J Physiol & Pathol Korean Med 29(3):223~229, 2015 용담초추출물의화장품소재로서약리활성에관한연구 최형욱 1 인명희 1 문연자 1,2 임규상 1,3 우원홍 3,4* 1 : 원광대학교한의학전문대학원한약자원개발학과, 2 : 원광대학교한의학전문대학원 BK21-plus 팀, 3 : 한국전통의학연구소, 4 : 한의과대학해부학교실 Study on Pharmacological Activation as Cosmetic Material of Gentianae scabrae bunge Extract Hyung Wook Choi 1, Myung Hee In 1, Yeun Ja Mun 1,2, Kyu Sang Lim 1,3, Won Hong Woo 3,4 * 1 : Department of Herbal Resources, Professional Graduate School of Korean Medicine, Wonkwang University, 2 : BK21-plus Team, Professional Graduate School of Korean Medicine, Wonkwang University, 3 : Research Center of Traditional Korean Medicine, 4 : Department of Anatomy, College of Korean Medicine, Wonkwang University In this study, we investigated the effect of ethanol extracts from Gentianae scabrae bunge (GSB) on the activities of antioxidant, whitening and anti-inflammation. Viability of cells was measured by neutral red (NR) assay, and inhibitory effects of GSB on melanin synthesis was determined the melanin production in B16F10 cells. The expression level of matrix metalloproteinase-1 (MMP-1) in media was analyzed by ELISA kit, and nitric oxide (NO) production in RAW264.7 cells was monitored by measuring the nitrite content in culture medium. GSB showed highly efficacy in 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging activity, and significantly reduced melanin synthesis in B16F10 cells. MMP-1 production in UVB-stimulated human dermal fibroblast (HDF) cells was inhibited by GSB treatments. NO production was suppressed by the treatment of GSB in LPS-stimulated RAW264.7 cells. From this results, it was indicated that GSB could be utilized as anti-aging and whitening cosmetic ingredients. keywords : Gentianae scabrae bunge, antioxidant, melanin, MMP-1, nitric oxide 서론 건강하고아름다운피부에대한관심이증가함에따라각종생약과식용식물추출물등에서보다안전하고효과가뛰어난천연항산화제를개발하기위해많은연구가활발히이루어지고있다 1,2). 피부는표피, 진피, 피하지방으로구성되어있으며표피층에는각질형성세포, 멜라닌세포, 랑게한스세포, 머켈세포등이존재한다. 이중멜라닌세포는표피의기저층에존재하여멜라닌을생성하며피부색과연관되어있다 3). 멜라닌은외부환경으로부터피부세포를보호해주는역할을하지만자외선노출및피부노화로인해생리기능이떨어지게되면멜라닌이국소적으로과도하게합성되거나피부표면에침착되어기미, 주근깨및다양한색소침착을형성하고심하게는피부암을유발하는것으로알려져있다 4). 피부의진피층에는 collagen과 elastin 섬유가그물망구조를형성하고있는데, elastin과 collagen이 elastase와 collagenase에의해분해되면피부가처지고주름이생겨피부노화가발생한다 5). 이러한피부노화와색소병변의주요원인이계속적인자외선노출로생성된과잉활성산소종 (reactive oxygen species, ROS) 에의한산화적스트레스로밝혀짐에따라피부노화를지연시키고억제하기위해서는생체내뿐만아니라피부에서의과잉활성산소종을억제하고활성산소를효과적으로제거할수있는항산화방어시스템이필요하다 6). 용담초 (Gentiana scabra Bunge) 는다년생초본으로초용담 ( 草龍膽 ), 지담초 ( 地膽草 ) 등여러가지이름으로불리고있으며맛은쓰고성질은차다. 간경, 담경, 위경에작용하며한방에서사용되는뿌리의성미 ( 性味 ) 는고한 ( 苦寒 ) 으로간담의열과위열을내리고하초의습열을없앤다 7). 용담초의성분은 gentiopicrin으로이는 secoiridoidal glycosides에속하며기타고미배탕체로는 sweroside, swertiamarin, amarogentin, amaroswerin 등이있다. 또한용담초는 gentianine을비롯한여러종류의알칼로이드를함유하고있으며약리작용으로는항균, 항기생충작용, 소염작용, 면역증강작용, 간기능보호작용, 이담작용등이있다 7-9). * Corresponding author Won Hong Woo, Department of Anatomy, College of Korean Medicine, Wonkwang University, 344-2, Sinyong-dong, Iksan-si, Jeollabuk-do, Korea E-mail : whwoo@wku.ac.kr Tel : +82-63-850-6845 Received : 2015/03/16 Revised : 2015/04/15 Accepted : 2015/04/23 c The Korean Society of Oriental Pathology, The Physiological Society of Korean Medicine pissn 1738-7698 eissn 2288-2529 http://dx.doi.org/10.15188/kjopp.2015.06.29.3.223 Available online at http://society.kisti.re.kr/sv/sv_svjscj03l.do?method=list&poid=ksomp&kojic=drsrdh&svnc=v28n5&menuid=1&subid=13
224 H. W. Choi et al 용담초에대한연구에서서 9) 는용담초추출물의항산화효과를 입증하였고, 김 10) 은용담초메탄올추출물이염증질환, 면역질환의 조절에효과가있다고하였다. 또한한 11) 은 CCl₄ 흰쥐의손상된간에 용담초약침을처치하여회복시키는효과를입증하였고, 문 12) 은용 담초약침을담석의치료에응용할수있다고보고하였다. 본연구에서는 RAW264.7 세포, B16/F10 멜라닌세포주및사 람진피섬유아세포 (human dermal fibroblast, HDF) 를이용하여 용담초추출물이독성실험, 항산화, 항염, 멜라닌및콜라겐생성에 미치는영향을비교분석하여천연화장품으로서용담초의사용가 능성을제시하고자한다. 1. 시료추출 재료및방법 용담초는시료중량에 10 배의 95% 에탄올을가하여상온에서 72 시간방치하고그추출액을 9,000 rpm 으로 15 분간원심분리하 여얻은상층액을여과지 (Whatman No. 2) 로여과한후필터링한 다음감압농축하여 3 일동결건조한후그분말을본실험에사용 하였다. 2. 세포배양 한국세포주은행 (Korea) 에서분양받은 RAW264.7 macrophage 세포, B16/F10 mouse melanoma 세포, human dermal fibroblast (HDF) 세포는 10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic 을첨가한 DMEM 을사용하여 37, 5% CO 2 배양기에서배양하였다. 3. 항산화활성측정 정 (1) 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼소거능측 DPPH 라디칼은매우안정한활성산소 (reactive oxygen species, ROS) 이며, 이라디칼을소거하는정도로써항산화작용을 평가할수있으며라디칼소거활성은 Blois 의방법으로측정하였다 13). 용담초에탄올추출물을 10 50 µg/ml 의농도로용해시킨 후 96 well plate 에 0.2 mm 로용해시킨 DPPH 용액 180 µl 와시 료액 20 µl 첨가하고 37 C 에서 30 분간반응시켰다. 반응후 517 nm 에서흡광도를측정하였으며표준물질은 ascrobic acid 를사용 하였다. DPPH 라디컬소거활성 (%) = 100 - [( 시료첨가군흡광도 ) 100] 시료무첨가군흡광도 (2) Superoxide dismutase (SOD) 유사활성측정 SOD 유사활성은 Marklund 와 Marklund 의방법 14) 에따라과 산화수소 (H 2O 2) 로전환반응을촉매시키는 pyrogallol 의생성량을측 정하여 SOD 유사활성으로나타내었다. 일정농도의시료 0.2 ml 에 ph 8.5 Tris-HCI buffer (50 mm tris-hydroxymethy1 amino methane + 10 mm EDTA) 2.6 ml 와 7.2 mm pyrogallol 0.2 ml 를첨가하고실온에서 20 분간반응시킨후 l N HCl 0.1 ml 를 가하여반응을정지시켰다. 반응액이중화된 pyrogallol 양은 420 nm 에서흡광도를측정하였다. SOD 유사활성은시료첨가군과무 첨가군간의흡광도차이를백분율로표시하였다. SOD 유사활성 (%) = 100 - [( 4. 세포생존율측정 시료첨가군흡광도 ) 100] 시료무첨가군흡광도 실험에서사용된시료의세포독성을나타내는농도범위는 neutral red (NR) assay 를이용하여확인하였다 15). 연구에사용한 세포주는 RAW264.7, B16/F10, HDF 세포를사용하였으며, 96 well plate 에 well 당 3 10⁴ 세포로분주하여 24 시간동안전배양 하였다. 세포에용담초를농도별로첨가하고 48 시간동안 37, 5% CO 2 배양기에서배양하였다. 배양한세포는배양액을 NR solution 이 1% 포함된무혈청배지로교환하여 3 시간배양한다음현미경 으로 NR 의결정화유무를확인하였다. Formaldehyde 용액 10% 가 첨가된 phosphate buffered saline (PBS) 을각 well 에 100 µl 로 20 분처리하여세포를고정하였다. NR desorb solution (1% glacial acetic acid, 49% ethanol, 50% distilled water) 을각 well 에 100 µl 분주하여세포내의 NR 을추출하고 540 nm 에서흡 광도를측정하였다. 세포생존율은아래의식에따라계산하였다. 세포생존율 (%)= 5. Melanin 생성억제능측정 시료첨가군흡광도 ) 100] 시료무첨가군흡광도 B16/F10 melanoma 세포를이용하여용담초의멜라닌생성 억제능을측정하였다 16). 96 well plate 에 B16/F10 세포를 2 10³/well 로분주하고, 세포가바닥에부착할수있도록 24 시간 동안전배양하였다. 세포부착확인후 melanin 생성을촉진하기 위하여혈청 5% 와 α-msh 10 nm 이포함된배지로교환후, 시료 를각농도별로처리하였다. 양성대조군 arbutin 을배양용배지에 용해하여사용하였으며, 분비된멜라닌의양은 405 nm 에서측정하 였고멜라닌생성량을 α-msh 무처리군과비교하여백분율로표시 하였다. 6. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 용담초추출물이 HDF 세포에서 MMP-1 생성에미치는영향을확 인하고자 ELISA 방법을이용하였다. 먼저 HDF 세포를 96 well plate 에 2 10³/well 로부착한후 UVB 25 mj/cm² 를조사한다음 용담초추출물을 1.25, 2.5, 5, 10, 20 µg/ml 로처리하였다. 24 시 간후배양상층액을제거한후 washing buffer (Tween 20 in PBS) 로 3 번세척하였다. Blocking buffer (0.1% BSA in PBS) 100 µl 로처리한후 37 C 에서 1 시간배양시킨다음상층액을제거하고 washing buffer (Tween 20 in PBS) 로 3 번세척하였다. 1:1000 으 로회석한일차항체 (anti-mmp-1 mouse antibody in 0.1% BSA/well) 50 µl 로처리한후 37 C 에서 1 시간배양시킨다음상층 액을제거한후 washing buffer (Tween 20 in PBS) 로 3 번세척하 였다. 1:4000 으로회석한이차항체 (anti-mouse IgG antibody in
H. W. Choi et al 225 0.1 % BSA/well) 50 µl로처리한후 37 C에서 1시간배양시킨다음상층액을제거한후 washing buffer (Tween 20 in PBS) 로 5번세척하였다. 1 mg/ml의농도로녹인 para-nirophenylphosphate (pnpp) 100 µl를각 well당처리한후 37 C 암실에서 1시간배양시킨다음 405 nm에서흡광도를측정하였다. 한결과 SOD 유사활성변화는용담초추출물의농도가올라갈수 록농도의존적으로활성이높게나타남을알수있었다 (Fig. 2). 7. Nitric oxide (NO) 생성저해능측정용담초추출물이 RAW264.7 세포배양에서 NO 생성에미치는영향을측정하기위해 Green 등의방법 17) 에따라세포배양액내 NO 양을 nitrite (NO2 - ) 와 nitrate (NO3 - ) 형태로측정하였다. RAW264.7 세포를 96 well plate에 5 10⁴/well로분주하고 24시간동안전배양후배지를제거하고 LPS가 1 µg/ml이포함된무혈청배지에용담초를각농도별로가하여 48시간동안후배양하였다. 새로운 96 well plate에배양된세포배양상층액 100 µl와 Griess reagent 100 µl을첨가하여차광된상태에서 10분간반응시키고 540 nm에서흡광도를측정하였으며 LPS 처리군과비교하여백분율로표시하였다. Fig. 1. DPPH radical scavenging activity of GSB extract. DPPH radical scavenging activity was measured as described in materials and methods. The results were expressed as the average of triplicate samples with S.D. *p<0.01 compared with ascorbic acid. NO 생성저해능 (%) = 100 - 시료첨가군의 O.D. at 540nm ) 100] 시료무첨가군의 O.D. at 540nm 8. 통계처리모든실험은 3회반복하였으며, 분석수치는 Mean ± S.D로표시하였고 SPSS (Statistical Package for the Social Science) WIN 17.0 프로그램을이용하였으며통계분석은 ANOVA Test에의해분석하였다. 통계적유의성은 *p<0.01, **(##)p<0.001로표기하여유의성의차이가있는것으로판단하였다. 결과 1. 항산화활성 1) DPPH radical 소거능항산화제는보랏빛의 DPPH 라디칼 (DPPH-) 을무색 (DPPH-H) 의형태로전환시키는데용담초추출물의항산화효과를알아보기위해 DPPH라디칼소거능을측정하였다. 본실험에서 DPPH를이용한 free- radical 소거활성을측정한결과 10µg의농도로용담초추출물을처리하였을때는크게변화가보이지않았으나 50µg 농도에서는 55% 의높은 DPPH radical 소거능을나타나는것을확인할수있었다 (Fig. 1). 따라서본실험에서는고농도용담초추출물을처리하였을경우 DPPH radical 소거능이높게나오는것을확인할수있었다. 2) SOD 유사활성 SOD는생체에매우유해한 peroxide anion radical(o ₂) 과반응하여 hydrogen peroxide (2O₂ + 2H+ H 2O 2) 를생성하는효소로써산소를운반하는모든생물종에존재하며, 생체내에서활성산소장애에대한방어작용을하는대표적인활성산소저해제이다 18). SOD에의해생성된 H 2O 2 는 peroxidase나 catalase에의해무해한물분자와산소분자로전환된다 19). 이러한 SOD와유사한역할을하는 superoxide anion의활성화억제능을알아보기위하여실험 Fig. 2. SOD-like activity of GSB extract. SOD-like activity was measured as described in materials and methods. The results were expressed as the average of triplicate samples with S.D. *p<0.01 compared with control. 2. 멜라닌생성억제효과 피부색은표피에존재하는색소세포인멜라닌세포에서생성하 는멜라닌색소의양, 분포, 혈류의흐름에영향을받게된다. 피부 에서색소침착의정도는멜라닌지수로평가될수있으며, 피부표 면의멜라닌수치는안면피부의색소침착형태, 자외선에대한민 감도등을파악하는데주요한평가지표가된다. 본실험에서는용 담초추출물의멜라닌형성에미치는영향을평가하기위한전단 계로 B16/F10 세포에대한독성을확인하기위해 B16/F10 세포에 용담초추출물을농도별로처리하여 48 시간동안배양한후 NR assay 를수행하였다. 실험결과거의모든농도에서세포생존율이 100% 이상나타나세포독성이없는것으로확인할수있었다 (Fig. 3A). 용담초추출물이멜라닌생성에미치는영향을조사하기위해 B16/F10 세포에멜라닌세포자극호르몬 (α-melanocyte Stimulating Hormone, α-msh) 10 nm 을처리하여멜라닌생성을 유도하고동시에용담초추출물 1.25, 2.5, 5, 10, 20 µg/ml 의농 도로처리한후멜라닌생성량을비교하였다. 실험결과 α-msh 단 독처리한경우멜라닌함량이대조군에비하여뚜렷하게증가하
226 H. W. Choi et al 는것을확인할수있었으며, 용담초추출물을 20 μg /ml의농도로처리한경우멜라닌생성이 62% 억제되었다 (Fig. 3B). A B 추출물 1.25, 2.5, 5, 10, 20 μg /ml의농도로처리하였을때, LPS 처리군에비해농도의존적으로 NO 생성이억제되는것으로나타났다 (Fig. 5B). A B Fig. 3. Effect of GSB extract on melanin production in B16/F10 cells stimulated with α-msh. B16F10 cells were plated at 3 10⁴cells/well and incubated in media containing from 1.25 to 20 µg/ml for 48 hours. Cell viability was measured by MTT assay (a). Effect on melanin production was tested with various doses of GSB extract and α-msh (b). The results were expressed as the average of triplicate samples with S.D. ##p<0.001 compared with control, and **p<0.001 compared with α-msh treated group. 3. MMP-1 발현억제능 MMP-1 은세포외기질을분해시키는단백질이며, 과도하게활 성화되면 MMP 의생성을억제하는 tissue inhibitor of MMPs (TIMP) 가발현되어서로상호작용에의해조절되고있다 20). 이러한 MMPs 의발현과활성이증가하게되면 collagen 분해를촉진시켜 피부노화를일으키는중요한원인이된다. 본실험에서는용담초추 출물이 MMP-1 의생성변화에미치는영향을알아보기위한전단 계로 HDF 세포에대한독성을확인하기위해 HDF 세포에용담초 추출물을농도별로처리하여 48 시간동안배양한후 NR assay 를 수행하였다. 실험결과모든농도에서세포생존율이 95% 이상으로 나타났다 (Fig. 4A). 용담초추출물이 MMP-1 의생성변화에미치는영향을알아보 기위하여용담초추출물을 HDF 세포에 24 시간동안처리한후배 양상층액을취하여 ELISA 방법으로 MMP-1 함량을측정하였다. UVB 25 mj/cm² 를조사한 HDF 세포에용담초추출물을 1.25, 2.5, 5, 10, 20 µg/ml 을처리한결과, 용담초추출물 5 µg/ml 까 지농도의존적으로 MMP-1 발현을억제하였다 (Fig. 4B). 4. NO 생성억제효과 용담초추출물의 NO 생성에미치는영향을평가하기위한전 단계로 RAW264.7 세포에대한독성을확인하기위해 RAW264.7 세포에용담초추출물을농도별로처리하여 48 시간동안배양한후 NR assay 를수행하였다. 실험결과용담초추출물을 5-20 µg/ml 의농도로첨가하였을때, 대체로 90% 이상의생존율을유지하였 다. 그러나농도가 50-100µg/mL 에서는세포의생존율이현격히줄 어드는것을확인할수있다. 따라서향후실험은 20 µg/ml 이내 에서실시하였다 (Fig. 5A). 용담초추출물을이용하여 RAW264.7 cell 에서 LPS 에의해유 도되는 NO 의생성을억제시키는지의여부를평가한결과용담초 Fig. 4. Effect of GSB extract on MMP-1 production in UVB-irradiated HDF cells. HDF cells were plated at 3 10⁴cells/well and incubated in media containing from 1.25 to 20 µg/ml for 48 hours. Cell viability was measured by MTT assay (a). HDF cells were pretreated with GSB followed by UVB irradiation(25mj/c m2 ). MMP-1 production was measured by ELISA assay as described in materials and methods(b). The results were expressed as the average of triplicate samples with S.D. ##p<0.001 compared with control, and *p<0.01, **p<0.001 compared with the UVB-irradiated group. A B Fig. 5. Effect of GSB extract on NO production in RAW264.7 cells. RAW264.7 cells were plated at 3 10⁴cells/well and incubated in media containing from 5 to 100 µg/ml for 48 hours. Cell viability was measured by MTT assay (a). RAW264.7 cells were treated with LPS (1 µg/ml) and combined with GSB for 48h. Nitrite was measured by Griess reagent(b). The results were expressed as the average of triplicate samples with S.D. ##p<0.001 compared with control, and *p<0.01, **p<0.001 compared with LPS treated group. 고 찰 피부는신체의생리적시스템과환경사이의장벽을구성하는 기관으로꾾임없이환경적스트레스에노출되고, 이로인해피부건 조, 주름, 어두운피부톤등이나타날수있으며, 대표적환경자극 인자외선의유해한영향으로인한화학적노화가자연적노화와 함께피부의노화를촉진시킨다 21). 피부가노화되면여러가지대 사활성이저하되고세포활성도떨어지게되는데이로인해피부가 건조해지고진피내의기질단백질이결핍되어피부가얇아지며탄 력이떨어져주름이생기게된다. 주름의생성은여러가지원인이 있으나나이의증가와환경적요인외에근육의분포와움직임등
H. W. Choi et al 227 결합조직섬유의손상과도연관성이있으며그밖에유전적요인과 estrogen등의호르몬에의해영향을받는다 22). 항산화효소중의하나인 SOD는세포에해로운활성산소를과산화수소수로전환시키는촉매작용을하는효소로 23), 생체내에서생성된활성산소는체내에서산화적장애를초래하게된다. SOD 유사활성물질은주로 phytochemical에속하는저분자물질이 SOD와유사한역할을하여 superoxide의반응성을억제하여 superoxide로부터생체를보호한다고보고되어있다. 따라서 SOD 유사활성을갖는물질은인체내의 superoxide를제거함으로써노화억제와더불어산화적장애를방어할수있다 24). 본실험에서용담초추출물이항산화활성에미치는영향을조사한결과, 항산화활성은농도의존적으로증가하였으며 DPPH radical 소거능에서는 10 µg/ml의용담초추출물을처리하였을때는크게변화가보이지않았으나 50 µg/ml 농도에서는 55% 의높은 DPPH radical 소거능을나타나는것을확인할수있었다. 멜라닌은표피의기저층에존재하는멜라닌세포내의 melanosome에서다양한효소에의해생성된다. 색소세포인멜라닌은외부환경으로부터피부세포를보호해주는역할을하지만자외선노출및피부노화로인해생리기능이떨어지게되면멜라닌이국소적으로과도하게합성되거나피부표면에침착되어기미, 주근깨및다양한색소침착을형성하고심하게는피부암을유발하는것으로알려져있다 25). 본실험에서용담초에탄올추출물이 melanin 생성에미치는영향을조사한결과, 용담초추출물 20 µg/ml 농도에서멜라닌생성이 62% 억제된것으로나타났다. 피부의결합조직은 collagen과 elastin에의해이루어지며노화로인해피부가약해지거나반복적인자외선의노출은어두운피부톤과피부에 metalloproteinases (MMPS) 를증가시키고 MMPs는피부의 collagen을분해하며이런현상의반복으로인해피부주름이가속화된다 22). MMP-1은세포외기질을분해시키는중요한단백질이며, 과도하게활성화되면 MMP의활성을억제하는 tissue inhibitor of MMPs (TIMP) 가발현되어서로상호작용에의해조절된다 20). 이러한 MMPs의발현과활성이증가하게되면 collagen 분해를촉진시켜피부노화를일으키는중요한원인이되며 26) 이러한단백질가수분해물로부터얻어진펩타이드가주름개선, 보습증진, 탄력증가와특정피부효능소재로활용되고있으며, 대표적인것이콜라겐가수분해물이다 27,28). 본실험에서 MMP-1 활성변화에미치는영향을조사한결과 HDF세포에 UVB를조사하면 MMP-1 활성이크게증가하였고용담초추출물을첨가하면이들의활성이감소하는것으로나타났다. 용담은 secoridoid 배당체를함유하고있는식물로서, 용담이가지는항염증효과에관한것으로는 Gentiana scabra Bunge에서분리된 5-(hydroxymethy1)-2-furfural 가 LPS로활성화시킨 RAW264.7 세포에서농도의존적으로 NO생성을저하시킨다는것을확인하였으며 gentiopicroside가 carrageenin으로유발시킨흰쥐족적부종시험에있어서항염증효과가있고 29,30) 한방에서는용담이가지는차가운성질로인하여열을내리고염증을억제하는작용이있으며, 위와장의운동기능을항진시키고소화액의분비를촉진하는성질이있는것 31) 으로보고되었다. 염증반응이란체내에외부로부터물리적, 화학적자극이나세균감염에대해면역세포가이를인지하여다양한염증매개물질을분비함으로써손상된조직을수복하거나재생하려는기전이다 32). 그러나지속적으로또는과도하게발생된만성염증반응은조직의손상을유발하며이와관련한 ROS와염증성 cytokine은내독소자극을포함한다양한질병의매개체로써중요한역할을한다 33). Nitric oxide (NO) 는혈압조절, 신경전달, 혈액응고, 면역기능등의역할을하는것으로알려져있으며, 여러조직과세포에서 Larginine으로부터 Nitric Oxide Synthase (NOS) 에의해생성된다 34). 또한 NO 가혈관투과성증가, 부종등염증반응을야기하거나 cyclooxygenase (COX) 의활성을촉진시켜 prostaglandin 등의생합성을촉진하여염증반응을심화시키는것으로나타난다 35-38). NO 는신경계, 면역계, 심장혈관계에있어서중요한전달물질로신경독성및신경보호성의기능을동시에나타내며쇼크와다른신경퇴행성질병의발생에도관여하는것으로알려져있다 39,40). 본실험에서용담초추출물이 RAW264.7 cell에서 LPS에의해유도되는 NO의생성을억제시키는지의여부를평가한결과용담초추출물 20 μg /ml의농도에서 NO 생성이 80% 이상억제되는것으로나타나항염작용이매우우수한것으로나타났다. 결론 용담초에탄올추출물의항산화, 항염증, 멜라닌및콜라겐생성에미치는영향을알아보기위하여 RAW264.7 세포, B16/F10 세포, HDF 세포들을활용하여세포독성과세포내 NO (Nitric Oxide) 생성량을측정하였고, 세포내멜라닌생성억제실험과 MMP-1 발현변화실험을실시한결과다음과같은결과를얻었다. 용담초에탄올추출물은 DPPH radical 소거능과 SOD 유사활성이농도의존적으로높게나타났으며 20 µg/ml 농도에서 RAW264.7 세포, B16/F10 세포와 HDF 세포의생존율은 90% 이상나타나세포독성이없는것을확인하였다. 용담초에탄올추출물은 B16/F10 세포의 melanin 생성을유의하게감소시켰으며 HDF 세포에서 MMP-1 발현을억제하였고 RAW264.7 세포에서 NO 생성을유의하게억제하였다. 이상의결과용담초추출물은본실험에서다양한세포에대해독성을나타내지않았으며항산화, 멜라닌및콜라겐생성효능및항염효능을가지고있는것으로보아기능성소재로서의활용성이있을것이라사료된다. References 1. Lim, D.K., Choi, U., Shin, D.H. Antioxidative activity of ethanol extract from Korean medicinal plants. Korean J. Food Sci.Technol. 28(1):83-89, 1996. 2. Kim, H.K., Kim, Y.E., Do, J.R., Lee, Y.C., Lee, B.Y. Antioxidative activity and physiological activity of some Korean medicinal plants. Korean J. Food Sci, Technol. 27(1):80-85, 1995.
228 H. W. Choi et al 3. Kang, T.C., Go, J.S., Kwon, O.Y., Gi, Y.G., Kim, K.Y. Human histology. Seoul. Ko Moon Sa. 7: 263, 2012. 4. Kubo, M., Matsuda, H. Development tudies of cuticle and medicinal drug from natural sources on melanin biosynthesis. Fragrance J. 8: 48-55, 1995. 5. Do, J.R., Baek, S.Y., Im, S.D., Kim, Y.M., Kim, I.H., Han, D.S., Kim, B.S. Selection of beauty material from Fruits and Vegetables. J Kor Soc Food Sci. Nutr. 10: 248-248, 2008. 6. Ryu, I.S., Lee, S.J., Lee, S.W., Mun, Y.J., Woo, W.H., Kim, Y.M., Lee, J.C., Lim, K.S. Dermal Bioactive Properties of the Ethanol Extract from Flowers of Lespedeza bicolor. J Korean Oriental Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology. 20(2):1-9, 2007. 7. Kim, H.C. Pharmacology for Herbal Medicine. Jipmoondang. pp 140-141, 2008. 8. Lee, H.J., Jang, M.Y., Kim, M.R., Bae, K.H., Sok, D.E. Screening of Inhibitor of Thyroid Peroxidase, and Oxidative Coupling Enzyme from Natural Poducts. 43(3):334-341, 1999. 9. Seo, J.W. The anti-oxidative activities and separation of the Gentiana scabra var. buergeri extracts. Wonkwang University. 2008. 10. Kim, M.S., Kim, S.C., Jee, S.Y., Hwang, S.Y., Cho, W.J., Lee, J.R., Park, S.J. Inhibitory effect of Gentianae Radix MeOH extract on pro-inflammatory mediator production in lipopolysaccharide activated Raw264.7 cells. J Korean Oriental Medical Ophthalmology & Otolaryngology & Dermatology. 21(1):28-38, 2008. 11. Han, S.W. Effects of Aqua - acupuncture with Gentianae scabrae Radix and Bupleuri Radix Extract on Serum Activities of GOT, GPT, LDH, ALP and r-gtp in Damaged Rat Liver induced by the Carbon Tetracholoride (CCL4). The Acupuncture. 10(1):297-313, 1993. 12. Moon, S.H., Park, D.S., An, B.C. Effects of G.S.R. Aqua - acupuncture by Density Gallstone Formation im Mice. J Kor Acupuncture & Moxibustion Soc. 8(1):141-156, 1991. 13. Blois, M.S. Anti oxidant deter minations by the use of stable free radical. Nature. 18: 1199-1120, 1958. 14. Marklund, S., Marklund, G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem. 47(3):469-474, 1974. 15. Borenfreund, E., Puerner, J.A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption. Toxicol Lett. 24(2-3):119-124, 1984. 16. Lim, H.W., Yoon, M.Y., Cha, S.B., Kim, K.W., Park, Y.K., Lee, J.Y. Effects of citrus essential oils melanin production in B16 melanima cell. J Yakhak Hoeji. 47: 15-30, 2003. 17. Green strok, C.L. Radiation and aging free radical damage, biological response and possible antioxidant intervention. Med Hypotheses. 41(5):473-482, 1993. 18. Kim, K.H. A Study on the Application of Cosmetic Materials using Antioxidant Activity of the Extracts from Castanea crenata Leaf. Daegu Haany University. 2011. 19. Pryor, W.A. Oxy-radicals and related specied their formation life-time and reactions. Annu Rev Physiol. 48: 657-667, 1986. 20. Homebeck, W. Downregulation of tissue inhibitor of matrix metallo protease-1 (TIMP-1) in aged human skin contributes to matrix degradation and impaired cell growth and survival. J Pathol Biol. 51(10):569, 2003. 21. Papa, S., Skulachev, V.P. Reactive oxygen species, mitochondria, apoptosis and aging. Mol Cell Biol. 174(1-2):305-319, 1997. 22. W. laschej, M., Brivib, K., Stricjlin, G.P., Sies, H., Scharffetter-Kochanek K. Singlet oxygen may mediate the ultraviolet A-induced synthesis of interstitial collagenase. J.Invest.Dermatol. 104(2):194-198, 1995. 23. Jang, M.J. Studies on anti-oxidant of Pinus rigida inner bark for the development of functional cosmetics. Daegu Haany University, 2007. 24. Kitani, K., Minami, C., Yamamoto, T., Kanai, S., Ivy, G.O., Carrillo, M.C. Pharmacological interventions in aging and age-associated disorders: potentials of propargylamines for human use. Ann. N.Y. Acad Sci. 959: 295-307, 2002. 25. Kubo, M., Matsuda, H. Development tudies of cuticle and medicinal drug from natural sources on melanin biosynthesis. Fragrance J. 8: 48-55, 1995. 26. Do, J.R., Baek, S.Y., Im, S.D., Kim, Y.M., Kim, I.H., Han, D.S., Kim, B.S. Selection of beauty material from Fruits and Vegetables. J Kor Soc Food Sci. Nutr. 10: 248-248, 2008. 27. Lee, S.J. Novel natural products as active material for beauty food. Food Sci Ind. 40: 10-18, 2008. 28. Zague, V. A new view concerning the effects of collagen hydroly- sate intake on skin properties. Arch Dermatol Res. 300: 479-483, 2008. 29. Kim, N.Y., Kang, T.H., Kim, D.H., Kim, Y.C. Anitric oxide synthesis inhibitor from the roots of Gentiana scabra in RAW 264.7 cells. J Kor Pharmacogn. 30(2):173-176, 1999.
H. W. Choi et al 229 30. Zhu, Y.P. Harwood academic publishers. Amsterdam, Chin. Mat. Med. pp 146-149, 1998. 31. Huh, H., Kim, H.K., Lee, H.K. PAF antagonistic activity of 2-hydroxy -3-methoxybenzoic acid glucose ester from Genyiana scabra. Arch Pharm. 21(4):436-439, 1988. 32. Willoughby, D.A. Human arthritis applied to animal models. Towards a better therapy. Ann Rheum Dis. 34: 471-478, 1975. 33. Chung, E.K., Seo, E.H., Park, J.H., Shim, J.H., Kim, K.H., Lee, B.R. Anti-inflammaatory and anti-allergic effect of extracts from organic soybean. Korean J Organic Agric. 2: 245-253, 2011. 34. Garthwaite, J. New insight into the functioning of nitric oxidereceptive guanylyl cyclase: physiological and pharmacological implications. Mol. Cell Biochem. 334: 221-232, 2010. 35. Förstermann, U., Sessa, W.C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur. Heart J. 33: 829-837, 2012. 36. Alderton, W.K., Cooper, C.E., Knowles, R.G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. Biochem J. 357: 593-615, 2001. 37. Andrew, P.J., Mayer, B. Enzymatic function of nitric oxide synthases. Cardiovasc. Res. 43: 521-531, 1999. 38. De Cruz, S.J., Kenyon, N.J., Sandrock, C.E. Bench-to-bedside review: the role of nitric oxide in sepsis. Expert Rev. Respir. Med. 3: 511-521, 2009. 39. Nathan, C.F., Hibbs, H.B. Jr. Role of nitric oxide synthesis in macrophage antimicrobial activity. Curr Opinion Immunol. 3(1):65-70, 1991. 40. Lee, B.H., Baik, D.S., Yun, S.U., Shin, J.M., Kim, J.H., Yun, S.Y., Kim, B.H., Kim, S.B., Shin, J.E., Song, I.H. Peripheral nitric oxide activity in patients with Liver cirrhosis. The Korean Journal of Medicine. 73(3):251-257, 2007.