원저 Korean Circulation J 2003;33(9):813-820 심장근육모세포주 H9c2에서산화스트레스에의한열충격단백질 (Heat Shock Protein) 과액틴의변화 강원대학교의과대학해부학교실 박정현 강한솔 Changes of Heat Shock Proteins and Actin Induced by Oxiative Stress in Cultured H9c2 Cell Line Jeong Hyun Park, MD and Han Sol Kang, BS Department of Anatomy, College of Medicine, Kangwon National University, Chuncheon, Korea ABSTRACT Background and Objectives:Even though they are identified on the basis of their induction by elevated temperatures, heat shock proteins are induced by various stimuli. Such inducers include viral infection, exposure to ethanol, sodium arsenite, steroid hormones and heavy metals. They become involved under pathological conditions, such as anoxia/ischemia, reperfusion injury and oxidative stress in the heart. In this research, the cellular damages and changes of Hsp25 and αb crytallin were investigated under oxidative stress induced H 2 O 2 treatment in a cultured cardiomyoblast cell line, H9c2. Materials and Methods:The morphological changes of the H9c2, and the distributions of Hsp25 and αb crytallin, were examined with phase-contrast, confocal and electron microscopy. The levels of Hsp25 and αb crytallin expressions within the cells were also checked. Results:After exposure to a low concentration (10 μm) of H 2 O 2, the amounts of Hsp25 and αb crytallin were increased more than in the control and heat shock groups. They were particularly localized in the perinuclear region and along the actin filament. When exposed to a high concentration (more than 100 μm) of H 2 O 2, many cells developed apoptotic features, such as vacuolization, blebbing and apoptotic body formations. The amounts of Hsp25 and αb crytallin were decreased more than in the control group. However, a weak reaction in the perinuclear region and along the actin filaments still remained when observed under confocal microscopy. Conclusion:These results suggest that the elevation of the expressions of Hsp25 and αb crytallin were dependent on the concentration of H 2 O 2. Additionally, the redistribution of these small Hsps is closely associated with the actin filaments, as well as the nuclei. Therefore, much more research will be essential for the elucidation of roles of Hsp25 and αb crytallin in oxidative stress, such as ischemia or ischemic-reperfusion injury. (Korean Circulation J 2003;33 (9):813-820) KEY WORDS:Heat shock protein;actin;oxidative stress;h9c2. 서 현대인의심장질환은운동부족, 식생활변화, 노인인 론 구의증가에따라그유병률이점차높아지고있다. 이런심장질환은대부분당뇨병, 고혈압과같은성인의만성질환과동반하여관상동맥질환폐쇄로나타나는데, 논문접수일 :2003 년 5 월 30 일심사완료일 :2003 년 7 월 04 일교신저자 : 박정현, 200-701 강원도춘천시효자 2 동강원대학교의과대학해부학교실전화 :(033) 250-8814 전송 :(033) 242-7571 E-mail:jhpark@kangwon.ac.kr 813
치료적인측면에서는우선그원인요소인만성질환을치료하는것이선행되어야한다. 그러나다른기관과달리심장질환특히, 허혈성심장질환은발병에따라즉시사망까지이르게하는치명적인병이므로관상동맥의혈관확장이나혈전의내외과적인제거보다, 보다효율적인치료방법이요구된다. 허혈성심질환의기전의정확한규명은그에따른이런효율적인치료법의개발에전제조건이될것이다. 허혈및재관류손상의기전에관여할것으로주장되고있는학설로는 ATP 와 creatine phosphate의고갈, 세포내 Ca ++ 축적, 용해소체효소의활성화, 인지질분해효소활성화등이알려져있지만아직까지기전에대한확실한규명을하지못하고있다. 1)2) 심장의허혈및재관류과정에서나타나는세포손상에관련하여중요한기전중의하나는산화스트레스와활성산소이다. 활성산소는정상적인대사과정중에서도생성되지만이와같은방어물질들이활성산소를제거해줌으로써독작용을나타내지않지만특정한병리상태에서과다한활성산소의생성으로이들방어물질들의제거능력의한계를넘어설경우에는심각한세포독작용을나타내는것으로알려져있다. 3-7) 심장근육세포에대한산화스트레스유도는 menadione, H 2O 2, xanthine과 xanthine oxidase 등의방법으로실험적으로접근할수있다. 6)7) 열충격단백질 (Heat shock protein) 은원래온도의증가에의하여유도된다고하여붙여진이름이다. 이단백질은정상적인조건에서도중요한기능을하지만열충격뿐만아니라다양한 stress에의하여발현이급격하게증가되는단백질이다. 8) 예를들면바이러스감염, 9) 에탄올, 10) 스테로이드호르몬, 11) 중금속 12) 등에노출될경우그양이증가한다고알려져있다. 특히심장에서는허혈 ( 무산소 ) 상태, 재관류조건, 활성산소에의하여유도된다고보고되고있다. 13) 열충격단백질은 10~100 kda 의다양한분자량을가지고있고거의모든세포에서발견된다. 분류는단백질의분자량에따라나뉘어지며, Hsp25, Hsp60, Hsp70 등으로표기된다. Hsp70 은동물실험결과허혈성조건에의한심장조직의손상을줄여주고심장기능을개선하는효과뿐만아니라예방효과가있는것으로밝혀져있다. 14)15) 분자량이작은 shsp(small heat shock protein) 는분자량 15~42 kda 에속하는열충격단백질들을말한다. 대표적으로 mouse 또는 rat 기원의 Hsp25 와사람의 814 세포에서기원하는 hsp27 이있으며서로의기원이다를뿐두단백질은 80% 의아미노산상동 (homology) 을보인다. 16) Hsp25/27 은내피세포, 혈관평활근세포, 심장근육세포등에서발견되며평상시에도세포내에분자량약 1 MDa 정도의큰 oligomer 의상태로존재하며열충격등의자극이전해질경우빠르게인산화 (phosphorylation) 되어크기가작아지고결국은본래의성질을잃게된다. αb crystallin 은안구의렌즈, 심장근육세포, 골격근세포에서주로관찰되며그분포는조건에따라다양하게나타난다고알려져있다. 17) 특히 Hsp25 와 αb crystallin은 small heat shock protein (shsp) 으로서세포골격단백인액틴의중합과밀접한관련이있다는사실이알려지기시작하면서그중요성이부각되고있으나, 18) 허혈및재관류에의한세포손상과의관련성에대한이해가부족한실정이다. 따라서본연구에서는심장근육세포주인 H9c2 에 H 2O 2 를다양한농도로처리한후산화스트레스를유도하고그에따른세포의형태학적인변화를조사하였다. 그와동시에 Hsp25 와 αb crystallin 의증감과분포를분석하였고액틴미세섬유와의상관관계를밝혀보고자하였다. 재료및방법 실험재료본실험에사용한 H9c2 세포주 (CRL-1446, ATCC, Rockville, MD, USA) 는심장에서분리한심장근육모세포이다. 배양액은 FBS(fetal bovine serum, Hyclone), sodium bicarbonate, 항생제 (penicillin G, streptomycin) 가첨가된 DMEM(Dulbecco s minimum essential medium, Gibco) 을사용하였다. 세포의전반적인형태관찰은도립위상차현미경 (Olympus), 공초점현미경 (Olympus), 전자현미경 (Hitachi) 등을사용하였다. Hsp25 와 αb crystallin 의분포와양적증감은간접면역염색과 western blotting 으로관찰하였다. Loading control 은 β-actin(sigma) 를사용하였고, 1차항체는 anti-hsp25 Ab와 αb Crystallin Ab(Stressgen), 2 차항체 anti-rabbit IgG Texas Red(Jackson) 로염색하였으며 phalloidin-fitc(sigma) 로 F-액틴을이중염색하였다. 전자현미경시약으로는 OsO 4, glutaradehyde, propylene oxide 및 Poly/Bed 812, MNA, DDSA, Korean Circulation J 2003;33(9):813-820
DMP-30(Polysciences), uranyl acetate(sigma), lead citrate(sigma) 를사용하였다. 대조군과실험군 H9c2 는 37, 95% air, 5% CO 2 환경에서배양하였고세포가 70% 의 confluency에도달하였을때시작하였다. 대조군은정상배지에서배양중인세포이고, 실험군은배양중인배지에 H 2O 2 의최종농도가 10, 50, 100, 200 μm가되도록첨가하여 4시간동안처리하였고, 열처리군은 43 에서 30분동안열처리한후정상배양하였다. Alamar blue assay 를이용한세포생존율검사세포의생존율은 Alamar blue assay를통하여세포생존율을측정하였다. 모든통계수치는평균 ± 표준편차 (SD) 로표기하였다. 결과에대한검정은액셀통계분석도구를이용하여 paired t-test 로대조군에대한실험군의유의성을분석하였다. 세포를미리 96-well plate 에배양한후, 각 well 에 Alamar blue 용액 (serotec) 을넣고 4시간동안 37 배양기에서반응시킨다음 570 nm와 600 nm의파장을사용하여 ELISA-reader 로흡광도를측정하여세포손상정도를비교하였다. 간접면역형광염색 Coverglass에배양한세포를 PBS으로세척한후 4% paraformaldehyde 로 10 분간고정하였다. 다시 PBS 로 2회세척하고 0.05% Triton-100 을이용하여투과성을증진시켰다. 0.1% BSA 가첨가된 PBS 에넣고 2시간동안상온에서처리한후, 1차항체인 Rabbit anti- Hsp25, anti-αb crystallin Ab 들이첨가된 0.1% BSA 가섞인 PBS 로 2시간동안 37 배양기에서반응시켰다. 2차항체인 anti-rabbit IgG Texas Red를 1: 1000으로희석하여 2시간동안 37 배양기에서반응시키고 PBS로다시 3회세척하였다. Phalloidin-FITC 로이중염색하여 F-액틴의분포를공초점현미경으로관찰하였다. Western blotting 대조군과실험군의세포에서추출한단백질을정량한후 anti-hsp25, αb crystallin 에대한항체를사용하여 immunoblotting 을실시하였다. 즉 6 cm 배양접시에서 자란세포들을 cold PBS 로 2회씻은후, 0.25% Trypsin-EDTA 로 5~10 분 37 배양기에서배양한후세포들을모아원심분리 (200 g, 5분 ) 하여세포들을수확한후, NP-40 lysis buffer(1% NP-40;0.1 M PMSF;10 mg/ml leupeptin;100 μg/ml pepstatin A;1 mg/ml Aprotinin) 를넣고얼음속에서 10분간세포들을용해시켰다. 다시원심분리 (13,000 g, 20분 ) 하여얻은상충액에대해 Bradford assay(bio-rad, Hercules, U.S.A) 로단백질양을측정하였다. 동량의단백질을 Sample treatment 용액 (0.125 M Tris-Cl, PH 6.8;4% SDS;20% glycerol;1% G-Mercaptoethanol;10 μg/ml bromophenol blue) 에넣고 5분간끓인후 15% polyacrylamide-gel에얹고 SDS- PAGE 를수행한다음 Transfer 완충액 (15.6 mm Trisbase, PH 8.3;120 mm glycine;20% methanol) 에서 gel 내의단백질을 PVDF membrane 으로이송 (50 V, 2시간 ) 시켰다. PVDF membrane을 3% BSA가포함한 TBST 완충액 (1 M Tris-Cl, PH 7.5;50 mm NaCl;0.05% Tween 20) 로 1시간동안상온에서흔들어준후 anti-hsp25 와 αb crystallin Ab를각각 1:1000, β-actin 을 1:5000으로희석하여 1시간반응시켰다. TBST 완충액으로 PVDF membrane 을다시 6회세척한후 HRP-conjugated anti-rabbit IgG (1:5000 dilution) 를넣고 1시간반응시켰다. TBST 완충액으로다시 6회세척한후 ECL(enhanced chemiluminescence) kit 를이용하여비교하였다. 결과에대한분석은 densitometry(digi DOC-IT, UVP) 를이용하여 Hsp25/β-actin과 αb crystallin/β-actin ratio 를구한후대조군과실험군을비교하였다. 전자현미경표본제작전자현미경의표본을제작하기위하여배양중인세포를인산완충용액으로세척하였고나머지과정은동일하였다. 인산완충용액을제거한후 2.5% glutaraldehyde 로 4 에서 60분간전고정한후 1% OsO4 에서 90분동안후고정하였다. alcohol은농도에따라순차적 (50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100%) 으로탈수과정을진행한후 propylene oxide 로치환하였다. 포매제인 epoxy resin 에포매하여 60 배양기에서 48시간중합하였다. 완전히중합된표본을적당한크기로다듬어 diamond 칼을이용하여 80 nm의두께로절편을만들 815
었다. 절편들은 uranyl acetate 와 lead citrate 에 15분및 10분씩이중염색을하여투과전자현미경으로관찰하였다. 결과 세포의형태변화 H9c2 세포는한개이상의핵소체를갖는핵이세포의중앙에위치하고핵주위에는검은과립들이분포하였다. 세포의형태는전형적인방추형을이루고있으며세포의경계는뚜렷하였다. 세포의가장자리에는많은세포질돌기들이있어인접한세포들과연결되어있었다. H9c2 세포에 50μM H 2O 2 이하의저농도를처리할경우세포들이다소위축하여세포사이공간이증가하였다. 세포내에는액포들이관찰되었으며, 세포의가장자리에는세포질돌기들의위축과아울러검은덩어리들이관찰되었다. 일부세포는배양용기에서떨어져원형으로부유하고있는세포들도관찰되었다. 200μM H 2O 2 를처리하였을때많은세포들은심한손상으로인하여배양용기에서떨어져나가세포수가급격히감소하였다. 남아있는세포들은형태가원형으로변하였고세포막에물집을형성하였다. 또한남아있는세포들중일부는세포막의손상으로세포질의농도가희석되어파괴된양상으로관찰되었다 (Fig. 1) 세포손상률및세포생존율결과 H9c2 세포에대한 H 2O 2 의농도에따른변화는 Alamar Blue assay를통하여측정하였다. Alamar Blue assay는배양액에직접시약을투여하여흡광도를측정함으로써시약과의반응시간을단축시키고기존의 MTT assay에서배양액을세척하는과정이필요없어오차를줄인검사방법이다. 전반적으로 H 2O 2 의농도증가에비례하여생존율이점차감소하는경향을볼수있었다. 100 μm H 2O 2 에서는부착되어있던세포들이손상을받아부유상태가됨에따라다소심한편차가나타났으며 200 μm H 2O 2 에서는 60±10% 로생존율이매우감소하였다 (Fig. 2). 투과전자현미경소견배양중인 H9c2 세포는한개이상의핵소체를갖는핵이세포의중앙에위치하였다. 세포질에는세포소기관들의발달이미약했고사립체들은세포내에산재해있었다. 액틴미세섬유들은다발을형성하며세로축으로주행하고있었으며, 세포의가장자리에도분포하였다. 또한인접한세포들간에는접촉을하고있지만세포사이결합에관련한특별한구조물들은관찰되지않았다. H 2O 2 를 100 μm 의농도로 4시간처리하였을경우세포내에크기가다양한액포의증가가두드러지게나타났고대조군에비하여세포가장자리의액틴미세섬유의양이증 Cell viability (OD 570 600 nm) 0.06 0.04 0.02 0.00 C 10 μm 50 μm 100 μm 200 μm Fig. 2. Cell viability of H9c2 cells after exposure to 10, 50, 100, 200 μm H2O2 for 4 hours by using Alamar blue assay. The values indicate the mean plus standard deviation (n=5). Data were analyzed by paired t-test (p<0.05). *:significant differences compared to control. * H2O2 A B C Fig. 1. Phase-contrast photnmomicrographs of H9c2 cell line;control (A), after exposure to 10 (B) and 200 (C)μM H2O2 ( 400) for 4 hours. Scale bar:40 μm. 816 Korean Circulation J 2003;33(9):813-820
가한 것으로 보아 세포질돌기의 위축이 일어난 것으로 생 H2O2 각되었다. 200μM의 농도로 처리하였을 경우 전형적 인 apoptosis 현상을 갖는 세포들의 수가 급격히 증가 하였다. 세포는 원형으로 변화하며 크기가 줄어들고 세 포막의 표면에는 다양한 크기의 물집들이 형성되었다. 세포질의 전자밀도는 매우 높아졌고 농축되어 나타났으 Hsp 25 인 apoptotic body를 형성하기도 하였다(Fig. 3). Hsp25와 αb crytallin 면역염색 50 μm 120 100 080 060 040 020 000 HS C 10 μm 50 μm 100 μm 200 μm 의 농도에서는 Hsp25의 발현은 대조군이나 열처리군 H2O2 Hsp25의 분포를 살펴보면 대조군에서는 핵의 인접부 위와 액틴 미세섬유가 발달한 곳에 반응이 나타났고 세 포의 가장자리에도 강한 반응이 나타났다. 한편, 10 μm H2O2를 처리하였을 때 액틴 미세섬유가 발달된 부위에 서 대조군보다 강한 반응이 나타났다. 100μM H2O2를 처리한 결과 저농도에서 관찰되었던 강한 반응이 약화되 었고 세포 가장자리에서는 관찰되지 않았다(Fig. 5). αb crystallin의 발현량은 10 μm의 H2O2 농도에 서는 대조군보다 다소 증가하였으나 H2O2의 농도가 증 A B αb crystallin/β-actin ratio (% of control) 보다 증가되었고, 50 μm에서는 대조군과 유사하였으 하였다(Fig. 4). 반면 열처리군은 대조군과 유사하였다. HS 140 H9c2에 H2O2를 다양한 농도로 처리한 결과 10 μm 나 점차 H2O2의 농도가 증가함에 따라 발현량이 감소 100 μm 200 μm A Hsp25/β-actin ratio (% of control) 어져 있었고 절편화로 농축된 핵이 핵막과 함께 독립적 10 μm αb crystallin 며 세포소기관의 관찰이 어려웠다. 핵 내에는 염색질이 여러 개로 절편화(fragmentation)가 일어나 핵질내에 흩 C 120 100 080 060 040 020 HS C B 10 μm 50 μm 100 μm 200 μm H2O2 Fig. 4. Western blotting analysis of Hsp25 and αb Crystallin (A) expression of H9c2 cells after exposure to 10, 50, 100, 200 μm H2O2 for 4 hours and heat stress (43, 30 min). The intensity of the bands of both proteins was measured by densitometry (B). C Fig. 3. Electron micrographs of cultured H9c2 cell line control (A), exposed to 100 (B) and 200 (C)μM H2O2 for 4 hours. Scale bar 5 μm. 817
가함에따라발현량이감소하였다 (Fig. 4). 열처리군에서도대조군보다발현량이매우감소하였다. αb crystallin 의분포를살펴보면대조군에서는핵의인접부위와액틴미세섬유가발달한곳에서분포하는반면세포 Hsp25 Hsp25 & F-actin 의가장자리에는반응이거의나타나지않았다. 한편, 10μM H 2O 2 를처리하였을때기존 αb crystallin 이분포하는곳에서보이던반응이매우강해졌고, 특히액틴미세섬유의분포와일치하는양상을보였다. 그러나세포의가장자리에는반응이나타나지않았다. 100 μm H 2O 2 를처리한결과핵주위에반응이대조군보다더욱약하게나타났다 (Fig. 6). A1 A2 고 찰 Hsp25 B1 Hsp25 C1 Fig. 5. Co-localization of Hsp25 & F-actin in cultured H9c2 cell line;control (A1, A2), exposed to 10 μm (B1, B2), 100 μm (C1, C2) H2O2 for 4 hours. Arrows indicate signals of Hsp25. Scale bar:50 μm. αb Crystallin A1 αb Crystallin B1 αb Crystallin C1 818 Hsp25 & F-actin B2 Hsp25 & F-actin Fig. 6. Co-localization of αb Crystallin & F-actin in cultured H9c2 cell line;control (A1, A2), exposed to 10 μm (B1, B2), 100 μm (C1, C2) H2O2 for 4 hours. Arrows indicate signals of αb Crystallin. Scale bar:50 μm. C2 αb Crystallin & F-actin A2 αb Crystallin & F-actin B2 αb Crystallin & F-actin C2 본연구에사용한 H9c2 세포주는쥐 (rat) 의심장에서분리한심장근육모세포로서조건에따라골격근육세포나심장근육세포로분화한다고알려져있는세포주이다. 아울러심장근육에대한 in vitro 실험에흔히사용되는세포주이기도하다. 그러나세포내의미세구조를조사한결과심장근육세포와는다소차이가있었다. 특히근육세포에서나타나는세포수축단백과사립체의발달이미약하고세포사이결합도형성되어있지않았다. Alamar blue 를이용한세포생존율검사는기존에알려진 MTT 분석을개선한실험방법이다. 배양중인세포에시약을바로첨가한후일정시간경과후 ELISA 분석을실시하여분석하는방법이다. 그동안 MTT 분석은배지를제거하고세척하는과정에서세포의손상뿐만아니라세포의손실이많아오차가심하게나타났으나본실험에서는오차를많이줄일수있었다. 산화스트레스는심장의허혈및재관류와관련된중요한손상기전중의하나로서심장근육세포의활성산소에의한손상을규명하는데이용할수있는실험방법이다. H 2O 2 를통하여다양한농도에서산화스트레스를주어세포의손상정도를파악한후 Hsp25 와 αb crystallin 과의상관관계를파악하고자하였다. 또한본연구에서 43 30 분간동안세포를방치한열처리군을포함시킨것은 Hsp 의발현이높게나타난다고알려진조건 19) 과비교하고자하였다. H9c2 세포에 H 2O 2 를처리한결과농도의증가에따라세포의생존율이낮아지는것을관찰할수있었다. 그러나 43 30분간열처리한세포에서는세포의 apoptosis 나세포내의형태학적인변화가없었고생존율도대조군과큰차이를보이지않았다. 200 μm 의 H 2O 2 를처리한경우에는전자현미경상에서핵의절편화, 핵과 Korean Circulation J 2003;33(9):813-820
세포질의농축, apoptotic body가뚜렷이관찰되는세포들이많이나타났다. 이와같은형태학적인변화와아울러 Hsp25 와 αb Crystallin 의발현량을조사한결과 10 μm의 H 2O 2 를처리할경우대조군보다조금증가하였으나처리농도가높아짐에따라이들단백질의발현량은감소한것으로관찰되었다. 동시에간접면역염색법을통하여이들단백질의분포를확인한결과저농도의 H 2O 2 를처리한세포에서는핵주변과액틴미세섬유의분포하는부위를따라강한반응이나타났으며덩어리형태의반응이나타났고 100 μm 이상에서는그반응이약해졌다. 허혈혹은산화스트레스등다양한 stress 에의하여 Hsp25 는인산화되고그에따른심장보호효과를나타낸다는보고 20)21) 가있으나본연구에서는산화스트레스의강도에따라 Hsp25 와 αb Crystallin 의양적인증감및분포가다르게관찰되었다. 아울러저농도의 H 2O 2 에의한산화스트레스를주었을경우 Hsp25 와 αb Crystallin이핵과액틴미세섬유가위치하는부위에서급격히증가하는것으로나타났으나고농도에서는이들구성물의손상으로그상관관계를파악할수없었다. 이러한결과는허혈이나저산소상태에서 Hsp25와 αb Crystallin는액틴미세섬유가분포하는부위로이동하며, 22-24) 액틴미세섬유의과중합을저해하여세포보호효과가나타난다는연구결과 25) 와일치하였다. 한편근육병 (myopathy) 이나신경성위축과같은산경근육질환에서도이러한 Hsp25 와 αb Crystallin 의변화는동일하게나타나지만 Hsp25 가액틴미세섬유와더밀접한관련이있는것으로보고되고있다. 26) 따라서본실험결과를통하여산화스트레스에의한세포손상에서저농도에서는 Hsp25 와 αb crystallin 의발현이증가할뿐만아니라분포도변화한반면, 고농도에서는모두감소함을알수있었다. 또한이들단백질의증감및분포가액틴미세섬유와밀접한관련이있는것을확인됨에따라향후 Hsp25 와 αb crystallin 의기능을연구하는데중요한기초자료가될것으로생각된다. 또한이결과를바탕으로하여이단백질들의기능과액틴과의연관성을밝혀내기위해서는이들단백질이과발현되거나발현되지않는 transfectant cell line 을구축하여산화스트레스와더불어허혈- 재관류조건에서의변화를추적하여야할것이다. 요약 배경및목적 : Hsp25 와 αb crystallin은분자량이작은열충격단백질 (shsp) 로서세포골격단백인액틴의중합과밀접한관련이있다고알려지면서그중요성이부각되고있으나, 허혈및재관류에의한세포손상과의관련성에대한이해가부족한실정이다. 따라서본연구에서는심장근육세포주인 H9c2 에 H 2O 2 를다양한농도로처리한후산화스트레스를유도하고그에따른세포의형태학적인변화를조사하였다. 그와동시에 Hsp25 와 αb crystallin 의증감과분포를분석하였고액틴미세섬유와의상관관계를밝혀보고자하였다. 방법 : 본실험에사용한 H9c2 세포주 (CRL-1446, ATCC, Rockville, MD, USA) 는심장에서분리한심장근육모세포이다. 실험군은배양중인배지에 H2O2 를 4시간동안처리하였고, 열처리군은 43 에서 30분동안열처리를한후정상배양하였다. 세포손상의정도는도립위상차현미경과 Alamar Blue assay를통하여확인하였고, Hsp25 와 αb crystallin의분포와증감은면역형광염색법과 Western blotting 으로분석하였으며액틴에대한이중염색도실시하였다. 결과 : H9c2 세포에 H 2O 2 를처리한결과농도의증가에따라세포의생존율이낮아지는것을관찰할수있었다. 200 μm 의 H 2O 2 를처리한경우에는전자현미경상에서 apoptotic body가뚜렷이관찰되는세포들이많이나타났다. 이와같은형태학적인변화와아울러 Hsp25 와 αb Crystallin의발현량을조사한결과처리농도가높아짐에따라이들단백질의발현량은감소한것으로관찰되었다. 동시에간접면역염색법을통하여이들단백질의분포를확인한결과저농도의 H 2O 2 를처리한세포에서는핵주변과액틴미세섬유의분포하는부위를따라강한반응이나타났고 100 μm 이상에서는그반응이약해졌다. 결론 : 본실험에서산화스트레스에의한세포손상에서저농도에서는 Hsp25 와 αb crystallin 의발현이증가하였고분포도변화하였으나고농도에서는모두감소함을알수있었다. 또한이들단백질이액틴미세섬유와밀 819
접한관련이있는것을확인할수있어향후 Hsp25 와 αb crystallin의기능을연구하는데중요한기초자료가될것으로사료된다. 중심단어 : 열충격단백 ; 액틴 ; 산화스트레스 ;H9c2. REFERENCES 1) Nayler WG. The role of calcium in the ischemic myocardium. Am J Pathol 1981;102:262-70. 2) Goldhaber JI, Weiss JN. Oxygen free radicals and cardiac reperfusion abnormalities. Hypertension 1992;20:118-27. 3) Hammond B, Hess ML. The oxygen free radical system: potential mediator of myocardial injury. J Am Coll Cardiol 1985;6:215-20. 4) Mak IT, Kramer JH, Weglicki WB. Potentiation of free radical-induced lipid peroxidative injury to sarcolemmal membrane by lipid amphiphiles. J Biol Chem 1986;261:1153-7. 5) Reilly PM, Bulkley GB. Tissue injury by free radicals and other toxic oxygen metabolites. Br J Surg 1990;77:1323-4. 6) Siwik DA, Pagano PJ, Colucci WS. Oxidative stress regulates collagen synthesis and matrix metalloproteinase activity in cardiac fibroblasts. Am J Physiol Cell Physiol 2001;280: C53-60. 7) Zhang X, Azhar G, Nagano K, Wei JY. Differential vulnerability to oxidative stress in rat cardiac myocytes versed fibroblasts. J Am Coll Cardiol 2001;38:2055-62. 8) Hartl FU. Molecular chaperonesin cellular protein folding. Nature 1996;381:571-9. 9) Collins PL, Hightower LE. Newcastle disease virus stimulates the cellular accumulation of stress (heat shock) mrnas and proteins. J Virol 1982;44:703-7. 10) Plesset F, Palm C, McHaughlin CS. Induction of heat shock proteins and thermo-tolerance by ethanol in saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys Res Commun 1982;108:1340-5. 11) Norton PM, Latchman DS. Levels of the 90kd heat shock protein and resistance to glucocorticoid-mediated cell killing in a range of human and murine lymphocyte cell lines. J Steroid Biochem 1989;33:149-54. 12) Li GC, Laszlo A. Amino acid analogues while inducing heat shock protein sensitive cells to thermal damage. J cell Physiol 1985;122:91-7. 13) Polla BS. A role for heat shock proteins in inflammation? Immunol Today 1988;9:134-7. 14) Heads RJ, Latchman DS, Yellon DM. Stable high level expression of a transfected human HSP70 gene protects a heart-derived muscle cell line against thermal stress. J Mol Cell Cardiol 1994;26:695-9. 15) Mestril R, Chi SH, Sayen R, O Reilly K, Dillmann WH. Expression of inducible stress protein 70 in heart myogenic cells confers protection against simulated ischaemai-induced injury. J Clin Invest 1994;93:759-67. 16) Latchman DS. Heat shock proteins and cardiac protection. Cardiovasc Res 2001;51:637-46. 17) Bennardini F, Wrzosek A, Chiesi M. αb-crystallin in cardiac tissue: association with actin and desmin filaments. Circ Res 1992;71:288-94. 18) Loktionova SA, Ilyinskaya OP, Kabalov AE. Early and delayed tolerance to simulated ischemia in heat-preconditioned endothelial cells: a role for HSP27. Am J Physiol 1998;275: H2147-58. 19) Kim DJ, Lee SY, Park JH, Hahn JH, Park SM, Jeong JS, Kim HD. The delayed phase of protection in heat-induced preconditioning: role of the heat shock protein associated with cytoskeleton. Korean Circ J 2001;31:1049-58. 20) Ciocca RR, Oesterreich S, Chamness GC, McGuire WL, Fuqua SA. Biological and clinical implications of heat shock protein 27,000(Hsp 27). J Natl Cancer Inst 1993;85: 1558-70. 21) Clerk A, Michael A, Sugden PH. Stimulation of multiple mitogen-activated protein kinase sub-families by oxidative stress and phosphorylation of the small heat shock protein, HSP25/27, in neonatal ventriclular myocytes. Biochem J 1998;333:581-9. 22) Arrigo AP, Landry J. Expression and function of the lowmolecular heat shock proteins. In: Morimoty RI, Tissieres A, editor. The Biology of Heat Shock Proteins and Molecular Chaperones. Cold Spring Harbor, MA: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1994. p.335-73. 23) Benjamin IJ, McMillan DR. Stress (heat shock) proteins: molecular chaperones in cardiovascular biology and disease. Circ Res 1998;83:117-32. 24) Yoshida K, Aki T, Harada K, Shama KM, Kamoda Y, Suzuki A, Ohno S. Translocation of HSP27 and MKBP in Ischemic Heart. Cell Struct Funct 1999;24:181-5. 25) Wieske M, Benndorf R, Behlke J, Dolling R, Grelle G, Bielke H, Lutsch G. Defined sequence segments of the small heat shock proteins HSP25 and αb-crystallin inhibit actin polymerization. Eur J Biochem 2001;268:2083-90. 26) Fischer D, Matten J, Reimann J, Bönnemann C, Schröder R. Expression, localization and functional divergence of αbcrystallin and heat shock protein 27 in core myopathies and neurogenic atrophy. Acta Neuropathol 2002;104:297-304. 820 Korean Circulation J 2003;33(9):813-820