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Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(4): 335-341 (2017) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2017.32.4.335 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 Research Paper 염증성사이토카인의발현억제를통한홍해삼추출물의항염증효과및아토피개선효과 전미지 1, 임은경 1, 김가연 1, 이승제 1, 정인철 2, 김상용 3, 김영민 1 * Anti-inflammatory Effects and Improving Atopic Dermatitis of Ethanol Extracts of Red Sea Cucumber Mi Ji Jeon 1, Eun Gyeong Lim 1, Ga Yeon Kim 1, Seung Jae Lee 1, In Cheol Jung 2, Sang-Yong Kim 3, and Young Min Kim 1 * Received: 26 November 2017 / Revised: 15 December 2017 / Accepted: 19 December 2017 2017 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: The red sea cucumber (RSC), Apostichopus japonicus, is a species of sea cucumber in the family Stichopodidae. It is widely distributed in China, Japan and Korea. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) and Interferon (IFNγ) induce inflammatory cytokines such as Thymus and activation-regulated chemokine (TARC/CCL17), Cutaneous T-cellattracting chemokine (CTACK/CCL27), interleukin-1β (IL- 1β), IL-6 and IL-8. These cytokines are increased in atopic dermatitis condition. In this study, we investigated the antiinflammatory and skin regeneration effects by RCS. To investigate cytotoxic effects in HaCaT cells, we performed MTT assay after treatment with RSC extracted by 70% EtOH. As a result, RSC extracts did not have cytotoxic effect in HaCaT cells. Also, mrna expression levels of CCL17, CCL27, ILβ, IL-6 and IL-8 genes induced by TNF-α/IFN-γ were decreased by RSC extracts. Moreover, we confirmed the release of CCL17 and CCL27 protein through ELISA assay. 1 한남대학교생명나노과학대학생명시스템과학과 1 Department of Biological Sciences and Biotechnology, College of Life Science and Nano Technology, Hannam University, Daejeon 34054, Korea Tel: +82-42-629-8753, Fax: +82-42-629-8873 e-mail : kym@hnu.kr 2 ( 주 ) 신한에코 2 Shinhan ECO Co., Ltd. Jeju 63242, Korea 3 신안산대학교식품생명과학과 3 Department of Food Science & Bio Technology, Shinansan University Wound healing assay and cell cycle assay were performed to identify cell regeneration effect of RSC extracts. These results demonstrated the prevention and treatment effects of RSC on skin inflammatory diseases such as atopic dermatitis. Keywords: red sea cucumber, keratinocyte, atopic dermatitis, anti-inflammatory 1. INTRODUCTION 피부의가장표면층인표피는외부의자극으로부터체내를보호하는필수적인장벽기능을수행하며표피세포의형성과분화, 탈각과정을반복함으로써항상성을유지한다 [1]. 그중각질형성세포는표피세포를구성하는대표적인세포로, 분화및각화를통해피부장벽을형성하고, 스트레스환경에노출되면 tumor necrosis factor (TNF), interleukin (IL) 등여러 cytokine 을생산하여염증반응및면역반응에관여한다 [1-3]. 하지만지속적인피부손상으로 cytokine 이만성적으로생성되면피부건조를유발시켜아토피피부염과같은피부질환을일으키게된다 [4,5]. 아토피피부염은만성염증성피부질환으로, 유아와소아에서높은발병률을보이며그원인으로는환경적, 유전적요인과면역학적반응및피부보호막의이상등이주요원인으로여겨지고있다 [6]. 아토피피부염의임상적인특징으로는소양감을동반한피부장벽의붕괴, 혈청내 IgE 의증가와염증부위의호산구의침윤및 Th1/Th2 세포의균형변화등이

336 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(4): 335-341 (2017) 있으며, T림프구 (T lymphocyte) 와수지상세포 (dendritic cell), Th1세포와 Th2 세포에서발현되는 cytokine 등이관여하게된다 [7,8]. 현재아토피피부염의치료제로는부신피질호르몬제, 면역조절제, 국소면역조절제와가려움증을치료하기위한항히스타민제가사용되고있다. 그러나스테로이드및항히스타민제는환자개개인에따라작거나또는커다란부작용을초래할수있다 [9,10]. 이러한치료제들의안전성에대한논란이계속되고있는가운데, 최근피부자극이적고안전한천연추출물을이용한아토피치료개발이활발해지고있다 [11]. 특히천연물은대개흡수, 대사, 배설측면에서약물과같은성질을지니고있어의약품으로이용될가능성이매우크다 [8,12]. 이점을이용해식물추출물과더불어해양생물또한미래의생리활성신물질의원천으로주목받고있다. 홍해삼 (Stichopus japonicus) 은한국, 일본등아시아일대에서자생하고있는돌기해삼과의한종이다 [13]. 해삼은세계적으로약 1천 5백종이분포하고있으며, 우리나라에서자생하고있는홍해삼, 청해삼및흑해삼중에서도홍해삼은영양성분이다른해삼보다풍부하고, Taurine, Tanin, 비타민 B 1 (Thiamin), B 2 (riboflavin), B 3 (niacin) 등을포함하여항암, 비만예방, 고혈압예방, 피부면역, 항산화등많은효능이보고되고있다 [14-17]. 또한한방약재로많이쓰이는재료로비교적안전성이높기때문에기능성식품으로써높은잠재력을가질것으로추정된다. 하지만아토피성피부염에대한홍해삼의항염증효능에대한연구는여전히미흡한실정이다. 따라서본연구에서는홍해삼추출물의피부각질형성세포 (HaCaT) 에서의항염증및아토피개선효과를확인하고자하였다. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1. 실험재료및기기실험에사용된 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide (MTT) 는 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis. MO, USA) 에서구입하였으며에탄올, 클로로폼, 이소프로판올등의시약은특급시약을사용하였다. 홍해삼추출물의비교군으로사용된 ATO AI water aqua mist 는 ATO AI Co. (ATO AI, Busan, Republic of Korea) 에서구입하여사용하였다. 시료의흡광도는 ELISA microplate reader (Model 680, Bio-Rad Laboratories, Inc., Tokyo, Japan) 를사용하여측정하였다. 2.2. 홍해삼추출물제조본실험에서사용된홍해삼은제주해안지에서구입하여사용하였으며, 원료홍해삼을분쇄하여홍해삼분쇄물 800 g 에 70% Ethanol 3.2 kg 을가하여 80 o C 조건에서 3 hr 동안가열하여추출하였다. 가열추출후, 여과보조제인 0.1% 규조토를첨가하고여과지를이용하여부유물을제거하였다. 추출용 액은 60 o C 에서농축 ( 고형분 40%) 하여 95 o C 에서 5 분간살균후, 냉장보관하였다. 실험에사용된홍해삼추출물은 500 mg/ml 의농도로보관하여실험에사용하였다. 2.3. 세포배양본실험에서사용된 HaCaT 세포는 Dr. Fusenig (German Cancer Research Center, DKFZ, Heidelberg, Germany) 로부터분양받았으며, Fibroblast 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) 에서분양받아사용하였다. 세포는 10% Fetal Bovine Serum 과 1% Antibiotics 가포함된 DMEM media (Hyclone, Laboratories Inc., Logan, UT, USA) 를이용하여세포를부유상태로만든후 1 10 6 cells/ml 로분주하고계대배양하였다. 2.4. 세포생존율측정세포생존율은 MTT assay법을이용하여측정하였다. 12 well plate에 HaCaT 세포를각각 1 10 5 cells/ml로분주하고 24시간동안안정화시킨후, 농도별로희석한시료를처리하여 24 시간동안 5% CO 2, 37 o C 조건하에서배양하였다. 염증반응유도군에서는 TNF-α, INF-γ 10 ng/ml를각각한시간동안전처리하였다. 배양이끝난후 5 mg/ml 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT, Sigma-Aldrich Co.) solution을각 well 당 40 μl씩첨가하여한시간동안 CO 2 incubator에반응시켰다. MTT solution이포함된 media 를제거하고 PBS washing 후 PBS를완전히제거하였다. 각 well 당 DMSO 150 μl을첨가하여생성된 formazan을모두녹인다음 96 well plate에 100 μl씩옮긴후 ELISA microplate reader (Bio-Rad model 680, Bio-Rad Laboratories Inc., Tokyo, Japan) 로 595 nm에서흡광도를측정하였다. 측정은모두 3번이상하였으며, 이에따른평균값과표준오차는 Microsoft Excel Program을이용하여분석하였다. 2.5. Total RNA 추출및 cdna 합성 6 well plate 에 HaCaT 세포를각각 1 10 5 cells/ml 로분주하고 24 시간동안안정화시킨후, 시료를농도별로처리하여 24 시간동안 5% CO 2, 37 o C 조건하에서배양하였다. 염증반응유도군에서는 TNF-α, INF-γ 10 ng/ml 를각각한시간동안전처리하였다. 배양후 media 를모두제거한뒤, PBS 로 1 회 washing 후 RiboEX Total RNA Isolation Solution (GeneAll Biotechnology, Seoul, Republic of Korea) 을가하여세포를용해한뒤클로로폼, 이소프로판올, 70% 에탄올을각각첨가하는과정을통하여 total RNA 를추출하였다. cdna 합성은 DiaStar TM RT kit (SolGent, Seoul, Korea) 를이용하여진행하였다. total RNA 1 μl 와 Oligo (dt) 20 primer 9 μl 를혼합한뒤 65 o C 에서 5 분동안반응시킨후얼음에넣어반응을중단하였다. 상기과정을통하여 oligo (dt) primer 가붙은 mrna 에 8 mm DTT 1 μl, RNase inhibitor (200 U/μL) 1 μl, 10 mm 의 dntps 가포함된 5X RT reaction buffer 4 μl, DEPC D.W 를첨가한후 40 o C 에서한시간, 95 o C 에서 5 분동안반응시킴으

염증성사이토카인의발현억제를통한홍해삼추출물의항염증효과및아토피개선효과 337 로써 cdna 를합성하였다. 2.6. 역전사중합효소연쇄반응 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR) PCR은 DNA polymerase, buffer, dntp, tracking dye가포함된 2X Taq PCR Smart mix 1 (SolGent, Seoul, Korea) 를이용하여실시하였다. PCR 증폭은 95 o C에서 10분동안 pre-denaturation 하고, denaturation은 95 o C에서 30 sec, annealing은 60 o C에서 30 sec, Extension은 72 o C에서 30 sec의조건으로 35 cycle 동안반응시켰으며, 72 o C에서 10분동안안정화시켰다. CCL17, CCL27, IL-1β, IL-6, IL-8, MMPs, Actin의 specific primer sequence는다음의 Table에서나타내었다. 2.7. CCL17, CCL27 ELISA assay 세포내 CCL17,CCL27 정량은 ELISA법으로측정하였다. 먼저, HaCaT 세포를 6 well plate에각 well 당 1.5 10 5 cells/ml 로분주한뒤, 5% CO 2, 37 o C 조건하에서 24시간동안배양하였다. 염증반응유도군에서는 TNF-α, INF-γ 10 ng/ml를각각 1시간동안전처리하였다. 배양후 media를 15 ml tube에넣고 1,500 rpm, 10분동안원심분리하였다. 배양액내의 CCL17 함량을측정하기위해 Human TARC ELISA kit (Abcam, Cambridge, MA) 를사용하였고, CCL27은 Quantikine ELISA Human CCL27/CTACT kit (R&D Systems, Minneapolis, MS) 를사용하여측정하였다. 실험과정은세포배양액을각 well에분주하고제공되는표준시료를주입하여제조회사에서제시하는방법에준하여 450 nm 파장에서흡광도를측정하였다. 2.8. Wound healing assay HaCaT 세포를 6 well plate에각 well 당 1 10 5 cells/ml로분주하여 24시간동안배양한다음배양액을제거한뒤 10 μl pipette tip으로스크래치를내었다. 현미경으로관찰한뒤배양액교체후홍해삼추출물시료를농도별로처리하였다. 염증반응군에서는 TNF-α/IFN-γ 10 ng/ml을한시간전처리하였다. 물질처리후 24시간뒤 wound healing이된정도를현미경으로관찰후사진을찍었다. 2.9. Cell cycle assay Cell cycle 은 Muse TM 를사용하여측정하였다. HaCaT 세포를 6 well plate 에 1 10 5 cells/ml 의농도로분주하여 24 시간배양후, 시료를농도별로처리하여 24 시간동안배양하였다. 염증처리군에서는 INF-α/IFN-γ 10 ng/ml 을한시간전처리하였다. 배지를제거하고 PBS 로 washing 한후 Trypsin-EDTA (Hyclone, Laboratories Inc., Logan, UT, USA) 를처리하고원심분리 (3,000 rpm, 5 min) 을통하여세포를분획하였다. PBS 0.3 ml 로세포를부유시키고 70% 에탄올 0.7 ml 로세포를고정하였다. 고정된세포를다시 PBS 로세척하고 Muse TM Cell Cycle Reagent 100 μl 를첨가하여상온에서 30 분간반응시킨뒤, PBS 100 μl 를추가하여 Muse TM Cell Analyzer 로분석하 여결과를측정하였다. 2.10. 통계처리통계프로그램인 SPSS 22.0 을사용하였고실험설계에대한분산분석은일원배치분산분석 (One-way ANOVA) 과독립표본 t-test (independent sample t-test) 를실시하여검정하였다. 각자료는 3 번이상의반복된실험을통하여얻어진결과로검정하였고 p<0.05 인경우통계적으로유의한것으로판정하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 홍해삼추출물의세포독성검사홍해삼추출물의항염증효과규명에앞서홍해삼추출물의피부를구성하고있는피부각질형성세포 (HaCaT) 에대한독성과용매에따른유효용량의범위를확인하기위하여 MTT assay 를수행하였다. 또한 HaCaT 세포가 cytokine 을분비하도록촉진시키는 tumor necrosis factor-α (TNF-α) 를처리하여아토피성염증환경을유발한뒤홍해삼추출물의농도별 (0.5, 1, 3, 5, 10, 20 μg/ml) 처리에따른세포독성여부를확인하였다. 70% Ethanol 에농도별로희석한홍해삼추출물을 24 h 및 48 h 동안처리한후세포생존율을확인한결과, Fig. 1 에나타난바와같이홍해삼추출물처리군에서 96% 이상의세포생존율을보였으며, 유의성이없는것으로판단되었다. 또한염증유발인자인 TNF-α 처리시 81% 로감소했던세포생존율이홍해삼추출물처리군에서농도의존적으로세포생존율이증가하였고, 3 μg/ml 에서 100% 의생존율을보였다. 3.2. 홍해삼추출물의염증관련유전자및단백질발현저해효과 HaCaT 세포는피부보호막역할을하는동시에여러 cytokine 을분비하여염증및면역반응에관여한다 [2,3]. HaCaT 세포가스트레스에노출되면 tumor necrosis factor (TNF-α) 와 IL-1β 등의 cytokine 이여러염증관련세포신호경로를활성화시킨다 [18]. 따라서본연구에서는 HaCaT 세포에 TNF-α/ IFN-γ 을처리한뒤홍해삼의항염증효과를확인하고자 RT- PCR 및 ELISA assay 를실시하였다. 그결과, Fig. 2 와같이무처리군과비교하였을때 TNF-α/IFN-γ 처리에따라 CCL17, CCL27, IL-1β, IL-6, IL-8 유전자의발현이증가하는것을확인하였다. 또한, 염증처리환경에서홍해삼추출물을농도별로처리할수록 TNF-α/ IFN-γ 단독처리군에비하여 CCL17, CCL27, IL-1β, IL-6, IL-8 유전자의발현이유의하게감소하였다. CCL17 과 CCL27 은 chemokine 의한종류로, inflammatory infiltrate 와연관되어있는피부염증에대표적인인자이다 [19]. ELISA assay 를통해 CCL17 과 CCL27 의단백질발현양을확인한결과, Fig. 3 에서보는바와같이염증유도환경에서 109.9% 로증가했던 CCL17 의단백질양이 85% 까지감소하였으며, CCL27 은염증처리군에서 105.4%, 홍해삼추출

338 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(4): 335-341 (2017) Fig. 1. Cytotoxic Effects of Red sea cucumber extracts in HaCaT cells. Cell viability was measured by MTT assay. Cells were treated with RSC for 24h and 48 h (a). Cells were pre-treated with 10 ng/ml TNF-α, IFN-γ for 1h prior to treated with RSC for 24 and 48 h (b). The statistical analysis of the data was carried out by using t-test. N.S means not significant (each experiment, n=3). 3.3. 홍해삼추출물의각질형성세포의이동성과증식에미치는효과피부각질형성세포는염증환경에서 cytokine 및피부세포의증식에관련된성장인자를생산하여항상성을유지한다 [1]. 따라서홍해삼추출물의세포이동성과증식에미치는영향을알아보기위해 Wound healing assay 를수행하였다. Fig. 4 에서나타낸바와같이, 무처리군의 Wound area 는 53.8%, 염증처리군에서는 89.3% 로염증환경에서세포이동및증식이감소하였다. 또한, 염증환경에서홍해삼추출물을농도별로처리하였을때, 1 μg/ml 에서 74.2%, 3 μg/ml 에서 41.2%, 5 μg/ml 에서 27.5% 로농도의존적으로 Wound area 가감소하였다. 이러한결과를통하여염증환경에서홍해삼추출물이피부각질형성세포의증식과이동능력을증가시키는데효과가있음을확인했다. Fig. 2. Effects on RSC extracts on CCL17, CCL27, IL-1β, IL-6, IL-8 mrna expression levels in HaCaT cells. Cells were pretreated with 10 ng/ml TNF-α, IFN-γ for 1 h prior to treated with RSC for 24 h. The statistical analysis of the data was carried out by using t-test. 물처리군에서 88% 까지감소하였다. 본실험을통해 TNF-α/ IFN-γ 에의해유도된염증환경에서 CCL17, CCL27, IL-1β, IL-6, IL-8 과같은염증표지인자들의발현이증가되며, 홍해삼추출물이염증표지인자들의발현의발현을농도의존적으로억제하는것을확인하였다. 해삼의성분은주로당단백질과 Chondroitin sulfate 로구성되어있으며 [20], 선행연구에따르면 Chondroitin Sulfate 와더불어 eicosapentaenoic acid (EPA), Holothurin 등의성분들이항염증효능을갖는것으로보고되었다 [21-23]. 따라서이러한홍해삼추출물에대한항염증효과는추출물에함유되어있는 Chondroitin Sulfate, EPA, Holothurin 성분에의한것으로추측된다. 3.4. 홍해삼추출물의각질형성세포성장유도효과홍해삼추출물이염증환경에서각질형성세포의세포주기변화에미치는영향을관찰하기위하여 TNF-α/IFN-γ 로염증반응을유도한뒤홍해삼추출물을농도별로처리하여 24 시간후세포주기를확인하였다. 그결과, Fig. 5 에서보는바와같이, 대조군에비하여염증처리군에서 S 주기가 39.02% 에서 28.96% 로감소하였고, G1 주기는 31.36% 에서 42.41% 로증가하였으며, G2/M 기에서는 28.4% 에서 22.14% 로감소하였다. 반면홍해삼추출물처리군의경우염증처리군과비교하였을때, 5 μg/ml 농도에서 S 주기가 36.21% 로증가하였으며, G1 주기는 32.11% 로감소하였다. 위의결과로보았을때, 염증처리군에서감소했던 G1 기에서 S 기로의세포주기이동이홍해삼추출물에서증가하여각질형성세포의세포주기진행을증가시킨다는것을알수있다. 3.5. 홍해삼추출물의세포성장유도관련유전자발현확인피부의염증반응을조절하는주요인자중하나인 Matrix metalloproteinase (MMPs) 는피부각질형성세포, 섬유아세포등

염증성사이토카인의발현억제를통한홍해삼추출물의항염증효과및아토피개선효과 339 Fig. 3. Measurement of CCL27 and CCL17 expression by Quantitative ELISA analysis. Cells were treated with variable concentrations of RSC (3 and 5 μg/ml) for 24 h. The statistical analysis of the data was carried out by using t-test. **p<0.01 and ***p<0.001 was compared to control and ##p<0.01 and ###p<0.001 was compared to TNF-α/IFN-γ treated group (each experiment, n=3). Fig. 4. Migration Effects of RSC in HaCaT cells. Cells were pre-treated with 10 ng/ml TNF-α and 10 ng/ml IFN-γ for 1 h prior to treated with variable concentrations of RSC for 24 h. Scratch wound healing assay was performed to examine the cell migration effects of RSC. (B) The statistical analysis of the data was carried out by using t-test. **p<0.01 and ***p<0.001 was compared to control. ##p<0.01 and ###p<0.001 was compared to TNF-α/IFN-γ treated group (each experiment, n=3). 으로부터분비된세포외기질 (extracellular matrix, ECM) 과기저막단백질구성요소들을가수분해하여피부노화, 주름의원인이되며, MMPs 의과도한증가는염증성질환을유도할수있다 [24-26]. 따라서본연구에서는각질형성세포에 TNF-α/ IFN-γ 를처리하여염증반응을유도한뒤피부의콜 라겐을분해하는효소인 MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9 의유전자발현에홍해삼추출물이미치는영향을확인하였다. 그결과, Fig. 6 에서보는바와같이대조군에비해염증처리군에서모든 MMPs 의활성이증가하였으며, 홍해삼추출물 5 μg/ml 처리군에서 MMP-2, MMP-3, MMP-9 유

340 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 32(4): 335-341 (2017) Fig. 5. Cell Cycle Regulation Effects of RSC in HaCaT cells. Cells were treated with variable concentrations of RSC (3 and 5 µg/ml) for 24 h. Cells wre pre-treated with 10 ng/ml TNF-α and 10 ng/ml IFN-γ for 1h prior to treated with RSC for 24 h. Cell cycle was measured by flow cytometric. 전자발현이감소하였다. 그러나홍해삼추출물처리군에서 MMP-1, MMP-7 유전자발현은감소하지않은것으로확인되었다. 결과적으로염증반응이유도되었을때 Matrix Metalloproteinase 의발현이증가하여피부노화에영향을끼칠수있음을확인하였다. 또한, 홍해삼추출물을처리함으로써 TNF-α/IFN-γ 에의해증가된콜라겐분해효소인 MMP-2, MMP-3, MMP-9 유전자발현을억제함으로써피부의콜라겐분해를저해하여피부노화억제에효과적이라고판단하였다. 4. CONCLUSION Fig. 6. Effect of RSC extracts on TNF-α induced matrix metallopeptidase (MMPs) activity in HaCaT keratinocyte. HaCaT cell were pre-treated with 10 ng/ml with various concentrations of RSC extracts for 24 h. 최근아토피피부염과여러알레르기성질환들이세계적으로증가하고있는가운데, 아토피를치료하기위한여러가지치료법들이고안되고있다. 하지만기존의치료법들은부작용의위험이있어치료에주의가요구되고있는실정이다 [10]. 따라서본연구에서는홍해삼추출물의세포독성, 항염증효과, 세포재생효과를확인하여천연물유래아토피치료용식품으로서홍해삼의가능성에대해알아보고자하였다. 그결과, 홍해삼추출물처리에따른세포독성은나타나지않았으며, TNF-α/ IFN-γ 로염증환경을유발한뒤, 염증관련유전자들과단백질의발현변화를통하여홍해삼추출물을확인한결과, 염증성사이토카인인 CCL17, CCL27, IL-1β, IL-6, IL-8

염증성사이토카인의발현억제를통한홍해삼추출물의항염증효과및아토피개선효과 341 의발현이감소하여항염증효과를나타내는것을확인하였다. 또한, 홍해삼추출물이 HaCaT 세포의증식을유도하였으며, 세포기질분해효소로알려진 MMPs 의발현억제를통해아토피피부염완화효과와더불어피부장벽의유지를돕는것을확인하였다. 최종적으로홍해삼추출물이아토피개선용천연소재로서충분한가치가있을것으로판단된다. Acknowledgements 본연구는 2016 년도중기청융복합사업 ( 과제번호 : S2357434) 에의해수행되었음. REFERENCES 1. De Benedetto, A., A. Kubo, and L. A. Beck (2012) Skin barrier disruption: a requirement for allergen sensitization. J. Invest. Dermatol. 132: 949-963. 2. Masuoka, M., H. Shiraishi, S. Ohta, S. Suzuki, K. Arima, S. Aoki, S. Toda, N. Inagaki, Y. Kurihara, S. Hayashida, S. Takeuchi, K. Koike, J. Ono, H. Noshiro, M. Furue, S. J. Conway, Y. Narisawa, and K. Izuhara (2012) Periostin promotes chronic allergic inflammation in response to Th2 cytokines. J. Clin. Invest. 122: 2590-2600. 3. Lee, H. J. and Y. C. Chang (2012) Suppression of TNF-α-induced inflammation by extract from different parts of Moringa in HaCaT cells. J. Life Sci. 22: 1254-1260. 4. Hudson, T. J. (2006) Skin barrier function and allergic risk. Nature Genetics 38: 399-400. 5. Chin, S. P. and D. H. Lee (2014) Epidermal structure and skin barrier. J. Skin Barrier Res. 16: 5-11. 6. Boguniewicz, M. and D. Y. Leung (2011). Atopic dermatitis: A disease of altered skin barrier and immune dysregulation. Immunological Reviews 242: 233-246. 7. Novak, N., T. Bieber, and D. Y. Leung (2003) Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. Journal of Allergy and Clinical Immunology 112: S128-S139. 8. Kim, M. A., H. U. Son, D. Y, Nam, Y. S. Cha, Y. K. Shin, Y. H. Choi, and S. H. Lee (2012) Inhibitory effect of Angelica keiskei extract in an atopic dermatitis animal model. Korean J. Food Preserv. 19: 792-798. 9. Kevin, D. C. (1994) Atopic dermatitis: recent trends in pathogenesis and therapy. J. Invest. Dermatol. 102: 128-137. 10. Lee, J. H., K. H. Kim, M. N. Kim, J. W. Kim, Y. S. Ro, Y. L. Park, C. W. Park, K. H. Lee, A. Y. Lee, S. H. Cho, and J. H. Choi (2006) Report from ADRG: The treatment guideline of Korean atopic dermatitis. Korean J. Dermatol. 44: 907-913. 11. Novak, N. and D. Simon (2011) Atopic dermatitis-from new pathophysiologic insights to individualized therapy. Allergy 66: 830-839. 12. Sidbury, R. and J. M. Hanifin (2000) Old, new, and emerging therapies for atopic dermatitis. Dermatologic Clinics 18: 1-11. 13. Namgung, J., K. J. Ahn, and I. K. Yeo (2015) Growth and physiological effects of immunity feed additives on the juvenile red sea cucumber Stichopus japonicus. Korean J. Fish. Aquat. Sci. 48: 466-473. 14. Choo, P. S. (2008) Population status, fisheries and trade of sea cucumbers in Asia. FAO Fisheries and Aquaculture Technical Paper 516: 81-118. 15. Kan-no, M. and A. Kijima (2003) Genetic differentiation among three color variants of Japanese sea cucumber Stichopus japonicus. Fish. Sci. 69: 806-812. 16. Tian, F., X. Zhang, Y. Tong, Y. Yi, S. Zhang, L. Li, and J. Ding (2005) PE, a new sulfated saponin from sea cucumber, exhibits anti-angiogenic and anti-tumor activities in vitro and in vivo. Cancer Biol. Therapy 4: 874-882. 17. Husni, A., I. S. Shin, S. You, and D. Chung (2009) Antioxidant properties of water and aqueous ethanol extracts and their crude saponin fractions from a far-eastern sea cucumber, Stichopus japonicus. Food Sci. Biotechnol. 18: 419-424. 18. Homey, B., M. Steinhoff, T. Ruzicka, and D. Y. Leung (2006) Cytokines and chemokines orchestrate atopic skin inflammation. J. Allergy Clin. Immunol. 118: 178-189. 19. Riis, J. L., C. Johansen, C. Vestergaard, R. Bech, K., Kragballe, and L. Iversen (2011) Kinetics and differential expression of the skinrelated chemokines CCL27 and CCL17 in psoriasis, atopic dermatitis and allergic contact dermatitis. Exp. Dermatol. 20: 789-794. 20. Ryu, H. S., J. H. Moon, and J. S. Suh (1997). Chemical compositions of glycoprotein and chondroitin sulfates from sea cucumber (Stichopus japonicus). J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. (Korea Republic) 21. Ronca, F., L. Palmieri, P. Panicucci, and G. Ronca (1998) Anti-inflammatory activity of chondroitin sulfate. Osteoarthritis and Cartilage 6: 14-21. 22. Song, S., L. Zhang, J. Cao, G. Xiang, P. Cong, P. Dong, and Y. Wang (2017) Characterization of metabolic pathways and absorption of sea cucumber saponins, holothurin A and echinoside A, in vitro and in vivo. J. Food Sci. 82: 1961-1967. 23. Simopoulos, A. P. (2002) Omega-3 fatty acids in inflammation and autoimmune diseases. J. Am. College Nutr. 21: 495-505. 24. Woessner, J. F. (2002) MMPs and TIMPs - An historical perspective. Molecular Biotechnol. 22: 33-49. 25. Kähäri, V. M. and U. Saarialho-Kere (1997) Matrix metalloproteinases in skin. Exp. Dermatol. 6: 199-213. 26. Mori, S., R. Pawankar, C. Ozu, M. Nonaka, T. Yagi, and K. Okubo (2012) Expression and roles of MMP-2, MMP-9, MMP-13, TIMP- 1, and TIMP-2 in allergic nasal mucosa. Allergy, Asthma & Immunol. Res. 4: 231-239.