대한한방내과학회지제 35 권 4 호 (2014 년 12 월 ) J. Int. Korean Med. 2014:35(4)519-531 挑仁이일측신절제와 streptozotocin 으로유발된당뇨병성신증 Rat 에미치는영향 김남규, 오재선, 전상윤동신대학교한의과대학내과학교실 The Effects of Prunus on Diabetic Nephropathy Rats Induced by Unilateral Nephrectomy and Streptozotocin Nam-kyu Kim, Jae-seon Oh, Sang-yun Jeon Dept. of Internal medicine, College of Korean Medicine, Dong-Shin University ABSTRACT Objectives: Diabetic nephropathy is the most common cause of end stage renal disease. Transforming growth factor (TGF)-β1, type Ⅳ collagen, advanced glycation end-products (AGEs), and angiotensin II type 1 receptor (AT1) are the main factors of diabetic nephropathy. We investigated the effects of Prunus on renal function and histopathological changes of diabetic nephropathy rat model induced by unilateral nephrectomy and streptozotocin. Methods: Diabetes was induced in male Sprague-Dawley rats (290±10 g) by injecting streptozotocin (55 mg/kg) into the tail vein after unilateral nephrectomy. Rats were divided into 3 groups (n=6): normal, control, and Prunus. After 8 weeks of oral administration of Prunus extract on the Prunus group from 3 days after streptozotocin injection, we checked weight, 24 hrs urine, blood biochemistry and renal tissue to evaluate renal function and histopathological changes by examining parameters including albuminuria, BUN, creatinine, cholesterol, low density lipoprotein (LDL), triglyceride, TGF-β1, type Ⅳ collagen, AGEs, and AT1. We also measured mrna expression of TGF-β1, type Ⅳ collagen, AGEs, and AT1 by Real Time polymerase chain reaction (RT-PCR). Results: Prunus decreased the amount of 24 hrs proteinuria, and inhibited histopathological changes of diabetic nephropathy including the expression and accumulation of TGF-β1, type Ⅳ collagen and AGEs which could promote development of diabetic nephropathy. Prunus also inhibited mrna expression of TGF-β1, type Ⅳ collagen. Conclusions: These findings suggest that Prunus might protect the renal function and inhibit the development of renal injury by regulating factors including TGF-β1, type Ⅳ collagen, AGEs, except AT1, so Prunus can be used for diabetic patients to prevent the progression of diabetic nephropathy. Key words: diabetic nephropathy, Prunus, unilateral nephrectomy, streptozotocin Ⅰ. 緖論 교신저자 : 전상윤광주시남구월산로 141번지동신대학교광주한방병원한방내과 TEL: 062-350-7207 FAX: 062-350-7551 E-mail: damiano70@hanmail.net 이논문은 2014년 2월동신대학교일반대학원한의학과내과학전공박사학위논문임. 당뇨병의합병증들은대부분장기적인고혈당상태로인한혈관장애로인해발생하게되는데, 그중당뇨병성신증은미세혈관합병증으로말기신부전으로이행되는주요한원인이다 1,2. 당뇨병성신증에의한말기신부전환자들은비당뇨병에의한 519
挑仁이일측신절제와 streptozotocin 으로유발된당뇨병성신증 Rat 에미치는영향 말기신부전환자들에비해여러가지동반질환을가지고있어생존율과삶의질이현저히저하된다. 이에따라당뇨병성신증의조기발견, 예방및그치료가중요하다 3. 당뇨병성신증은한의학적관점에서消渴의轉變證중水病으로水腫, 浮腫, 眩暈, 虛勞, 尿濁如膏, 尿甛, 關格등의범주에속한다 4,5. 한의학적병리기전으로는燥熱로陰虛가발생되어津液이상하고氣가모손되어결국肝腎陰虛와氣陰兩虛가나타나며결국陰陽兩虛하게되니腎陽虛로인해水腫에이르게된다. 병이오래되거나혹은오랜치료가효과가없을때는瘀血이內阻되는경우가많으니活血化瘀하는치법을겸하여사용한다 4,6. 당뇨병성신증에대한한의학적연구를보면복합처방에대한연구 7-9 와丹蔘 10, 水蛭 11, 三七根 12, 紅花 13, 牧丹皮 14 등化瘀劑를사용하여유의한결과를얻은실험이보고되고있다. 본실험에응용한桃仁 (Prunus Persicae Semen) 은活血祛瘀약으로活血祛瘀, 潤腸通便의효능이있어瘀血阻滯로인한經閉, 痛經, 癥瘕痞塊, 跌撲損傷, 腸燥便秘등을치료하는효능이있다 15. 최근桃仁을이용하여항염효과 16, 고지혈증 17, 죽상동맥경화 18, endotoxin 을투여한혈액에미치는작용 19 등의연구가보고되었으며특히桃仁이포함된복합제제로桃仁承氣湯을이용하여당뇨병성혈관장애에대한개선및혈관합병증에대한효능 20 이밝혀져당뇨병의미세혈관합병증인당뇨병성신증에桃仁의좋은효과를기대할수가있다. 이에저자는 1/2 신절제술후췌장의 β세포에특이적으로반응하여당뇨를유발시키는약물로알려진 streptozotocin 으로당뇨병성신증이유도된 21-23 rat에桃仁을투여하여체중과 24시간요단백배설량, 혈청생화학분석, 신장의조직병리학적변화, 당뇨병성신병증의주된병리인자들의면역조직화학염색이미지분석, 당뇨병성혈관합병증의주요병리인자들의유전자발현등을관찰하여다음과같은결과를얻었기에보고하는바이다. Ⅱ. 材料및方法 1. 材料 1) 실험약재본실험에사용한약재인桃仁 (Prunus persicae semen) 은동신대학교부속한방병원 (Mokpo, Korea) 에서구입한것을정성하여사용하였다. 2) 동물 280~300 g의수컷 Sprague-Dawley rat( 중앙실험동물, Korea) 을구입하여실온의 cage 에서 40~70% 의습도를유지하며 12시간씩낮과밤이교대되는환경으로실험전 1주일간사육하여적응기를거쳤으며, 음수는자유롭게공급하였다 (Table 1). Table 1. Composition of Experimental Diets (LabDiet 5002C33) Protein 20.1 Fat (ether extract) 4.5 Fat (acid hydrolysis) 5.1 Ingredient (%) Crude Fiber 4.6 Ash 5.8 Calcium 0.80 Phosphorus 0.60 Gross nergy (kcal/gm) 4.04 3) 시약및기기일반시약의경우당뇨병유도제 streptozotocin (Sigma Chemical Co, USA), 동물마취제 (zoletil, Virbac Laboratories, France) 를사용하였다. 검체의제조및실험결과측정을위해사용된기기는 rotary evaporator(model NE-1, 東京理化學株式會社, Japan), 동결건조기 (Model FD-1, 東京理化學株式會社, Japan), 혈당측정기 (SureStep, LIFESCAN Inc, USA), high-resolution camera 부착광학현미경 (Olympus BX-50, Olympus Optical, Japan), MetaVue (Molecular devices, USA), 실시간유전자분석기 (StepOne real-time PCR device, Applied Biosystems, USA), 통계학적비교분석기 (GraphPad PRISM statistical 520
김남규 오재선 전상윤 package(ver 2.00), Graphpad software Inc, USA) 를사용하였다. 면역조직화학염색을위하여 bovine serum albumin (Sigma-Aldrich, USA.), 10% normal horse serum (Vector Laboratories, USA.) vectastain ABC ELITE kit(rat IgG)(Vector Laboratories, USA) 를사용하였고, 이때사용한각각의 primary antibody 종류는 TGF-β1 은 polyclonal rabbit anti-rat TGF-β1 antibodies(santa Cruz Biotechnology, USA), Type Ⅳ collagen 은 Goat Anti-Type Ⅳ Collagen(SouthernBiotech, USA), AGEs는 Anti AGE Monoclonal Antibody (Clone No.6D12)(TransGenic Inc, Japan), AT1은 Rabbit polyclonal Antibody(abcam, USA) 를사용하였으며, secondary antibody는 biotinylated Anti- Mouse/Rabbit/Goat IgG(H+L) made in horse(vector Laboratories, USA) 를사용하였다. 신장수질조직에서의 RNA 분리는 Mini RNA Isolation ⅡTM(ZYMO RESEARCH, USA) 을이용하였으며, 유전자발현을위하여 SYBR R Premix Ex TaqTM(Takara, Japan), ROX(Takara, Japan) 를사용하였고, 역전사연쇄중합반응 (Reverse transcription polymerase chain reaction : RT-PCR) 을위하여 StepOne real-time PCR device(applied Biosystems, USA) 와 StepOne Software(Applied Biosystems, USA) 를이용하였다. 2. 方法 1) 검체의제조총량 1000 g의桃仁을 1,500 ml의 80% 에탄올에넣고 heating mantle 을이용하여 2시간동안가열추출하고여과한여액을 500 ml 플라스크에 applicator 를이용하여넣은후 filter로걸러냈다. 걸러진여과액을 rotary evaporator로감압농축한후동결건조기로건조시켰다. 동결건조된桃仁추출물을실온에서보관하였다. 桃仁의최종수거율은 9.0%(90 g) 였다. 2) 당뇨병성신병증동물모델의제작적응기간을마친후, zoletil을 1 cc/kg 당 rat의꼬리정맥을통해주사하여마취시켰다. 마취된 rat 의우상복부를절개하여우측신장을노출시킨후신동맥, 신정맥, 우측요관을봉합사로묶은다음우측신장을절제하였다. 정상군의경우개복수술시마취하에서복부를절개하여신장을노출시킨후손으로만지기만하고신장의어떠한절제나손상없이다시봉합하였다. 실험동물에수술전후수술부위에대한소독, 체온유지를위한기본처치및감염예방을위해 ampicillin(150 mg/kg) 으로피하처치하였다. 우측신장절제 1주일후 ph 4.5 의 citrate buffer(2.5 ml/kg) 에녹인 streptozotocin 을 rat 의꼬리정맥을통해 55 mg/kg 의용량으로 1회주사하였다. 반면정상군은 citrate buffer(2.5 ml/kg) 만을 rat의꼬리정맥으로주사하였다. 당뇨병의유발여부를확인하기위해 streptozotocin 정맥주사 3일후 rat의꼬리정맥에서혈액을채취하여혈당측정기를이용하여혈당을측정하였고, 측정한혈당이 300 mg/dl 이상인 rat만을본실험에사용하였다. 3) 실험군의배정및연구과정본연구의실험군은각군당 6마리씩정상군 (Normal group), 대조군 (Control group), 桃仁투여군 (Prunus group) 의 3군으로나누어진행하였다. 정상군은 streptozotocin 없이 citrate buffer만을정맥주사하였고, 연구기간동안어떤약물도투여하지않았다. 대조군은 streptozotocin 투여 3일후측정한혈당이 300 mg/dl 이상인 rat을대상으로연구기간동안 insulin 투여없이 streptozotocin 투여 3일후부터생리식염수 5 ml/kg만을 8주간경구투여하였다. 桃仁투여군은 streptozotocin 투여 3일후측정한혈당이 300 mg/dl 이상인 rat을대상으로연구기간동안 insulin 투여없이 streptozotocin 투여 3일후부터桃仁추출물을생리식염수에현탁하여 500 mg/kg의용량으로 zonde를이용하여 1일 1회경구로 8 주간투여하였다. 4) 혈액학적분석실험시작 8 주째마지막투약다음날 rat의심장에서채혈하여혈청 glucose, albumin, blood urea 521
挑仁이일측신절제와 streptozotocin 으로유발된당뇨병성신증 Rat 에미치는영향 nitrogen(bun) 및 creatinine, total cholesterol, low density lipoprotein(ldl) cholesterol, triglyceride (TG) 등의생화학적분석을시행하였다. 5) 체중및 24시간요단백배설량측정체중은 streptozotocin 투여이전에측정하고, streptozotocin 투여 4일째부터실험종료시까지 1주일간격으로측정하였다. 24시간요단백배설량의측정은 streptozotocin 투여 8주째에 rat을 metabolic cage에넣고 24시간동안소변을수거하여수거된소변에함유되어있는알부민의양을측정하였다. 6) 신장의조직병리학적평가마지막투약다음날체중을측정하고채혈후 rat의좌심실에바늘을꽂아 0.05 M phosphate buffered saline(pbs) 와 4% paraformaldehyde(pfa) 을 perfusion pump 를이용하여주입하여신장의붉은색이없어질때까지관류시켰다. 이후좌측신장을절제하여 10% 중성완충포르말린용액에고정하고 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올에차례로담가탈수시킨다음파라핀용액에담가파라핀블록을만들었다. 이후 microtome 을이용하여 4 μm의두께로각신장조직을관상으로절편하여 gelatin coated slide에부착시켰다. 이렇게만들어진조직절편들은조직염색을위해 xylene 에담가파라핀을제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에차례로담가재수화 (rehydration) 시켰다. 재수화된조직을 hematoxylin and eosin(h&e) 로염색하여광학현미경하에서컴퓨터와연결된 high-resolution camera 부착광학현미경을이용하여각각의디지털영상을얻었다. 이러한과정으로얻은영상을통한사구체내메산지움기질의팽창정도의평가는이미지분석프로그램인 MetaVue 를이용하여측정하였다. 무작위로각 rat당 10개의사구체를선정하여디지털영상상메산지움기질이염색된 pink 색에대한 RGB값의하한값과상한값을입력하고외곽선기능을이용하여사구체안쪽만을선택한후각각의사구체내에서메산지움기질이차지하는비율을백분율로계산하였다. 7) Transforming growth fasctor(tgf)-β1, type IV collagen, advanced glycation end-products(ages), angiotensin Ⅱ type 1 receptor(at1) 의면역조직화학염색 TGF-β1, type Ⅳ collagen, AGEs, AT1에대한분석은 4 μm의두께의신장조직을 gelatin coated slide에부착시킨후 xylene에담가파라핀을제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에차례로담가재수화 (rehydration) 시켰다. 1% H 2O 2 in methanol에 15분간반응시킨후 1% bovine serum albumin과 10% normal horse serum을혼합하여만든 protein blocking agent를분주하고 1시간동안배양하였다. 재수화및 blocking agent 의처치과정을거친 slide 상조직절편에해당하는각각의 primary antibody 를분주하고실온에서 overnight 시켰다. 50 mm PBS로 3회세척한후 secondary antibody 와 1시간동안반응시켰다. 다시 50 mm PBS 로 3회세척한후 vectastain ABC ELITE kit를분주하고 1시간동안반응시켰다. Diaminobenzidine(DAB) 을이용하여갈색으로염색하고 hematoxylin 으로대조염색한후증류수, 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올, xylene에차례로담가탈수화 (dehydration) 시키고 permount 로 mounting 하여컴퓨터와연결된 high-resolution camera 부착광학현미경을이용하여각각의디지털영상을얻었다. 이러한과정으로얻은영상은이미지분석프로그램인 MetaVue 를이용하여측정하였다. 무작위로각 rat당 10개의사구체를선정하여디지털영상상조직내 TGF-β1, type IV collagen, AGEs, AT1 가염색된갈색에대한 RGB값의하한값과상한값을입력하고외곽선기능을이용하여사구체안쪽만을선택한후각각의사구체내에서차지하는비율을백분율로계산하였다. 8) 신장조직에서의 RNA 분리마지막투약다음날 rat의혈액생화학분석용혈액을심장에서채취한후신장관류를시행한다음우측신절제후남아있는좌측신장을절제 522
김남규 오재선 전상윤 하여절제한좌측신장중신수질을선택적으로 15 mg씩분리하여신속하게 tube에넣고여기에 ZR RNA buffer 300 μl씩을분주한다음 homogenizer 를이용하여조직을분쇄하였다. 분쇄된조직이담긴 tube를 1,000 rpm에서원심분리한후상층액을 Zymo-Spin Ⅲ Column 에옮기고이를 2 ml collection tube에꽂은다음 2,000 rpm으로 1분간원심분리하였다. Column에 RNA wash buffer 350 μl를분주하고 1분간원심분리하여 2회세척한후 column 을 1.5 ml tube에옮겨꽂은다음 RNA-free water 50 μl를분주하여 1,000 rpm으로원심분리하여최종적으로 RNA를수거하여사용하기전까지 -70 에보관하였다. 9) Transforming growth fasctor(tgf)-β1, type Ⅳ collagen, receptor for AGEs(RAGEs), angiotensinconverting enzyme(ace) 및 angiotensin Ⅱ type 1 receptor(at1) 의 real time 연쇄중합반응 (Real time polymerase chain reaction, RT-PCR) TGF-β1, type Ⅳ collagen, RAGEs, ACE 및 AT1의 mrna 발현은 real time 연쇄중합반응을이용하여측정하였다. 신피질에서분리한 1 μg의 RNA에 PCR buffer와 5 mm의 MgCl 2, 1 mm의 dntp, 20 U의 RNasin, 2.5 M의 Oligo(dT), 100 U의 mononey murine leukemia virus reverse transcriptase 를혼합하여 42 에서 50 분, 70 에서 15분씩반응시켰다. 역전사를통해얻어진각각의 complementary DNA(cDNA) 에 PCR buffer, SYBR R Premix Ex Taq TM, ROX, primers 를혼합하여 StepOne real-time PCR device 를이용하여연쇄중합반응을시행하였다. 연쇄중합반응의신장단계온도 (annealing temperature) 는 58 로시행하였다. 이상의과정을통해얻어진결과는 StepOne Software 를이용하여각기 threshold cycle(ct) 에서의증폭산물을정량화하였으며, GAPDH 에대한값으로환산한후대조군을 1로환산하여 relative quantitation(rq) 값으로표시하였다. 10) 통계분석통계학적비교분석은 GraphPad PRISM statistical package 를이용하였다. 각군간의비교는 one-way analysis of variance(anova) 에이어 Tukey's post-hoc test로사후검증하였다. 각각의수치는평균 ± 표준편차 (mean±s.d.) 로표시하였으며, 양방검정유의도 (Two-tailed p value) 는 p값이 <0.05 수준일때를기준으로하였다. Ⅲ. 結果 1. 체중과 24시간요단백배출양에미치는영향체중은 8주째에정상군의 396.85±30.16 g에비해대조군에서 186.00±29.90 g으로유의하게감소하였다 (P<0.001). 桃仁투여군에서는 192.00±23.59 mg/dl 로대조군에비해증가하였으나통계학적유의성은없었다 (Table 2). 24시간요단백배출량에서 8주째에정상군의 19.59±6.49 mg/kg에비해대조군에서 137.75±84.81 mg/kg으로유의하게증가하였고 (P<0.001), 桃仁투여군에서는 8주째 36.36±19.20 mg/kg으로대조군에비해유의하게감소하였다 (P<0.05)(Table 2). Table 2. The Body Weight and 24hrs Urinary Protein Excretion of Each Experimental Group Normal (n=6) Control (n=6) Prunus (n=6) Body weight (g) 8 weeks 396.85±30.16 186.00±29.90*** 192.00±23.59 Urinary protein excretion (mg/kg/day) 8 weeks 19.59±6.49 137.75±84.81*** 36.36±19.20 # * Significantly different from the normal group (*** P<0.001) # Significantly different from the control group (# P<0.05) 2. 혈청생화학분석상지표들의변화에미치는영향 Glucose(P<0.001), BUN(P<0.001), creatinine(p<0.001), total-cholesterol(p<0.001), LDL-cholesterol(P<0.001), triglyceride(p<0.001) 는정상군에비해대조군에서유의하게증가하였고, albumin 은정상군에비해대조군에서유의하게감소하였다 (P<0.01). Creatinine 은 523
挑仁이일측신절제와 streptozotocin 으로유발된당뇨병성신증 Rat 에미치는영향 桃仁투여군에서대조군에비해유의하게감소하였고, 이외의측정항목에서는桃仁투여군과대조군사이에서유의한차이를나타내지않았다 (P<0.01)(Table 3). Table 3. The Blood Chemistry of Each Experimental Group Normal (n=6) Control (n=6) Prunus (n=6) Glucose 193.66 ±49.77 1014.00 ±90.36*** 1005.66 ±95.99 Albumin 2.38 ±0.08 1.86 ±0.22** 1.92 ±0.08 BUN 24.05 ±1.33 60.23 ±6.00*** 63.85 ±14.76 Creatinine 0.55 ±0.05 0.71 ±0.07*** 0.63 ±0.05 # Total-cholesterol 77.00 ±6.54 147.83 ±35.96*** 128.00 ±28.72 LDL-cholesterol 9.66 ±2.06 15.16 ±3.43** 11.83 ±4.75 Triglyceride 77.66 ±20.65 1210.66 ±423.34*** 1054.67 ±360.18 * Significantly different from the normal group (** P<0.01, ***P<0.001) # Significantly different from the control group (# P<0.05) 의과다증식으로인한세포밀도의증가가보였다. 아울러메산지움기질을포함한세포외기질의팽창이관찰되었다. 桃仁투여군에서는사구체와보우만씨내강의크기가대조군에비해커졌고, 세포밀도는경도의메산지움세포의증식으로인해증가하였으나대조군에비해그정도가현저히낮았다. 또한내피세포, 장측상피세포들역시약간의비후가관찰되었으나정상군과비슷한정도를유지하고있었고, 메산지움기질을포함한세포외기질의일부축적이관찰되었으나, 이역시대조군에비해현저히낮았다. 또한메산지움기질의팽창정도를평가하기위해사구체내에서메산지움기질이차지하는비율을이미지분석프로그램을이용하여분석한결과정상군의 10.13±2.62% 에비해대조군에서는 38.93 ±9.17% 로유의하게증가하였고 (P<0.001), 桃仁투여군에서는 23.84±7.44% 로대조군에비해현저한증식억제효과를나타내었다 (P<0.01)(Fig. 1). 3. 신장의조직병리학적변화에미치는영향정상군은사구체의크기와보우만씨막 (Bowman's capsule) 과내강 (space) 이정상크기를나타내며, 보우만씨막내부사구체에서의내피세포 (endothelial cell), 장측상피세포 (visceral epithelial cell), 메산지움세포 (mesangial cell) 들의세포밀도 (cellularity) 가정상범위로잘유지하고있고, 기저막 (basement membrane) 의비후나메산지움기질 (mesangial matrix) 을포함한세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 의팽창이나축적이관찰되지않았으며, 결합조직의증식이나섬유화역시관찰되지않았다. 대조군에서는미만성 (diffuse) 의사구체비후와함께이로인한보우만씨내강의축소가관찰되었으며, 보우만씨막내부사구체에서는모세혈관내강 (capillary lumen) 의축소와함께메산지움세포 Fig. 1. Morphological profiles and morphometric studies of the kidney cortex from the rats with diabetic nephropathy experimentally induced by streptozotocin. (A) Normal group, (B) Control group, (C) Prunus group. Original magnification 200. (D) The proportion of mesangial matrix area within glomerulus (% of positive area). * Significantly different from the normal group (*** P<0.001) # Significantly different from the control group (## P<0.01) 524
김남규 오재선 전상윤 4. Transforming growth fasctor(tgf)-β1, tadvanced glycation end-products(ages), angiotensin Ⅱ type 1 receptor(at1) 의면역조직화학염색의변화에미치는영향사구체에서의 TGF-β1, type IV collagen, AGEs, AT1 의발현정도를평가하기위해각각의항목에대한면역조직화학염색및이미지분석을시행하였다. 사구체내 TGF-β1 양성면적은정상군의 5.91± 3.72% 에비해대조군에서 22.10±5.01% 로유의하게증가하였고 (P<0.001), 桃仁투여군에서는 16.14±5.98% 로대조군에비해유의하게감소하였다 (P<0.05)(Fig. 2). 로대조군에비해유의하게감소하였다 (P<0.01)(Fig. 4). Fig. 3. Effects of Prunus on renal type Ⅳ collagen expression in streptozotocin-induced diabetic nephropathy rats. Original magnification 200. The proportion of type Ⅳ collagen positive area within glomerulus (% of positive area). * Significantly different from the normal group (*** P<0.001) # Significantly different from the control group (# P<0.05) Fig. 2. Effects of Prunus on renal trnasforming growth factor (TGF-β1) expression in streptozotocininduced diabetic nephropathy rats. Original magnification 200. The proportion of TGF-β1 positive area within glomerulus (% of positive area). * Significantly different from the normal group (*** P<0.001) # Significantly different from the control group (# P<0.05) 사구체내 type Ⅳ collagen 양성면적은정상군의 5.15±3.51% 에비해대조군에서 24.12±3.310% 로유의하게증가하였고 (P<0.001), 桃仁투여군에서는 13.39±4.52% 로대조군에비해유의하게감소하였다 (P<0.05)(Fig. 3). 사구체내 AGEs의양성면적은정상군의 6.76± 2.21% 에비해대조군에서 23.46±5.79% 로유의하게증가하였고 (P<0.001), 桃仁투여군에서는 11.93±4.52% Fig. 4. Effects of Prunus on renal advanced glycation end-products (AGEs) expression in streptozotocin -induced diabetic nephropathy rats. Original magnification 200. The proportion of AGEs positive area within glomerulus (% of positive area). * Significantly different from the normal group (*** P<0.001) # Significantly different from the control group (## P<0.01) 525
挑仁이일측신절제와 streptozotocin 으로유발된당뇨병성신증 Rat 에미치는영향 사구체내 AT1 의양성면적은정상군의 5.24±2.38% 에비해대조군에서 23.31±7.92% 로유의하게증가하였고 (P<0.001), 桃仁투여군에서는 18.58±7.98% 로대조군에비해감소하였으나통계학적유의성은없었다 (Fig. 5). 1로설정했을때정상군에서는 0.84±0.09였고, 桃仁투여군에서는 0.93±0.12 로대조군에비해유의한차이는관찰되지않았다 (Fig. 6). ACE에대한유전자발현분석에서대조군을 1로설정했을때정상군에서는 0.39±0.19였고 (P<0.001), 桃仁투여군에서는 0.86±0.19 로대조군에비해유의한차이는관찰되지않았다 (Fig. 6). AT1에대한유전자발현분석에서대조군을 1로설정했을때정상군 0.62±0.09였고 (P<0.01), 桃仁투여군에서는 0.86±0.13 로대조군에비해유의한차이는관찰되지않았다 (Fig. 6). Fig. 5. Effects of Prunus on renal Angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1) expression in streptozotocininduced diabetic nephropathy rats. Original magnification 200. The proportion of RAGEs positive area within glomerulus (% of positive area). Each column represents the mean±s.d. * Significantly different from the normal group (* P<0.001) N.S. : No significance 5. Transforming growth fasctor(tgf)-β1, type Ⅳ collagen, receptor for AGEs(RAGEs), angiotensinconverting enzyme(ace) 및 angiotensin Ⅱ type 1 receptor(at1) 유전자발현에미치는영향 TGF-β1에대한분석에서대조군을 1로설정했을때정상군에서는 0.59±0.14였고 (P<0.01), 桃仁투여군에서는 0.76±0.14 로대조군에비해유의하게감소하였다 (P<0.05)(Fig. 6). Type Ⅳ collagen 에대한분석에서대조군을 1로설정했을때정상군에서는 0.64±0.14였고 (P<0.01), 桃仁투여군에서는 0.80±0.18로대조군에비해유의하게감소하였다 (P<0.05)(Fig. 6). RAGEs 에대한유전자발현분석에서대조군을 Fig. 6. Effects of Prunus on expression of Transforming growth factor (TGF)-β1, type Ⅳ collagen, receptor for advanced glycation end-products (RAGEs), angiotensin converting enzyme (ACE), angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1) in the renal glomerulus. * Significantly different from the normal group (** P<0.01, *** P<0.001) # Significantly different from the control group (# P<0.05) N.S. : No significance 526
김남규 오재선 전상윤 Ⅳ. 考察당뇨병은고혈당을보이는모든대사성질환들의집합체를의미한다. 당뇨병으로인한대사이상은여러장기들특히신장, 눈, 신경그리고혈관들에이차적인병태생리학적인변화를일으키게된다 2,24. 당뇨병은최근의학의발달로혈당조절이용이해지면서급성합병증에따른사망은감소하였으나유병기간의연장에의한만성합병증인대혈관및미세혈관합병증등은오히려증가하는추세이다 24,25. 특히미세혈관합병증중하나인당뇨병성신병증은말기신부전의주요한원인이며, 당뇨병과관련된이환율과사망률의주요원인이다 26. 말기신부전을일으키는만성고혈당에대한기전은완전히알려져있지않으나유전적요인과후천적요인이동시에관여한다고생각하고있다 26. 후천적요인으로는다음과같은가설에의해발생할것으로생각하고있다. 수용성인자 ( 성장인자, angiotensin Ⅱ, endothelin, AGEs) 의영향, 신장미세순환계의혈류역동적변화 ( 사구체여과율의증가, 과관류, 사구체모세혈관내압력증가 ) 및사구체내의구조적변화 ( 세포외기질의증가, 기질막의비후, 사구체간질의확장및섬유화 ) 가그것이며이러한작용의일부는 angiotensin Ⅱ 수용체를통해일어난다고알려져있다 2. 한의학에서는당뇨병을消渴의범주에속한다. 消渴이오래되면여러가지轉變證이나타나는데, 그원인에는氣虛와함께濕痰과瘀血이관여한다. 이때발생한瘀血과濕痰이全身脈絡의흐름을방해하여해당기관에기혈공급이차단되어여러가지轉變證을유발하게된다 27. 한의학에서는비록당뇨병성신증이라는병명은존재하지않지만, 당뇨병성신증의임상증상이라할수있는부종및소변증상의변화에대한내용을참고해보면水腫, 小便白濁, 關格의범주로볼수있다 4,5. 결국당뇨병성신증은精氣虛에濕痰이나瘀血이겸하여증상이더욱악화된다는것을알수있는데, 이는중 국에서만성신부전환자들을대상으로분석한자료에서도알수있다. 당뇨병성신증은결국만성신부전으로이행되게되는데, 만성신부전의경우精氣虛에주로濕熱이나瘀血이겸하여증상을더욱악화시킨다고보고하였다 27,28. 또한陣은당뇨병성신병증이당뇨병으로凝血이심해져혈류장애와말초순환장애를일으켜서발생한것으로보고치료에活血化瘀하는약물을사용함을원칙으로하였다 29. 본실험에쓰인桃仁 (Prunus Persicae Semen) 은장미과 ( 薔薇科 : Rosaceae) 에속한낙엽소관목인복숭아나무 Prunus persica (L.) Batsch 와산복사 P. davidiana (Carr.) Franch 의성숙한種子를건조한것으로, 性은平하며, 味는苦甘하고, 心 肝 大腸經에들어간다. 桃仁은破瘀行血에상용하는약물로瘀血阻滯로인한血閉 血結 血燥를잘치료하고혈의막힘을통하며血癥을破한다 15,30. 당뇨병성신증에대한최근연구를살펴보면丹蔘 10, 水蛭 11, 三七根 12, 紅花 13, 牧丹皮 14 등活血祛瘀하는약물들을단미제제로사용하여유의한결과를얻은실험들이보고되고있다. 최근桃仁에대한연구로항염효과 16, 고지혈증 17, 죽상동맥경화 18, endotoxin 을투여한혈액에미치는작용 19 등의보고가있었다. 특히桃仁이포함된복합제제로桃仁承氣湯을이용하여당뇨병성혈관장애에대한개선및혈관합병증에대한효능 20 이밝혀져破瘀行血에상용하여血瘀阻滯로인한모든증에사용하는약물인桃仁이당뇨병의미세혈관합병증인당뇨병성신증에좋은효과가있을것으로생각한다. 이에일측신절제와 Streptozotocin(STZ) 투여로유발된당뇨병성신증 rat에桃仁을투여하여 24시간요단백배설량측정, 혈청생화학적분석, 신장의조직병리학적검사, 면역조직검사및유전자발현등을관찰하였다. 실험에서는당뇨병성신증을유발하고자일측신절제후에베타세포를선택적으로파괴하는 STZ 527
挑仁이일측신절제와 streptozotocin 으로유발된당뇨병성신증 Rat 에미치는영향 를투여하여만성당뇨병성신증과같은상태를유발하고자하였다. STZ는항생제로개발되어항백혈병치료제와발암물질로도보고되었는데 1963 년 Rakieten 에의해당뇨병유발작용이발견된뒤로실험동물에서당뇨를유발하는물질로가장유용하게사용되고있으며, Ⅰ형당뇨병을유발하는가장좋은가장좋은물질이다 31. STZ와더불어일측신장의제거로인해사구체모세혈관, 메산지움, 보우만주머니의병변등의병리적인변화가나타나당뇨병성신증이유발된다 21-23,31. 또한 STZ로유발된당뇨병의경우일측신절제술없이는최소 3개월정도의유발기간이필요하지만일측신절제술을할경우이기간이단축되므로 32 실험기간의단축과보다확실한당뇨병성신증모델의유발을위하여일측신절제후에 STZ를투여하였다. 본실험에서는이렇게유발된당뇨병성신증 rat에桃仁을투여하여다음과같은결과를얻었다. 신질환에서단백뇨는신질환진행에가장강력한예측인자로, 신질환의중증도를나타내는척도일뿐아니라비정상적으로여과된다량의단백질이재흡수되어근위세뇨관세포내에단백질이축적되면신장간질에손상을입히고독성작용을끼쳐신질환의진행기전에중요한역할을한다 25,33. 당뇨병성신증에서도미세단백뇨의발생은현성단백뇨의진행에중요한위험되고일단현성단백뇨가발생하면말기신부전증으로의진행가능성이매우높다 2. 그러므로요단백의배설량감소는신부전진행속도를늦추는중요한방법이된다 25. 본실험에서는 24시간요단백배설량은대조군에서정상군에비해유의하게증가하였고, 桃仁투여군은대조군에비해유의한감소가나타났다 (Table 2). 이는桃仁의투여가당뇨병성신증의진행을억제하는것으로생각한다. 혈당의정상화와엄격한혈압조절및이상지질혈증의치료가미세단백뇨에서단백뇨로의진행을억제하는효율적인방법이다 2. 특히혈당조절은당뇨병치료에서가장중요한과제로불량한혈당 조절은당뇨병성신증의가장큰위험인자이다. 또한고지혈증이당뇨병성신증의악화인자로작용할수있는데당뇨병환자에서는 triglyceride 의상승과 high density lipoprotein(hdl)-cholesterol의감소등의이상지질혈증을동반하고, 신증에서는단백뇨의결과로 LDL-cholesterol 의상승이더악화된다. 이결과심혈관계질환의발생과이에의한높은사망률의원인이된다 26. 당뇨병성신증에서는단백뇨로인해뇨를통해배설되는단백량이증가하므로혈중 albumin 이감소하게된다. 혈중 BUN 과 creatinine 의수치는 glomerular filtration rate (GFR) 과관련이있는데, BUN과달리 creatinine 이신장이외의인자에대하여영향을거의받지않는특이성때문에 GFR의측정물질로주로사용된다 1. 본실험에서 Glucose, BUN, creatinine, total-cholesterol, LDL-cholesterol, triglyceride는정상군에비해대조군에서유의하게증가하였고, albumin은정상군에비해대조군에서유의하게감소하여대조군에서사구체손상이발생하였음을보여준다. 桃仁투여군에서대조군에비하여혈청 creatinine 농도가유의하게감소하여桃仁의투여가신장기능저하를개선시키는것으로보여지나 BUN 의변화가미미하여지속적인연구가필요할것으로생각된다 (Table 3). 당뇨병성신병증에서신장의특징적인조직학적소견으로사구체의비후, 사구체기저막의비후, 메산지움의확장과바탕질의증가, 보우만피막의유리질방울, 섬유성모자등이나타난다 26,34. 대조군에서는미만성 (diffuse) 의사구체비후와함께이로인한보우만씨내강의축소가관찰되었으며, 보우만씨막내부사구체에서는모세혈관내강 (capillary lumen) 의축소와함께메산지움세포의과다증식으로인한세포밀도의증가가보였다. 아울러메산지움기질을포함한세포외기질의팽창이관찰되었다 (Fig. 1, Control). 桃仁투여군에서는사구체와보우만씨내강의크기가대조군에비해커졌고, 세포밀도는경도의메산지움세포의 528
김남규 오재선 전상윤 증식으로인해증가하였으나대조군에비해그정도가현저히낮았다. 또한내피세포, 장측상피세포들역시약간의비후가관찰되었으나정상군과비슷한정도를유지하고있었고, 메산지움기질을포함한세포외기질의일부축적이관찰되었으나, 이역시대조군에비해현저히낮았다 (Fig. 1, Prunus). 또한메산지움기질의팽창정도가桃仁투여군에서대조군에비해유의한증식억제효과가나타나 (Fig. 1), 桃仁의투여가당뇨병성신병증의진행을억제하는효과가있음을보여준다. 당뇨병성신증에서고혈당에의한조직손상의매개인자로알려진신장내 trnasformaing growth factor(tgf)-β1, type Ⅳ collagen, advanced glycation end-products(ages), Angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1) 의발현정도를파악하였다. TGF-β1은다기능 cytokine 으로정상발육, 조직의손상과복구등생물학적활동에관여하는성장조절인자로, 사구체에서 type Ⅳ collagen, laminin, fibronectin 과같은세포외기질단백의합성을증가시키고분해는감소시켜 integrin 과같은접착물질의생성을촉진하여결과적으로사구체경화를유발시킨다 2,35-36. TGF-β1 은고혈당이나 angiotensin Ⅱ 및최종당화산물등의자극에의해생성이현저히증가하기때문에사구체섬유화의공통인자로작용함을시사한다 26. Type Ⅳ collagen 은사구체기저막을구성하는대표적인세포외기질단백으로, 메산지움의팽창과세포외기질단백의축적의주된매개인자이다 26,36-37. AGEs 는만성적인고혈당이지속되어발생되는단백질의당화반응의최종산물로, 당뇨병성신증발생의대사적요인중중요한병리인자이다. AGEs 는염증세포, 내피세포, 혈관평활근에발현되는특이수용체 (RAGEs) 와결합하고, 세포외기질단백들과직접교차결합을하여조직을손상시키고당뇨병의혈관병변을일으키는등의여러가지세포유해반응을일으킨다 24,26,34,38. Angiotensin Ⅱ는 renin-angiotensin system(ras) 의기전에의해 renin으로부터일련의과정을거쳐변환되어신장의수출세동맥에작용하여사구체내혈압을증가시켜사구체경화증을유발하며, albumin 누출을증가시키고, 그자체로 TGF-β 의발현을촉진시켜메산지움세포및세포외간질의비후를더욱유발할뿐아니라, protein kinase C나 nuclear factor κ-b와같은전사인자의발현에직접적인영향을미쳐사구체경화증을악화시킨다 26,37,39. 이러한 Angiotensin Ⅱ가작용하는수용체는크게두가지가있으나 Angiotensin Ⅱ type 2 receptor(at2) 는혈관의이완작용에관여하는물질로그발현이매우적은것으로알려져있고, 대부분이 AT1을통해서그작용이이루어지게되어혈관의수축, 심장의비대, 알도스테론분비, 나트륨재흡수, renin 분비억제등의작용을하게된다 40. 본실험에서는사구체내 TGF-β1, Type Ⅳ collagen, AGEs 의양성면적에서桃仁투여군이대조군보다유의하게감소하였으나, AT1의경우에는유의성이없었다 (Fig. 2, 3, 4, 5). 신수질 (renal medulla) 에서의 TGF-β1, type Ⅳ collagen, RAGEs, ACE, AT1 유전자발현에서는 TGF-β1, type Ⅳ collagen 이桃仁투여군에서대조군에비하여유의하게감소하였으나, RAGEs, ACE, AT1의경우유의성은없었다 (Fig. 6). 桃仁의투여가 TGF-β1 과그의작용에의해증가하는 type Ⅳ collagen 의유전자발현을억제하는것으로보아, 당뇨병성신증의발생원인중대사적요인에의해발생하는사구체경화의진행을억제하는데도움을줄수있다고생각한다 2,35. 또한桃仁의투여가 AGEs 의수용체인 RAGEs 의유전자발현에영향을끼치지못하였지만 AGEs 자체의양적면적을줄임으로혈관구역내의 AGEs-RAGEs 신호전달축의유해효과역시억제될수있으며, AGEs 와직접교차결합하는 type Ⅳ collagen 의유전자발현이억제되는것으로보아당뇨병미세혈관병증의특징인기저막의비후를억제하는데에도또한도움을줄수있다고생각된다 24. 그러나 529
挑仁이일측신절제와 streptozotocin 으로유발된당뇨병성신증 Rat 에미치는영향 桃仁의투여가 ACE와 AT1의유전자발현에유의한차이가없는것으로보아, 당뇨병성신증의발생원인중혈류역동학적원인에의해발생하는사구체경화의진행의억제에는영향이미비한것으로생각한다. 본실험에서당뇨병성신증에대한桃仁의투여는요단백배설량을감소시키고, 혈청생화학지표에서 creatinine 이유의하게감소하였다. 또한신장의여러가지조직병리학적변화억제에효과가있었으며, 이러한변화를일으키는주요인자들중 TGF-β1, type Ⅳ collagen, AGEs 등의억제에효과가있었으며, 당뇨병성신증의발생요인중대사적요인에영향을주는주요인자들의발현을억제시켰다. 이를종합해보면桃仁의투여가당뇨병성신병증의진행을지연시키고신장의기능을회복하는데유효할것으로생각한다. 參考文獻 1. Futoshi Shintani. Steps to Internal medicine. 서울 : 도서출판정담 ; 2005, p. 49-52, 165-74. 2. 대한내과학회해리슨내과학편집위원회. Harrion s 내과학. Vol. 2. 서울 : MIP; 2013, p. 2922-57. 3. 서울대학교의과대학내과학교실. 최신지견내과학 (Ⅱ). 서울 : 도서출판고려의학 ; 2003, p. 1460-72. 4. 김성아, 강윤호. 당뇨병성신증의한의학적접근및치료에대한연구. 대한한의정보학회지 2005; 11(2):1-13. 5. 두호경. 동의신계학. 서울 : 성보사 ; 2003, p. 1131-41. 6. 張天, 陳以平. 實用中醫腎病學. 서울 : 일중사 ; 1992, p. 712-8. 7. 정형철, 정지천. Streptozotocin 으로유발된흰쥐의당뇨병성신증에서加味九氣環童丸이 Oxidative Stress 및 Polyol Pathway에미치는영향. 동의생리병리학회지 2007;21(3):671-8. 8. 신현권, 류충렬. 韓藥複合處方이 Streptozotocin 으로유발된糖尿病흰쥐의血糖및糖尿病性腎 症발현에미치는영향. 대한침구학회지 2008; 25(3):1-11. 9. 이연경, 강석봉. 加味五苓散이 Streptozotocin으로유발된흰쥐의糖尿病性腎症에미치는영향. 대한한방내과학회지 2012;33(4):367-86. 10. 김영성, 이병철, 안세영, 두호경, 안영민. 단삼이당뇨병성신병증 Rat의신기능및조직학적변화에미치는영향. 대한한방내과학회지 2008;29(3): 787-99. 11. 서수환, 김용성, 한양희. 水蛭이 Streptozotocin 으로유발된 Rat의糖尿病性腎症에미치는影響. 대한한의학회지 2008;29(4):133-45. 12. 김동훈. 三七根이당뇨병성신병증에미치는영향. 동신대대학원 2013. 13. 김경국. 紅花가일측신절제와 streptozotocin 으로유발된 rat의糖尿病性腎症에미치는영향. 동신대대학원 2013. 14. 김민석. 당뇨병성신증 Rat에牧丹皮가미치는영향. 동신대대학원 2013. 15. 全國韓醫科大學共同敎材編輯委員會編著. 本草學. 서울 : 永林社 ; 2011, p. 462-3. 16. 조우아, 장민정, 천순주, 등. 桃仁껍질의화장품약리활성및항염효과. 大韓本草學會誌 2006; 21(2):87-93. 17. 윤왕수, 소경순, 정찬길. 도인이 Triton WR-1339 로誘發된흰쥐의高旨血症에미치는影響. 대한예방한의학회지 2002;6(2):128-36. 18. 尹仁漢. 桃仁이高 Cholesterol 食餌에의한家兎의粥狀動脈硬化에미치는影響. 경산대학교대학원 1996. 19. 이창근, 소경순, 정찬길. 桃仁이 Endotoxin 을투여한흰쥐의혈액에미치는影響. 대한약침학회지 2005;8(2):59-65. 20. 金言國. 당뇨병성혈관장애에대한도인승기탕의개선효과연구. 원광대학교대학원. 2010. 21. Yokozawa T, Nakagawa T, Wakaki K, Koizumi F. Animal model of diabetic nephropathy. Exp 530
김남규 오재선 전상윤 Toxic Pathol 2001;53: 359-63. 22. Wei M. Ong L, Smith MT, Ross FR, Schmid K, Hoey AJ, et al. The streptozotocin-diabetic rat as a model of the chronic complications of human diabetes. Heart, Lung and Circulation 2003;12: 44-50. 23. Brondum E, Nilsson H, Aalkjær C. Funtional abnormalities in isolated atteries from Goto- Kakizaki and streptozotocin-treated diabetic rat models. Horm Metab Res 2005;37:56-60. 24. 범문에듀케이션편집부. 병리학. 서울 : 범문에듀케이션 ; 2011, p. 927-8, 1118-33. 25. 대한신장학회. 임상신장학. 서울 : 광문출판사 ; 2005, p. 330-43, 594-7. 26. 김용진, 민헌기, 최영길, 이태희, 허갑범, 신순현, 등. 당뇨병학. 제 4판. 서울 : 대한당뇨병학회 ; 2011, p. 585-603. 27. 전국한의과대학신계내과학교실. 腎系內科學. 서울 : 군자출판사 ; 2011, p. 89-96, 300-12. 28. 양위, 주문봉, 용국향, 주소주, 호박군, 구용만, 등. 681례의만성신부전환자에대한각단계에서의邪實兼證의특점분석. 동서의학 2000; 27(1):33-40. 29. 陳以平. 腎病的辨證與辨病治療. 북경 : 人民衛生出版社 ; 2003, p. 143-61. 30. 張介賓. 景岳全書. 서울 : 도서출판한미의학 ; 2006, p. 2512-3. 31. 이태희. 당뇨병유발약물의기전. 대한당뇨병 학회지당뇨병 1993;27(1):1-15. 32. Lopes GS, Lemos CC, Mandarim-De-Lacerda CA, Bregman R. Effect of unilateral nephrectomy on renal function of diabetic rats. Histol Histopathol 2004;19(4):1085-8. 33. 서울대학교병원신장내과. 임상신장학입문. 서울 : ( 주 ) 신흥메드싸이언스 ; 2002, p. 389-91. 34. 대한병리학회. 병리학 [Ⅱ]. 서울 : 고문사 (KMS); 2011, p. 770-7, 814-6. 35. Sharma K, Ziyadeh FN. The emerging role of transforming growth factor-β in kidney disease. Am J Physiol 1994;35(6):829-42. 36. 강영선, 지이화, 한상엽, 신진호, 조상경, 차대룡, 등. 당뇨병성신증의발병기전으로족세포 (Podocyte) 에서형질전환인자 (Transforming Grdwth Factor) β의역할. 대한신장학회지 2003;22(6):645-54. 37. 김용섭, 이정호, 조상경, 윤종우, 이소영, 한상엽, 등. 고농도포도당에서배양한혈관사이질세포에서안지오텐신 Ⅱ와안지오텐신전환효소억제제가 Procollagen α1(Ⅳ) mrna 발현에미치는효과. 대한신장학회지 2000;19(1):12-21. 38. 대한내분비학회. 내분비대사학. 서울 : 군자출판사 ; 2011, p. 713-20. 39. 박정탁, 강신욱. 당뇨병성신증의병태생리. 대한내과학회지 2009;77(6):670-7. 40. Atlas SA. The renin-angiotensin aldosterone system: pathophysiological role and pharmacologic inhibition. J Manag Care Pharm 2007;13:9-20. 531