Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(1): 16-21 (2017) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.1.16 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 Research Paper 코돈최적화된유전자를이용한재조합대장균으로부터인간인터페론베타발현 김종석 1, 장승원 1, 박재범 1, 권덕호 1, 장영준 2, 정형무 2, 한상인 2, 홍억기 1, 하석진 1 * Production of Human Interferon β by Recombinant E. coli Using the Codon Optimized Gene Jong-Seok Kim 1, Seung-Won Jang 1, Jae-Bum Park 1, Deok-Ho Kwon 1, Young-Jun Chang 2, Hyung-Moo Jung 2, Sang-In Han 2, Eock-Kee Hong 1, and Suk-Jin Ha 1 * Received: 29 November 2016 / Revised: 9 January 2017 / Accepted: 12 January 2017 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: The multiple sclerosis caused by multiple inflammatory disease or immune system disorder, is usually treated by interferon β through adjusting the abnormal immune reactions. For high production of human interferon β using recombinant E. coli, codon optimized and wild type genes were synthesized. When pet-15b or pet-21a vector was used as an expression vector with each gene, there was no target protein expression. When pqe30 vector was used as an expression vector, human interferon β was expressed by recombinant E. coli XL1-blue and E. coli JM109. Using the codon optimized gene, the expression of human interferon β was slightly increased as compared to that from wild type gene. However, most of expressed human interferon β was insoluble form. Keywords: Human interferon β, Recombinant E. coli, Codon optimization 1 강원대학교생물공학과 1 Department of Bioengineering and Technology, Kangwon National University, Chuncheon, Korea Tel: +82-33-250-6278, Fax: +82-33-243-6350 e-mail: sjha@kangwon.ac.kr 2 한국코러스 2 Hankook Korus Co., Ltd., Chuncheon, Korea 1. INTRODUCTION 다발성경화증 (multiple sclerosis) 은중추신경계가다발성으로침윤되는염증성질환또는면역체계이상으로발생되는질병을말한다 [1]. 다발성경화증은보통 20~40 대에발생하며여자가남자보다 2 배정도높은발병률을보이며미국에서는다발성경화증으로인해많은사회경제적인손실이초래되고있다고한다. 다발성경화증의발생원인은아직까지정확한이론으로설명할수는없으나일반적으로유전적인소인이있는사람에게서환경적요인이복합적으로작용함으로써발생한다고생각된다 [2]. 다발성경화증의증상은주로감각장애, 통증, 운동마비, 시각장애가있다. 다발성경화증의치료제로는스테로이드와면역억제제가주로사용되고있으며, 이는신체의면역기능을약화시킴으로써다발성경화증을조절하는방법이다 [3-5]. 현재많이사용되는다발성경화증의치료제로는인터페론베타 (interferon β) 가있다 [6, 7]. 인터페론베타는항염증작용으로인해염증작용을감소시켜다발성경화증에서보이는비정상적인면역작용을조절하고, 바이러스감염에대항하여혈액뇌장벽 (BBB; blood brain barrier) 의손상을부분적으로예방한다 [8,9]. 인터페론베타는거의모든종류의세포에서생산되며. 그중 CHO (Chinese hamster ovary) 세포를이용하여생산되는인터페론베타 1a 와 Escherichia coli 에서생산되는인터페론베타 1b 가있다 [2,10-12]. 1993 년최초로 Interferon β-1b (Betaferon ) 가다발성경화증치료제로미국 FDA 인증을받은이후, 두가지다른 Interferon β-1a (Rebif 와 Avonex ) 가연이어개발되어
Human Interferon β Production by Recombinant E. coli 17 치료에이용되기시작했으며, 이들인터페론베타제품은좋은관용성 (tolerability) 과장기적인안정성을보여다발성경화증의주요치료제로사용되고있다 [6,7,13,14]. 인터페론베타를구성하는 166 개의아미노산중 17 번째, 31 번째그리고 141 번째위치에 cysteine 잔기가존재한다. 한개이상의 cysteine 잔기가존재할경우엔 disulfide bond 를형성하고 free thiol group 을형성하는것으로알려져있으며연구결과를통해, 인터페론베타의 3 개의 cysteine 잔기중에 17 번째 cysteine 잔기는단백질안정성을저하시키고, dimer 또는 oligomer 를형성하여단백질발현시 misfolding 을일으켜 inclusion body 를형성에관여하는것으로확인이되었다 [15-17]. 이로인해 17 번째 cysteine 잔기를 serine 으로치환된인터페론베타 1b 가주로생산되고있다 [6,15]. 본연구에서는재조합대장균을이용한인간인터페론베타의대량생산을위해야생형 (wild type) 또는코돈최적화된 (codon optimized) 인간인터페론베타유전자를각각확보한후다양한발현벡터에따른인간인터페론베타 1b 의발현을확인하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 실험균주및시약 Luria-Bertani (LB) broth (Difco Laboratories, MI, USA) 는대장균배양을위해사용하였으며이때필요에따라 50 μg/ml 농도의엠피실린 (Thermo Fisher Scientific, USA) 이사용되었다. 재조합인간인터페론베타의대량생산을위한발현벡터로는 pet-15b벡터와 pet-21a벡터 (Novagen, WI, USA) 그리고 pqe30 벡터 (QIAGEN, CA, USA) 가각각사용되었다. 대장균은각각 E. coli Top10 (Invitrogen, CA, USA) 이 cloning을목적으로사용되었으며 E. coli BL21 (DE3) (Novagen, WI, USA), E. coli Rosetta TM (DE3) plyss (Novagen, WI, USA), E. coli HMS174 (DE3) (Novagen, WI, USA), E. coli XL1-blue (Invitrogen, CA, USA), E. coli JM109 (Promega, WI, USA) 가단백질발현을목적으로본연구에사용되었다. 벡터시스템개발을위한제한효소와 ligase 효소들은모두 Enzynomics (Daejeon, Korea) 의제품을구매하여이용하였다. IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) 는바이오세상 (Biosesang, Korea) 에서구매하였으며, SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis) 에사용된각종시약들은 Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories. Inc, USA) 에서구매하였다. 1에정리하였다. 이러한방법을통해총 6가지 (pet15b-hif NβW, pet15b-hifnβo, pet21a-hifnβw, pet21a-hifnβo, pqe30-hifnβw, pqe30-hifnβo) 의재조합인간인터페론베타생산을위한발현벡터를개발하였다. 2.3. 발현확인개발된 6 가지종류의재조합인간인터페론베타생산을위한발현벡터는각각발현벡터에따라서로다른발현균주를이용하였다. pet15b-hifnβw, pet15b-hifnβo, pet21a-hif NβW, pet21a-hifnβo 의경우엔 E. coli BL21 (DE3), E. coli Rosetta TM (DE3) plyss, E. coli HMS174 (DE3) 의 3 가지발현균주를이용하였으며 pqe30-hifnβw, pqe30-hifnβo 의경우엔 E. coli XL1-blue 와 E. coli JM109 의 2 가지발현균주에각각도입하여재조합인간인터페론베타의발현을확인하였다. 50 μg/ml 의엠피실린이포함된 LB 배지에상기벡터가도입된재조합대장균을각각접종하여, 37 o C 에서진탕배양하였다. 그리고인간인터페론베타발현을유도하기위하여흡광도 (OD 600 ) 값이 0.4~0.5 이되었을때, 단백질발현유도물질인 IPTG 를최종농도가 0.2 mm 되도록첨가하고, 20 o C 에서 18 시간동안추가로배양하여인간인터페론베타의발현을유도하였다. 배양된재조합대장균배양액을원심분리하여상등액을제거하고세포를회수한후회수된세포의파쇄를위해 ph 7.4 의 67 mm 인산완충식염수 (phosphate buffered saline) 에부유시킨다음초음파분쇄기를이용하여파쇄하였다. 파쇄된세포를원심분리를이용해수용성분액과불용성분액으로나누어각각을 SDS-PAGE 를이용하여분석하였다. 2.4. SDS-PAGE를이용한발현확인재조합인간인터페론베타유전자가삽입된총 16가지재조합대장균의발현유무를확인하기위하여각각 SDS-PAGE 를수행하였다. SDS-PAGE의 stacking gel은 5% polyacrylamide를그리고 separating gel은 12% polyacrylamide를각각이용하였으며전기영동조건은 stacking gel의경우 60 V와 500 ma로 20분동안그리고 separating gel의경우 110 V와 500 ma로 1시간 30분가량전기영동하였다. 그후 Coomassie staining solution (Coomassie brilliant blue R-250 3 mm, SIG- MA aldrich, Korea) 를이용하여 1시간동안염색후증류수로세척해주고, destaining solution을첨가하여염색약을제거하였다. 2.2. 인간인터페론베타발현벡터개발야생형인간인터페론베타유전자와대장균에서의발현에대해코돈 (codon) 최적화된인간인터페론베타유전자는바이오니아 (Daejeon, Korea) 에의해합성되었다. 대장균에의한재조합단백질의효과적인발현을위해합성된코돈최적화된인간인터페론베타유전자는 ( 주 ) 바이오니아의 Gene Synthesis 프로그램에의해디자인되었다. 발현벡터개발을위해사용된각각의 primer 와제한효소에대한정보는 Table 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 코돈최적화된인간인터페론베타유전자확보총 166 개의아미노산으로구성된인간인터페론베타단백질을발현하기위하여이미보고되어있는야생형의인간인터페론베타유전자를포함하여대장균에서의보다효과적인발현을위해대장균에서의발현에적합한 codon usage 를이
18 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(1): 16-21 (2017) Fig. 1. The alignment result of nucleotide sequences from wild type and codon optimized human interferon β genes. 용하여 코돈이 최적화된 유전자를 각각 합성하였다. 이때 코 돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자의 디자인은 (주)바 이오니아의 자체 프로그램을 이용하였다. 또한 단백질 발현 시에 misfolding 또는 inclusion body 형성을 방지하기 위해 17 번째 아미노산인 cysteine은 serine으로 치환하여 주었다 [1517]. 합성된 야생형의 인간 인터페론 베타 유전자와 코돈 최 적화된 인간 인터페론 베타 유전자의 염기서열을 비교한 결 과, 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자는 야생형 인간 인터페론 베타 유전자와 비교했을 때 55개의 염기서열이 변 화하여 결과적으로 89%의 상동성을 나타내었다 (Fig. 1). 코 돈 최적화로 인해 아데닌 (adenine)의 함량이 28.14%에서 29.54%로 증가하였고 티민 (thymine)의 함량이 31.54%에서 23.55%로 크게 감소하였으며 구아닌 (guanine)과 시토신 (cytosine)의 함량이 20.16%과 20.16%에서 24.15%과 22.75%로 각각 증가하였다. 따라서 G+C 함량은 야생형이 40.32%였으 나 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자의 경우엔 46.91%로 증가하였다. 3.2. pet-15b그리고 pet-21a 벡터를 이용한 인간 인터페 론 베타 발현 야생형 그리고 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자를 재조합 대장균에서 효과적으로 발현하기 위하여 pet-15b와 pet-21a 발현용 벡터를 먼저 이용하였다. pet-15b와 pet-21a 발현용 벡터는 모두 강력한 프로모터 (promoter)인 T7 프로모 터를 가지고 있어서 재조합 대장균에서 외부 단백질을 과 발 현시킬 때 주로 이용되는 것으로 알려져 있다. 두 가지 벡터 의 차이점으로는 pet-15b벡터로 발현할 경우엔 발현된 단백 질의 N-terminal에 그리고 pet-21a벡터는 C-terminal에 hexahistidine (His6) tag를 가지고 있어서 단백질의 발현 이후 NiNTA 컬럼을 이용해 정제과정이 용이하다는 장점을 가지고 있다. 본 연구에서는 pet-15b벡터를 이용하여 N-terminal에 His6 tag를 갖는 재조합 인간 인터페론 베타를 발현하기 위한 시도를 하였으며, 또한 pet-21a 벡터를 이용한 경우엔 벡터 에 삽입하는 과정에서 reverse primer에 종결 코돈을 삽입하 여 His6tag가 제거된 순수한 재조합 인간 인터페론 베타를 발 현하기 위한 시도를 하였다. 따라서 같은 T7 프로모터를 갖는
Human Interferon β Production by Recombinant E. coli 19 Table 1. Sequences of PCR primers to amplify wild type or codon optimized human interferon β gene for constructions of pet-15b, pet21a or pqe30 expression vectors Vectors (type) pet-15b (Wild) pet-15b (Codon optimized) pet-21a (Wild) pet-21a (Codon optimized) pqe30 (Wild) pqe30 (Codon optimized) Name Sequence pet15b-hifnβ(w)-f pet15b-hifnβ(w)-r pet15b-hifnβ(o)-f pet15b-hifnβ(o)-r pet21a-hifnβ(w)-f pet21a-hifnβ(w)-r pet21a-hifnβ(o)-f pet21a-hifnβ(o)-r pqe30-hifnβ(w)-f pqe30-hifnβ(w)-r pqe30-hifnβ(o)-f pqe30-hifnβ(o)-r 3 -AATGCCCATATGATGAGCTATAACCTGCTGGGT-5 3 -AATGCCCTCGAGTTACGCAGATAACCGGTCAG-5 3 -AATGCCCATATGATGAGCTATAACCTGCTGGGC-5 3 -AATGCCCTCGAGTTAGTTGCGCAGATAGCCGGT-5 3 -AATGCCCATATGATGAGCTATAACCTGCTGGGT-5 3 -AATGCCCTCGAGTTACGCAGATAACCGGTCAG-5 3 -AATGCCCATATGATGAGCTATAACCTGCTGGGC-5 3 -AATGCCCTCGAGTTAGTTGCGCAGATAGCCGGT-5 3 -CGGGATCCATGAGCTATAACCTGCTGGGTTT-5 3 -GGGGTACCTAAGTTACGCAGATAACCGGTCA-5 3 -CGGGATCCATGAGCTATAACCTGCTGGGC-5 3 -GGGGTACCTTAGTTGCGCAGATAGCCGGT-5 발현 벡터를 이용하여 His6 tag를 갖는 퓨전 재조합 인간 인 터페론 베타와 His6 tag를 갖지 않는 순수한 재조합 인간 인 터페론 베타를 각각 발현하여 비교하고자 하였다. Table 1에 기술된 각각의 primer들과 제한효소들을 이용하여 각각의 재조합 인간 인터페론 베타 발현 벡터를 개발하였다. 개발된 총 4가지의 재조합 인간 인터페론 베타 발현용 벡터 (pet15b-hifnβw, pet15b-hifnβo, pet21a-hifnβw, pet21ahifnβo)는 씨컨싱 (sequencing)을 통해 모든 서열이 정확하게 도입되었는지 검증한 후 각각의 발현 벡터들을 3가지의 발 현 균주인 E. coli BL21 (DE3), E. coli Rosetta TM (DE3) plyss, E. coli HMS174 (DE3)에 도입하여 IPTG를 이용한 발현 유도 를 통해 재조합 인간 인터페론 베타 발현을 시도하였다. 실험 결과 Fig. 2의 SDS-PAGE 결과와 같이 pet-15b 발현용 벡터를 이용하여 개발된 발현 벡터 (pet15b-hifnβw, pet 15b-hIFNβO)와 pet-21a 발현용 벡터를 이용하여 개발된 발 현 벡터 (pet21a-hifnβw, pet21a-hifnβo)를 E. coli BL21 (DE3)에 도입하여 IPTG를 이용하여 발현한 결과 재조합 인 간 인터페론 베타의 발현이 전혀 확인되지 않았다. pet-15b 를 이용한 pet15b-hifnβw와 pet15b-hifnβo의 경우엔 His 6 tag가 포함되어 있어 약 21 kda 크기의 재조합 인간 인터페 론 베타 발현이 예상되며 pet-21a 발현용 벡터를 이용한 pe T21a-hIFNβW, pet21a-hifnβo의 경우엔 His6 tag가 포함되 지 않아 약간 작은 크기인 18.5 kda 크기의 재조합 인간 인터 페론 베타 발현이 예상되지만 각각의 예상 위치에 전혀 단백 질의 발현을 확인할 수 없었다. 다른 발현 균주인 E. coli Rosetta TM (DE3) plyss와 E. coli HMS174 (DE3)에 개발된 4가지 의 발현 벡터를 각각 도입한 경우에도 발현 결과 재조합 인간 인터페론 베타의 예상 위치에 단백질의 발현을 전혀 확인 할 수 없었다. 따라서 재조합 대장균에서 효과적으로 인간 인터 페론 베타를 발현하기 위한 야생형 유전자와 코돈 최적화된 유전자의 차이를 확인할 수 없었으며, 또한 벡터의 종류 (pet-15b와 pet-21a)와 6 his tag의 유무에 따른 차이도 확인 할 수 없었다. Restriction Enzymes BamHI KpnI BamHI KpnI Fig. 2. The expression of wild type or codon optimized human interferon β by recombinant E. coli BL21 (DE3) using pet-15b vector (A) and pet-21a vector (B). Arrow indicate the estimated size of recombinant human interferon β with or without 6 his tag. (lane 1: wild type total protein, lane 2: wild type soluble protein, lane 3: wild type insoluble protein, lane 4: codon optimized total protein, lane 5: codon optimized soluble protein, lane 6: codon optimized insoluble protein).
20 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(1): 16-21 (2017) 3.3. pqe30 발현벡터를 이용한 인간 인터페론 베타 발현 pqe30 발현용 벡터를 이용하여 재조합 인간 인터페론 베타 를 발현하기 위한 시도를 하였다. pqe30 발현용 벡터는 T5 프로모터를 가지고 있으며 이는 pet-15b또는 pet-21a 벡터 가 가지는 T7 프로모터에 비해 비교적 낮은 발현 정도를 갖는 것으로 알려져 있다 (11). pqe30 발현용 벡터 또한 발현 과정 에서 N-terminal에 His6 tag를 가지게 되며 IPTG를 이용하여 발현이 유도된다. Table 1에 기술된 primer들과 제한효소들을 이용하여 pqe30-hifnβw와 pqe30-hifnβo를 각각 개발하 였다. 개발된 두 가지의 재조합 인간 인터페론 베타 발현용 벡터는 씨컨싱을 통해 모든 서열이 정확히 도입되었는지 검 증하였으며 각각 E. coli XL1-blue에 도입한 후 IPTG를 이용 한 발현 유도를 통해 재조합 인간 인터페론 베타 발현을 시 도하였다. Fig. 3A의 결과와 같이 pqe30-hifnβw와 pqe30hifnβo 발현 벡터를 이용한 경우, His6 tag가 포함되어 약21 kda 크기의 재조합 인간 인터페론 베타 발현을 확인할 수 있 었다. pet-15b또는 pet-21a 발현용 벡터를 이용한 경우 인간 인터페론 베타의 효과적인 발현이 되지 않고 pqe30 발현용 벡터를 이용한 경우 발현이 이루어진 이유에 대해서는 정확 하게 보고된 바는 없으나 인간 단백질을 대장균에서 발현하 려고 하는 경우 이와 유사한 연구결과들이 보고되었다. 인간 aspartyl-trna synthetase (hdrs) 또는 microtubule affinityregulating kinase 4 (MARK4)를 대장균을 이용하여 생합성하 기 위해 각각 petabc 또는 pet28b 발현용 벡터를 이용한 경우 전혀 발현이 되지 않았으나 pqe30 발현용 벡터를 이용 하였을 때 두 경우 모두 효과적으로 발현이 확인되었다 (ref). 따라서 대장균을 이용하여 인간 단백질을 과발현하려는 경 우 비교적 발현 정도가 낮은 T5 프로모터를 갖는 pqe30 발현 용 벡터가 보다 적합한 것으로 예상된다 [18,19]. 코돈 최적화 된 인간 인터페론 베타 유전자를 이용한 pqe30-hifnβo 발 현 벡터의 경우 야생형 인간 인터페론 베타 유전자를 이용한 pqe30-hifnβw 발현 벡터의 경우에 비해 발현 정도가 약간 증가하였음을 확인할 수 있었다. 하지만 야생형 유전자와 코 돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자를 이용한 경우 모두 에서 soluble 형태의 인간 인터페론 베타의 발현은 거의 확인 할 수 없었으며 대부분이 insoluble 형태로 발현이 되었음을 확인할 수 있었다. Insoluble 형태이긴 하지만 발현이 확인된 pqe30-hifnβw 와 pqe30-hifnβo 발현 벡터를 다른 발현 균주인 E. coli JM 109에 도입하여 재조합 인간 인터페론 베타 발현을 시도하였 다. 하지만 Fig. 3B의 결과와 같이 다른 발현 균주인 E. coli JM 109를 이용한 경우에도 insoluble 형태의 재조합 인간 인터페 론 베타의 발현만 확인되었으며 soluble 형태의 발현은 거의 확인할 수 없었다. 그리고 코돈 최적화된 인간 인터페론 베타 유전자와 야생형 인간 인터페론 베타 유전자의 발현 차이를 크게 확인할 수 없었다. 다만 E. coli JM109를 발현 균주로 사 용했을 때에는 전체적인 재조합 인간 인터페론 베타의 발현 량이 E. coli XL1-blue를 발현 균주로 사용했을 때에 비해 다 소 증가하였음을 확인할 수 있었다. Fig. 3. The expression of wild type or codon optimized human interferon β by recombinant E. coli XL1-blue (A) or E. coli JM109 (B) using pqe30 vector. Arrow indicate the estimated size of recombinant human interferon β with 6 his tag. (lane 1: wild type total protein, lane 2: wild type soluble protein, lane 3: wild type insoluble protein, lane 4: codon optimized total protein, lane 5: codon optimized soluble protein, lane 6: codon optimized insoluble protein). 이전의 연구결과에 따르면 ptpm13 벡터를 이용하여 E. coli BL21-SI에서 인간 인터페론 베타의 발현을 시도한 후 발 현이 되었다는 것만 Western blot으로 확인하였으며 인간 인 터페론 알파 2a의 경우엔 T7 프로모터를 갖는 pet-32b 벡터 에 삽입하여 E. coli BL21에서 발현확인 결과 soluble 형태로 발현된 것이 보고되었다 [11,20]. Insoluble 형태로 발현되는 재조합 인간 인터페론 베타를 재접힘 (re-folding) 방법을 이 용하여 soluble 형태로 생산하고자 하는 방법 또한 시도되고 있다 [1]. 본 연구를 통해 강력한 프로모터를 가지고 있는 pet-15b와 pet21a 벡터에서는 재조합 인간 인터페론 베타의 발현을 확인하지 못하였고 오히려 상대적으로 약한 프로모 터를 가지고 있는 pqe30 벡터에서 재조합 인간 인터페론 베 타의 발현을 확인하였다. 발현 조건 최적화를 통해 soluble 형 태의 재조합 인간 인터페론 베타의 발현을 증가시키기 위한 연구 또는 재접힘 방법을 통한 insoluble 형태의 재조합 인간
Human Interferon β Production by Recombinant E. coli 21 인터페론베타를 soluble 형태로전환하기위한연구가추가로진행되어야할것으로예상된다. 4. CONCLUSION 다발성염증성질환또는면역체계이상으로발생되는질병인다발성경화증은주로인터페론베타를이용하여비정상적인면역작용을조절한다. 인간인터페론베타를대장균을이용해대량생산하기위해코돈이최적화된유전자와야생형유전자를각각합성하였다. 각각의인간인터페론베타유전자를 pet-15b 또는 pet-21a 발현벡터에삽입하여발현을시도한결과인간인터페론베타의발현을확인하지못하였다. pqe30 발현벡터를이용한경우엔두가지발현균주 (E. coli XL1-blue, E. coli JM109) 에서모두발현이되었음을확인할수있었다. 하지만 soluble 형태의발현은거의없었으며대부분이 insoluble 형태로발현되었음을확인할수있었다. Acknowledgements This research was financially supported by the Ministry of Education (MOE) and National Research Foundation of Korea (NRF) through the Human Resource Training Project for Regional Innovation (No. 2015H1C1A1035529). REFERENCES 1. Lee, G. W. (2005) Textbook of Neurology. pp. 369-370. Panmuneducation, Seoul, Korea. 2. Latimer-Cheung, A. E., K. A. M. Ginis, A. L. Hicks, R. W. Motl, L. A. Pilutti, M. Duggan, G. Wheeler, R. Persad, and K. M. Smith (2013) Development of evidence-informed physical activity guidelines for adults with multiple sclerosis. Arch. Phys. Med. Rehabil. 94: 1829-1836. 3. Goodin, D., E. Frohman, G. Garmany, J. Halper, W. Likosky, and F. Lublin (2002) Disease modifying therapies in multiple sclerosis. Neurology 58: 169-178. 4. Craig, J., C. Young, M. Ennis, G. Baker, and M. Boggild (2003) A randomised controlled trial comparing rehabilitation against standard therapy in multiple sclerosis patients receiving intravenous steroid treatment. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 74: 1225-1230. 5. Troiano, R., S. D. Cook, and P. C. Dowling (1987) Steroid therapy in multiple sclerosis: Point of view. Archives of Neurology 44: 803-807. 6. Paty, D. W., D. K. B. Li, the UBC MS/MRI Study Group, and the IFNB Multiple sclerosis Study Group (1993) Interferon beta-1b is effective in relapsing-remitting multiple sclerosis II. MRI analysis results of a multicenter, randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Neurology 43: 662-667. 7. van Beers, M. M., W. Jiskoot, and H. Schellekens (2010) On the role of aggregates in the immunogenicity of recombinant human interferon beta in patients with multiple sclerosis. J. Interferon Cytokine Res. 30: 767-775. 8. Severa, M., F. Rizzo, E. Giacomini, M. Salvetti, and E. M. Coccia (2015) IFN-β and multiple sclerosis: Cross-talking of immune cells and integration of immunoregulatory networks. Cytokine & Growth Factor Rev. 26: 229-239. 9. Bertolotto, A., L. Granieri, F. Marnetto, P. Valentino, A. Sala, M. Capobianco, S. Malucchi, A. Di Sapio, M. Malentacchi, and M. Matta (2015) Biological monitoring of IFN-β therapy in multiple sclerosis. Cytokine Growth Factor Rev. 26: 241-248. 10. Ghane, M., B. Yakhchali, and M. Khodabandeh (2008) Over Expression of Biologically Active Interferon Beta Using Synthetic Gene in E. coli. Iran J. Sci. Technol. Trans. A Sci. 19: 203-209. 11. Kusumawati, A., A. Santoso, and M. Radji (2013) Soluble Expression of Recombinant Human Interferon Alpha 2a Fusion Protein in Escherichia coli. Int. J. Pharm. Healthc. 3: 42-49. 12. Gross, G., C. Mielke, I. Hollatz, H. Blöcker, and R. Frank (1990) RNA primary sequence or secondary structure in the translational initiation region controls expression of two variant interferon-beta genes in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 265: 17627-17636. 13. van Beers, M. M., M. Sauerborn, F. Gilli, V. Brinks, H. Schellekens, and W. Jiskoot (2010) Aggregated recombinant human interferon beta induces antibodies but no memory in immune-tolerant transgenic mice. Pharm. Res. 27: 1812-1824. 14. Newsome, S., S. Guo, A. Altincatal, I. Proskorovsky, E. Kinter, G. Phillips, X. You, and G. Sabatella (2015) Impact of peginterferon beta-1a and disease factors on quality of life in multiple sclerosis. Mult. Scler. Relat. Disord. 4: 350-357. 15. Lin, L. S., M. G. Kunitani, and M. S. Hora (2002) Interferon-β-1b (Betaseron ): A model for hydrophobic therapeutic proteins. pp. 275-301. In: Formulation, characterization, and stability of protein drugs: Case histories. Springer, US. 16. Basu, A., K. Yang, M. Wang, S. Liu, R. Chintala, T. Palm, H. Zhao, P. Peng, D. Wu, ans Z. Zhang (2006) Structure-function engineering of interferon-β-1b for improving stability, solubility, potency, immunogenicity, and pharmacokinetic properties by site-selective mono-pegylation. Bioconjug. Chem. 17: 618-630. 17. Fiers, W., E. Remaut, R. Devos, H. Cheroutre, R. Contreras, D. Gheysen, W. Degrave, P. Stanssens, J. Tavernier, and Y. Taya (1982) The Human Fibroblast and Human Immune Interferon Genes and their Expression in Homologous and Heterologous Cells [and Discussion]. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences, 299: 29-38. 18. Naz, F., M. Asad, P. Malhotra, A. Islam, F. Ahmad, and M. I. Hassan (2014) Cloning, expression, purification and refolding of microtubule affinity-regulating kinase 4 expressed in Escherichia coli. Appl. Biochem. Biotechnol. 172: 2838-2848. 19. Guzzo, C. M. and D. C. Yang (2007) Systematic analysis of fusion and affinity tags using human aspartyl-trna synthetase expressed in E. coli. Protein Expr. Purif. 54: 166-175. 20. Maldonado, L. M. P., V. E. B. Hernández, E. M. Rivero, A. P. B. de la Rosa, J. L. F. Flores, L. G. O. Acevedo, and A. D. L. Rodríguez (2007) Optimization of culture conditions for a synthetic gene expression in Escherichia coli using response surface methodology: The case of human interferon beta. Biomol. Eng. 24: 217-222.