도, PCO는단백질산화정도, SOD는 SOD(superoxide dismutase) 의활성정도, CAT는카탈라아제 (catalase) 의활성정도, GPx는 GPx(glutathion peroxidase) 의활성정도를나타낸다. [0036] 발명을실시하기위한구체적인내용 이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세히설명하기로한다. 이들실시예는단지본발명을예시하기위한 것이므로, 본발명의범위가이들실시예에의해제한되는것으로해석되지는않는다. [0037] [0038] [0039] [0040] 실시예 1. 본발명에따른약제학적조성물의제조본실시예에서사용한약재는 ( 주 ) 광명당제약 ( 울산, 한국 ) 으로부터구입하여동국대학교한의과대학본초학교실에서검정하고정선한것을사용하였다. 건조된단삼 1kg을세말하고물 (4l) 을가하여상온에서 24시간추출한후 2겹거어즈와와트만여과지 (Whatman No. 3) 로여과하여완전히용해되지않은고형물들을분리한다음감압농축을통해수분을제거하여분말형태로제조하였다. 상기의추출과정을 3회반복실시하였고, 이때얻은추출물의수율은 36.9% 였다. 상기조성물은 4 에보관하면서효과검증을위한약제로사용하였다. [0041] [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] [0050] [0051] [0052] 실시예 2. 본발명에따른약제학적조성물의제조 (1) 재료단삼 (Salviae miltiorrhizae radix): 150g 백출 (Atractylodis macrocephalae rhizome): 80g 저령 (Polyporus): 80g 백복령 (Poria): 80g 반하 (Pinelliae rhizome): 100g 황련 (Coptis rhizome): 60g 대황 (Rhei radix et rhizoma): 100g (2) 본발명의추출물제조상기준비된혼합한약재 650g에물을한약재부피의두배정도로넣고, 5시간동안가열하여열수추출한다음, 추출물을거어즈로여과하고수득한추출액을동결건조하여본발명의만성신부전치료용약제학적조성물을제조하였다. 이때, 수율은 30.1% 였다. 상기조성물은 4 에보관하면서효과검증을위한약제로사용하였다. [0053] [0054] [0055] [0056] [0057] 실험예 1. 세포및동물실험을통한효과 (1) 항염증효과가. 활성질소종억제효과활성질소종 (nitric oxide; NO) 은병원균감염후활성화되는대식세포로부터생성되는자유라디칼로서적정양의활성질소종의생성은혈관내항상성을유지시키고항암효과를나타내지만, 과도한양의활성질소종의생성은오히려세포와조직에강력한독성을나타내어염증반응을매개함으로써급성및만성염증성질환의병발달을가속화시키는것으로알려져있다. 이에, 본실험예에서는쥐의대식세포주인 RAW264.7 세포를대상으로상기실시예 1 및 2의추출물을처리한후 - 7 -
대식세포들로부터분비되는활성질소종의양이감소되는지의여부를확인하고자하였다. [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] 먼저, RAW264.7 세포를 24시간배양한다음상기각추출물을여러농도로처리하여 30분간배양하였다. 여기에 lipopolysaccharide(lps) 를처리하여세포를활성화시킴으로써활성질소종분비를유도하였다. 다시이를 24시간동안배양한후배양액을수거하여세포로부터분비된활성질소종의농도를그리스 (Griess) 반응법으로측정하였다. 이를통해처리한약물이대식세포로부터분비되는염증을유발물질인활성질소종의생산을얼마나억제시킬수있는지조사하였다. 이의결과, 도 1 및 2에서도시한바와같이, 본발명의약제학적조성물은활성화된대식세포로부터과도하게분비되는활성질소종의생산을효과적으로감소시킨것으로나타났다. 나. 염증사이토카인분비의억제효과일반적으로외부병원균에노출되면대식세포로부터 TNF-α나 IL-1β와같은염증반응을매개하는사이토카인이다량분비되어염증반응이가속화되기때문에, 사이토카인의다량분비는신장염, 대장염, 폐혈증, 류마티스관절염및퇴행성뇌질환과같은다양한염증질환의발병과밀접하게연관이있는것으로알려져있다. 또한, TNFα와같은염증사이토카인의증가는암을발생시킬뿐아니라악액질, 당뇨, 비만등의대사성질환에서인슐린에대한저항성을유도함으로써병발달에기여하는것으로보고되고있다. 이에, 본실험예에서는쥐의대식세포주인 RAW264.7 세포를대상으로상기실시예 1 및 2의추출물을처리한후, 외부자극에의해활성화된대식세포로부터과도하게분비되는 TNF-α를효과적으로억제시키는지와대식세포들로부터분비되는 TNF-α와 IL-1β의양이감소되는지의여부를확인하고자하였다. 먼저, RAW264.7 세포를 24시간배양한다음본발명의추출물을여러농도로처리하여 30분간배양한후 LPS를처리하여세포를 24시간동안활성화시켰다. 그리고, 세포배양액을수거하여세포로부터분비된사이토카인의농도를효소결합반응법 (enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 으로측정하였다. 이때, 측정은각사이토카인을검출할수있는 ELISA 키트 (kit) 를이바이오사이언스 (ebioscience) 사로부터구입하여사용하였으며, 배양액내사이토카인농도 (pg/ ml ) 는각사이토카인의재조합단백질 (recombinant protein) 을이용하여표준정량곡선 (standard curve) 을제작한후이를기준으로환산하였다. 이의결과, 도 3 내지 6에도시한바와같이본발명의추출물은투여량과비례하여활성화된대식세포로부터과도하게분비되는염증사이토카인의생산을강력하게감소시키는것으로나타났다. (2) 신장의섬유화억제효과일반적으로신장의섬유화 (progressive interstitial fibrosis) 는세뇨관과모세관의파괴를유발하여불안정성당뇨병 (diabetes mellitus) 이나신장비대 (hypertension), 신장동맥협착 (renal artery stenosis), 신장기형 (abnormalities) 및요관폐쇄 (ureteral obstruction) 등을유발시키는데, 특히혈관의생장과분화를촉진하는성장인자인 TGF(tumor growth factor)-β이다량분비되면조직의섬유화 (renal fibrotic events) 를가속화시키는것으로알려져있다. 그리고만성신부전의경우, 신장세포의파괴와섬유화가동반되며발생하고, 결국에는신장실질 ( 腎臟實質 ) 에비가역성변화를초래하여미오피브로블라스트와같은형태 (myofibroblast-like phenotype) 로세포가변해가면서 TGF-β1 mrna의발현및 α-sma 발현이평행하게증가하게되는데, 이때상기 TGF-β1 mrna의발현및 α-sma의발현을유도하는신호전달자 (signal transducer) 로 Smad2 (Sma- and Mad-related protein 2) 가공지되어있다. 가. 신장세포의섬유화형태변화이에, 본실험예에서는마우스의신장섬유세포인 MDCK 세포 ( 근위세뇨관세포기원 ) 에 TGF-β를처리하여섬유화를유도하고, 여기에본발명의추출물을처리하여추출물이신장세포의섬유화를억제시킬수있는지여부를확인하고자다음과같은실험을수행하였다. 먼저, MDCK 세포에 TGF-β(2.5ng/ml) 을처리하여신장세포의섬유화를유도하였으며, 여기에상기실시예 1 및 2의추출물을여러농도로처리하여 72시간배양한후현미경으로신장섬유화정도를관찰함으로써추출물에의한섬유화억제정도를조사하였다. 이의결과, 도 7에도시된바와같이, MDCK 신장세포에본발병의추출물 1mg / ml을처리하였을때, TGF-β 처리에의해유발되는신장세포의섬유화를억제함으로써신장섬유화를막아줄수있는것으로나타났다. - 8 -
[0072] [0073] [0074] [0075] [0076] [0077] [0078] [0079] [0080] [0081] [0082] 나. α-sma(alpha-smooth muscle actin) 및 Smad2(Sma- and Mad-related protein 2) 발현억제또한, 본실험예에서는본발명의추출물처리에의해 α-sma와 TGF-β의신호전달자인 Smad2/3의세포내발현을억제할수있는지의여부를알아보고자다음과같은실험을수행하였다. 먼저, MDCK 세포에 TGF-β(2.5 ng/ ml ) 와상기실시예 1 및 2의추출물을처리하여 24시간배양한후배양액을제거하고세포만수거하였다. 그리고수거된세포에 1mM PMSF 및프로테아제억제제칵테일 (protease inhibitor cocktail) 이첨가된 RIPA 완충용액 (50mM Tris-HCl, ph7.5, 150mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% deoxycholic acid, 0.1% SDS) 을넣어세포로부터단백질을용출시켰다. 추출된단백질 30μg을 SDS-PAGE로분리한후니트로셀룰로스막 (nitrocellulose membrane) 에전이 (transfer) 하였다. 여기에 Smad2/3 항체 (anti-smad-2 monoclonal antibody; mab) 및 mab가결합된알칼리성인산분해효소 (alkaline phosphatase-conjugated mab) 를반응시킨후화학발광 (Chemiluminescence) 방법을이용하여 Smad2/3의발현정도를측정하였다. 이의결과, 도 8 및 9에도시된바와같이, TGF-β로세포를자극하면 MDCK 세포에서 α-sma와 Smad의단백질발현이증가하는데여기에본발명의추출물을처리하면이들의발현이효과적으로감소됨으로써신장세포의섬유화를막을수있는것으로나타났다. 상술한결과로보아, 본발명에따른약제학적조성물은 TGF-β에의해유발되는세포독성및섬유화를억제함으로써신장세포를보호할수있으며, 섬유화를가속화시키는인자인 α-sma와 Smad2/3의유전자발현을강력하게억제할수있는것으로나타났다. 또한, 본발명의추출물은만성신부전증환자의신장세포섬유화를막음으로써신장염을치료할수있음을입증할수있었다. (3) 독성자유기소거효과일반적으로반응성산소기들 ( 유해산소 ; reactive oxygen species; ROS) 은신장에서허혈성급성신부전, 항생제나독성물질에의해유발되는급성신부전및사구체신염등과같은여러급성및만성신장질환을일으키는원인으로알려져있다. 본실험예에서는본발명의추출물이반응성산소기들을효과적으로소거할수있는지여부를알아보고자총항산화능 (trolox equivalent antioxidant capacity; TEAC), 반응성산소기제거능 (oxygen radical absorbance capacity, ORAC) 및 DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl) 분석 (assay) 을실시하였다. 먼저, DPPH 소거효과를측정하기위해, 일정농도로희석한시료 2ml에, 순수에탄올 (absolute ethanol) 에 0.2mM 농도로희석한 DPPH 용액 1ml를가하여 37 에서 30분간반응시켰다. 이반응액을 517nm에서흡광도를측정하였으며시료첨가전과후의흡광도차이를 % 로나타내었다. 또한, 본발명의추출물에의한총항산화능은 TEAC 방법을이용하여측정하였다. 즉, 산성 ph에서무색의환원형 ABTS(2, 2'-azinobis(3-ethylbenzothiazo-thiazoline-6-sulfonate)) 는 H 2 O 2 에의해청록색의 ABTS+ 로산화 되게되므로시료내에항산화물질이존재하게되면, 이들농도에비례하여 ABTS+ 는탈색되게된다. TEAC 반응을위해먼저 2.45mM K2S2O8이포함된 7mM ABTS 용액을제조하고암반응조건에서 12 ~ 48 시간동안안정화하였다. 대조액으로써아스코르브산 (ascorbic acid) 을사용하였으며, 트롤록스 (Trolox) 를표준액으로사용하였다. 시료, 대조액및표준액에 1980μl의 ABTS?+ 용액을넣은후실온에서 6분동안반응시켰으며 734nm에서흡광도를측정하였다. 시료의 TAC 활성은 nmol 트롤록스당량 (Trolox equivalent) 으로표기하였다. [0083] [0084] [0085] ORAC 분석 (assay) 을위해형광물질로플루오레세인 (fluorescein) 을사용하였으며, 퍼록실라디칼 (peroxyl radical) 을생성하는 AAPH(2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride) 를사용하였다. 먼저시료 20μl에 16.7nM 베타-피코에리트린 (β-phycoerythrin) 용액 120μl를넣은후실온에서 15분간반응시키고다시 32mM AAPH 용액 60μl를넣고여기 (excitation) 파장 485nm와발광 (emission) 파장 530nm에서 2분간격으로 60분동안흡광도를측정하였다. 표준시약으로 0, 0.02, 0.2, 1.0 및 2.0nmol의트롤록스를사용하였으며, 표준시약과시료의 AUC(area under the curve) 를측정하였다. ORAC는표준시약농도와 AUC 간의회귀곡선을이용하여 nmol 농도로표기하였다 (AUCnet= AUCsample/standard_AUCblank). 이의결과, 도 10에도시된바와같이, 본발명의추출물은항산화제인아스코르브산과유사하게총항산화능 (TEAC) 과반응성산소기제거능을나타내었으며, 독성자유기인 DPPH를소거할수있는것으로나타났다. 상술한결과를보아, 본발명에따른약제학적조성물은항산화효과를통해신장조직을보호할수있는것으로 - 9 -
나타났다. [0086] [0087] [0088] (4) 신부전쥐에서의치료효과일반적으로반응성산소기들 ( 유해산소 ; reactive oxygen species; ROS) 은신장에서허혈성급성신부전, 항생제나독성물질에의해유발되는급성신부전및사구체신염등과같은여러급성및만성신장질환을일으키는원인으로알려져있다. 그리고정상적인조건에서산소를소모하는모든세포의미토콘드리아에서대사과정중에대사되는산소의 2 ~ 5% 가슈퍼옥사이드 (superoxide) 나과산화수소 (H 2 O 2 ) 같은반응성산소기들로전환되는데, 세포들은이들을분해하 는효소나물질들을가지고있어서그독성으로부터세포를보호하는기작을가지고있다. [0089] [0090] [0091] [0092] [0093] [0094] [0095] [0096] [0097] [0098] [0099] [0100] [0101] [0102] [0103] 하지만, 세포가정상적인보호기작을수행하지못하면, 세포에남은반응성산소기들은지질, 단백질, DNA 등세포의여러구성성분을공격하게되는데, 특히세포의생체막의경우에는불포화지방산이많아반응성산소기들의공격을쉽게받아서지질의과산화 (lipid peroxidation) 가발생되면서세포막의투과성이증가되어세포기능저해로인하여결국세포는사멸하게된다. 또한, 반응성산소기들은세포내다량의염증사이토카인및섬유세포생장인자들을분비하도록자극하여세포섬유화를통해신장염을더욱악화시키게된다. 이에, 본실험예에서는허혈성급성신부전을유발한쥐 (renal ischemia/ reperfusion mouse model) 에본발명의추출물을먹인후, 반응성산소기들의활성억제정도및신부전치료효과를검증하였다. 가. 크레아티닌생성억제효과먼저, 허혈 / 재관류 (ischemia/reperfusion) 에의해신부전이유발된쥐 (Balb/c male mice, 8 week old) 에상기실시예 2의추출물 10, 50, 100mg /kg을수술후 30분및 1일간격으로 14일간경구투여하였다. 그리고상기신부전쥐로부터혈액을채취한다음, 이혈액으로부터혈장을분리한후크레아티닌 (creatinine) 수치를측정하였다. 이의결과, 신부전이유발되면혈장내크레아티닌의수치가올라가게되는데, 도 11에서보는바와같이, 본발명에따른약제학적조성물을투여한쥐의경우혈장내크레아티닌수치가떨어지는것을알수있었다. 나. 신부전쥐의신장에서의항산화효소들의활성증가효과일반적으로, 반응성산소기들의생성은세포에산화적스트레스를유발하여신장의섬유화를촉진시킴으로써신장을파괴하는것으로알려져있다. 이에, 본실험예에서는본발명의추출물이신부전쥐의신장에서반응성산소기들로부터신장을보호할수있는지확인하기위해, 신장조직내활성산소종제거에중요한항산화효소들인 SOD(superoxide dismutase), 카탈라아제 (catalase), GPx(glutathion peroxidase) 의활성정도를측정하였다. 이를위해쥐로부터적출된신장을수크로오스완충용액 (sucrose buffer)(0.32m sucrose, 10mM Tris-HCl, ph7.4) 에넣어균질기 (homogenizer) 로마쇄한후 1,000g에서 5분간원심분리하여상층액을회수하였다. 상층액을다시 15,000g에서 30분간원심분리하여세포질분획 (cytosolic fraction) 을수집한후 SOD, 카탈라아제및 GPx의활성을측정키트 (kit) 를이용하여측정하였다. 이의결과, 도 12에서보는바와같이, 신부전쥐에본발명의추출물을먹인경우, 본발명의추출물에의해 SOD, 카탈라아제및 GPx의활성이모두용량에의존적으로증가하는것으로나타났다. 즉, 본발명의추출물은활성산소생성억제에관여하는항산화효소의활성을증가시켜결과적으로활성산소종의생성을억제함으로써신장의섬유화로부터신장을보호하는것을알수있었다. 라. 과산화 (hydrogen peroxide) 및지방산화 (lipid peroxidation) 에대한억제효과상술한바와같이, 세포내반응성산소기들의생성이증가하면과산화작용이나지질산화작용에의한세포막구조의파괴, 수산기 (OH-) 에의한 DNA 손상및 DNA 이중결합구조나 SH를포함하는산화반응에의한단백질의변성등을통해신장세포고사 (apoptosis) 의원인이되고있다. 이에, 본실험예에서는신부전쥐에본발명의추출물을투여한후, 활성산소생성으로인한지질과산화작용 (lipid peroxidation) 이나단백질산화작용 (protein oxidation) 에어떤영향을주는지를확인하였다. - 10 -
[0104] [0105] [0106] 먼저, 신장에서의지질과산화정도는 TBARS(thiobarbituric acid-reactive substances) 를이용하여 MDA(malodialdehyde) 의생성량을분광광도분석 (spectrophotometric assay) 을이용하여측정하였다. 또한신장에서의단백질산화정도는단백질카보닐 (protein carbonyl) 의양을단백질카보닐 ELISA 키트 (Protein Carbonyl ELISA Kit) 를이용하여측정하였다. 이의결과, 도 12에서보는바와같이, 정상쥐의경우본발명조성물의투여여부에상관없이신장조직에서의과산화작용및지질산화작용정도에변화가없었지만, 신부전쥐의경우지방산화와과산화작용이증가하였고이는본발명의추출물에의해용량에의존적으로억제되는것을나타낸다. 도면 도면 1 도면 2 도면 3-11 -
도면 4 도면 5 도면 6-12 -
도면 7 도면 8 도면 9 도면 10-13 -
도면 11 도면 12-14 -