후생유전학 (epigenetics) CHEMISTRY TOPICS 1 히스톤탈아세틸화효소와저해제의기전 허우영 KIST, whur@kist.re.kr 서론히스톤의아세틸화 (histone acetylation) 는유전자발현을결정하는중요한변화중의하나이다. 아세틸화는일반적으로유전자발현을증가시키며탈아세틸된히스톤은종종유전자억제와연관된다. 히스톤탈아세틸화효소 (HDAC) 은히스톤의아세틸그룹을제거하며유전자발현의중요한조절자이다. HDAC 은아세틸기 (acetyl group) 외에다른 acylated lysine( 예 crotonylation, succinylation, malonylation 등 ) 역시제거한다. 히스톤이외에다양한비히스톤단백질들의아세틸화도인지하는것으로알려져있지만, 아직이들에대한생물학적인역할에대해서는충분히연구되어있지않다. 지금까지 11가지 HDAC 이알려져있으며크게세가지 HDAC 클래스 (I, II, IV) 로나뉜다. Class III HDAC 들은 siruin 들이며, NAD- 의존적활성부위 (active site) 를지니고있으며다른 HDAC 들과어느정도기능이중복된다. 그러나 sirunins 은기존의 HDAC 저해제 (HDACi) 에의해저해되지않는다. HDACi 은이미항암제로이용되고있으며, HDAC 저해의결과는 HDACi 의선택성과세포신호전달에따라결정되는데, 여기서는 HDACi 의기전과효능에대해토의하고자한다. 본론후생유전 (epigenetic) 효소후생유전 (epigenetics) 과연관된연구로서 DNA 의변화 가가장많이연구되었지만, 실제히스톤단백질에서가장다양한후생유전적변화가일어난다. 히스톤 N-terminal 영역은아세틸화, 메틸화, 인산화, 유비퀴틴화, 수모화 (sumoylation), ADP 리보실화 (ADP ribosylation), deimination, proline isomerization, crotonylation, propionyation, butyrylation, formylation, hydroxylation, O-glcNAcylation 등의다양한번역후변형 (post-translational modification, PTM) 이일어난다. 후생유전학적조절효소들은기능면에서 3가지로나뉘는데, DNA 혹은히스톤에표지하는 writer, 이들표지들을제거하는 eraser, 이들표지를인지하는 reader 로나뉜다 [ 그림 1]. Writer 와 eraser, reader 에대한많은저해제가개발되었고, 몇몇은 FDA 승인되었는데, 암과뇌질환등의여러질병에좋은효능을보인다. 가장성공적인후생유전학적저해제는 DNA- 탈메틸화화합물인 Celgene 에서개발한 azacitidine (5-azacytidine/Vidaza) 과 Eisai 에서개발한 decitabine (5-aza-2 -deoxycytidine/dacogen) 이며, 이들은골수형성이상증후군 (myelodysplastic syndrome) 과여타암종에대한치료제로이용되고있다. 최근히스톤메틸화효소 DOT1L 과 EZH2 저해제등의 writer 에대한저해제들이신규항암제로서각광받고있으며, PRMT ( 아르기닌탈메틸화효소 ) 저해제역시항암제및면역관련질병에대한치료제로부각되고있다. HDAC 등의 eraser 에대한 Merck 사의저해제 (vorinostat/zolinza) 는피부 T- 세포림프종 CTCL) 치료제로, Celgene 사의 romidepsin (Istodax) 는 CTCL 과말초 T-세포림프종 (PTCL) 치료제로 2015. 06 화학세계 13
읽기쉬운총설 그림 1. 후생유전적 writer, eraser, reader 승인받았다. 또한히스톤리신탈메틸화효소 (KDM) 의저해제역시항암제및뇌질환치료제로부각되었다. Writer 와 eraser 와는다르게 reader 의저해제는단백질 -단백질상호작용을저해하는화합물이다. 가장잘알려진예로서브로모영역 (bromodomain) 을포함하는 BET(bromodomain and extraterminal) 단백질저해제이다. BET 저해제는 MYC oncogene 등의직접적인약물표적이될수없는단백질의기능을저해할수있으며, MYC 의전사표적을저해하여 MYC 에의해유발되는급성골수성백혈병 (AML), 버킷림프종 (Burkitt lymphoma) 등의혈액암을억제한다. 히스톤탈인산화효소 (HDAC) 지금까지 11가지 HDAC 이알려져있으며크게세가지 HDAC 클래스 (I, II, IV) 로나뉜다 [ 그림 2]. 엄밀히 HDAC 은리신탈아세틸화효소 (KDAC) 이라불리워야하는데, 인간세포에서 1,700 가지이상의단백질에서리신의아세틸화가일어나며, HDAC 은다양한핵혹은세포질단백질의아세틸그룹을제거한다. HDAC 은단일단백질로서가아닌단백질복합체의한구성원으로서역할을하며 HDAC 저해 도당연단백질복합체의맥락에서이해되어야한다. 특정프로모터상에서히스톤과아세틸화가전사활성과연관되어있을것으로예상되지만, 실제로는 HDACi 투여에의해많은유전자들의발현이억제된다. 발현이나유전자적인변이외에도, HDAC 은암유발퓨전단백질에의해특정유전자프로모터에끌리는기전으로백혈병을유발한다 [ 그림 3]. HDAC 들이이복합체의구성요소라는점이 HDAC 이퓨전단백질에의해유발되는백혈병의약물표적이되는배경이된다. 예를들어 t(8;21) AML 환자에서발견되는 AML1- ETO 퓨전단백질은 ETO 부분을통해 HDAC1/2/3 을끌어들여 AML1 표적유전자의발현을억제하여골수의분화를억제하고세포형질전환을일으킨다. 또한 PML RARα(promyelocytic leukaemia retinoic acid-related receptor-α) 는 RXR 과이중합체를형성하며 NCoR, SMRT 를포함한리프레서 (repressor) 들과 HDAC 1/2/3, DNMT1, DNMT3A, EZH2 를끌어들여 RARα 표적유전자들을억제시킨다. NcoR 와 SMRT 는 HDAC3 와결합하며, SIN3A 는 HDAC1/2 와결합한다. 이러한 HDAC 억제복합체의끌림에대한연구를통 Depsipeptide SK-7041, SK-7068 Tubacin Class Ⅰ HDAC1 HDAC2 HDAC3 HDAC8 Class Ⅱa HDAC4 HDAC5 HDAC7 HDAC9 Class Ⅱb HDAC6 HDAC10 Class Ⅳ HDAC11 MS-275 SB-379872-A ClassⅠcatalytic domain ClassⅡ catalytic domain ClassⅡ catalytically inactive domain 그림 2. HDAC family VPA Butyrate Trapoxin SAHA, TSA, PXD101, LBH589, LAQ824 ClassⅣ catalytic domain Coiled-coil region Zinc finger 14 화학세계 2015. 06
히스톤탈아세틸화효소와저해제의기전 해급성전골수성백혈병 (acute PML) 의치료법개발로이어질수있다. 암과 HDAC 암세포에서유전자게놈수준에서단일아세틸화와삼중메틸화의전체적인감소가나타난다. 많은연구들이암종양에서 HDAC 의비정상적인발현이발견되었고, HDAC1,5,7 이종양의바이오마커로이용되었다. 여러암종 ( 전립선, 대장암, 유방암, 폐암, 간암, 위암등 ) 에서 HDAC 과발현이무병 (disease-free), 전체생존율 (overall survival) 을상당히줄였고, 예후가상당히좋지않다. 실제로 HDAC 과발현은 CDKN1A 종양억제유전자, DNA 회복효소 (BRAC1) 를후생유전학적으로억제하는등의종양형성 (tumorigenesis) 과밀접한연관이있다. HDAC 의과활성으로인한 p53 의직접적인탈아세틸화는전사활성을줄이며, 이에따라 Bcl2 암유전자 (oncogene) 의 upregulation, SP1, C/EBPa 등전사인자의활성화가유발된다. 특정유전자 loci 에 HDAC 의비정상적인끌림 (oncogenic fusion proteins 과의결합을통한 ) 또한종양생성에서중요한메커니즘이다. 그러나 HDAC 과발현이항상나쁜예후마커를의미하는것은아니다. 실제로 HDAC6 발현양은 ER-positive 유방암에좋은예후를보인다. 더욱이 CTCL 에서 pan-hdaci 이임상학적활성을보이지만 HDAC6 과발현은좋은예후를보인다. 따라서모든경우에서 HDAC 발현양과히스톤아세틸화레벨이 HDACi 를포함한항암제의약효를결정하지는않는다. Classic I HDAC 의활성은복합체형성으로증가하는데, 최근연구에의하면 HDACi 은 HDAC 의단백질복합체를구별할수있다는점이알려졌다. Class IIa HDAC 은 HDACi 의직접적인표적이되지않는데, 아마도낮은효소활성에기인하는것으로여겨진다. 이효소군은탈아세틸화보다는아세틸화된히스톤을인지하여다른후생유전효소들을끌어들이는기능이주가되는것으로여겨진다. HDAC1/2/3/4/11 중어느하나를녹아웃 (knockout) 혹은녹다운 (knockdown) 으로제거하면다양한암세포주에서세포자살 (apoptosis) 이유도된다. 특히 HDAC1/2/3 은다 그림 3. 백혈병연관퓨전단백질과 HDAC 효소간결합양한복합체에서중요한촉매소단위 (catalytic subunit) 이며암유발퓨전단백질들에의해끌리는데, HDAC 녹다운이 HDAC 활성이제거되었기때문인지, 실제기능을수행하는 HDAC 의복합체가와해되었기때문에세포사멸이일어나는지명확하지않다. 저해제에의한 HDAC 의저해는유전학적인녹아웃이나녹다운과는다른데, 특히각각의단백질복합체의형성과기능에미치는영향이나활성이낮은 HDAC class IIa 에미치는영향이다르다. 두가지중요한 HDACi 에대한바이오마커가알려져있다. JAK/STAT 신호전달 (signaling) 이활성화되면 HDACi 에의한세포사멸을방해한다. STAT1 가핵내에축적되거나 STAT3 인산화가높아지면 HDACi 의임상효능이없어진다. 또한유전자스크리닝에서 human RAD23 homolog B (HR23B) 가 HDACi 에의한세포자살에중요하다고알려져있다. HR23B 발현양과보리노스타트 (vorinostat) 의임상효능이연관이있음이알려졌고, HSP90 과 hdac6 간의상호작용이 HR23B 발현에중요한메커니즘이다. 아직 JAK/STAT 신호전달과 HR23B 발현양간의연관성은아직밝혀지지않았다. HDAC 저해제 (HDACi) HDACi 은다양한암종에대한항암제로개발되었지만뇌질환, 감염, 염증에도효능을보인다. 다양한천연물, 합성 2015. 06 화학세계 15
읽기쉬운총설 의약화합물이 HDACi 로알려져있으며, 두가지 HDACi (vrinostat, romidepsin) 이 refractory CTCL 에대해 FDA 승인이되었으며다양한화합물이임상시험에있다. HDACi 은그구조에따라분류될수있는데, 하이드록사아마이트 (trichostatin A, vorinostat), 카복실산 (valproate, butyrate), 아미노벤즈아미드 (entinostat, mocetinostat), 고리펩타이드 (apicidin, romidepsin), 에폭시케톤 (trapoxins) 등이다 [ 그림 3]. 11 가지의 class I, II, IV HDAC 이존재하며, 높은 HDAC 표적선택성을보이는저해제는아직그수가적다. 일반적으로 HDCAi 의약리단 (pharmacophore) 은세가지영역으로구성되어있다. Cap 영역 ( 혹은표면인지도메인 ) 은 active site pocket 의입구를막고, Zn 이온- 결합그룹은 active site 의 Zn 이온과배위결합하며, 이두영역이 linker 영역으로연결된다 [ 그림 3]. 대부분의 HDACi 은하이드록사아마이트 (hydroxamate) 이다. 그러나선택성을높이기위해다른 Zn 이온결합작용기도이용되는데, 벤즈아마이드 (benzamide) 유도체, 싸이올 (thiol), 설파미드그림 4. 대표적 HDACi 의구조 (sulphamide), 케톤, 트라이싸이오카보네이트 (trithiocarbonate) 등이있다. 보리노스타트 (Vorinostat) 와파비노스타트 (panobinostat) 등의하이드록사아마이트유도체들은일반적으로다양한부류의 HDAC 들을저해한다. 에티노스타트 (Etinostat), 모세티노스타트 (mocetinostat) 등의벤즈아미드유도체들은 Class I HDAC 저해에국한된다. HDAC3 에선택적인저해제인 RG2833 과 RGFP966 역시벤즈아미드유도체들이다. Cap 영역이선택성을결정하는데, cap 영역이 HDAC 자체뿐아니라활성사이트 (active site) 근처의다른결합단백질과도결합하기때문이다. 따라서특정복합체에존재하는 HDAC 을저해하는화합물을디자인하는데이용될수있다. 또한연결자 (linker) 를변화시켜선택성을조절할수있는데, 예를들어연결자영역에방향족고리를삽입하면유일하게 catalytic pocket 이큰 HDAC7 에선택적인저해제를도출할수있다. 대부분의 HDACi 은여러 HDAC 들을동시에저해하는화합물이며, HDAC 의저해효과를특정 HDAC 이아닌통합적저해결과혹은 HDAC 을내포한여러단백질복합체 ( 예 CoREST, NuRD, SIN3, NcoR 복합체 ) 가저해된결과로보아야한다. 실제 HDAC 복합체에대한화합물프로파일링을통해여러 HDACi 가 HDAC 의상태에따라독특한현상을보인다는것이알려졌다. 예를들어정제한 HDAC 에대해서아미노벤자마이드계열의 BML-120 과 tacedinaline 은 HDAC1/2 보다 HDAC3 을좀더선호하는데, 단백질복합체에서는이들저해제들은 HDAC3-NcoR 복합체를낮은농도에서저해하나, HDAC1/2-SIN3 복합체를전혀저해하지않는다. 또한 HDACi 이동일 HDAC 를함유하는여러복합체들에대하여여러가지활성을보인다. BML-120, 로미뎁신 (romidepsin), tacedinaline, VPA 를 HDAC1 이나 HDAC2 포함한복합체에대해측정하였을때 CoREST 에서가장높은결합능력을보이며, 뒤이어 NuRD, SIN 순이다. HDACi 는 HDAC 이존재하는복합체에의해활성이결정되며따라서순수한 HDAC 단백질보다는 HDAC 을함유한복합체에대한선택성이있는저해제를발굴하는연구가요구된다. 또한어느특정 HDAC 의다른 HDAC 에대한효과도고려 16 화학세계 2015. 06
히스톤탈아세틸화효소와저해제의기전 되어야한다. 예를들어 HDAC4 의 catalytic 도메인은 NCoR-SMRT 복합체내에서 HDAC3 와상호작용한다. HDAC4 은 HDAC 활성이매우낮은데도 NcoR-SMRT- HDAC3 복합체의전사억제능에서필수적인단백질이다. 또한 HDAC4 와 HDAC5 간의이중합체형성이 HDAC4 의 CaMKII- 의존적유전자조절에서필수적이다. HDAC 과여타다른표적단백질을동시에저해하는화합물도항암제로개발되었다. 이러한 polypharmacology 기전의몇가지화합물이임상시험에있다. HDAC 저해기능을보이는하이드록삼산 (hydroxamic acid) 과 PI3K 와강하게결합하는모르폴리노피리미딘 (morpholinopyrimidine) 그룹을가지고있는 CUDC-908 은이두가지효소를동시에저해하며, 림프종과다발성골수종 (multiple myeloma) 에대한 1상시험이진행되고있다. CUDC-101 은하이드록삼산과페닐아미노퀴나졸린 (phenylaminoquinazoline) 골격의메톡시에톡시 (methoxyethoxy) 작용기를지니고있으며 HDAC 과 EGFR/HER2 를동시에저해한다. 전임상에서하이드록사아마이트의 HDACi 와토포이소머라아제 (topoisomerase) 저해제의병용투여가좋은 항암효능을보였다. 결론후생유전적변화가질병을일으키고확대시킨다는점은이제널리받아들여지는사실이다. 다행히후생유전은가변적이어서많은경우에이러한변화를 HDAC 등의후생유전효소를조절함으로써되돌릴수있다는점이다. 점점질병의원인에대한이해가넓어지고 HDAC 저해의효과가자세히밝혀지면서 HDACi 들이보다더효율적이고확실한대상에적용될수있을것으로기대된다. 선택성이결여된 HDACi 가특히혈액암의임상시험에서좋은효능을보이지만, 부작용을줄일수있는선택적인 HDACi 가개발된다면독성을줄인다는측면에서매우의미있을것이다. 보다정확한 HDACi 의기전에대한연구가지속되어야할것이며, 이에따라 HDACi 을다른약물과병용투여하는등의다양한전략으로활용할수있을것이다. 이미 HDACi 과기타약물간의병용투여의개념은이미전임상단계에서증명되었는데, HDACi 에대한기전과내성과연결되는관한명확한바이오마커의발굴이요구된다. 참고문헌 1. Peart, M. J. et al. Proc. Natl Acad. Sci. USA 2012, 102, 3697. 2. Gray, S. G., Qian, C. N., Furge, K., Guo, X., Teh, B. T. Int. J. Oncol. 2004, 24, 773 3. Bantscheff, M. et al. Nature Biotech. 2011, 29, 255. 4. Delcuve, G. P., Khan, D. H., Davie, J. R. Clin. Epigenet. 2012, 4, 5. 5. Minucci, S., Pelicci, P. G. Nature Rev. Cancer 2006, 6, 38. 6. Ai, T., Cui, H. Chen, L. Curr. Med. Chem. 2012, 19, 475. 7. Qiu, T. et al. Future Oncol. 2013, 9, 255. 8. Falkenberg, K. J., Johnstone, R. W., Nature Rev. Drug Discov. 2014, 13, 673. 9. Bolden, J. E., Peart, M. J., Johnstone, R. W., Nature Rev. Drug Discov. 2006, 5, 769. 10. Ellis, L., Hammers, H., Pili, R. Cancer Lett. 2009, 280, 145. 허우영 Hur, Wooyoung 포항공과대학교화학과, 학사 (2001.2) 포항공과대학교생명과학과, 학사연구원 (2001.8) Genomics Institute of the Novartis Research Foundation, San Diego, USA, 연구원 (2003.6) The Scripps Research Institute, La Jolla, USA, 화학과, 박사 (2009.1) Dana Farber Cancer Institute, USA, 박사후연구원 (2013.8) 한국과학기술연구원, 선임연구원 (2013.9- 현재 ) 연구분야 : 화학생물학 (Chemical Biology), 신약탐색 (Drug Discovery) 2015. 06 화학세계 17