대한생식의학회지 : 제 34 권제 2 호 2007 난자 - 난구세포복합체에서발현하는 Rpia 유전자의종특이적발현 포천중문의과대학교생명과학전문대학원 1, 차병원여성의학연구소 2 김윤선 1 윤세진 2,3 김은영 2 이경아 1,2 Species-specific Expression of Rpia Transcript in Cumulus-oocyte-complex Yun-Sun Kim 1, Se-Jin Yoon 2,3, Eun-Young Kim 2, Kyung-Ah Lee 1,2 1 Graduate School of Life Science and Biotechnology, Pochon CHA University College of Medicine, Seoul, Korea, 2 CHA Research Institute, Fertility Center, CHA General Hospital, Seoul, Korea Objective: We previously identified differentially expressed genes (DEGs) between germinal vesicle (GV) and metaphase II (MII) mouse oocyte. 1 The present study was accomplished as a preliminary study to elucidate the role of ribose 5-phosphate isomerase A (Rpia), the essential enzyme of the pentose phosphate pathway (PPP), in oocyte maturation. We observed expression of Rpia in the mouse and porcine oocytes. Methods: Expression pattern of the 11 MII-selective DEGs in various tissues was evaluated using RT-PCR and selected 4 genes highly expressed in the ovary. According to the oocyte-selective expression profile, we selected Rpia as a target for this study. We identified the porcine Rpia sequence using EST clustering technique, since it is not yet registered in public databases. Results: The extended porcine Rpia nucleotide sequence was submitted and registered to GenBank (accession number EF213106). We prepared primers for porcine Rpia according to this sequence. In contrast to the oocyte-specific expression in the mouse, Rpia was expressed in porcine cumulus and granulosa cells as well as in oocytes. Conclusion: This is the first report on the characterization of the Rpia gene in the mouse and porcine ovarian cells. Results of the present study suggest that the mouse and porcine COCs employ different mechanism of glucose metabolism. Therefore, the different metabolic pathways during in vitro oocyte maturation (IVM) in different species may lead different maturation rates. It is required to study further regarding the role of Rpia in glucose metabolism of oocytes and follicular cell fore exploring the regulatory mechanism of oocyte maturation as well as for finding the finest culture conditions for in vitro maturation. [Korean. J. Reprod. Med. 2007; 34(2): 95-106.] Key Words: EST clustering, in vitro maturation, Pentose phosphate pathway (PPP), Ribose 5-phosphate isomerase A (Rpia) 여성의생식세포인난자는태어날때부터제1 감수분열전기에세포주기가정지하여성장이멈 3 윤세진현 ) Stantford University School of Medicine, Department of OB/GYN, 300 Pasteur Drive, Room S385, Stanford, CA 94305, USA 주관책임자 : 이경아, 우 ) 135-081 서울특별시강남구역삼 1 동 606-13, 포천중문의과대학교생명과학전문대학원 Tel: (02) 3468-3440, Fax: (02) 563-2028, e-mail: leeka@ovary.co.kr * This work was supported by the Research Project on the Production of Bio-organs, Ministry of Agriculture and Forestry, Republic of Korea. 춰진채로난포안에존재하고있다. 사춘기를지나면서여러가지난소및난소외적인요인에의해난자의성장과성숙을재개하게되는데이때난자의성숙은핵성숙 (nuclear maturation) 과세포질성숙 (cytoplasmic maturation) 으로나뉘어일어나며, 두과정이긴밀하게연결되어있다. 2,3 본연구진은난자성숙의분자생물학적조절기전을규명하기위해생쥐의미성숙난자 (GV) 와 - 95 -
난자 - 난구세포복합체에서발현하는 Rpia 유전자의종특이적발현 대한생식의학회지 성숙난자 (MII) 사이에서차이나게발현하는유전자 (DEGs) 의목록을발굴하여보유하고있으며, 이들유전자중에서목표유전자로차례로선택하여각유전자의발현양상과더불어난자성숙에관련된유전자의기능을알아보기위한연구를꾸준히수행해오고있다. 1,4 목록에있는여러가지유전자중에서연구를위한목표유전자를정하는것은여러가지방법이있겠으나, 본연구의경우에서는 120개의 Annealing Control Primer를이용하여 PCR해서얻은 DEGs 목록중, 성숙난자에서더많이발현하는유전자 11개에대하여발현양상을확인하는과정중에특별히난소에서높게발현하는유전자 Ribose 5-phosphate isomerase A (Rpia) 를선택하게되었다. 우리는선행연구에서 RNAi (RNA interference) 를이용하여난자의에너지대사에관여하는효소중의하나인 malate dehydrogenase의기능을분석한결과, 난자의에너지대사상태가난자성숙에매우밀접하게관계되어있다는것을보고하였다. 4 따라서, 우리가보유하고있는유전자목록중에서포도당대사에관여하는또다른유전자이면서난소에서특히높게발현하고있는유전자인 Rpia의기능을알아보는것이매우흥미로울것으로사료되었다. 포도당대사는모든세포에서에너지원을확보하기위해필수적인과정이다. 포도당은 hexokinase 에의해 glucose-6-phosphate (G-6-P) 로전환되고 G- 6-P는 glycolysis ( 해당과정 ) 과 pentose phosphate pathway (PPP) 두가지방법에의해대사과정을거치게된다 (Figure 1). 이때어떤과정에의해포도당대사가일어날것인지의여부는세포내 NADP+ 의농도에의해 G-6-P의운명이결정된다. 3,4 이들두가지대사중에 PPP를통한포도당대사는생쥐와돼지난자에서핵성숙을증진시키는것으로보고되어있다. 3,5~7 PPP는 G-6-P가 Glucose 6-phosphate dehydrogenase (G-6-PDH) 에의해 NADP+ 를 NADPH로산화시켜 lactone을형성하고, 탈수소효소인 lactonase에의해 6-phosphogluconate (6- Figure 1. Schematic diagram of the metabolic pathway for glucose. PPP, pentose phosphate pathway; Ru-5-P, ribulose 5-phosphate; Rpia, Ribose 5-phosphate isomerase A; Rib-5-P, ribose 5-phodphate; PRPP, 5-phospho- D-ribosyl-1-pyrophosphate. PG) 로전환되고 6-phosphogluconate dehydrogenase (6-PGDH) 에의해또다시 NADP+ 를 NADPH로산화시켜 ribulose 5-phosphate (Ru-5-P) 를생성하게함으로써시작된다. Ru-5-P는 phosphopentose isomerase 에의해 ribose 5-phodphate (Rib-5-P) 를형성하게되어마지막산물인 5-phospho-D-ribosyl-1-pyrophosphate (PRPP) 로전환된다. PRPP는 purine이나 pyrimidine의합성을위한전구체로이용된다. 이렇게 PRPP에의해생성된 camp는난소내과립세포에서생식소호르몬을활성시키고 GVBD를활성시킨다는보고도있다. 3 본연구에서선택한유전자 Rpia는 Ru-5-P가 Rib-5-P로전환될때사용되는필수적인효소다 (Figure 1). 돼지의경우, 유전적개량기술과생산성과번식의효율을향상, 바이오장기생산등을위한연구를위해서는성숙란혹은체외수정란의이용이필수불가결한데, 이들의이용효율을향상시키기위해서는분자생물학기술을토대로수정전후돼지의난자및배아의성숙과발달에관한유전자 - 96 -
제 34 권제 2 호, 2007 김윤선 윤세진 김은영 이경아 발현을연구하는일은매우중요하다. 따라서본연구진은생쥐에서얻어진연구결과를돼지에접목하여두종간의유전자발현및난자성숙의기전을비교분석연구해오고있다. 그러나, Rpia에대한정보가생쥐에서는 GenBank에등록이되어있는반면돼지의 Rpia에대해서는아직알려져있지않다. 따라서, 본연구는 EST Clustering 기법을통해 Rpia 상동성을이용하여돼지의 Rpia를동정하고, 이를이용하여 Rpia 유전자의발현을생쥐및돼지의난자및난포내세포에서비교분석하기위하여진행하였다. 연구대상및방법 1. 실험동물및난자회수유전자발현양상을관찰하기위해서는생후 4주령된 ICR 생쥐의암컷으로부터각조직을적출하여 total RNA를뽑아 RT-PCR 을수행하였다. 난자를모으기위해서는생후 4주령된 ICR 생쥐에 PMSG (Folligon, Intervet, Holland) 5 IU/ml를주사하여 48시간째에배란전난포를얻어이로부터 GVBD를방지하기위해 0.2 mm IBMX를처리한 M2 (Sigma) 배양액에서 GV 난자와난구세포복합체, 과립세포를모은후난자크기에맞는미세유리관파이펫을통해난자주위에둘러쌓여있는난구세포를물리적으로제거하여난자만을얻었고난구세포와과립세포는따로튜브에넣어 4 에서 8,000 g로 5 분간원심분리하고 PBS로세척하여사용하였다. 돼지의난포를채취하기위해서는도축직후의난소를 32~35 의생리식염수 (0.9% NaCl) 에넣어 2시간내에실험실로운반하여사용하였다. 실험실에서약 39 생리식염수로난소를 3회이상세척한뒤직경 2~6 mm 내외의난포에서 18 gauge 주사침이부착된 10 ml 주사기로흡인한후흡입된난포난을 TL-HEPES로 3회세척하여실제현미경하에난구세포가 2~3층이상치밀하게붙고세포질이균질한난자만을선별하여실험에공시하였다. GV 난자-난구세포-과립세포가같이붙어있는 복합체를골라내어 GV 난자-난구세포에붙어있는과립세포만을따로모으고생쥐에서와같은방법으로난자크기에맞는미세유리관을이용하여난자와난구세포를분리하여, 따로튜브에모은후 4 에서 8,000 g로 5분간원심분리하고 PBS로세척하여사용하였다. 한번실험을위해서 10~20개의난자를사용하였고, 이때에함께나온난구세포와과립세포를공시하였고, 모든실험은 3~4번반복하였다. 2. RNA 분리및 RT-PCR 생쥐의각조직은 TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) 사용하여균질화시킨후상온에서 5분간두었다가 4 에서 12,000 g로 15분간원심분리한뒤, RNA를포함한무색의상층액을새로운튜브로옮겼다. 여기에서동일한양의 isopropanol을첨가하여상온에서 10분간둔후 4 에서 12,000 g로 10분간원심분리하여 RNA를침전시켰다. 상층액을버린후 75% ethanol을넣고 4 에서 10분간 8,000 g로원심분리하여 RNA 침전물을공기중에서건조시킨후 DEPC 처리된물에녹여 RNA를분리하였다. 난자, 난구세포, 과립세포는 PicoPure TM RNA Isolation Kit (ARCTURUS, KIT0202) 를이용하여 total RNA를분리하였다. 이렇게각각뽑은동량의 RNA를사용하여전체반응용액이 20 µl가되도록 DNase I (Invitrogen, Carlsbad, CA) 1 U/µl을처리한후, MMLV reverse transcriptase (Promega) 와 oligo (dt) 를이용하여 cdna를합성하였다. 세포내존재하는 mrna 의 polyadenylation 상태를알아보기위해서는각각 oligo (dt) 와 hexamer 를이용하여 cdna를합성한후각유전자의발현양상을 PCR로확인하였다. 난자와난구세포, 과립세포가완전히분리되었음을증명하기위해서, 생쥐의난자특이적발현유전자로 GDF-9, 8 돼지의난자특이적발현유전자로는 Has-3의유전자발현을확인하였고, 9 난구및과립세포특이적유전자발현은생쥐는 FSH receptor, 돼지는 Has-2의유전자발현을확인하였다. 9 또한 internal control로는주로사용하는 GAPDH와 β-actin - 97 -
난자 - 난구세포복합체에서발현하는 Rpia 유전자의종특이적발현 대한생식의학회지 Table 1. Sequence of oligonucleotide primers with GenBank accession numbers, annealing temperature (AT), and expected RT-PCR product size for various genes Genes Accession No. Oligonucleotide Sequences AT ( ) Size (bp) mβ-actin NM_007393 F-GGGTGTGATGGTGGGAATGGG 60 314 R-GCTGTGGTGGTGAAGCTGTAG BC067074 BC067074 F-ACCTGCCACTCTGTTAAGAA 60 290 R-AGTTTGCCCTGTAATCTGAA mbtg4 NM_019493 F-AAACCTTTGCACTAAAGCTG 60 246 R-TGCTTTTTCTCACCATACCT mgapdh BC093598 F-ACCACAGTCCATGCCATCAC 60 512 R-TCCACCACCCTGTTGCTGTA mgdf-9 NM_008110 F-GGTTCTATCTGATAGGCGAGG 60 472 R-GGGGCTGAAGGAGGGAGG mh3f3b NM_008211 F-GACTTGAGGTTTCAAAGTGC 60 319 R-CAGTCACTCTTCCCATTCAT moas1d NM_133893 F-GTTCAACGGACAGGTAGTGT 60 304 R-GGGCGTAGACTTTGTTGTAG mkctd5 NM_027008 F-AGCTCACACAGATGGTATCC 60 350 R-AAAGCAGGTTTCTTCTCACA mrent1 NM_030680 F-AGCCAATGTGGAGAAGATAA 60 214 R-GCAGGACAGAATGATGAAGT mrpia NM_009075 F-CAGTATGGCTTAACCCTCAG 60 367 R-CAAACTTCCAGTCCAGGATA msiah2 NM_009274 F-CCATACAGAGAAACCAGAGC 60 401 R-AACTCCAGTCTGTAGGCAAA 1110006I15Rik NM_134142 F-CTGGTCAACAGAAGAAGGAG 60 312 R-ACAGCAACCAGTAGATGACC 2010007H12Rik AK008184 F-GTAGAGGAGCAGCTGAGAAA 60 392 R-TTCCAGACTTATGAGGGCTA 9530068E07Rik BC034829 F-GGAGGATAGCCATTTCTTTT 60 315 R-TCTCGGCTAAGTACCTCTTG phas2 U52524 F-GAATTACCCAGTCCTGGCTT 60 581 R-GGATAAACTGGTAGCCAACA - 98 -
제 34 권제 2 호, 2007 김윤선 윤세진 김은영 이경아 Table 1. Sequence of oligonucleotide primers with GenBank accession numbers, annealing temperature (AT), and expected RT-PCR product size for various genes Genes Accession No. Oligonucleotide Sequences AT ( ) Size (bp) phas3 U86408 F-CCTACTTTGGCTGTGTGCAA 60 525 R-AGGCTGGACATATAGAGAAG pβ-actin X03672 F-GACCCAGATCATGTTTGAGACC 60 593 R-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCAG prpia EF213106 F_ACCGACACCCAGAGATTGA 60 263 R_AATTACGCCCCCAAACTTCT 두가지를사용하였는데, 이는 GAPDH가대사에관련된유전자이기때문에본연구시스템에서발현양의변화를보일수도있는가능성때문이었다. 각유전자의 primer 서열에대한정보는 Table 1에정리하였다. 3. EST clustering 생쥐의 Rpia에대한정보는 MGI (http://www. informatics.jax.org/) 를통해확인하였고, Rpia 유전자서열은 Entrez Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/query) 에서얻었다. 생쥐의 Rpia 서열을돼지의 EST 데이터베이스를통해 (http://www.ncbi.nlm. nih.gov/blast/) 검색하여상동성이있는돼지의 EST를찾은후각각의 EST를연결하였다. 연결한돼지의 Rpia의 ORF과단백질서열을예상하는것과생쥐, 사람, 돼지단백질서열의상동성을정렬하는일은 BioEdit Sequence Alignment Editor program V7.0.0 (Tom Hall Ibis Therapeutics, Carlsbad, CA) 을사용하여수행하였다. 결과 1. GV 난자와난구세포사이에서차이나게발현하는유전자발현양상생쥐의미성숙난자와성숙난자사이에차이나게발현하는유전자들을 ACP-PCR을이용하여발굴한유전자목록중성숙난자에서많이발현하 Figure 2. RT-PCR analysis of various MII-selective genes in various mouse tissues identified by ACP-PCR method. GAPDH was used as an internal control. Genes that highly expressed in gonads, especially in ovary were selected (Red box). B, Brain; H, Heart; L, Liver; K, Kidney; S, Stomach; M, Muscle; E, Epididymis; T, Testis; O, Ovary; U, Un-pregnant Uterus; P, Placenta. 는 11개의유전자 (Btg4, H3f3b, Oas1d, Kctd5, Rent1, Rpia, Siah2, 1110006l15Rik, 2010007H12Rik, 9530068- E07Rik, BC067074) 를선택하여, 생쥐의다양한조직에서이유전자들의발현양상을 RT-PCR 을통해알아보았다. 흥미롭게도 4개의유전자 (Oas1d, Rpia, 2010007H12Rik, BC067074) 는다른조직과비교해생식소에서, 그중에서도정소보다는난소에서특히많이발현하는것을확인할수있었다 (Figure 2). 이처럼난소에서특히많이발현하는 4개의유전자의발현을다시난소내세포, 즉난자와난 - 99 -
난자 - 난구세포복합체에서발현하는 Rpia 유전자의종특이적발현 대한생식의학회지 Figure 3. RT-PCR analysis of four ovary-selective genes. cdnas were prepared by using two different methods, oligo(dt) and hexamer. For PCR reaction, cdna equivalent to that of single oocyte was used as template for amplification. GAPDH was used as an internal control. Oo; GV oocytes, Cc; Cumulus cells. 구세포에서각유전자의발현하고있는 mrna polyadenylation 상태를알아보기위하여 oligo(dt) 와 hexamer를이용하여 reverse transcription한후, PCR 하여비교해보았다 (Figure 3). Oas1d는 oligo(dt) 와 hexamer 를이용한두경우모두에서모두난자특이적으로발현함을확인할수있었으나, 반면 Rpia 는 oligo(dt) 를이용할경우에는난자특이적으로발현하였지만, hexamer를이용할경우에는난구세포에서적은양발현하는것을확인할수있었다. 2010007H12Rik, BC067074는 oligo(dt) 와 hexamer에서모두난자와난구세포에서높게발현하는것을관찰하였다. 2. EST clustering 기법을이용한돼지의 Rpia 유전자동정 생쥐의난소에서많이발현하고, 특히난자에서높게발현하는 Oas1d와 Rpia 유전자중 Oas1d는수정이후배발생단계까지중요한역할을하는유전자임이이미밝혀져보고되어있었다. 10 따라서, 본연구에서는 Rpia를연구대상으로선택하였는데, 생쥐의염기서열은알려져있음에도불구하고, 돼지의염기서열이아직밝혀져있지않으므로먼 저 EST clustering 기법을이용하여돼지의 Rpia를동정하였다. 1,834 bp의사람 Rpia (NM_144563) 를기준으로돼지의 EST BLAST 프로그램에검색하여돼지의 48개의 EST 조각이존재하는것을확인하였고 (data not shown), 이중 412 bp의 AJ662969, 724 bp의 CK454038, 610 bp의 DY416706을선택하여돼지 Rpia를연결하였다 (Figure 4A). 동정한돼지 Rpia는총 1,211 bp의길이를가지며시작코돈과정지코돈을확인함으로써 10 bp의 5'-UTR, 281 bp의 3'-UTR, 920 bp의 ORF로구성된다는것을확인할수있었다 (Figure 4B). 이렇게동정한돼지의 Rpia와각종간의아미노산서열의상동성을정렬해보면, 생쥐와는 87.5%, 사람과는 92.8% 높은상동성을가진것을확인하였다 (Figure 4C). 동정한돼지 Rpia의서열을 GenBank에등록하였다 (Accession Number EF 213106). 3. 생쥐와돼지의종특이적 Rpia 발현양상돼지에서동정한 Rpia의발현양상을난포내세포에서확인하기위해총 1,211 bp 길이의유전자중 445~758 bp 부위에 PCR 생산물이 313 bp 길이가되게 primer를만들어서, 배란전난포로부터난자, 난구세포, 과립세포를분리하여 RT-PCR 로확인하였다. 각각의세포들이잘분리되었는지확인하기위해난자특이적으로발현하는유전자와난구세포, 과립세포에서발현하는유전자를생쥐에서는 GDF-9와 FSHR를, 돼지에서는 Has2와 Has3 유전자를각각비교유전자로확인해보았다. GDF-9과 Has3는난자특이적으로발현하였고, FSHR과 Has2 는난구세포와과립세포에서발현하는것으로보아각각세포들분리가잘된것을확인하였다. 또한모든세포에서 GAPDH와 β-actin 유전자가발현하는반면생쥐의 Rpia는난포세포와과립세포에서발현하지않고난자특이적으로발현하는것을확인하였는데, 이는난자특이적으로발현하고있는유전자로알려진 GDF-9의발현양상과동일하였다. 그러나돼지에서 Rpia 발현은생쥐와차이를보였는데, 난자는물론난구세포및과립세포모두에서 - 100 -
제 34 권제 2 호, 2007 김윤선 윤세진 김은영 이경아 발현하는것을확인하였다. 이를통해 Rpia의발현은두종간에서, 특히난포내중요세포에서 Rpia 의발현이차이나는것을확인하였다 (Figure 5). 고찰포유류에서여성의생식세포인난자는매우큰핵을 (germinal vesicle; GV) 가지고있으며오랜기간동안제1 감수분열에정지되어있다. 미성숙한 GV 난자에서성숙한 MII까지성숙하는동안난자는수정이후배발생단계까지정상적으로발달할수있는충분한능력을갖추기위해핵성숙과세포질성숙과정을거치게된다. 2,3 본연구진은난자의핵성숙및세포질성숙을조절하는분자생물학적기전연구를집중하여수행하고있다. 본연구에서는 ACP-PCR로얻은 DEGs 목록중에서 Rpia라는포도당대사에주요한역할을하는유전자를선택하게된과정을설명하였다. A B - 101 -
난자 - 난구세포복합체에서발현하는 Rpia 유전자의종특이적발현 대한생식의학회지 C Figure 4. EST Clustering for porcine Rpia sequences. (A). Schematic diagram of EST clustering of porcine Rpia sequences starting from human Rpia (NM-144563). The complete coding sequence of the porcine Rpia was determined by assembling AJ662969, CK454038 and DY416706. Nucleotides 37-957 constitute the coding region of porcine Rpia. (B). The complete coding sequence of the porcine Rpia cdna and its amino-acid sequence. The porcine Rpia gene encodes the 306 amino acids for Rpia protein. (C). Alignment of amino acid sequences of Ribose 5-phosphate isomerase A in three different species, mouse, human, and porcine. Different residues are boxed, and the numbers left indicate the amino acid position in each sequence. The GenBank accession numbers for mouse, human, and porcine are NM_008618, NM_005917, and EF213106. 또한생쥐에서 Rpia를목표유전자로정함으로인해돼지의 Rpia 유전자염기서열이아직밝혀져있지않은것을발견하였고, 이에돼지의 Rpia 유전자염기서열을동정하였다. 이후, 난소에서의이유전자의발현양상을분석한결과, 생쥐의경우에는난자특이적으로발현하는데반하여, 돼지의경우에는난자, 난구세포, 과립세포모두에서 Rpia가발현함으로생쥐와돼지의두종간에 Rpia 유전자의발현양상이차이가있음을확인하였다. 난자성숙은난자와난자주위를둘러싸고있는난구세포와과립세포, 각세포간결합을통해서여러가지물질의상호교환에의해조절될뿐아니라, 각세포들의역할에의해서조절되는데, 그중난자가이모든것을지휘하는중요한역할을한다고생각되어지고있기때문에, 11 난소및난자특이적으로발현하는유전자를선택하여그기능을연구하는것은매우유용한방법이라고생각된다. 성숙난자에서높게발현하는유전자중에서도난소 - 102 -
제 34 권제 2 호, 2007 김윤선 윤세진 김은영 이경아 Figure 5. Confirmation of Rpia mrna expression in mouse and porcine follicular cells using RT-PCR. For the PCR reaction, cdna equivalent to that of single oocyte was used as templates for amplification. GAPDH and β-actin were used as an internal control. Oo; GV oocytes, Cc;Cumulus cells, Gc; Granulosa cells. 에서높게발현하는 4개의유전자의발현을 oligo (dt) 와 hexamer을이용하여비교하였는데, 그이유는 oligo(dt) 를이용하여 reverse transcription할경우에는 polyadenylation되어 poly(a) tail을가진전사체만을확인할수있지만, hexamer 를이용할경우는 mrna 서열의아무곳에서나무작위로합성되기때문에 deadenylation 되어 poly(a) tail를갖지않은형성하지못한전사체의존재까지확인해볼수있다. 12 4개의유전자중 2개, Oas1d와 Rpia의유전자의발현양상이난자에서높게발현하는결과를관찰할수있었다. 그런데, Oas1d는 oligo(dt) 와 hexamer 모두난자특이적으로발현하였으나, 이미다른연구진에의하여난자특이적으로발현함이보고되어있었고, 유전자결핍동물모델을만들어서이유전자가결핍되면난포내세포들의발달이감소하며배란이수정이후배발생단계까지중요한역할을하는유전자임이이미보고되어있었다. 10 따라서아직까지기능연구가많이되지않은 Rpia 를연구대상으로삼았는데, Rpia는 oligo(dt) 에서는난자특이적으로발현하였지만, hexamer에서는난포세포에서도적은양발현하는것을관찰할수있었다. 특정유전자의 polyadenylation된전사체들은곧 translation되어단백질을만들수있는것을의미하며, oligo(dt) 를이용하여측정가능하다. 반면 hexamer를이용하여전사체의양을측정할경우, polyadenylation된전사체이외에도 deadenylation된채로존재하는양까지도측정할수있다. 13~16 이렇게 deadenylation되어존재하고있던전사체로는특히배아발달과정에필요한몇가지의 maternal mrna가대표적인예인데, 이와같이난자내에불활성한형태로존재하다가특정한시기에특정한세포에서짧은시간안에단백질을만드는일에사용되는것으로생각된다. 16 이번연구에서생쥐의결과를위의기전을토대로생각해볼때난구세포에적은양존재하는 Rpia mrna는단백질을합성하지는않는형태로존재하고있으나, 필요한순간에언제라도 polyadenylation될수있는 pool로존재하고있는것으로추측된다. 본연구진은그동안생쥐의난자성숙과정에서차이나게발현하는유전자를발굴하고그중에서기능이알려지지않은유전자의기능연구를수행해오고있다. 이와같은기술력과정보를바탕으로생쥐의결과를돼지의난자성숙과정에접목하여, 해당유전자의기능을비교분석하는연구를수행하고있는데, 돼지의유전자중에는아직까지그염기서열이보고되어있지않은유전자가많이있다. 돼지의 Rpia 유전자도아직까지그염기서열이알려진바없었다. 따라서본연구에서 EST clustering 기법을통해돼지의 Rpia를동정하여 GenBank에등록하였다 (Accession Number EF 213106). EST clustering 기법은 database에등록되어있는유전자의조각즉, EST 서열들을 computer상에서생명정보학적방법을이용하여 overlap되는부분을중심으로서로연결하고 NCBI에서 Uni- Gene과같은서열을예측함으로써유전자의염기서열을동정할수있는방법이다. 17 실제로돼지에서많은유전자들이 EST 서열로만존재하고전체염기서열이밝혀져있지않은데, 생쥐에서밝혀진유전자들의정보를바탕으로돼지에서동정하는일은돼지에서유전자서열을새로밝히는일뿐아니라돼지의난자성숙과정의분자생물학적기전을연구하는데중요한자료가될것이다. - 103 -
난자 - 난구세포복합체에서발현하는 Rpia 유전자의종특이적발현 대한생식의학회지 Rpia는포도당대사과정중 PPP에필수적인효소이며, 더욱이돼지에서동정한것이흥미롭고중요한것은돼지난자의 PPP는다른종과매우다른독특한특징을보이는데, 그활성이체외배양과체내배양할때큰차이를보이는것이다. 생쥐난자의경우체외, 체내배양할때비슷하게 PPP 가활성되지만돼지난자의경우체외배양할때 PPP의활성이 8배이상떨어지며 PPP 활성을억제하는물질을첨가했을때 Glutatione (GSH) 양이함께떨어졌다고보고되어있다. 18 GSH는항산화물질로써활성산소로부터난자를보호해주는역할을하고, 정자의 decondensation에참여하며전핵을형성하는데중요한역할을하여수정이후정상적인배발생단계에도중요한역할을한다. 19 이를통해돼지난자의 PPP의활성은핵성숙뿐만아니라세포질성숙에도많은영향을끼친다는것을알수있다. 본연구에서생쥐와돼지에서 Rpia가난자및난구세포, 과립세포에서의발현이매우다른것을확인하였는데, 생쥐에서난자특이적으로발현하는반면에돼지에서는난자, 난구세포, 과립세포에서모두발현하는것을확인할수있었다. 그러나, hexamer를이용한 RT-PCR 결과로부터생쥐의경우에도난구세포에서 deadenylation된형태의 Rpia 전사체는적은양존재하고있다는것을알수있었는데, 이사실은세포의에너지대사의변화가필요한순간즉각적인변화를갖기위한전략으로보이며, 이것이난자성숙을세밀하게조절하기위한기전의하나인것으로생각된다. 본연구결과, 대사에연관되어있는효소들의발현이특히난자와난구세포에서발현하고있는양상이생쥐와돼지, 두종간에차이나는것은또한각세포의 PPP 활성의차이와깊은연관이있을것이라생각할수있다. 이와같은차이가난자의체외성숙시생쥐와돼지의성숙율및성숙난의품질의차이와깊은관련이있을것으로추측된다. 돼지난자는보통 70% 이상핵성숙이진행되어도세포질성숙까지잘진행되지않아 polyspermy 등다른종에비해 배아생성성공률이매우낮은데이와같은문제점의해결을각세포의에너지대사경로의차이와연관하여풀어갈수있을것으로사료된다. 20 최근종간 PPP 활성의차이를통해돼지난자의체외배양시배양액에 PPP를활성시킬수있는 NADP, PRPP, R-5-P 등을넣어난자성숙율을높인실험들이진행되고있다. 21,22 이처럼서로다른종간대사관련유전자의발현차이에관한연구는보다나은난자의체외성숙, 체외수정, 체외배양시스템을구축하는데중요한자료가될것이다. 체외배양시난자성숙율과배발생율의종간의차이는 PPP 활성차이뿐만아니라아직까지많이알려져있지않은여러가지분자생물학적기전의차이때문일것이라생각할수있는데이부분에대한후속연구가활발히진행되어야할것으로생각된다. 본연구를기반으로생쥐에서미성숙난자와성숙한난자에서차이나게발현하는유전자목록을중심으로여러유전자의기능을연구하는가운데중요한분자생물학적기전에관련된유전자를발굴하고, 이에따른돼지의유전자염기서열을발굴하여, 종간난자성숙의기전의차이를이해한다면다른종보다현저히낮은배발생율을가지고있는돼지, 나아가서는사람에서의체외성숙및배아발달의성적을높일수있는새로운체외배양시스템구축할수있을것이라기대한다. 참고문헌 1. Yoon SJ, Chung HM, Cha KY, Kim NH, Lee KA. Differentially expressed mrna profiles between immature germinal vesicle (GV) and mature metaphase II (MII) mouse oocytes. Dev. Reprod 2004; 8: 35-42. 2. Barnes FL, Sirad MA. Oocyte maturation. Semin Reprod Med 2000; 18: 123-31. 3. Sirard MA. Resumption of meiosis: mechanism involved in meiotic progression and its relation with developmental competence. Theriogenol 2001; 55: 1241-54. 4. Yoon SJ, Koo DB, Park JS, Choi KH, Han YM, Lee KA. Role - 104 -
제 34 권제 2 호, 2007 김윤선 윤세진 김은영 이경아 of cytosolic malate dehydrogenase in oocyte maturation and embryo development. Fertil. Steril 2006; 86(S3): 1129-36. 5. Colton SA, Humpherson PG, Leese HJ, Downs SM. Physiological changes in oocyte-cumulus cell complexes from diabetic mice that potentially influence meiotic regulation. Biol Reprod 2003; 69: 761-70. 6. Downs SM, Humpherson PG, Leese HJ. Meiotic induction in cumulus cell-enclosed mouse oocytes: involvement of the pentose phosphate pathway. Biol Reprod 1998; 58: 1084-94. 7. Sato H, Iwata T, Hayashi K, Kimura T, Kuwayama Y, Monji Y. The effect of glucose on the progression of the nuclear maturation of pig oocytes. Anim Reprod Sci 2007; 99: 299-305. 8. McGrath SA, Esquela AF, Lee SJ. Oocyte-specific expression of growth/differentiation factor-9. Mol Endocrinol 1995; 9: 131-6. 9. Kimura NK, Konno Y, Miyoshi K, Matsumoto H, Sato E. Expression of hyaluronan synthases and CD44 messenger RNAs in porcine cumulus-oocytes complexes during in vitro maturation. Biol Reprod 2002; 66: 707-17. 10. Yan W, Ma L, Stein P, Pangas SA, Burns KH, Bai Y, et al. Mice deficient in oocyte-specific oligoadenylate synthetaselike protein OAS1D display reduced fertility. Mol Cell Biol 2005; 25: 4615-24. 11. Eppig J. Oocyte control of ovarian follicular development and function in mammals. Reprod 2001; 122: 829-38. 12. Lequarre A, Traverso J, Marchandise J, Donnay I. Poly(A) RNA is reduced by half during bovine oocyte maturation but increases when meiotic arrest is maintained with CDK inhibitors. Biol Reprod 2004; 71: 425-31. 13. Bettegowda A, Patel OV, Ireland JJ, Smith GW. Quantitative analysis of messenger RNA abundance for ribosomal protein L-15, cyclophilin-a, phosphoglycerokinase, β-glucuronidase, glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase, β-actin, and histone H2A during bovine oocyte maturation and early embryogenesis in vitro. Mol Reprod Dev 2006; 73: 267-78. 14. Lequarre AS, Traverso JM, Marchandise J, Donnay I. An embryonic poly(a)-binding protein (epab) is expressed in mouse oocytes and early preimplantation embryos. Proc Natl Acad Sci USA 2005; 102: 367-72. 15. Piccioni F, Zappavigna V, Verrotti AC. Translational regulation during oogenesis and early development: The cap-poly(a) tail relationship. C R Biol 2005; 328: 863-81. 16. Oh B, Hwang S, McLaughlin J, Solter D, Knowles BB. Timely translation during the mouse oocyte-to-embryo transition. Development 2000; 127: 3795-803. 17. Hwang SJ, Park CE, Hwang KC, Lee KA. Identification of a novel gene by EST clustering and its expression in mouse ovary and testis. Korean J Fertil Steril 2006; 33: 253-63. 18. Herrick JR, Brad AM, Krisher RL. Chemical manipulation of glucose metabolism in porcine oocytes: effects on nuclear and cytoplasmic maturation in vitro. Reprod 2006; 131: 289-98. 19. Yoshida M, Mizoguchi Y, Ishigaki K, Kojima T, Nagai T. Birth of piglets derived from in vitro fertilization of pig oocytes matured in vitro. Theriogenol 1993; 39: 1303-11. 20. Krisher RL, Brad JR, Herrick ML, Sparman JE, Swain. A comparative analysis of metabolism and viability in porcine oocytes during in vitro maturation. Anim Reprod Sci 2007; 98: 72-96. 21. Singh B, Meng L, Rutledge JM, Armstrong DT. Effects of epidermal growth factor and follicle stimulating hormone during in vitro maturation on cytoplasmic maturation of porcine oocytes. Mol Reprod Dev 1997; 46: 401-7. 22. Tubman L, Peter A, Krisher R. Pentose phosphate pathway activity controls nuclear maturation of porcine oocytes. Reprod Fertil 2006; 18: 279-80. - 105 -
난자 - 난구세포복합체에서발현하는 Rpia 유전자의종특이적발현 대한생식의학회지 = 국문초록 = 목적 : 본연구진은선행연구를통하여생쥐의미성숙난자와성숙난자사이에차이나게발현하는유전자 (DEGs) 의목록을보유하고있는데, 1 그중에서 pentose phosphate pathway (PPP) 에필수적효소인 Ribose 5-phosphate isomerase A (Rpia) 를선택하여본연구를수행하였다. 난자성숙과정에관련된 Rpia의기능을알아보기위한기초연구로서생쥐와돼지의난소에서 Rpia의발현을비교분석하였다. 연구방법 : 생쥐의각조직에서 11개의 MII-selective DEGs의발현을 RT-PCR 방법으로확인하여난소에서강하게발현하는 4개의유전자를선택하였고, 다시이들 4개유전자중난자에서높게발현하는 Rpia를선택하여생쥐및돼지의난자, 난구세포, 과립세포에서의발현을비교분석하였다. 돼지 Rpia 염기서열은밝혀져있지않아 EST clustering 기법을통해동정하였다. 결과 : EST clustering 기법으로찾아낸돼지 Rpia 염기서열은 GenBank에등록하였고 (Accession Number: EF213106), 이를근거로 primer를작성하여 RT-PCR을수행하였다. Rpia 유전자는생쥐에서는난자특이적으로발현하는반면돼지에서는난자, 난구세포, 과립세포에서모두발현하는차이점을발견하였다. 결론 : 본연구는생쥐와돼지의난소에서 Rpia 유전자동정에대한첫보고로서, 본연구결과로부터생쥐와돼지의 COCs는서로다른경로로포도당의대사가일어나는것을알수있었다. 따라서이와같은차이점이두종의난자를체외배양할때나타나는난자성숙률의차이를가져오는기전중의하나가아닐까추측된다. 난자성숙을조절하는기전을연구함과동시에체외에서난자성숙이어려운종의최적의 IVM (in vitro maturation) 조건을찾기위해서는앞으로난자와주변세포의포도당대사과정에미치는 Rpia의기능에대한후속연구가필요할것으로사료된다. 중심단어 : EST clustering, 체외성숙, 펜토오스인산경로, Ribose 5-phosphate isomerase A (Rpia) - 106 -