212 / 홍삼및사상자, 산수유혼합추출물섭취와표피세라마이드 은 피지막의 주요 구성 지질인 함량을 감소시켜 피 지막 층상 구조의 파괴를 야기하고 궁극적으로 수분손실 증가 에 의한 피부 건조를 유발한다 손실을 막기 위 해 자외선 차단제를 피부에 직접 도포하거나 증진 효 과

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212 / 홍삼및사상자, 산수유혼합추출물섭취와표피세라마이드 은 피지막의 주요 구성 지질인 함량을 감소시켜 피 지막 층상 구조의 파괴를 야기하고 궁극적으로 수분손실 증가 에 의한 피부 건조를 유발한다 손실을 막기 위 해 자외선 차단제를 피부에 직접 도포하거나 증진 효 과가 있는 기능성 식품 또는 의약품 등의 사용이 일반화 되고 있다 특히 최근에는 식생활을 통해 피부와 연관성을 지닌 특 정 영양성분 및 식이 소재를 섭취하여 생성을 증가 시키고 장기적인 피부손상을 좀 더 효과적으로 예방할 수 있는 방법에 대한 관심이 높아지고 있다 생성을 증가시키는 식이 소재로 홍삼을 이용하고 자 하는 시도가 진행되고 있다 홍삼은 동양뿐 아니라 서구에 서도 강장제 또는 건강식품 그리고 대체의학의 - 로서 사용되어 왔다 홍삼의 학명은 로 이는 백삼과 달리 수삼을 증숙한 후 건조하여 제조 한 것으로 이러한 과정에 의한 화학성분의 변화가 수삼 또는 백 삼과는 다른 홍삼의 생리활성 변화를 유도하는 것으로 알려져 있고 부작용이 거의 없는 생약으로 인정되어 소비자의 효능에 대한 인지도는 가장 높다고 할 수 있다 검증되는 효능들 중 동물 및 실험을 통해서 항산화 작용을 통한 항피로 항노화 작용과 관련된 효능 보고가 이어지고 있는데 이는 특 히 홍삼의 특수 제조과정에서 생성되는 이 의 구조와 매우 흡사하여 인체 노화 억제를 야기 하는 것에 기인 한다 홍삼 함유 건강식품에는 원료 단가의 경감을 위해 빈번 히 사상자 와 산수유 를 첨가한 다 사상자는 산형과에 속하는 사상 의 과실 로써 식품공전 상에 식품부원료로 분류되어 있으며 습창 완 선 음중 옴 등의 피부 질환에 유효하다고 알려져 있다 산 수유는 산수유나무 의 과육 으로 씨를 제거하여 사용하며 생리활성으로는 항산화 항균 항 알러지 및 미백 작용이 보고되어 있고 특히 피부의 색소 침 착을 억제한다는 보고가 있다 시중에 홍삼 사상자 산수유 를 함유한 건강기능식품이 상용되고 있으며 건강한 피부 유지 기능이 있는 것으로 여겨지고 있으나 아직까지 구체적으로 이 들 혼합 추출물과 표피 의 관계를 밝혀 광노화에 효 과적임을 입증하는 연구가 미흡한 실정이다 이에 본 연구에서 는 자외선 조사에 의해 노화가 유도된 무모생쥐에서 홍삼 사 상자 산수유 혼합 추출물의 식이 공급이 표피 함량 및 관련인자 발현에 미치는 영향에 대해 알아보고자 하였다 재료및방법 재료및시약 - 는 주 바이오니아에서 구입하였고 - - 는 주 서 린바이오사이언스에서 구입하였다 - 와 는 주 대명사이언스에서 구입하였다 단백질 발 현에 사용되는 와 차 항체 는 에서 주문 제작하여 사용하였다 실험동물 내외의 수컷 - 무모생쥐를 중앙 실험동물 사육장 으로부터 공급 받아서 사료와 물을 마음껏 섭취 하도록 하며 온도 ± 습도 ± 가 유지되고 시간 간격으로 명 암을 바꿔주는 동물 무균 실에서 적응시켰다 자외선조사 약 정도의 를 함유하고 있음 - 을 사용하여 주일에 회 동물의 등 부위에 조사하였다 첫째 주는 씩 둘째주는 셋째주는 넷째주부터 다섯째주까지는 를 조사하여 주름살을 유도하였다 홍삼, 사상자및산수유혼합추출물본 연구에 사용한 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물은 한 국인삼공사 에서 제공받 았다 제공받은 이들 혼합 추출물은 한국산 홍삼추출 분말과 중국산 사상자 및 산수유 혼합 분말이 의 비율로 함유되어 있었다 홍삼 추출 분 말은 년근 홍삼에 주정을 배량 가하여 에서 시간 추출한 다음 상층액과 침전물을 분리하여 회 반복하였 다 사상자는 중국산을 사용하였고 산수유는 국산으로 시중에 서 구입하여 사용하였다 정제수를 비율의 사상자 및 산수유 중량의 배량을 가하여 에서 시간동안 추출한 후 원심분 리 여과한 상층액을 감압 농축하여 수분함량 의 엑기스를 제조한 다음 동결 건조하였다 준비한 홍삼 사상자 및 산수유 혼 합 추출물의 지표물질은 - 및 이 각각 으로 파악되었다 식이구성실험 식이로 사육하기 전 주 동안 고형배합 사료로 적응시 켰다 체중에 따라 난괴법으로 군으로 나눈 후 실험군은 자외 선 조사와 병행하여 실험 식이를 주간 공급하였다 각 실험군 의 식이 조성은 과 같으며 식이 지방은 식이 무게의 로 고정시키고 을 공급하였다 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물의 식이 급여군은 전체 식이 무게의 군 군 에 상응하는 분말을 식이에 혼합하여 공급하였 다 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물 분말의 사용에서 생 기는 건분 식이 무게 차이는 옥수수 전분을 감하여 조정하였

한국영양학회지 (Korean J Nutr) 2012; 45(3): 211 ~ 217 / 213 다 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물이 함유되어 있지 않는 식이를 주간 공급받는 군 정상대조군 군 을 양성대조군으 로 이들 혼합 추출물이 함유되어 있지 않는 식이와 함께 자외 선 조사를 주간 병행하는 군 자외선 조사 대조군 군 은 음 성대조군으로 두었다 체중및실험식이섭취량측정식이효율 측정을 위해 주 회 체중과 남은 식이량 및 공급량 을 측정하였고 식이효율은 실험기간 동안의 체중증가량을 식 이섭취량으로 나누어 계산하였다 주간의 식이 급여 후 체중 증가량 식이섭취량 및 식이효율은 군간의 유의성이 없었다 - 표피조직의분리식이 급여 주에 의 방법으로 희생시키 고 얻어진 피부조직에 을 아랫방향으로 넣은 후 와 을 비율로 혼합한 용액을 첨가하여 에서 시간동안 반응시켜 표피를 분리하였다 항체제작 의 차 항체는 을 기준으로 하여 에서 를 가지는 몇 개 의 위치를 찾아내었다 그 중 - 끝부분에 위치 하고 가 상대적으로 가장 높은 을 선택한 후 다른 단백질 Tale 1. Diet composition of experimental groups (g/kg) Ingredients Experimental groups Cornstarch 372 372 367 362 Sucrose 200 200 200 200 Cellulose powder 050 050 050 050 Corn oil 100 100 100 100 Vitamin mixture 1) 010 010 010 010 Salt mixture 2) 035 035 035 035 L-cystine 003 003 003 003 Casein 3) 230 230 230 230 Medicinal plant mixture contained diet - - 5 10 Firoin - + + + Composition is in units of g/kg of diet. Group C, hairless mice fed a control diet without UV irradiation for 5 weeks; groups UV, M0.5, and M1.0, hairless mice fed a control diet (UV) or diets supplemented with 0.5% (M0.5) or 1.0% (M1.0) of red ginseng extracts mixed with Torilis fructus and Corni fructus (66.7% red ginseng) contained diet in parallel with UV irradiation for 5 wks 1) AIN-93 Vitamin Mix #310025 (Dyets Inc., Bethlehem, PA) 39) 2) AIN-93G salt mix 3210025 (Dyets Inc.) 39) 3) Casein (nitrogen 6.25), 870 g/kg 과의 일치성을 을 통해 살펴보았다 의 차 항체는 을 기준으로 와 같은 방법으로 진행하여 - 을 선택하였다 각각 의 차 항체 와 의 는 에 하여 에 주입하였다 항체 생성여부는 효소면 역측정법으로 확인하고 심장 채혈 후 혈청을 을 사용하여 하여 항체로 사용하였다 Ceramides 함량측정 의 정량분석을 위해 실험동물에서 채취된 표피 조 직에 - μ 을 가하여 으로 분쇄하고 용액 μ 을 첨가하여 분 동안 원심분리 하였다 이 과정을 회 반복 후 모아진 하층액을 로 건조시키고 을 함 λ 를 이용하여 분석하였다 분석에 이용한 은 μ 을 사용하였고 는 과 의 혼 합액을 사용하였으며 는 흡광도는 에서 측정하였다 Serine palmitoyl transferase (SPT) 와 ceramidase 의 mrna 발현변화분리한 표피조직에 - 를 이 용하여 를 분리 정제하고 파장 에서 정량하였다 μ μ 를 에서 분간 가열하고 에서 분 동안 방치한 후 μ μ μ μ μ - μ 유한 을 첨가한 후 한 을 - μ - μ μ - - 증류수를 첨가하여 에서 시간 동안 가열하여 를 합성하였다 의 μ 및 - - μ 를 각각 합성된 μ 에 - - 와 함께 - 주 바이오니아 에 첨가하여 - 은 에서 분 은 에서 분 - 은 에서 분 동안 로 진행하였다 -

214 / 홍삼및사상자, 산수유혼합추출물섭취와표피세라마이드 의 은 μ μ 이며 - 은 에서 분 은 에서 분 초 - 은 에서 분 동안 로 진행하였다 와 의 는 각각 이며 생성물은 에서 확인하였다 생성물의 양 은 인 를 기준으로 정량하였으며 를 사 용하여 측정하였다 Serine palmitoyl transferase 와 ceramidase 의단백질발현분리된 표피 조직의 단백질 정량은 을 표준으로 한 - 를 이용하여 에 서 흡광도를 측정하여 정량하였다 준비된 상층액을 에서 분간 가열한 다음 에서 전기 영동시킨 후 에 흡착시켰다 차 항체 - 를 에서 시간동안 한 후 로 분씩 회 세척하였다 - - 차 항체와 실온 에서 시간 동안 반응 시킨 후 로 회 세척하고 발색은 으로 확인하였다 각 의 는 - 를 사용하 여 정량하였으며 β- 의 발현을 기준으로 로 나 타내었다 통계분석모든 실험 결과는 을 이용하여 분 석하였으며 그 결과는 평균 ± 표준오차 - 로 표시 하였다 각 실험군의 평균의 차이는 의 를 사용하여 < 에서 유의성을 검증하였 다 결 표피세라마이드의총함량변화피부의 자외선 노출은 표피장벽의 붕괴 와 더불어 표피 세 라마이드 또는 그들의 대사 물질의 감소에 의해 피부의 장벽 항상성 유지를 방해한다고 알려져 있다 주간의 식이 공급 후 각 군의 표피에서 측정된 총 세라마이드 함량은 군 이 군에 비해 유의적으로 낮았다 군의 표피 세라 마이드 총 함량은 군 뿐 아니라 군 보다도 유의적으로 높 은 수준이었다 반면 군의 세라마이드 총 함량은 군과 과 Ceramides (ng/μg protein) 800 700 600 500 400 300 200 100 0 유사한 수준이었다 이러한 결과에서 군의 세라마이드 총 함량 증가는 식이 수준의 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추 출물 섭취가 표피 세라마이드의 함량을 증가시켜 자외선 조사 로 손상된 각질층의 장벽을 회복시켰음을 의미한다 c Groups Fig. 1. Ceramide levels in the epidermis of hairless mice fed a control diets without UV irradiation for 5 weeks (group C) and UV-irradiated hairless mice fed a control diet (group UV) or diets supplemented with 0.5% (M0.5) or 1.0% (M1.0) of red ginseng extracts mixed with Torilis fructus and Corni fructus (66.7% red ginseng) in parallel with UV irradiation for 5 weeks. The ceramide levels were determined in the epidermis of group C, UV, M0.5, and M1.0 y highperformance thin-layer chromatography and expressed as ng of ceramides/μg of protein. Date are mean ± SEM (n = 10). Values without a common letter are significant different (p < 0.05) using one-way ANOVA and Duncan s multiple range test. 표피 SPT 및 ceramidase 의 mrna 와단백질발현자외선 조사와 병행된 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물 의 섭취로 인한 세라마이드 함량 변화를 설명하기 위해 및 의 단백질 발현을 살펴보았다 는 세라 마이드 합성 과정에서 세라마이드를 증가시키는 주요 효소이고 는 세라마이드 분해 효소이다 군 의 단백질 발현은 군과 유사한 수준이었으나 군은 군에 비해 유의적으로 매우 높게 나타났다 군의 - 발현은 군에 비해 유의적으로 현격히 높게 나타났으 며 군은 군과 비교하여 유사한 수준으로 감소하였다 반 면 군의 발현은 모두 군과 유사한 수준이었으나 - 발현은 군 및 군과 유사하였다 즉 이 결과는 자 외선 조사로 인한 표피 세라마이드 함량 감소는 단 백질 발현 증가와 병행되었고 군의 표피 세라마이드 함량 증가는 의 단백질 발현 증가와 함께 세라마이드 함량 증가가 병행되었음을 의미한다 의 단백질 발 현은 군에서 의 단백질 발현은 군에서 유의적으 로 높게 나타났지만 와 의 발현을 분 석한 결과 각 군 간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다 - 이상의 결과는 식이 수준의 홍삼 사상자 및 산수 유 혼합 추출물의 주간의 식이 공급은 의 단백질 발현 증 가와 더불어 표피 세라마이드 함량을 증가시켰음을 제시한다 a c

한국영양학회지 (Korean J Nutr) 2012; 45(3): 211 ~ 217 / 215 %Control (SPT/actin) %Control (ceramidase/actin) 800 700 600 500 400 300 200 100 0 700 600 500 400 300 200 100 0 SPT Ceramidase A B Actin 고 a SPT protein Groups 본 연구는 자외선 조사에 의해 광노화가 유도된 무모생쥐에 서 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물의 식이공급이 세라마 찰 a Ceramidase protein a Groups Fig. 2. Altered expression of SPT and ceramidase proteins in the epidermis of hairless mice fed a control diet without UV irradiation for 5 weeks (group C) and UV-irradiated hairless mice fed a control diet (group UV) or diets supplemented with 0.5% (M0.5) or 1.0%(M1.0) of red ginseng extracts mixed with Torilis fructus and Corni fructus (66.7% red ginseng) in parallel with UV irradiation for 5 weeks. A: Representative expressions of SPT and ceramidase protein in epidermis of mice. Protein extracts (15 μg each) from groups C, UV, M0.5, and M1.0 were sujected to 10% sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis and immunolotted with polyclonal antiserum against SPT (67 kda) or ceramidase (45 kda) and with actin (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)-specific antiodies. The region of gel shown for SPT was etween the 62- and 83-kDa prestained molecular markers. The region of each gel shown for ceramidase and actin was etween the 34- and 55-kDa prestained molecular markers. B: The signal intensities from multiple experiments of (A) were quantified, and the integrated areas were normalized, first to the corresponding value of actin and then to the signal oserved in the normal control group (group C). Data are mean ± SEM (n = 10). Values without a common letter are significant different (p < 0.05) using one-way ANOVA and Duncan s multiple range test. 이드 및 관련인자 발현에 미치는 영향을 조사하였다 자외선 노출은 피부 조직의 과증식 거침 주름형성 색소 침착 등과 유해 현상을 유발시킬 뿐 아니라 표피장벽의 붕괴 와 더불어 표피 세라마이드 또는 그들의 대사 물질에 의해 피부의 장벽 항상성 유지를 방해하여 피부 건조를 유발한다 광노화 유도 후 측정한 군의 피부 보습은 군 보다 감소하여 피부 건조화를 유발하였지만 홍삼 함유 건강기능식품을 전체식이의 또는 수준에 섭취시킨 군 및 군은 군과 비교하여 유사한 수치를 보여 피부 보습에 변화를 초래하지 않았다 그러나 피부장벽의 주요 구성 지질로 피부 보습의 생체지표인 총 세라마이드 함량은 군이 군에 비해 감소한 반면 군에서는 표피의 세라마이드 총 함량이 군 보다도 유의적으로 높았다 등은 자외선 조사된 쥐의 표피에서 세라마이드 생성이 억제됨을 보고하였다 또한 등의 논문에서는 주요 자외선인 조사군에서 각질층의 가 유의적으로 감소함을 보고하였다 이들 연구와 연관하여 본 연구 결과에서 군에 비해 군의 표피 총 세라마이드 함량이 현격하게 저하되었음은 자외선에 의한 세라마이드 감소로 볼 수 있으며 이것과 비교하여 군의 세라마이드 총 함량 증가는 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물의 식이 공급이 표피 세라마이드의 함량 증가를 초래하여 자외선 조사로 손상된 표피 장벽 복구를 야기 시켰다고 볼 수 있다 이상의 결과에서 주간의 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물의 식이 공급은 자외선 조사로 인해 유도된 피부 건조화를 개선시키기에는 충분하지 않은 기간이었으나 피부 장벽의 주요 지질인 표피의 세라마이드 함량은 증가시켰음을 알 수 있다 자외선 조사와 병행된 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물의 식이 공급으로 인한 세라마이드 함량 변화를 설명하기 위해 살펴본 및 의 발현은 군 간 유의성을 보이지 않았으나 군의 의 단백질 발현은 군에 비해 유의적으로 매우 높게 나타났으므로 자외선 조사로 인한 표피 세라마이드 함량 감소는 단백질 발현 증가에 의한 결과로 보인다 반면 군의 의 단백질 발현은 군과 유사한 수준이었으나 군은 군과 비교하여 유의적으로 현격히 높은 수치를 보였는데 이는 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물의 식이공급에 의한 표피 세라마이드 함량 증가는 단백질 발현 증가와 더불어 세라마이드 함량이 증가되었기 때문으로 보인다 는 과 가 결합하여 - - 의 중간산물을 거쳐 합성된다 이 합성 과정에 가 주요 효소로 작용하는 것으로 밝혀져 있으며 합성 이외에 세

216 / 홍삼및사상자, 산수유혼합추출물섭취와표피세라마이드 Tale 2. Altered mrna levels of SPT and ceramidase in the epidermis of hairless mice Percentage of control in group 1) SPT (SPT/GAPDH) 3) 100.00 ± 0.00 a,2) 62.63 ± 10.85 a 98.18 ± 24.81 a 105.59 ± 23.86 a Ceramidase (ceramidase/gapdh) 100.00 ± 0.00 a,2) 219.20 ± 109.25 a 91.36 ± 28.44 a 144.27 ± 9.79 a 0 1) Data are mean ± SEM value (n = 10). Group C, hairless mice fed a control diet without UV irradiation for 5 weeks; groups UV, M0.5, and M1.0, hairless mice fed a control diet (UV) or diets supplemented with 0.5% (M0.5) or 1.0% (M1.0) of red ginseng extracts mixed with Torilis fructus and Corni fructus (66.7% red ginseng) in parallel with UV irradiation for 5 weeks 2) Date are mean ± SEM (n = 10). Values without a common letter in the same row are significantly different (p < 0.05) using one-way ANOVA and Duncan s multiple range test 3) Total RNA in the epidermis of group C, UV, M0.5, and M1.0 was isolated, and real-time PCR was performed for SPT and ceramidase mrnas. The signal intensities from real-time PCR analysis were quantified and normalized, first to the corresponding values for the GAPDH internal controls and then to that of normal control group (group C) 라마이드 함량을 증가시키는 요인으로 의 활성을 통한 가수분해의 증가와 의 활성을 통한 - 가수분해 증가가 알려져 있으며 이외에 및 효소들 또한 그 중요성이 부각되고 있다 한편으로 자외선 조사가 세라마이드 생성을 증가시킨다는 본 연구와 상반되는 연구 보고가 있으나 이는 일 미만의 단기적인 자외선 조사의 경우로 주간 저용량의 장기적인 자외선 조사를 시행한 본 연구와는 다른 경우이다 본 연구에서 장기적인 저용량의 자외선 조사와 병행된 식이 수준의 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물의 섭취는 표피 장벽 유지의 주요 구성 지질인 세라마이드 함량을 증가시켰으나 군에 비해 감소된 단백질 발현에도 불구하고 식이 수준의 동일한 혼합 추출물 급여군 군 은 효능이 나타나지 않아 이는 긍정적 결과를 위한 건강기능 식품섭취에는 적정 용량이 있음을 제안한다 홍삼 및 사상자 산수유에는 지표물질인 - 및 이외의 페놀성 화합물 폴리아세틸린계 화합물 등 여러 성분들이 함유되어 있으며 이들이 항상 용량 의존적인 방식으로 활성화 되는 것은 아니다 즉 및 식이 공급시 서로 상반되는 결과가 초래된 것은 여러 함유 성분들의 상호 상승 및 억제 등의 복합적인 작용에 의한 것으로 여겨지며 이들 지표성분들의 혼합에 의한 세라마이드 함량 및 관련효소의 발현 또는 활성 변화에 대한 연구가 추후 진행될 필요성이 있다 또한 본 연구의 사전 연구인 등의 논문에서는 혼합 추출물이 아닌 홍삼 추출물 자체 성분 섭취에 따른 피부 장벽 유지 기능에 대해 살펴보았으며 그 결과는 식이 수준에서만 세라마이드 함량을 증가시킨 본 연구의 결과와 유사하였다 예로부터 습창 완선 옴 등이 피부 질환에 유효하다고 기록되어 있는 사상자 와 항산화 항알러지의 생리활성과 함께 피부 주름 억제 효능이 보고되어 있는 산수유 를 홍삼과 혼합하여 건강기능식품을 만들 경우 홍삼 자체 성분과 비교하여 효능은 유사하지만 단가를 감소시킬 수 있다는 점에 기여할 것으로 여겨진다 요약및결론 자외선 조사에 의한 피부 광노화 유도와 함께 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물의 식이 공급이 무모생쥐 표피의 세라 마이드 함량 및 관련인자 발현에 미치는 영향을 알아보았으며 그 결과는 다음과 같다 주간 자외선 조사를 받은 군 의 세라마이드 함량은 자외선 조사를 하지 않은 군 - 에 비해 현저히 낮았다 주간 자외선 조사와 함께 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물을 식이 무게의 공급한 군의 표피 세라마이 드 함량은 군보다 유의적으로 높았다 군의 의 단백질 발현양은 군에 비해 높게 증 가되었고 군의 의 단백질 발현 양은 군에 비 해 유의적으로 높았다 주간 자외선 조사와 함께 홍삼 사상자 및 산수유 혼합 추출물을 수준으로 식이 공급한 군은 군에 비해 감소된 단백질의 감소에도 불구하고 표피 세라마 이드 함량이 군과 유사한 수준으로 낮았다 주간 식이 공급 후 및 의 발현 양은 군간 유의적인 차이를 보이지 않았다 이상의 결과는 식이 수준의 홍삼 사상자 및 산수유 혼 합 추출물 섭취는 표피 세라마이드 함량을 높이는데 효과적임 을 제시한다 Literature cited 1) Elias PM. Epidermal lipids, arrier function, and desquamation. J Invest Dermatol 1983; 80 Suppl 1: 44s-49s 2) Feingold KR, Schmuth M, Elias PM. The regulation of permeaility arrier homeostasis. J Invest Dermatol 2007; 127(7): 1574-1576

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