농약과학회지 (Korean J. Pestic. Sci.) Vol. 19, No. 3, pp. 185-194 (2015) Open Access http://dx.doi.org/10.7585/kjps.2015.19.3.185 Online ISSN 2287-2051 Print ISSN 1226-6183 ORIGINAL ARTICLES / RESIDUE HPLC-DAD/MS 를이용한농산물중살균제 Carpropamid 의정밀잔류분석법확립 이혜리 최훈 1 김은혜 2 이영득 3 김정한 2, * 국립환경과학원환경측정분석센터, 1 원광대학교식품환경학부, 2 서울대학교농생명공학부, 3 대구대학교생명환경학부 Establishment of Analytical Method for Carpropamid in Agricultural Commodities using HPLC-DAD/MS Hyeri Lee, Hoon Choi 1, Eunhye Kim 2, Young Deuk Lee 3 and Jeong-Han Kim 2, * Environmental Measurement and Analysis Center, National Insitutue of Environmental Research, Incheon, Korea 1 Division of Food and Environmental Sciences, Wonkwang University, Korea 2 Department of Agricultural Biotechnology, Seoul National University, Korea 3 Division of Life and Environmental Science, Daegu University, Korea (Received on May 15, 2015. Revised on August 27, 2015. Accepted on September 11, 2015) Abstract This study was performed to establish a single residue analytical method for determining fungicide carpropamid residues in various agricultural commodities. Korean cabbage, apple, brown rice and green pepper were selected as representative crops. Samples were homogenized, extracted with acetone and purified by liquid-liquid partition and Florisil column chromatography. Carpropamid residues were analyzed at 220 nm with reversed phase HPLC equipped octylsilyl and octadecylsilyl column and confirmed using mass spectrometry. ILOQ (Instrumental limit of quantitation) of carpropamid was 2 ng and MLOQ (Method LOQ) was 0.02 mg/kg. Mean recoveries from four kinds of crop samples fortified at three levels (MLOQ, 10LOQ, 100LOQ) in triplicate were in the range of 84~112%. Relative standard deviations of the analytical method were all less than 10%, irrespective of crop types. Key words Carpropamid, HPLC, Analytical method 서 론 Carpropamid는 cyclopropanecarboxamide계살균제로써분자내 3개의키랄성탄소의존재로인하여총 4종의부분입체이성질체로구성되어있으며주요 2종의부분입체이성질체가전체의 95% 이상을구성하고있다 (Fig. 1). 일본 Nihon Bayer Agrochem사와독일 Bayer AG사가 1994년에공동으로개발하였으며국내에는 1996년종자소독제로처음소개된이후 1998년부터작물에사용되었다 (Tomlin, 2009). 현재국내에선액상수화제인솔라자 ( 동부한농, 바이엘 ) 과 iminoctadine tris (albesilate) 와의합제인넘보원 ( 동부한농 ) These authors contributed equally to this work *Corresponding author E-mail: kjh2404@snu.ac.kr 이판매되고있으며, 종자처리수화제로서살충제 imidacloprid 와살균제 fludioxonil의합제인자바라 ( 동부한농 ) 와 imidacloprid와살균제 prochloraz의합제인기라성 ( 바이엘 ) 이판매되고있다 ( 한국작물보호협회, 2012). Carpropamid는벼의잎도열병, 목도열병, 세균벼알마름병, 흰잎마름병방제에사용되고있으며 ( 한국작물보호협회, 2012), 원인균인 Pyricularia oryzae의 melanin 생합성을저해함으로써약효를나타낸다 (Tomlin, 2009). Carpropamid 분석은가스크로마토그래피 (Gas Chromatography; GC) 와액체크로마토그래피 (High-Performance Liquid Chromatography; HPLC) 모두가능하다. Seiji (2002) 은현미와콩을대상으로 GC-electrochemical detection (ECD) 를이용하여잔류분석하였고, 박등 (2009) 과박 (2011) 은토양의잔류분석을위해 GC-ECD를사용하였다. Chu 등 (2005) 185
186 이혜리 최훈 김은혜 이영득 김정한 Fig. 1. Chemical structure and physico-chemical properties of carpropamid. 은사과주스를대상으로 GC-MS를이용한반면, Rizzutti 등 (2007; 2009) 은 LC-MS를이용한다성분동시분석법으로콩의잔류분을분석하였다. Seiji (2002), 박등 (2009) 및박 (2011) 이제시한 GC-ECD 분석법은별도의유도체화과정을거치지않고바로기기분석하는방법이지만, 현재식품공전상 carpropamid 분석법은 sodium hydride, methyl iodide, 및 dimethyl sulfoxide 시약을사용하여 carpropamid 를 alkylation한후 GC-NPD로분석하는방법으로효율성이떨어진다. 또한, 식품공전상의 carpropamid 분석법은단성분분석법이아닌 pencycuron과의동시분석법으로묶여있어서 carpropamid 잔류허용기준이설정되어있는모든농산물을대상으로정밀잔류분석을수행하는데한계가있다 ( 식품의약품안전처, 2015a). 따라서, 본연구에선다양한농산물에보편적으로적용할수있는정확하고정밀한 carpropamid 단성분분석법을개발하고자하였으며, 이를위해각작물군의대표작물을선정하여표준화된공전시험법으로사용될수있도록하였다. 작물품목은쌀과기타농산물로써각각 1.0 mg/kg, 0.05 mg/kg 이하이고 ( 식품의약품안전처, 2015b), 분석법확립을위한대표작물로서채소류인배추와고추, 곡류인현미, 과일류인사과를선정하였다. 회수율분석대상농산물은시중에서유통중인무농약작물로구입하였다. 배추, 사과및고추는믹서기를이용하여균질화하였고, 현미는믹서기로분쇄한후표준체 420 µm를통과시켜균질화하였다. 균질화된시료는분석할때까지비닐백에담아 -20 o C에서보관하였다. 표준용액조제 Carpropamid 표준품을 1,000 mg/l가되도록 acetonitrile 에용해시켜 stock solution을조제하였으며, working solution 은분석당일에 stock solution으로부터 acetonitrile을이용하여 0.05, 1, 5, 10 mg/l 농도로조제하였다. Stock solution 은냉장고 4 o C에보관하였으며실험기간동안 carpropamid 분해는발생하지않았다. 재료및방법 시약, 재료및기구 Carpropamid 표준품 (99.9%) 은 Fluka (USA) 에서구입하였고, acetonitrile, acetone, dichloromethane, ethyl acetate, n-hexane은 HPLC급으로 Burdick & Jackson (USA) 로부터구입하여사용하였다. 또한 sodium chloride, 무수 sodium sulfate, formic acid는 GR급을사용하였다. Florisil (60-100 mesh) 은 Fluka (USA) 에서흡착크로마토그래피용으로구입하였으며실험에사용하기전에 130 o C 오븐에서 5시간이상활성화시켰다. 시료균질화를위해믹서기 ( 한일, HMF- 1000A) 를이용하였고추출을위해진탕추출기 (SA-2s, Taitec, Japan) 을사용하였으며시료추출액농축시감압농축기 (R- 114, Buchi, Switzerland) 를사용하였다. 추출액은 GF/A 여과지 (Whatman International Ltd., UK) 를사용하여여과하였다. 대표작물의선정및시료손질식품공전에 carpropamid 잔류허용기준이설정되어있는 HPLC 분석조건설정작물중 carpropamid의분석은 diode array detector (DAD) 가장착된 Agilent 1100 series HPLC (Agilent, USA) 를사용하였다. Carpropamid 표준용액 1mg/L을분석하여최적의흡광파장을선정하였다. 분석칼럼으로는역상 C18 칼럼인 YMC-Pack Pro C18 (250 4.6 mm, 5 µm), Shiseido CapcellPack C18 (150 4.6 mm, 3 µm), Phenomenex Gemini- NX C18 (150 4.6 mm, 3 µm, USA) 과역상 C8 칼럼인 Agilent Eclips XDB-C8 (150 4.6 mm, 5 µm, USA) 을사용하여작물종류별최적의분석칼럼과이동상조성및유속등분리조건을설정하였다 (Table 1). 검출한계, 정량한계, 분석의반복성및표준검량선의직선성 Carpropamid 표준용액 1, 0.5, 0.1, 0.05 mg/l을차례로 HPLC에주입하여크로마토그램의 signal과 noise의비를구하여기기검출한계 (Instrumental limit of detection; ILOD) 및정량한계 (Instrumental limit of quantitation; ILOQ) 를계산하였다. Carpropamid 표준용액 0.1 mg/l을배추및사과의
HPLC-DAD/MS 를이용한농산물중살균제 Carpropamid 의정밀잔류분석법확립 187 Table 1. HPLC operating condition for the analysis of carpropamid Instrument Agilent 1100 series (USA) Column Korean cabbage, apple - Agilent Eclips XDB-C8 (150 4.6 mm, 5 µm, USA) Brown rice, green pepper - Phenomenex Gemini-NX C18 (150 4.6 mm, 3 µm, USA) Column Temp. 35 o C Mobile phase Korean cabbage, apple, brown rice - acetonitrile : water = 65 : 35 (v/v) Green pepper - acetonitrile : water = 60 : 40 (v/v) Flow rate Korean cabbage, apple, brown rice : 1.0 ml/min Green pepper : 1.1 ml/min Detection 220 nm Sample size 20 µl 분석조건하에서연이어 7번 HPLC에주입하여크로마토그램상의머무름시간 (t r ), 피크의면적, 피크높이의변이를비교검토하여분석의반복성을확인하였으며, carpropamid 표준용액 0.05~10 mg/l 범위의표준검량선을작성하여직선성을확인하였다. Carpropamid 추출및분배조건최적화일반적으로잔류농약추출에널리사용되고있는 acetone, acetonitrile 및 methanol 중에서극성용매이면서앞선문헌에서 carpropamid를추출하는데사용된바있는 acetone을추출용매로써선정하였다 (Seiji, 2002; 박등, 2009; 박, 2011). 최적의분배조건을설정하기위하여본연구에서는액-액분배용매로많이사용되고있는 n-hexane, dichloromethane 및 ethyl acetate을검토하였다. 이를위해분액여두에포화식염수 50 ml와증류수 50 ml를넣고 carpropamid 표준용액을처리하여혼합액이 1mg/L 수준이되게한후, 분배용매를각각 100 ml, 50 ml씩두번첨가하여분배함으로써각분배용매별분배효율을산출하였다. Florisil 흡착크로마토그래피정제조건최적화추출액정제를위해정제과정에많이쓰이는 Florisil를이용하여 glass 칼럼정제를수행하였다. 안지름 15 mm, 길이 350 mm의유리칼럼에 Florisil 10 g과무수 sodium sulfate 3g을차례로건식충진하여정제용유리칼럼을만들고용출용매로많은연구에서사용되고있는 ethyl acetate/n-hexane 혼합액을사용하였다. Ethyl acetate 비율을 5% 또는 10% 씩높이면서용출혼합액 100 ml를 Florisil 칼럼에흘려보내각용출액의 carpropamid 용출율을검토하였다. 분석칼럼의머무름특성및칼럼효율성확인다양한시료매질하에서 HPLC상의 carpropamid 피크의머무름특징을확인하기위해 capacity factor (k) 를머무름 시간과보정머무름시간 (t r '; adjusted retention time) 을이용해계산하였다 ( 이등, 2009). 또한, HPLC 칼럼의효율성을측정하기위해이론단수 (Number of plates; N) 는머무름시간과피크의너비를이용하여계산하였고, 이론단높이 (Height of theoretical plates; H) 는계산된 N과칼럼의길이를이용하여계산하였다 (Rood, 2007). k =t R '/t 0 t R = 머무름시간, t 0 = dead time t R '=t R t 0 = 보정머무름시간 N =5.545 (t R /W h ) 2 W h = 피크 1/2 높이의피크너비 H = 컬럼길이 (mm) / N 분석법검증을위한회수율실험 전처리과정을확정한이후, 전처리과정의시료채취량및분석조작중의희석배율을고려하여기기정량한계 (ILOQ) 로부터분석정량한계 (Method LOQ; MLOQ) 를산출하였다 ( 이등, 2009). 본연구의기기분석법및전처리법을포함한전과정을검증하기위해무처리시료에표준용액첨가법에따라 3수준 (MLOQ, 10MLOQ, 100MLOQ) 3반복으로처리된시료를이용해서회수율과상대표준편차를구하였다. 균질화된시료 25 g을정밀히달아 100 ml의 acetone을가하여 1시간동안진탕추출하였다. 현미는추출전에증류수 25 ml를넣어시료를습윤화시켰다. 추출물을흡인여과하고, 30 ml acetone으로잔사및용기를씻어내어앞의여액과합한다음 40 o C 이하의수욕조에서감압농축하였다. 농축잔사를 50 ml 포화식염수가담긴 500 ml 분액여두에 50 ml 증류수와 100 ml n-hexane으로헹구어담고격렬히진탕한후층이분리될때까지정치하였다. n-hexane 층을무수 sodium sulfate에통과시켜탈수한후, 다시 n-hexane 50 ml을가하여한번더분배추출하고추출액을합하여
188 이혜리 최훈 김은혜 이영득 김정한 Table 2. LC/MS operating condition for the analysis of carpropamid Instrument Varian 500-MS IT-MASS spectrometer (USA) Column Phenomenex Kinetex C18 (100 2.1 mm, 2.6 µm, USA) Column Temp. 40 o C Mobile phase 0.1% formic acid in acetonitrile : 0.1% formic acid in water = 60 : 40 (v/v) Flow rate 0.2 ml/min Sample size 5 µl Ionization ESI positive mode Drying gas Temp. 350 o C Capillary voltage 36.6 V RF loading storage 93% Mass range m/z 100~400 SIM ion m/z 334 40 o C 이하에서감압농축한후 n-hexane 5 ml에재용해하여정제에사용하였다. 추출액정제를위해 Florisil 유리칼럼에 n-hexane 100 ml를가하여세척하고추출액 5mL를첨가한다음 ethyl acetate:n-hexane (5/90, v/v) 용액 100 ml 로세척해서버렸다. 그후 ethyl acetate:n-hexane (10/90, v/ v) 용액 100 ml를가하여용리시켜받았다. 용리액을 40 o C 이하에서감압농축한후 5 ml acetonitrile로재용해하여 HPLC로분석하였다. 처리수준및작물종류간의회수율결과의유의적검정확립된분석법에따라잔류분석을수행할때 carpropamid 잔류수준정도와작물종류에따라분석법의정확도에차이가발생하는지를확인하기위해처리수준에따른작물별회수율결과로부터통계프로그램인 SPSS (ver 14.0.2KO, SPSS Inc., USA) 를이용하여일원분산분석 (one-way analysis of variance, ANOVA) 을수행하였으며사후분석을위해다중범위검정 (Duncan) 을 p 0.05 수준에서수행하였다. LC/MS를이용한확인분석 HPLC-DAD를이용하여분석된잔류분의신뢰성을확보하기위해 LC/MS 로확인분석하였다. LC/MS 분석은 Varian 500-MS IT-MASS spectrometer (Varian, USA) 를사용하였으며 ESI (Electron spray ionization) positive mode에서이온화하였고 SIM (Selective ion monitoring) mode를이용하였다. 칼럼은작물종류에관계없이역상 C18 칼럼인 Phenomenex Kinetex C18 (100 2.1 mm, 2.6 µm, USA) 을사용하였다 (Table 2). 결과및고찰 Carpropamid의 UV 흡광파장결정 Carpropamid는형광을발생하는특성을나타내지않기때문에 UV 흡광검출기를적용하였다. 화합물의 UV 흡광 Fig. 2. Ultraviolet absorption spectra of carpropamid. 특성을조사하기위해 carpropamid 표준용액 1mg/L을 DAD 로분석한결과, 그림과같이최대흡광파장이 220 nm에서관찰되어분석시에 HPLC 정량분석을위한흡광파장을 220 nm으로결정하였다 (Fig. 2). HPLC 분석칼럼및기기분석조건결정 Carpropamid는총 4개의이성질체로구성되어있고그중 2개의주요이성질체가전체의 95% 이상을차지하는특징을가지고있다. 따라서, HPLC 분석시주요 2개의이성질체를분리, 정량하는방식이아닌 1개의피크로검출될수있는기기조건으로설정하고자하였다. 먼저 YMC-Pack Pro C18 (250 4.6 mm, 5 µm) 을이용하였으나, 두개의이성질체가완전히분리되거나하나로합쳐지지않은피크로나타났다 (Fig. 3a). 칼럼의길이를보다짧은 Shiseido CapcellPack C18 (150 4.6 mm, 3 µm) 으로바꾸어분석한결과앞선칼럼보다는피크가합쳐진형태로나타났지만여전히피크띠가넓게나타났다 (Fig. 3b). 따라서, 칼럼의종류를 Agilent Eclipse XDB-C8 (150 4.6 mm, 5 µm) 으로변경하여분석한결과, 피크의모양이 Gaussian 분포형태를보여본칼럼으로최종결정하였다 (Fig. 3c). 하지만, 현미와고추의경우새로운방해물질과의분리를위하여 Phenomenex Gemini-NX C18 (150 4.6 mm, 3 µm) 를이용하여
HPLC-DAD/MS 를이용한농산물중살균제 Carpropamid 의정밀잔류분석법확립 189 Table 3. Reproducibility of carpropamid analysis Reproducibility Average C.V a) (%) t r 5.20 (min) 0.4 Area 2.45 13.3 Height 0.22 6.8 a) C.V (Coefficient of variation, %) = Standard deviation / Average 100 Fig. 4. Calibration curve of carpropamid. 산물별매질효과의상이함으로인해작물별로설정되었으나공정분석법으로가장우선시되어야할분석의신뢰성을확보하는데최적화된조건이라사료된다. Fig. 3. HPLC analysis of carpropamid using different analytical columns. A; YMC-Pack Pro C18 (250 4.6 mm, 5 µm), acetonitrile : water = 70 : 30 (v/v), B; Shiseido CapcellPack C18 (150 4.6 mm, 3 µm), acetonitrile : water = 60 : 40 (v/v), C; Agilent Eclipse XDB-C8 (150 4.6 mm, 5 µm), acetonitrile : water = 65 : 35 (v/v). 분석하였다. 이동상은용출용매인 acetonitrile과 water의비율과속도를조절하여 carpropamid 분리를최적화하였다. 그결과, 현미, 사과, 배추시료분석시이동상조성은 acetonitrile 비율이 65% 로결정하였고고추시료분석시이동상조성은 acetonitrile 비율이 60% 로결정되었다. 유속은현미, 사과, 배추시료분석시 1.0 ml/min으로고추시료분석시 1.1 ml/min으로작물에따라세분화하였다. 확립된기기분석조건은 carpropamid의입체화학적특성과농 HPLC 분석의기기검출한계, 기기정량한계및반복성기기검출한계 (ILOD) 는기기상피크로인정할수있는한계로써크로마토그램상 S/N (signal과 noise) 비가 3배이상수준에해당하는농약의양으로결정하며, 기기정량한계 (ILOQ) 는기기상으로신뢰성있게정량할수있는한계로 S/N비가 10배이상되는농약의양으로정한다 (Fong 등, 1999; Miller, 2005). ILOD와 ILOQ를결정하기위해다양한농도의표준용액을분석하였으며그결과, carpropamid 의기기정량한계 (ILOQ) 는 2ng이었다. 분석기기의안전성을확인하기위해분석의반복성시험을수행하였다. 역상 C8 칼럼 (Agilent Eclips XDB-C8, 150 4.6 mm, 5 µm, USA) 을사용하여 65% acetonitrile 이동상조건하에서설정된정량한계 2ng을 7번반복측정하였다. 그결과, 머무름시간, 피크면적및높이의반복분석간오차가작아재현성있는기기분석이가능함을확인하였다 (Table 3). 검량선의직선성 (Linearity) 다양한농도의표준용액을분석하여농약농도와피크면적와의회귀방적식을계산하였으며결정계수 (R 2 ) 를산출하였다. 검량선의범위는 0.05~10 mg/l이었으며, 여러번반복하여검량선을작성하였을때 R 2 값은 0.999로양호하였다 (Fig. 4).
190 이혜리 최훈 김은혜 이영득 김정한 Table 4. Efficiency of liquid-liquid partition a) with three different solvents Solvents Recovery (%) Partition-1 (100 ml) Partition-2 (50 ml) Total n-hexane 63.1 34.5 97.6 Ethyl acetate 70.6 42.4 113.0 Dichloromethane 77.7 27.5 105.2 a) Partition mixture : 1 ml of 100 mg/l carpropamid + 50 ml of saturated NaCl + 50 ml of distilled water Table 5. Recovery rate by sequential elution of ethyl acetate/n-hexane mixture Ethyl acetate/n-hexane Recovery (%) Ethyl acetate/n-hexane Recovery (%) 10 : 90 100 ml 71.9 5 : 95 100 ml - 20 : 80 100 ml 38.9 10 : 90 100 ml 89.5 30 : 70 100 ml - 15 : 85 100 ml - 40 : 60 100 ml - 20 : 80 100 ml - 50 : 50 100 ml - 25 : 75 100 ml - Total 110.8 Total 89.5 액-액분배조건확립추출액으로부터분석방해물질을제거하기위해액-액분배법을사용하였다. 액-액분배는물과비극성용매를이용하여비극성인농약성분을작물의극성방해물질로부터분리해내는방법이다. n-hexane, ethyl acetate 및 dichloromethane을사용하였으며분배용매별 100 ml의 1회분배회수율은 63.1~77.7% 이었으나, 분배용매 50 ml로추가분배할경우회수율이 97.6~113.0% 이었다 (Table 4). 따라서, 100 ml 및 50 ml씩두번액-액분배하는것으로분배조건을결정하였다. 분배용매로검토한세가지용매모두양호한회수율을보였으나, 이중에서방해물질의추출이적고이후정제과정으로진행하는데효율적인 n-hexane을분배용매로선정하였다. Florisil 칼럼정제최적화농산물중잔류농약분석은미량성분을정량하기때문에최대한분석방해물질을제거할필요성이있다. 액-액분배는작물중당이나알코올등극성방해물질을제거할수있고, 정제과정은색소나유지등액-액분배에서제거하지못한많은분석간섭물질로부터농약성분만을분리해낼수있다 (Fong 등, 1999). 용출용매 ethyl acetate/n-hexane 혼합액을사용하였으며, ethyl acetate 비율을 10% 씩높이면서용출혼합액 100 ml씩용출시켜 carpropamid 용출율을검토한결과, ethyl acetate 비율이 10% 일때 71.9% 가용출되었고이후 20% 비율일때 38.9% 의용출율을보였다 (Table 5). 정제조건을보다세분화하기위해 ethyl acetate 비율을 5% 씩높이면서 carpropamid 용출특성을추가검토하였으며, ethyl acetate 5% 용출액 100 ml에서는 carpropamid가용출이되지않고그이후 ethyl acetate 10% 용출액 100 ml의용출율이 89.5% 로대부분이회수되었다 (Table 5). 따라서, ethyl acetate/n-hexane 5:95 (v/v) 혼합액 100 ml로칼럼을세척하고 ethyl acetate/n-hexane 10:90 (v/v) 혼합액 100 ml로 carpropamid를용출하는 Florisil 정제조건을확립하였다. 분석칼럼의 carpropamid 머무름특징및칼럼효율성확립된전처리법에따라배추, 현미, 사과및고추시료를전처리한후 Table 1에따라분석하였을때, HPLC 크로마토그램에서 carpropamid의머무름특성및칼럼효율성을확인하였다. Carpropamid의머무름시간은배추에서 5.29분, 사과 5.31분, 현미 6.18분, 고추 6.92분이었으며 (Table 6), Fig. 5에서보듯이크로마토그램상에서 carpropamid의 peak 주위로분석방해물질이관찰되지않았기때문에다양한농산물매질로부터 carpropamid를선택적으로분석할수있음을확인할수있었다. 작물종류별상이한매질하에서 HPLC상의 carpropamid 피크의머무름특징을확인하기위해 capacity factor인 k값을산출하였으며, 배추, 사과, 현미, 고추에서각각 4.32, 4.26, 5.09, 5.87이었다 (Table 6). 배추와사과는동일한분석조건에서분석하였기때문에각각 4.32, 4.26의유사한 k값이산출되었고, 현미는 C8칼럼보다머무름특성이높은 C18칼럼으로분석하였기때문에상대적으로높은 5.09 값이계산되었다. 고추는이동상의 acetonitrile 비율이다른작물에비해 60% 로낮았고 C18칼럼으로분석하였기에가장높은 5.59이산출되었다. Capacity factor가낮으면짧은시간내에분석이가능하지만해당 peak의선택성및분해능을확보하기어렵고, 반대로 capacity factor가너무크면분석의선택성및분해능을높일수있지만많은시료를분석하
HPLC-DAD/MS 를이용한농산물중살균제 Carpropamid 의정밀잔류분석법확립 191 Table 6. HPLC chromatographic behavior of carpropamid Crops a) t R (min) b) t 0 (min) t R ' c) (min) k d) N e) H f) (mm) Korean cabbage 5.29 0.97 4.32 4.45 3519 0.043 Apple 5.31 1.05 4.26 4.06 3545 0.042 Brown rice 6.18 1.09 5.09 4.67 3677 0.041 Green pepper 6.92 1.05 5.87 5.59 3157 0.048 a) Retention time of carpropamid b) Retention time of unretained compound c) Adjusted retention time = t R t 0 d) Capacity factor = t R '/t 0 e) Number of plates = 5.545 (t R /W h ) 2, W h = peak width at half height f) Height of theoretical plates = column length (mm) / N Fig. 5와같이크로마토그램상의 carpropamid의 N은배추, 사과, 현미, 고추시료에서각각 3519, 3545, 3677, 3157이었으며 H는 0.043, 0.042, 0.041, 0.048 mm이었다 (Table 6). 한편, 이등 (2009) 은 fenhexamid 분석시 N값이 18252~ 22952이었고이등 (2010) 은 cyprodinil 분석시 N값이 23451 ~27731으로모든경우에서 18000 이상이었다. 이는 carpropamid의머무름시간이 fenhexamid (9.74~11.44분 ) 이나 cyprodinil (8.98~10.33분) 보다짧고 carpropamid의 2개이성질체가한개의 peak로나타나 fenhexamid이나 cyprodinil 보다 peak 띠가넓게나타났기때문이다. Fig. 5. HPLC chromatograms of carpropamid in crop extracts. A; control, B; fortified with carpropamid at 0.2 mg/kg. 는데한계가있다. 앞선문헌에서이등 (2009) 는 fenhexamid 을분석하는데 k 값이 4.53~5.46, 이등 (2010) 은 cyprodinil 분석시 k 값이 3.12~3.94 그리고 Kwon 등 (2011) 은 orystrobin 및대사체를분석하는데 k값이 4.5~6.5되는분석조건으로결정하였다. 이론단수 (N) 과이론단높이 (H) 는칼럼의분리효율을나타내며, N은클수록 H는작을수록칼럼의분리효율이높다 ( 김강진등, 1997; McNair and Miller, 1997; Rood, 2007). 분석정량한계 (MLOQ) 분석정량한계 (MLOQ) 는시료전처리및분석과정을통틀어전체분석법으로시료기준으로분석물질을정량할수있는한계치를일컫으며 ( 이등, 2009), 분석장비의검출한계또는정량한계로부터시료채취량, 전처리과정중의희석또는농축배율등을감안하여산출된다. 앞서설정된 HPLC 를통한 carpropamid의기기정량한계 (ILOQ) 가 2 ng, HPLC 시료주입량이 20 µl이었으며, 확정된전처리과정중최종시험용액부피가 5mL, 시료채취량 25 g이므로본연구의분석정량한계는 0.02 mg/kg로산출되었다. 이는식품의약품안전처에서추천하고있는 0.05 mg/kg 이하또는 MRL의 1/2을충족하는수준이었으며 ( 이영득, 2009), carpropamid의농산물최저잔류허용기준인 0.05 mg/kg 수준을정량할수있는수준이었다. 분석법의회수율본연구에서확립된전처리법및기기분석법을이용하여농약이처리되지않은배추, 사과, 현미및고추에표준용액첨가법에따라 3수준으로농약을첨가하고회수율시험을수행하였다. 처리수준은 MLOQ (0.02 mg/kg), 10MLOQ (0.2 mg/kg, 100MLOQ (2 mg/kg) 이었으며, 3번반복실험하였다. 회수율결과, MLOQ 수준에서는 88~112%, 10MLOQ 수준에서는 84~100%, 100MLOQ 수준에서는 87~97% 의양호한회수율을보였고, 정밀성 (C.V < 10%) 도우수하여식
192 이혜리 최훈 김은혜 이영득 김정한 Table 7. Recovery of carpropamid from different crops Fortification Recovery a) (%) (mg/kg) Korean cabbage Apple Brown rice Green pepper 0.02 98.0 ± 4.9 a b) 112.5 ± 9.8 a 90.2 ± 8.1 a 87.7 ± 8.2 a 0.2 84.0 ± 4.2 b 100.5 ± 4.9 ab 92.8 ± 5.5 a 85.5 ± 5.8 a 2.0 91.8 ± 4.5 ab 97.2 ± 3.1 b 87.0 ± 1.0 a 92.8 ± 0.2 a a) mean ± SD, n = 3 b) 다중범위검정결과 (p 0.05) Fig. 6. LC/MS total-ion chromatogram (A) and mass spectrum (B) of carpropamid. A standard solution (1 mg/l) was analyzed. 약처분석법기준인회수율 70~120%, C.V 20% 을만족하였다 (Table 7). 농약처리수준별회수율의유의적차이를확인한결과, 현미와고추는처리수준별유의적차이를확인할수없었지만배추와사과에서는낮은처리수준에서유의적으로회수율이높게산출되었다 (Table 7). 작물별회수율결과를살펴보았을때, 사과작물에서처리수준에관계없이회수율이높았지만나머지작물에서의회수율결과간에는유의적차이를확인할수없었다. 따라서, 본연구를통해확립된 carpropamid 분석법은작물잔류수준의정도나작물종류에따라정확도의차이를보이지않아광범위한작물의잔류수준을검정에적용될수있는분석법임을확인할수있었다. 잔류분의재확인본연구에선 HPLC로검출된 carpropamid 잔류분을재확인할수있는 LC/MS법을확립하였다. ESI (electro spray ionization) positive mode에서이온화하였고이동상은 HPLC 와같은 acetonitrile/water 혼합액에추가로 0.1% formic acid를사용하였다. Formic acid는 LC/MS 분석시이동상으로많이사용되는시약으로, 이온화를위한 proton을제공하고해당 peak의모양을향상시키는장점을가지고있다 ( 이등, 2011). 최적화된이온화조건에서 m/z 100~400 범위를 scan하여 1 mg/l 표준용액의 total-ion chromatogram (TIC) 과 carpropamid의 mass spectrum을얻었다 (Fig 6). Carpropamid은분자식이 C 15 H 18 Cl 3 NO이고 nominal mass는 333.0으로서 carpropamid의 ESI(+) mass spectrum은 m/z Fig. 7. LC/MS SIM chromatograms of carpropamid in crop extracts. A; control, B; fortified with carpropamid at 0.2 mg/kg.
HPLC-DAD/MS 를이용한농산물중살균제 Carpropamid 의정밀잔류분석법확립 193 334 에서 [M+H + ] 이온을확인할수있었다. 또한 carpropamid 의구성원자중 Cl 원자가 3 개존재하고, Cl 의동위원소 35 Cl 와 37 Cl 비율이 100:32.5이기때문에, [M+H=334] +, [M+2+ H=336] + 및 [M+4+H=338] + 의비가 100:96.6:22.3으로나타나서이러한동위원소비율을잘반영하고있다. 따라서, SIM 분석을위한최적 ion으로 m/z 334을선정하였다. 확립된 LC/MS법에따라농산물시료중 carpropamid 잔류분을재확인한결과, 모든시료에서분석방해물질은관찰되지않아잔류분의재확인분석법으로이용가능함을확인하였다 (Fig. 7). 감사의글 본연구는 2012년도식품의약품안전청용역연구개발과제의연구개발비지원 (09072잔류약997-4403) 에의해수행되었으며이에감사드립니다. Literature Cited Chu, X. G., X. Z. Hu and H. Y. Yao (2005) Determination of 266 pesticide residues in apple juice by matrix solid-phase dispersion and gas chromatography-mass selective detection. Journal of Chromatography A 1063:201-210. Fong, W. G, H. A. Moye, J. N. Seiber and J. P. Toth (1999) Pesticide Residues in food: Methods, Technologies, and Regulations. Wiley Interscience. pp. 3-4, 40-44, Canada. Kwon, C. H., Y. D. Lee and M. H. Im (2011) Simultaneous determination of orysastrobin and its isomers in rice using HPLC-UV and LC-MS/MS. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59:10826-10830. McNair, H. M. and J. M. Miller (1997) Basic Gas Chromatography. pp.7, 51, Wiley Interscience, USA. Miller, J. M. (2005) Chromatography : conseps and contrasts (2nd), Wiley Intersciense, pp. 286-287, USA. Pizzutti, I. R., A. Kok, R. Zanella, M. B. Adaime, M. Hiemstra, C. Wickert and O. D. Prestes (2007) Method validation for the analysis of 169 pesticides in soya grain, without clean up, by liquid chromatography-tandem mass spectrometry using positive and negative electrospray ionization. Journal of Chromatography A 1142:123-136. Pizzutti, I. R., A. Kok, M. Hiemstra, C. Wickert and O. D. Prestes (2009) Method validation and comparison of acetonitrile and acetone extraction for the analysis of 169 pesticides in soya grain by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography A 1216: 4539-4552. Rood, D. (2007) The Troubleshooting and Maintenance Guide for Gas Chromatographyers pp. 16-17, p. 22, Wiley-VCH, USA. Seiji, N. (2002) Application for rapid and simultaneous detamination method on the analysis of chlorothalonil and carpropamid. Annual Reports of Fukuoka City Institute for Hygiene and Environment 27:141-145. Tomlin, C. D. S. (2009) The Pesticide Manual (15th), pp. 436-437, British Crop Protection Council, Hampshire, UK. 김강진, 김하석, 이대운, 이원 (1997) 분석화학 ( 제4판 ), pp. 698, 자유아카데미. 박병준, 권오경, 김진경, 김진배, 김진호, 윤순강, 심재한, 홍무기 (2009) 영농지역에서작물재배형태에따른농약의잔류성과유출특성. 한국환경농학회지 28(2):194-201. 박병준 (2011) 전국논토양과시설하우스토양중잔류농약모니터링과노출성평가. 농약과학회지 15(2):1-6. 식품의약품안전처 (2015a) 식품공전. 식품의약품안전처 (2015b) 식품의농약잔류허용기준. 이영득 (2009) 식품공전잔류농약분석법실무해설서 pp. 3, 식품의약품안전청. 이영득, 오재호, 장상원 (2011) 고성능액체크로마토그래피와질량분석법을이용한농산물중 Phenothrin 및 Silafuofen 의정밀잔류분석법개발 15(4):389-400. 이혜리, 류명주, 박희원, 나예림, 송혁환, 금영수, Yongzhe Zhu, 김정한 (2009) HPLC를이용한배추, 사과, 감귤, 고추중살균제 Fenhexamid의정밀분석법확립 13(4):223-231. 이혜리, 류명주, 김은혜, 문준관, 도정아, 오재호, 권기성, 임무혁, 이영득, 김정한 (2010) HPLC를이용한사과, 감귤, 배추, 고추중살균제 Cyprodinil의분석법확립 14(4):371-380. 한국작물보호협회 (2012) 농약사용지침서, 삼정인쇄공사 pp. 248-249, 786-787.
194 이혜리 최훈 김은혜 이영득 김정한 HPLC-DAD/MS 를이용한농산물중살균제 Carpropamid 의정밀잔류분석법확립 이혜리 최훈 1 김은혜 2 이영득 3 김정한 2, * 국립환경과학원환경측정분석센터, 1 원광대학교식품환경학부, 2 서울대학교농생명공학부, 3 대구대학교생명환경학부 요약본연구는대부분의농작물중살균제 carpropamid 의잔류량을정밀하게분석할수있는단성분분석법을개발하고자하였다. 대표농작물로배추, 사과, 현미, 고추를선정하였으며, 균질화된농작물시료중 carpropamid 잔류분을 acetone 을이용하여진탕추출하고액 - 액분배법과 Florisil 크로마토그래피법을통해정제하였다. C8 및 C18 역상컬럼이장착된액체크로마토그래피를이용해 UV 220 nm 파장에서 carpropamid 를정량분석하였으며, 질량분석기를통해잔류분을확인하였다. 본분석법을통한 carpropamid 의기기정량한계는 2ng 으로분석정량한계는 0.02 mg/kg 이었다. 표준용액을 3 수준 ( 분석정량한계 1, 10, 100), 3 반복으로무처리시료에첨가하고본분석법의회수율을산출한결과 84~112% 이었으며, 농산물종류에상관없이반복간분석오차는 10% 미만으로우수한정밀성을보였다. 색인어 Carpropamid, 액체크로마토그래피, 분석법