Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(3): 158-164 (2016) http://dx.doi.org/10.7841/ksbbj.2016.31.3.158 ISSN 1225-7117 / eissn 2288-8268 연구논문 광합성세균 Rhodobater capsulatus PS-2 의대량배양최적화및대사산물분석 봉기문 1, 김종민 1, 유재홍 2, 박인철 2, 이철원 3, 김평일 1 * Mass Cultivation and Secondary Metabolite Analysis of Rhodobacter capsulatus PS-2 Ki Moon Bong 1, Jong Min Kim 1, Jae-Hong Yoo 2, In Chul Park 2, Chul Won Lee 3, and Pyoung Il Kim 1 * Received: 8 August 2016 / Revised: 20 September 2016 / Accepted: 21 September 2016 2016 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering 1 전남생물산업진흥원생물방제연구센터 1 Bio Control Research Institute, Jeonnam Bioindustry Foundation, Gokseong 57509, Korea Tel: +82-61-363-8994, Fax: +82-61-363-9503 e-mail:pikim30@gmail.com 2 국립농업과학원농업생물부농업미생물과 2 Department of Agricultural Biology, National Institute of Agricultural Sciences, RDA, Wanju 55365, Korea 3 전남대학교자연과학대학화학과 3 Department of Chemistry, Chonnam National University, Gwangju 61186, Korea Abstract: Plant growth promoting (PGP) hormones, which are produced in a small quantity by bacteria, affect in plant growth and development. PGPs play an important role on the crop productivity in agricultural field. In this study, a photosynthetic bacterial strain producing the PGP was isolated from paddy soil. Bacterial isolate was gram negative, rod-shaped and motility positive. From the 16s rrna gene sequence analysis, the isolate was identified as Rhodobacter capsulatus PS-2. The mass cultivation of R. capsulatus PS-2 was optimized by considering of the carbon, nitrogen and inorganic salt sources. Optimal medium composition was determined as Na-succinate 4.5 g, yeast extract 5 g, K 2 HPO 4 1 g, MgSO 4 5 g, per liter. From the result of 500 L fermentation for 2 days using the optimal medium, the viable cells were 8.7 10 9 cfu/ml. R. capsulatus PS-2 strain produced the carotenoid and indole-3- acetic acid (IAA). The carotenoid extraction and quantitative analysis were performed by HCl-assisting method. Total carotenoid contents from R. capsulatus PS-2 culture broth were measured as 7.02±0.04 and 6.93±0.05 mg/l under photoheterotrophic and chemoheterotrophic conditions, respectively. To measure the productivity of IAA, colorimetric method was employed using Salkowski reagent at optical density 535 nm. The results showed that the highest content of IAA was 197.44 ±5.92 mg/l in the optimal medium supplemented with 0.3% tryptophan. Keywords: Rhodobacter capsulates PS-2, Carotenoid, Heterotrophic cultures, Plant growth promoting bacteria, Indole-3-acetic acid(iaa) 1. INTRODUCTION 최근소득수준과삶의질향상에따라소비자들은화학비료와화학합성농약을사용하여생산된농산물보다미생물, 천연식물추출물, 천적등생물학적제제를사용하여재배한친환경 유기농산물을선호하고있다. 국내외적으로친환경농자재에대한관심과수요가증가되고있는가운데농업용미생물제제는유기성분의퇴비발효촉진, 인산가용화, 영양성분의전환등작물의생장촉진과식물병원균방제를위한작물보호제로사용되고있다 [1]. 이중작물의생장촉진에관여하는미생물제제는주로미생물대량배양을통한액상형태나동결건조 분무건조에의해분말제형화공정을거쳐사용하는것이일반적이다. 이러한미생물제제를생산하기위
광합성세균 Rhodobater capsulatus PS-2 의대량배양최적화및대사산물분석 159 해서는미생물의대량배양이필수적으로이루어져야한다. 그러나일반적으로미생물배양에는주로고가의상업용배지를사용하기때문에미생물제품의생산비를낮춰다수의수요자에게공급하는것이급선무이다. 또한미생물제품의효과를보증하기위하여배양물의생균수를기준치이상으로보증하여야함에도불구하고현실적으로그렇지못하는경우도많이있다. 농축산용미생물제제로활용되는주요미생물종류는고초균 (Bacillus), 효모 (Yeast), 유산균 (Lactic acid bacteria, LAB), 광합성세균 (Photosynthetic bacteria), 슈도모나스 (Pseudomonas), 트리코더마 (Trichoderma), 아스퍼질러스 (Aspergillus) 가있다. 그중광합성세균은논, 하천, 하수처리장등담수상태인곳에대부분존재하고있으며, 생균수는다른유기영양세균과비교하였을때거의유사한것으로알려져있다 [2]. 광합성세균은기본적으로빛이있는혐기 광 (photoheterotrophic culture) 조건에서광합성작용에의해생장하지만, 이들중일부는빛이없는호기 암 (chemoheterotrophic culture) 조건에서다른종속영양미생물처럼생육하기도한다 [3]. 농축산용미생물제제로활용되는광합성세균중홍색비유황세균 (purple nonsulfur bacteria, PSB) 은혐기 광조건이나호기 암조건에서생장이가능하며여러유기물과무기물을이용하여다양한대사활동을한다 [4]. 또한균체성분중비타민과아미노산함량이높고식물생장촉진효과가있는것으로알려져있다 [5]. 그러나광합성세균은보존력이낮고유통이까다로우며제품생산에대한체계적인연구결과가많지않아지속적인연구가필요한실정이다. 미생물제제로활용되는미생물은다양한대사산물을생산하며이를통해자연계의순환에영향을미치고있다. 미생물이생산하는대사산물종류중식물성장호르몬은농작물의생육촉진효과에있어서영양소가아닌유기물질로특정부위에서생성되어다른부위로이동하며낮은농도의미량에서도특정한생리, 생화학적또는형태학적반응을일으키는물질로정의된다. 식물생장촉진물질은식물의생장과발달을촉진하는식물호르몬의일종으로여겨지며다양한물질이존재하는것으로알려져있다. 현재식물생장촉진물질중에서상업적으로이용되는예는 auxin (indole-3-acetic acid, IAA), gibberellin (GA 3 ), abscisic acid (ABA), 에틸렌등이있다. 이중 auxin 의대표적인물질인 IAA 는줄기절편의길이생장을촉진하고줄기와뿌리의발달, 꽃과과실의발생, 그리고굴성운동등을유도한다. 광합성세균은 IAA 와 indole- 3butyric acid (IBA) 를포함하는 auxin 계열의식물생장촉진물질을생산하며, 이들대사산물들은식물생장과생리적과정에매우광범위하고다양하게작용하는것으로보고되고있다 [6,7]. 또한, 광합성세균중에는 5-aminolevulinic acid (ALA), gibberellin 을생성하여세포분열과종자발아촉진작용을하는것으로알려져있다 [8]. 이외에도식물생장에영향을미치는대사산물을생산하는미생물종류는 Pseudomonas fluorescens sp., Pseudomonas putida, Enterobacter sp., Azotobacter sp., Bradyrhizobium japonicum, Azotobacter vinelandii, Erwinia herbicola 등이있으며, 현재활발한연구가진행되고있다 [9]. 본연구에서는농업에활용하기위해논, 시설재배밭토양및호수의퇴적토양등에서분리한광합성세균을선별하여대량생산최적화를통해보존성을높이고, 광합성세균이생산하는대사산물탐색을통해미생물제제로의가능성을탐색하고자하였다. 2. MATERIALS AND METHODS 2.1. 광합성세균의분리및선발광합성세균의분리및선발을위해논, 시설재배밭토양, 쓰레기장, 하천및호수의퇴적토양등 22개소에서시료를수집하였다. 수집된시료는각종류별로 0.1 g 씩 150 20 mm의 culture tube에 30 ml Biebl & Pfennig s 배지 (KH 2 PO 4 0.5 g, MgSO 4 7H 2 O 0.2 g, NaCl 0.2 g, CaCl 2 2H 2 O 1.2 g, yeast extract 0.05 g, malic acid 0.3 g, succinic acid 1 g, Na-acetate 1 g, 0.1% ferric citrate 5 ml, Trace Element Solution SL-7* 1 ml, per liter) 를혼합하여액체파라핀으로중층하였으며, 혐기상태로 3,000 lux 조도의형광을조사한후 28 o C 항온기에정치배양하였다 [10]. Tube 표면에형성된적색또는갈색의균체를백금선으로채취하여 Biebl & Pfennig s 고체배지에평판법으로도말하여순수분리하였다. 광합성세균중호기 암배양이가능한균주를선별하기위해각각의균주를 Van niel s yeast 배지 (K 2 HPO 4 1 g, MgSO 4 0.5 g, Yeast extract 10 g, per liter) 에호기 암조건에서 30 o C, 48시간동안배양하여적색의 colony 형태를나타내는균주를얻었다. 균주의분류학적동정을위하여다양한생화학적성상검사및전자주사현미경 (scanning electron microscope, SEM) 으로그형태를관찰하였다. 이를바탕으로 Bergey s manual of systematic bacteriology의색인에따라최종분류동정하였다 [11]. 2.2. 광합성세균배지최적화및제형화광합성세균의배지최적화를위해일반적으로사용되는 Van niel s yeast 배지에탄소원, 유기산, 질소원, 무기염류를첨가하여최적배지를선정하였다. 배지에따른광합성세균의생장률을측정하기위해탄소원 (glucose, soluble starch), 유기산 (sodium acetate, sodium succinate), 질소원 (yeast extract, soy peptone, MSG,), 무기염류 (K 2 HPO 4, KH 2 PO 4, MgSO 4, NaCl, NH 4 Cl, H 3 BO 3, CaCO 3,) 를농도별로첨가하였으며, 흡광도 (600 nm) 및생균수측정을통해최적배지를선정하였다. 배양조건은호기 암상태에서 120 rpm, 30 o C, 48 시간동안진행하였다. 선발된배지를대상으로대량생산최적화를위해 500 L 발효기를이용하여광합성세균의배양을수행하였다. 100 ml 최적배지가포함된 500 ml 삼각플라스크에서 1 차종균배양을진행하였으며, 2 차종균의경우최적배지 2 L 를포함한 5 L 삼각플라스크에서동일한조건으로배양한후 500 L
160 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(3): 158-164 (2016) 발효기의 300 L 대량배양을위한접종원으로사용하였다. 배양조건은동일하게호기 암조건으로 120 rpm, 30 o C, 48 시간동안배양하였다. 대량배양한광합성세균의분말제형화를위해광합성세균배양액을 15,000 g 에서 15 분동안관형원심분리기를이용하여균체를회수하였다. 보존첨가제에따른광합성세균의생존율비교를위해회수한균체에성분조성이다른각각의보존첨가제 (#1; 0.2% SiO 2, 1% starch, #2; 0.2% SiO 2, 0.5% starch, 0.5% MSG) 를첨가하여 80 시간동안동결건조한후핀밀분쇄기를이용하여균질한상태로분말화하였다. 또한분쇄된광합성세균제제를이용하여 4 o C ( 냉장 ), 25 o C ( 실온 ), 40 o C 조건에서 6 주동안온도별보존안정성실험을수행한후분말제형화에따른광합성세균의보존성을조사하였다. 2.3. Carotenoid 추출및분석광합성세균이생산하는 carotenoid 의추출과배양조건에따른 carotenoid 생산량을비교하기위해최적배지에서호기 암조건으로 120 rpm, 30 o C, 48 시간동안 100 ml (V 2 ) 로배양하였으며, 혐기 광조건으로 3000 lux 에 N 2 gas 를주입하여 120 rpm, 30 o C, 48 시간동안 100 ml (V 2 ) 에서비교배양하였다. Carotenoid 추출은염산추출법 (HCl-assisted extraction) 으로추출하였다. Carotenoid 의경우균체내부에서합성되기때문에상등액이제거된광합성세균균체를사용하였으며, 3M HCl 을첨가하여 carotenoid 가추출될수있도록균체를분해하였다. 3M HCl 에의해분해된균체는 10,000 g 에서 20 분동안원심분리한후상등액은제거하였다. 상등액이제거된시료에 acetone (V 1 ) 을첨가하여 28 o C, 100 rpm, 30 분동안교반하여 carotenoid 를추출하였다. 분리한상등액의 480 nm 에서흡광도값 (A), carotenoid 함량은흡광도에따라산출식 (D: dilution ratio, 0.16: extinction coefficient of carotenoid) 에근거하여정량분석하였다 [12]. Table 1. Optimized LC-MS/MS parameters for the determination of IAA MRM parameters IAA m/z 176 130 DP a), V 21 CE b), V 31 Mass spectra range 100~500 m/z Ionization ESI positive mode Source temperature ( o C) 500 Ionization voltage (V) 4500 Ion source (GS1) setting 30 Mpsi Ion source (GS2) setting 30 Mpsi Curtain gas setting 10 Mpsi DP a) : declustering potential, CE b) : collision enegy. 2.4.2. LC-MS/MS를이용한 IAA 정성분석 0.3% tryptophan이첨가된최적배지에서배양한광합성세균배양액 100 ml을 10,000 g으로원심분리한후 0.2 μm filter 로제균한상등액을 LC-MS/MS 분석용시료로사용하였다. Biosystems-Sciex API 2000 (Applied Biosystems, Concord, Ontario, Canada) 분석기기와분석용 column으로 Sunfire ( 5 μm, 4.6 250 mm, Waters, USA) 를사용하였다. MS의 Ion source는 turbo spray 5500, capillary temperature는 500 o C으로설정하였다. 분석시험에는용매의비율이점진적으로높아지는 gradient program (5-65%, 30 min) 을사용하였으며, 유속은 1 ml/min의조건으로하였다. 이동상조건시험에서 A 용액은 100% H 2 O에 0.05% Trifluoroacetic acid (TFA), B용액은 100% acetonitrile (ACN) 에 0.05% TFA를사용하였다. 대사산물의정성분석을위한 LC-MS/MS의 ionization mode는 ESI positive mode와 MRM mode를이용하여분석하였다 (Table 1) [14]. Total pigment = ADV ------------------- 1 0.16V 2 3. RESULTS AND DISCUSSION 2.4. 식물생장촉진물질분석 2.4.1. 비색법 (colorimetric method) 에의한 IAA 함량측정광합성세균이생산하는식물생장촉진물질중비색법을통해분석이가능한 IAA 함량을측정하였다. 광합성세균을최적배지에접종한후 IAA 의전구물질인 L-tryptophan 을 0.05, 0.1, 0.2, 0.3% 농도로각각첨가하여호기 암조건에서 48 시간배양하여시간변화에따른 IAA 의생성량을조사하였다. IAA 생성량측정은배양후배양액을취하여 10,000 g 로 20 분동안원심분리한상등액 1 ml 에 salkowski 용액 (H 2 SO 4 150 ml, H 2 O 250 ml, 1.5 M FeCl 3 6H 2 O 7.5 ml) 2 ml 을혼합하여상온에서 20 분반응시킨후분광광도계를이용하여 535 nm 에서측정하였고, 표준 IAA (Sigma Co., USA) 을사용하여얻어진표준곡선에따라정량하였다 [13]. 3.1. 광합성세균선발논, 시설재배밭토양, 쓰레기장, 하천및호수의퇴적토양등으로부터광합성세균을선발하기위해 Biebl & Pfennig s 배지를이용하여 tube 표면에형성된적색또는갈색의균체총 6종을분리였다. 그중호기 암배양이가능한 1종의광합성세균을선별하였다. 선별한광합성세균의유전학적특징을확인하기위하여각각의 genomic DNA를 template DNA로사용하여 16S rrna 염기서열분석을수행하였다. 선별한광합성세균의 16S rrna 염기서열을 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 의 gene bank database 정보로부터균주염기서열의상동성을확인하였다. 수집된염기서열들간의 Multiple alignment는 DNAStar program을이용하여편집하였다. 그리고 MEGA 6.0 program의 neighbour-joining method (Fig. 1), Maximum Parsimony, Maximum Likelihood 에의해염기서열간의유전적거리와 phylogenetic tree를확
광합성세균 Rhodobater capsulatus PS-2 의대량배양최적화및대사산물분석 161 Fig. 1. Neighbour-joining phylogenetic tree based on 16S rrna gene sequences showing the relationship of strain PS-2 with close relatives of the family Rhodobacteraceae. 인한결과, Rhodobacter capsulatus ATCC 11166 과 99% 의상동성을나타내었다. 선별한균주는그람음성세균으로운동성을나타내었다. 호기적조건뿐아니라혐기적환경에서생장가능한통성혐기성균주였으며, amylase, cellulase, xylanase, protease 활성은없었다 (data not shown). 이러한각종생리생화학적특징을조사한결과 Rhodobacter capsulatus 와가장가까운특성을나타내었으며, 본연구에서는 Rhodobacter capsulatus PS- 2 로명명하였다 [15]. 3.2. 배지조성최적화및대량배양조건확립선별한광합성세균 R. capsulatus PS-2 의최적배양조건을확립하였다. Van niel s yeast 배지에유기산, 질소원, 무기염류를농도별로첨가하여선발한최적배지 (4.5 g Na-succinate, 5 g yeast extract, 1 g K 2 HPO 4, 5 g MgSO 4, per liter) 의경우흡광도 2.12, 생균수 1.2 10 9 cfu/ml 으로최고의배양효율을나타내었으며, 상업용배지를사용한결과와유사한배양효율을나타내었다 [16]. 대량배양의최적화를위해최적배지를대상으로 5, 50, 500 L 발효기를이용하여 R. capsulatus PS-2 를호기 암조건에서 pilot-scale 대량배양을수행하였다. 배양조건은 30 o C, 120 rpm 에서배양액의 1% 를접종하여 48 시간배양하였다. 또한산소공급량은 0.3 vvm 으로설정하였으며, 초기 ph 6.5-7.0 에서최종 ph 8.49-8.55 로배양이종료되었다. 5 L jar-fermenter 에서최적배양한결과최종생균수는 2.7 10 9 cfu/ml, 50 L 발효기에서최적배양한최종생균수는 5.8 10 9 cfu/ml, 500 L 대용량발효기를이용하여호기 암배양한결과최종생균수는 8.7 10 9 cfu/ml 로측정되었다 (Fig. 2). 대량배양 scale-up 결과 500 L 대용량발효기에서가장높은생균수가조사되었으며, 이는 500 L 발효기의통기량및온도조절기능이 5 L 및 50 L 보다안정하기때문에가장높은효율을나타낸것으로판단된다. 동결건조기를이용해분말제형화된초기생균수는각각 2.3 10 9 cfu/g ( 제형화조건 #1; 0.2% SiO 2, 1% starch), 2.1 10 9 cfu/g ( 제형화조건 #2; 0.2% Fig. 2. Scale-up and culture profile of Rhodobacter capsulatus PS- 2 using 5, 50 and 500 L fermenters.
162 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(3): 158-164 (2016) Fig. 4. Carotenoid production of Rhodobacter capsulatus PS-2 from the chemoheterotrophic and photoheterotrophic culture conditions. 수는제형화조건 #1 의경우 7.5 10 8 cfu/g, 제형화조건 #2 의경우 7 10 8 cfu/g 로최종확인되었다 (Fig. 3(b)). 40 o C 에서온도별보존안정성실험결과 1 주일경과후생균수는제형화조건 #1 의경우 9.5 10 6 cfu/g, 제형화조건 #2 의경우 8.0 10 6 cfu/g 로확인되었다. 이러한결과를바탕으로제형화조건 #1 이 #2 에비하여온도에대한안정성이높은것으로판단되며, 이후모든실험은제형화조건 #1 번 (0.2% SiO 2, 1% starch) 으로선정하여모든실험을수행하였다. 광합성세균분말제형화후온도별보존안정성실험결과, 40 o C 조건에서보존성은 1 주일경과후부터생균수가급격하게감소됨을확인하였으며, 2 주후부터생균수는전혀확인할수없었다 (Fig. 3(c)). 결론적으로, 각각의조건에서분말제형화된광합성세균의보존성을조사한결과 4 o C ( 냉장 ), 25 o C ( 실온 ) 에서 6 주이후에도 1 10 8 cfu/g 이상의생균수를확인할수있었다. 따라서, 본연구를바탕으로제품을개발할경우생산된제품은 4~25 o C 조건에서보관하는것을보관온도로선정하고 6 주이상보관하지않는것을권장해야할것으로판단된다. Fig. 3. Stability and conservativeness of Rhodobacter capsulatus PS-2 under different storage conditions. A, 4 o C; B, 25 o C; C, 40 o C. SiO 2, 0.5% starch, 0.5% MSG) 로조사되었다. 분말제형화된광합성세균의보존성 ( 안정성 ) 을조사하기위하여 4 o C ( 냉장 ), 25 o C ( 실온 ), 40 o C ( 가혹조건 ) 에서 1 주일간격으로 6 주동안생균수를측정하였다. 4 o C 에서 6 주후생균수를측정한결과, 제형화조건 #1 의경우 9 10 8 cfu/g, 제형화조건 #2 의경우 8.5 10 8 cfu/g 로확인되었다 (Fig. 3(a)). 25 o C 에서 6 주후생균 3.3. Carotenoid 추출및정량분석최적배지에서 100 ml volume 으로배양한 R. capsulatus PS-2 가생산하는 carotenoid 의정량분석을위해염산 (HCl-assisted extraction) 을이용한추출법을수행하였다. 추출용매는 acetone 을이용하였으며, 추출물은 480 nm 에서흡광도를측정하였다. 흡광도에따라산출식에대입하여정량분석한결과, 7.18±0.15 mg/l 의함량이측정되었다. 배양조건에따른 carotenoid 생산차이를조사하기위해혐기 광조건과호기 암조건에서각각배양한 R. capsulatus PS-2 의 carotenoid 생산량을비교하였다. 분석한결과, 혐기 광배양의경우 7.02±0.04 mg/l, 호기 암배양의경우 6.93±0.05 mg/l 의총 carotenoid 함량이측정되었다 (Fig. 4). 배양조건에따른 R. capsulatus PS- 2 의색소생산은커다란차이가없음을확인하였다.
광합성세균 Rhodobater capsulatus PS-2 의대량배양최적화및대사산물분석 163 Fig. 5. Quantitative analysis of IAA produced by Rhodobacter capsulatus PS-2 with the tryptophan concentration gradient. 3.4. IAA 분석 R. capsulatus PS-2 균주를 tryptophan 이첨가된최적배지에서배양하며시간변화에따른 IAA 생성량을조사하였다 [17]. IAA 전구물질로알려진 tryptophan 0.05, 0.1, 0.2, 0.3% 을최적배지에각각첨가하여호기 암조건에서배양한후 IAA 생산농도를측정한결과 tryptophan 0.05% 에서 65.73 mg/l, 0.1% 에서 95.18 mg/l, 0.2% 에서 175.58 mg/l, 0.3% 에서 197.44±5.92 mg/l 가각각조사되었다 (Fig. 5). IAA 전구물질인 tryptophan 농도증가에따라 IAA 생산량도증가하였으며, 41 mg/l 의 IAA 를생성하는 Azotobacterium vinelandii 와비교하였을때약 1.6~4.8 배의높은 IAA 생산량을확인할수있었다 [18]. R. capsulatus PS-2 의시간변화에따른생산량은 42 시간에서최대결과를나타내었으며, 본연구에서분리한광합성세균은 tryptophan 을 IAA 의전구물질로활용하여 IAA 에의한생장촉진효과를충분이나타낼수있는것으로판단된다. Tryptophan 을전구물질로활용하는 IAA 의정성분석을위하여 LC-MS/MS 에서 MRM 조건을 176.1 130.1 m/z 로설정하여최적탐색하였다. 전처리시료를분석한결과머무름시간 (retention time) 21 min 에서표준물질 (Fig. 6(a)) 과동일한시간의머무름시간을나타내었으며 (Fig. 6(b)), 본연구에서분리한광합성세균 R. capsulatus PS-2 의경우식물생장촉진물질중 auxin 의대표물질인 IAA 를생산하는것을확인할수있었다. 4. CONCLUSION 본연구를통해논, 시설재배밭토양, 쓰레기장, 하천및호수의퇴적토양등 22 개소에서분리한총 6 종의광합성세균중호기 암배양이가능한 R. capsulatus PS-2 를분리하였다. 형태학적특징으로는그람음성의막대모양으로, 운동성이있 Fig. 6. Qualitative analysis of IAA using LC-MS/MS mass spectra from Rhodobacter capsulatus. Retention time 21 min, IAA. (a) standard IAA, (b) IAA extracted from R. capsulatus PS-2 culture broth. 었다. 분리균주는호기및혐기조건에서배양이가능한통성혐기성으로확인되었으며, amylase, cellulase, xylanase, protease 활성을나타내지못하였다. 분리균주의 16S rrna 염기서열을분석한결과 Rhodobacter capsulatus ATCC 11166 과 99% 의상동성을나타내었으며, 본연구에서 Rhodobacter capsulatus PS-2 로명명하여연구를수행하였다. 선별균주의최적배양조건으로는 30 o C, ph 7.0 이었고, 유기산, 질소원, 무기염류첨가를통해산출한최적배지의조성은 4.5 g Na-succinate, 5 g yeast extract, 1 g K 2 HPO 4, 5 g MgSO 4, per liter 로조사되었다. 대량배양의최적화를위해최적배지를대상으로 5, 50, 500 L 발효기를이용하여 scale-up 을수행한결과, 최종적으로 8.7 10 9 cfu/ml 의생균수로배양할수있었다. 제형화한분리균주의온도보존성 ( 안정성 ) 은 4 o C ( 냉장 ), 25 o C ( 실온 ) 에서 6 주동안 1 10 8 cfu/ml 의보존성을나타내었으며, 40 o C 에서는불안정한것으로조사되었다. 최적배지에서배양한광합성세균 R. capsulatus PS-2 는 carotenoid 를합성하였으며, 식물생장촉진물질 indole-3-acetic acid (IAA) 를전구물질인 tryptophan 첨가에의해높은수준으로생산하였다. IAA 는 tryptophan 농도에따라증가하였으며, tryptophan 0.3% 를첨가한최적배지에서 42 시간배양시가장높은 197.44±5.92
164 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 31(3): 158-164 (2016) mg/l 의생성량을확인할수있었다. LC-MS/MS 분석을통해이온화된 IAA 의모분자는 176.1 Da, 세분화이온은 130.1 Da 이었으며, 머무름시간 21 min 에서식물생장촉진물질인 IAA 가검출되는것을확인할수있었다. Acknowledgements 본논문은농촌진흥청공동연구사업 ( 과제번호 PJ010513) 의지원에의해이루어졌으며이에감사드립니다. REFERENCES 1. Nam, H. S. (2011). Environmentally-friendly agriculture & biotic pesticide. KIC News 14: 12-18. 2. Van Niel, C. B. (1944) The culture, general physiology, morphology, and classification of the non-sulfur purple and brown bacteria. Bacteriological Reviews 8: 1. 3. Zeilstra-Ryalls, J., M. Gomelsky, J. M. Eraso, A. Yeliseev, J. O Gara, and S. Kaplan (1998) Control of photosystem formation in Rhodobacter sphaeroids. J. Bacteriol. 180: 2801-2809. 4. Sasikala, C. R. C. V. and C. V. Ramana. (1995) Biotechnological potentials of anoxygenic phototrophic bacteria. I. Production of single cell protein, vitamins, ubiquinones, hormones, and enzymes and use in waste treatment. Advances in Applied Microbiology 41: 173-226. 5. Sunayana, M. R., Ch. Sasikala, and Ch. V. Ramana (2005) Rhodestrin: A novel indole terpenoid phytohormone from Rhodobacter sphaeroides. Biotechnol. Lett. 27: 1897-1900. 6. Costacurta, A., P. Mazzafera, and Y. Rosato (1998) Indole-3-acetic acid biosynthesis by Xanthomonas axonopodis pv. citri is increased in the presence of plant leaf extracts. FEMS Microbiol. Lett. 159: 215-220. 7. Kende, H. and J. Zeevaart (1997) The five classical plant hormones. Plant Cell 9: 1197-1210. 8. Chon, S. U. (2003) Herbicidal activity of δ-aminolevulinic acid on several plants as affected by application methods. Kor. J. Crop Sci. 48: 50-58. 9. Beyeler, M., C. Keel, P. Michaux, and D. Haas (1999) Enhanced production of indole-3-acetic acid by a genetically modified strain of Pseudomonas fluorescens CHA0 affects root growth of cucumber, but does not improve protection of the plant against Pythium root rot. FEMS Microbiol. Lett. 28: 225-233. 10. Biebl, H. and N. P. Pfennig (1978) Growth yields of green sulfur bacteria in mixed culture with sulfur and sulfate reducing bacteria. Arch. Microbiol. 117: 9-16. 11. Vos, P., G. Garrity, D. Jones, N. R. Krieg, W. Ludwig, W. Rainey & Whitman (Eds.) (2011). Bergey's Manual of Systematic Bacteriology: Volume 3: The Firmicutes. Springer Science & Business Media, USA. 12. Chen, D., Y. Han, and Z. Gu (2006) Application of statistical methodology to the optimization of fermentative medium for carotenoids production by Rhodobacter sphaeroides. Process Biochemistry 41: 1773-1778. 13. Glickmann, E. and Y. Dessaux (1995) A critical examination of the specificity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 61: 793-796. 14. Kim, J. H., J. M. Park, G. H. Choi, Y. K. Park, G. J. Im, D. H. Kim, and O. K. Kwon (2013) Comparison of liquid chromatographymass/mass spectrometry (MS) and gas chromatography-ms for quantitative analysis of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid from the concentrated liquid fertilizer. Journal of Applied Biological Chemistry 56: 53-57. 15. Jumas-Bilak, E., S. Michaux-Charachon, G. Bourg, M. Ramuz, and A. Allardet-Servent (1998) Unconventional genomic organization in the alpha subgroup of the Proteobacteria. Journal of Bacteriology 180: 2749-2755. 16. Lee, S. S., T. J. Oh, J. Kim, J. B. Kim, and H. S. Lee (2009) Bacteriocin from purple nonsulfur phototrophic bacteria, Rhodobacter capsulatus. Journal of Bacteriology and Virology 39: 269-276. 17. Normanly, J., J. D. Cohen, and G. R. Fink (1993) Arabidopsis thaliana auxotrophs reveal a tryptophan-independent biosynthetic pathway for indole-3-acetic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences 90: 10355-10359. 18. Jeon, J. S., T. S. Ahn, and H. K. Song (2003) Indoleacetic acid producing ability of soil bacteria that promote plant growth and phosphate solubilizing capability. Institute of Basic Sciences 14: 171-180.